Induzioni DeltaFosB in coperto orbitofrontal potentiates a sensibilizazione locomotrizità pese à attenuate a disfunzioni cognu causata da a cocaine. (2009)

2. Metodi

Tutte l'esperimenti foru realizati in strictu accunsenu cù a NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals è anu accettata da u Cuntattu Istitutu di Curesu è Ughjettu di l'UT Southwestern.

2.5. Quantificazione di mRNA

I tarritorii ricivutu l'incezzioni intra-OFC di AAV-GFP o AAV-ΔFosB, seguitatu da 21 intiggie di alte di ogni ghjurnata di salina o di cocaine, cumu secondu e scumite per l'esperimenti di compulsione. L'animali eranu usati 24 h dopu l'ultima incisione salina o cocaine. I rossi fùbbenu tumbati da decapituta. I moins anu aghjuntu rapidamente è bilaterali 1 mm gruxie 12 puncher puntei di l'NAc sò stati acquistati è immediatamenti secchiata è guardatu in -80 ° C finu à l'RNA a isolazione. Punches da l'OFC anu ancu eliminati da l'analisi di u microarray di DNA chì cunfirmà a trasmissione di genitali virali mediata in questa regione (vede (Winstanley et al., 2007) per risultati più detallati). RNA hè stata extravaganta da a specie di NAc usando u RNA Stat-60 reagent (Teltest, Houston, TX) d'acord à l'urdinamentu di u fabricatore. L'annu Contaminante fù eliminatu da u trattamentu DNase (DNA-Free, catalogu # 1906, Ambion, Austin TX). RNA purificatu era trascurutu à u cDNA (Superscript First Strand Sintesi, Catalogue # 12371-019; Invitrogen). I Transcritti per i genesi di interessu sò stati quantificati in questione à tempu real (CIRC), in un Stratagene (La Jolla, CA) Mx5000p 96-well thermocycler. Tutti i primi eranu custom-synthesized by Operon (Huntsville, AL; see Table 1 per sequences) è validati per a linearità è spicità prima di spirimintali. Tutte e ducumentu di PCR sò stati normalizzati à niveddi di gliceraldehyde-3-fosfat desidrogenase (GAPDH), chì ùn era micca alteratu da u trattamentu di cocaini, secondu a furmazione seguente: ΔC_t =C_t(genu d'interessu) - C_t (GAPDH). E l'arette AAV-ΔFosB è AAV-GFP chì anu ricivutu a cocaine, è a fugliale AAV-ΔFosB chì anu ricivutu salina crunulica, sò stati calculati per relative à i cuntrolli (gruppu AAV-GFP sulci crunatuali) da seguente: ΔΔC_t = ΔC_t - ΔC_t (gruppu di cuntrollu). In seguitu cù a pratiche ra ricumandata in u campu (Livak è Schmittgen, 2001), l'espressioni relative à i cuntrolli anu calculatu cume l'espressione esse: 2^-ΔΔCt.

  

Table 1

Sequenza di primirsi utilizati per quantificà e livelli di cDNA a través da PCR in tempu real.

3. Risultati

Spirimentu 1

L'amministrazione di cocaine crònica pruduce a sensibilizazione à l'effetti di iperlimiomorfi di a cocaine aguda chì hè mimita da ΔFosB

Cumu esse espertu, a sensibilizazione di locomotora robusta era osservata in animali di cuntrollu dopu l'esposizione cocaine crònica, cù l'animali trattati cruamenti in cocaine chì mostranu a crescenza in rispittà à a cocaine aguda (Fig. 1A, trattamentu crunulòlicu: F_1,34 = 4.325, p<0.045). Animali chì esprimenu eccessivamente ΔJunD, un mutante negativu dominante di JunD chì agisce da antagonista di ΔFosB (Zachariou et al., 2006), in l'OFC sò micca distinguishenu da animali di cuntrollu (Fig 1C, GFP v ΔJunD, gruppu: F_{1, 56} = 1.509, NS). In ogni modu, l'animali chì anu esse esprimintu ΔFosB in l'OFC chì anu ricivutu injections di salina rimettenu parevanu "sensibilizati": anu vistu una risposta locomotora rinfurzata à cocaine aguda chì ùn si distinguiste da a risurta sensitizzata di i so contrapartiti trattati cù cocaine crònica (Fig 1B, GFP vs ΔFosB surgery × trattamenti crònii: F_{1, 56} = 3.926, p<0.052; ΔFosB solu: trattamentu crònicu: F_1,22 = 0.664, NS). L'animali di l'ΔFosB sò pocu ripetutu in u primu minimu 15 d'esse situatu in i locomotorii (GFP vs ΔFosB, cirurgia: F_1,56 = 4.229, p <0.04), ma i livelli di attività locomotoria eranu paragunabili à i controlli in u 15 min prima di l'amministrazione di cocaina (chirurgia: F_{1, 56} = 0.138, NS).

  

Fig. 1

Sensibilizazione in locomotora di cocaine. A cocaine aguda produciu aumentos superiore in l'attività locomotrizi in i animali di cuntrollu trattati chronicamenti cù cocaine versus salina (panel A). In l'animali chì anu spressione ΔFosB (panel B), quelli chì sò dati risposti saline (più ...)

In cunsiderà chì, quandu u cocaine durante u 5CSRT, i stessi animali ammanate una capacità relativamente avanzata di ricusalli di fà risposti di muturi prematuri, sta hyperactitetà appare specifiche locomotiva ambulatoriu, ie u tipu di movimentu chì hè tipicu attu in studi di sensibilizazione locomotriz. Ancu l'attività megliu in rispondenu à stimulant drugs puderanu rifuggià un prughjettu à l'angiogene, l'intracellenza di l'OFC di l'ΔFosB ùn aumenta l'ansietà quantità per u labirintu più elevatu o prufeta di campu apertu (dati ùn sanu). L'animali eranu ancu bè cù l'injections IP, è l'injezione di salina ùn anu alteru u so funziu cognettu (Winstanley et al., 2007), per questu queste effettu di u mutore pò esse attribuita à una risposta generale à una inedizione IP. In sumarii, sti sviutati indicanu chì l'induczione di ΔFosB in l'OFC hè abbastanza (ma micca necessariu) per locomotora sensitizzata chì risponde à cocaine, anche ancu ΔFosB in a listessa regione induve a toleranza à l'effetti di a cocaine nantu à a motivazione è l'impulsività (Winstanley et al., 2007).

3.1. ΔFosB / FosB

I nivimi di FosB mRNA in NAc ùn anu micca altera da u trattamentu di droga crònica (Fig. 2A, droga: F_1,14 = 1.179, ns) o espressione di ΔFosB in the OFC (cirurgia: F_{1, 14} = 0.235, ns). In ogni modu, i livelli di ΔFosB sòranu significativamente maiori in l'animali chì anu trattatu chronicamenti cù cocaine in accordu di rapporti previos (Chen et al., 1997); Fig 2B, droga: F_1,14 = 7.140, p<0.022). Curiosamente, a quantità di ΔFosB mRNA in u NAc di animali trattati cù salina era più bassa in quelli in cui stu fattore di trascrizzione era statu eccessivamente espressu in OFC (droga: F_1,14 = 9.362, p<0.011). Tuttavia, l'assenza di un'interazione droga × chirurgia indica chì u trattamentu crònicu di cocaina avia u listessu effetti in i gruppi trattati AAV-GFP è AAV-osFosB, elevendu proporzionalmente i livelli di ΔFosB in una misura simile (droga × chirurgia: F_{1, 14} = 0.302, ns).

  

Fig. 2

Changes in ARNI in l'NAc di l'animali chì anu espresa di GFP o ΔFosB in l'OFC, è trattati cruamenti cù a salina o a cocaine. A data indicate i cambiamenti linearie di volte di l'espressione comu una proporzione di valuri di cuntrollu. Dati sanu sanu sanu (più ...)

4. Discussion

Quì ammuce chì l'expressione espresa di ΔFosB in i fugliali sensitizzati di l'OFC a l'accusazioni stimulanti locomotiva di a coca, simule l'attività di l'amministrazione di cocaine cronica. Avemu prumittu chì l'esercitu di questi animali nantu à u 5CSRT è i paradigmi di dimostrazione di rimborsu hè menu affettivu di cocaine aguda, è chì un esempiu simili di a tolernità hè osservatu wara a cocaine repetitiva. Cusì, a sensibilizazione è a toleranza à l'azzioni di a cocaine pò esse osservata in i stessi animali, cù e dui adattazione mediate via a stissa molecule, ΔFosB, chì operanu in a listessa moina. U fattu chì i dui fenomeni ponu esse in a partazione di imitazzione unu di l'azzioni di a cocaine in un locu frontocortical singulu pò esce da l'impurtanza di e regioni corticale in secuelae di ingesta di droga crònica. Inoltre, queste dati suggerenu chì a tolleranza è a sensibilizazione riflettunu dui aspetti chì pareanu cuntrastanti, affissati intimamente, di a risposta à i droghe additivi.

Dognu chì l'incrementu di l'espressione ΔFosB in NAc hè involudatu critichi in u sviluppu di a sensibilizazione locomotrize, una ipotesi plausibile seranu chì l'expressione expresa ΔFosB in l'OFC pre-sensitize l'animali à a cocaine crescenu i nivimi di ΔFosB in NAc. Tuttavia, u risultatu inversu hè stata trovi: i livelli di ΔFosB in a NAc eranu significativamente bassa in animali chì anu spressione ΔFosB in l'OFC. I consecuenzia cumportamentali di sta dimostrazzioni in NAc ΔFosB sò dritti d'interpretà, cum'è inhibitori di l'azzioni di ΔFosB per l'esercitu di l'ΔJunD in questa reperta reduce quelchi di l'effetti di cocaine in i sele (Peakman et al., 2003). Certi paralelli attranu questi questi osservazioni è quelli fatti in riferimentu à u sistema dopamine. Per esempiu, aghjunamentu à dopamine parfetta in a NAc pò diri à l'iperattività quantu pò diretta l'applicazione di l'agonisti dopamine in questa regione (Bachtell et al., 2005; Costall et al., 1984; Parkinson et al., 2002; Winstanley et al., 2005b). Cumu averà, u fattu chì l'altitudine corticale di ΔFosB pò disurzà l'espressione subcortical s'assumiglia à u stabilitu beni chì un crescente di a trasmissionazione dopaminergica prefrontale hè spessu accumpagnata da una regula reciproca in i nivuli striatiali dopamine (Deutch et al., 1990; Mitchell è Gratton, 1992). Cumu tali mecanismu di retroalimentazione pò travaglià per molèuli di signalamentu intracelulare ùn hè micca cusì chjaru, ma puderete riflette i cambiamenti in l'attività generale di certi rete neuronal causati per un cambiamentu di a trascrita genetica. Per esempiu, l'incrementu di u ΔFosB in l'OFC ponit à un regulu regulatu di l'attività inhibitore local, cum'è evidenze per un incrementu di i livelli di u GABA_A receptor, mGluR5 receptor and substance P, as detected by microarray analysis (Winstanley et al., 2007). Stu cambiamentu in l'attività di l'OFC puderà puderà influenzà a attività in altre area di u funziunale, chì puderia cambià in un mudificazione lucali di l'espressione di ΔFosB. Sia quantità di nivula di ΔFosB riflette i cambiamenti relattivi in ​​l'attività di dopamine hè un prublema chì guariscenze più investigazione.

Tutte l'animali hà vede un incrementu significativu in ΔFosB mRNA livelli in a NAc seguenti trattamentu di cocaine cronica, in seguitu cù rapporti precedente di nivandu di nivula di proteina (Chen et al., 1997; Hope et al., 1992; Nye et al., 1995). In ogni modu, un rapportu recenti trova chì i niveli di ΔFosB mRNA ùn anu più eslevatu significativu di u 24 h cù trattamentu anfetaminu crunulariu, anche nuteve l'aumentu significativu anu osservatu 3 h dopu a l'injezzione finali (Alibhai et al., 2007). Questa discrepanzia pò esse da a diferenza in a droga psichistimulante (cocaine vs amphetamine), ma datu à a morti più corta di a cocaine, saria raziunatu chì cresce chì i so effetti nantu à l'espressione generale si nurmalizzaru più rapidamente ca l'anfetamine, inveci di vice versa. Un raghjone più plausibile per questi risultati medichi hè chì l'animali in l'attuali studiu sò injected cun una dosi moderate di droga duie volte di darbu per 21 ghjorni in paraguni à una unica injezione alta dosata per 7 ghjorni (Alibhai et al., 2007). U regimen più stesu di trattamentu puderia riesce u cambiamentu più notu osservatu quì.

Ancu s'è li cambiamenti in l'espressione generale osservata ind'u NAC seguente a cocaine cronica sò in accordu generalu cù esibizioni rapportati prima, a magnitudine di effetti hè più chjesa in u studiu curcu. Un ragiunatu potenutu per questa hè chì l'animali sò sacrificati solu 24 h dopu l'ultima incisione di cocaine, mentri a maiuranza di studii anu fattu u tessulu ottu duie simani da l'ultima esposizione di droga. Studi chì analizanu u tempu-cursu di a sensibilizazione locomotrizita indicanu chì cambiani i più dramatichi cambiamenti in u cumpurtamentu è l'espressione generale / di prutezzione sò osservati à u puntu di tempu dopu. Ancu avemu infurmatu un ligeru crescenu di l'ARNm per a dopamine D₂ Receptor in NAc, u cunsensu generale hè quella espressione di u D₂ o D₁ Receptor ùn sò micca cambiatu permanentemente dopu à l'evoluzione di locomotor sensitization, ma spicciù à l'aumentà è diminutes in D₂ Receptor numero hè statu informatu pocu dopu à a fine di u regimen di sensibilizazione (vede (Pierce è Kalivas, 1997) per discussione). Nostra osservazione chì GluR1 è GluR2 mRNA anu cambiatu in seguitu trattamentu di cocaine cronica in questa tempiu puntuale hè ancu cumu cun cumunità previ (Fitzgerald et al., 1996), anche si un accentu in GluR1 mRNA hè stata detta in i later-points after the cessation of chimeric stimulant treatment (Churchill et al., 1999).

In ogni modu, avemu osservatu un petitu aumentu di PSD95 mRNA in NAc d'animali chì anu trattatu chronicamenti cù cocaine. PSD95 hè una molécula di andamia, è hè unu di i prutezioni principali in a densità postsinflittiva di i sinapsi excitatori. Ancure diverse receptori di u gluutatma è cunnessi assulanati à a sinàscita, è un incrementu in l'espressione PSD95 hè pensatu per riflettà a creazione d'attività sinaptica è l'incrementu d'inserzione è stabilizazione di i receptors di glutamate in sinapsi (van Zundert et al., 2004). Un rolu per PSD95 in u sviluppu di a sensibilizazione di locomotrizità hè stata suggerita prima (Yao et al., 2004).

Aiuta in l'espressione di l'arcus hè statu ancu ligatu cù l'aumentazioni in l'attività sinaptica. In ogni modu, mentre chì un incrementu di l'espressione di l'arc in NAc hè statu osservatu 50 min dopu l'injezione cù l'anfetamine (Klebaur et al., 2002), i nostri dati indicanu chì l'amministrazione crunna di a cocaine ùn addicìscenu l'arcu in l'NAc più permanentement, ancu s'e l'aumentu in l'arcu sò osservati 24 h dopu a dosazione chronica cù antidépressure (Larsen et al., 2007) è anfetamine (Ujike et al., 2002). Un incrementu di a fosforilazione di CREB hè ancu osservatu ind'u NAc dopu a cocaine aguda è l'amministrazione anfetamine (Kano et al., 1995; Konradi et al., 1994; Self et al., 1998), ma hè forsi micca surprisante chì nisunu aumentu in CREB mRNA hà osservatu dopu l'amministrazione di cocaine cronica. A signalazione à traversu a via CREB hè creatu per esse più impurtante in e fasi iniziali di l'adopru di droga, cù fattori di transcrizione, cum'è ΔFosB chì venenu per dominaru cum'è l'addictionu averebbe (McClung è Nestler, 2003). Ancu CREB hè stata implicata in l'effetti rimuneranti di a coca (Carlezon et al., 1998), ùn anu micca esse infurmati chì l'espressione CREB crepe a sensibilizazione locomotrize, anche l'incrementu virali di l'antagonistatu negativu di l'CREB, l'induvibilità di l'AMPAR, a cAMP pruspera prima repressor (ICER), aumenta l'iperattività causata per una ingiuta aguda di anfetamina (Green et al., 2006).

In sumario, anche a maiuranza di i mudiri induve a droga, avemu observatu chì sò cunforme cù predizioni da a literatura, ùn truvamu micca cambiamenti in l'espressione generale in l'NAc chì puderia spiegà a locomotora sensibilizada in risponde à a cocaine osservata in l'animali di nausea trattata cù intra-OFC AAV-ΔFosB. Questa risata a pussibilità chì l'incrementu di u ΔFosB in l'OFC pò esse micca affissà a sensibilizazione di u mutore via NAc, anche altri ghjente parechje genesi, ùn anu studiatu quì, puderia esse implicati. Pruva evidenza pruvucarà chì a modulazione di u cortical prefrontal medial (mPFC) pò cambià l'attività striata è permette à a sensibilizazione di cumportamentu à i psiculimuli (Steketee, 2003; Steketee è Walsh, 2005), anche si menu hè cunnisciutu da u rolu di e repertori prefrontali più ventralsu cum'è l'OFC. A NAc riceve parechje projezzione di l'OFC (Berendse et al., 1992). In ogni modu, un studiu più ricenti è detallatu hà identificatu pocu prucessi directe OFC-NAc: sparghjera l'etichettatura di a parte più larga laterale di a cuncetera di NA hè osservata seguitenze injections of tracer versione anterògradi à l'area laterali è ventrolaterali di l'OFC, è a più ventrali OFC Righjina Mandarà projezzione minima à u core NAc (Schilman et al., 2008). U caudate-putamen cintrali riceve inervazione più densu. In u lume di questa evidenza anatomica, a maiuranza di u teste NAc analizata in i nostri reazzione di PCR ùn anu micca diretta inervatu da l'OFC, chì diminuite a possibbiltà chì qualsiasi cambiassi in l'espressione generale seranu detecciutu bè.

L'OFC hà prughjettu assai in rigioni chì si sò stati bè in cunnessione ligata cù a NAc, cum'è u mPFC, l'amigurine basolateral (BLA), caudate putamen è u nucliu sotttalamicu (STN). Sè o cambiamenti in l'OFC puderanu indirettu modulerà u funziunamentu di l'NAc a través da a so influenza in queste spazii hè una domanda. Hè statu dimustratu chì l'attività in u BLA hè alterata dopu l'OFC, è dinò chì contribuisce significativamente à i difetti in invià l'invellamentu causatu da u danu OFC (Stalnaker et al., 2007), ma qualsiasi effetti in e spazii cum'è a NAc ùn sò micca informatu. Pò esse esse più produtivu per fucalizza l'attenzione à l'altri spazii più vicinu a l'OFC è chì sò ancu implicati in u cuntrollu di u mutore. U STN hè un miraculu particulari assai prottetivu, cum'è no solu lesi di l'STN è OFC producinu effetti simili in l'impulsività è l'impiegazione Pavlovianu (Baunez è Robbins, 1997; Chudasama et al., 2003; Uslaner è Robinson, 2006; Winstanley et al., 2005a), ma sensibilizazione di locomotora induve psichistimulante hè assuciata cun un incrementu di l'espressione c-Fos in questa regione (Uslaner et al., 2003). Esperimenti futuri designati per sonda quantu cambiani induzzione di droga in l'espressione generale di l'OFC anu u funziunamentu di e verticali avanti, com'è l'STN sò guarantiti. L'OFC puru envia una prugramma minima à a zona tegmentali ventrali (Geisler et al., 2007), una regione chjamata cuncrita in u sviluppu di a sensibilizazione locomotrize. Hè pussibuli chì l'esercitu di l'ΔFosB in l'OFC ponu influenza a sensibilizazione locomotrizità per questa via.

A natura esatta di a relazione trà i cambiunità induvati in droga à a funzione cognu è a sensibilizazione locomotrize hè micca cusida chjesa, è avemu finu à u focu annantu à l'OFC. In vista di sti trovii, hè pussibule chì i cambiamenti in l'espressione generale assuciatu cù u sviluppu di a sensibilizazione locomotrizità in autri rigioni di u sensu pò avè avè qualchì impattu in a risultu cognittivu à a cocaine. I sperimenti chì scopre u jocu trà e làriche corticale è sottucorritte da l'amministrazione di droghe additivi pò spuntà a nova luci chì u state addicti hè generatu è mantatu, è i rolli interattivi ghjucatu da sensibilizazione è toleranza in questu prucessu.

Vede ancu