Drogenza prima di epigenètica primes Fosb inducibility in nucleus nucleus accumbens (2012)

astrattu

I MUVRINI

A tossicità hè caratterizzata da una ricerca impurtante di droghe è di pigliu, malgradu e grave conseguenze avverse (Kalivas et al., 2005; Hyman et al., 2006). L'esposizione cronica à i medicinali hè causa di cambiamenti persistenti in l'espressione genica in u striatum ventralis (o nucleo accumbens; NAc) è u striatu dorsale (o putudu caudatu; CPu), strutture striatali implicate in ricumpensa è dipendenza (Freeman et al., 2001; Robinson è Kolb, 2004; Shaham è Hope, 2005; Maze and Nestler, 2011). B FosB, una proteina truncata è stabile codificata da u gene immediato-primu, Fosb, hè un fattore di trascurazione ben caratterizatu indu in NAc è CPu da esposizione cronica à virtualmente tutti i farmaci di l'abusu, induve intervene risposti comportamentali sensibilizzati à l'administrazione ripetuta di farmaci (Nestler, 2008). Tuttavia, sì chì una esposizione cronica precedente à una droga di abusu altaria dopu l'induzione di ΔFosB rimane sconosciuta.

Abbiamo ipotizzatu recentemente chì e modifiche di a cromatina in risposta à l'esposizione cronica di i farmaci putissi alterà l'induttibilità di i geni specifici in e regioni di u cervellu targetRobison è Nestler, 2011). L'evidenza crescente hà dimostratu chì droghe di abusu dopu ind'è l'amministrazione cronica alteranu a struttura è l'accessibilità trascrizzionale di a cromatina attraverso numerosi tipi di modifiche, chì includenu a fosforilazione, l'acetilazione e a metilazione delle code dell'istone. I travaglii più recenti in i sistemi di cultura cellulare anu pusatu nantu à a recruzione di RNA polimerasi II (Pol II) à u promotore di geni “indutibili” prima di a so espressione, cun Pol II legatu persistente à e regioni promotore prossimu è intornu à u situ di inizio di a transcription ) in un statu "stallatu" (Core è Lis, 2008; Nechaev è Adelman, 2008). L'attivazione di u Pol II stallatu hè allora cunsideratu esse responsabile di a so fuga da e regioni promotore è TSS è a so trascrizzione di questi geni "primed" (Zeitlinger et al., 2007; Saha et al., 2011; Bataille et al., 2012).

Quì, mustremu chì l'esposizione prima cronica à a cocaina, seguita da un periodu di ritruvamentu prolungatu, altera l'indivulità di a Fosb un gene à l'administrazione successiva di cocaina, cù NAc essendu primed per l'induzione mentre CPu ùn hè micca. Dopu identificemu firme di cromatina distinti in u Fosb promotore di u gene in NAc è CPu chì sò associati cun tale inducibilità aberente di u Fosb U gene, tra cui u ricrutamentu di u Pol II stallatu à u Fosb promotore prossimu in NAc solu ancu cambiamenti in parechje modifiche di istone attivante o repressive in entrambe e regioni di u cervellu. Quessi risultati fornenu una novità di a dinamica di a cromatina in u Fosb promotore di u genu è indica per a prima volta un meccanismu pè u stallamentu di i primori di Pol II Fosb per una maggiore attivazione in NAc dopu à una ri-esposizione à a cocaina.

Materiale è Metodi

Risposte alla lingua

Greater Induzibilità di Fosb in NAc, ma micca CPu, di ratti sperimentati da cocaina

Esaminà l'influenza di un cursu precedente cronicu di cocaina, seguita da un periodu prolungatu di ritruvazione, di inducibilità di a Fosb u genu in risposta à una successiva sfida di cocaina, ratti chì eranu inghjunti nantru ip ghjornu cù salina o cocaina (15 mg / kg) per i ghjorni 10 fù doumu doie sfide di u medicamentu dopu à 28 ghjorni di ritruenza (Fig 1A). Avemu primu misuratu risposte locomutore in un gruppu di animali per confermà l'induzione di sensibilizazioni locomotorie cù esposizione di prima cocaina, una conseguenza durabile prevista di l'administrazione di u medicamentu. I razzi sperimentati da cocaina è -nu nevi hà cunnosciutu l'attività locomotoria basale equivalente, cun un prublema di cocaina à animali animali ingenui chì aumentanu a so locomozione (Fig. 1B. Misure ripetute à dui sensuri ANOVA, curamentu: F_1,66 = 30.42, p <0.0001; sfida di cocaina: F_2,66= 58.39, p <0.0001; trattamentu x sfida di cocaina: F_2,66= 8.56, p = 0.0005, post-test Bonferroni ^{^}p <0.001). Questa sfida di cocaina induce una attività locomotoria significativamente più grande, vale à dì, sensibilizazione, in ratti sperimentati da cocaina (Bonferroni post-test * p <0.001).

  

figura 1

Effetto di esposizione cronica precedente di cocaina in attività locomotoria è Fosb induzione in NAc è CPu dopu a ri-esposizione à u medicu

Per valutà i effetti di questu schema di pretrezzione di cocaina in l'espressione di BFosB in NAc è CPu, abbiamo misuratu proteina ΔFosB con metodi immunoistochimici 24 hr dopu animali cocaine-spiriti è cocaina sperimentati sò stati trattati cun 0, 1, 3 o 6 iniezioni (15 mg / kg; vede Fig 1A). Come stabilitu in precedenza (Nye et al., 1995), L'iniezioni di cocaina di 3 eranu abbastanza per induce significativamente a proteina B FosB in NAc è CPu di animali di naufavii droghe è a so accumula rimasce significativa dopu à i ghjorni di 6 di iniezioni di cocainaFig. 1C. Misure ripetute à dui riforme ANOVA, nucleo di NAc, trattamento: F_1,28= 23.5, p <0.0001; sfida di cocaina: F_3,28= 49.16, p <0.0001; trattamentu x sfida di cocaina: F_3,28= 6.83, p = 0.0014; Conchiglia NAc, cure: F_1,28= 18.69, p <0.0001; sfida di cocaina: F_3,28= 31.52, p <0.0001; trattamentu x sfida di cocaina: F_3,28= 3.21, p <0.05; CPu, trattamentu: F_1,28= 9.47, p <0.001; sfida di cocaina: F_3,28= 19.74, p <0.0001; trattamentu x sfida di cocaina: F_3,28= 0.94, p> 0.05. In core NAc, shell è CPu, Bonferroni post-test ^{^}p <0.05). In animali sperimentati da cocaina, ùn ci era alcuna evidenza di persistenza di induzione di ΔFosB in NAc o CPu dopu à 28 ghjorni di ritruvamentu, coerente cù i rapporti precedenti chì u segnale di osFosB si dissipa pienamente da questu puntu di tempu (Nye et al., 1995), u mutivu di sta puntazione hè stata aduprata in stu studiu. Strazzante, parechje, i razzi sperimentati da cocaina chì anu avutu iniezioni di sfida di cocaina 3 o 6 mostranu una induzione di proteina B FosB in NAc, un effettu apparente in e sottoregioni di core è di shell.Fig. 1C. Bonferroni post-test * p <0.05). In cuntrastu, nisuna induzione più grande di a proteina BFosB hè stata osservata in CPu; invece, induzione equivalente di ΔFosB hè stata vista in questa regione dopu à 3 o 6 ghjorni di iniezioni di cocaina sfida in topi non-naïve di cocaina è -periziati (Fig. 1C).

Per appressu di e alterazioni trascrizzionali chì si verificanu in NAc è CPu in risposta à una sfida di cocaina, abbiamo studiatu u corsu di tempu (45, 90, è 180 min) di l'induttibilità di transcripts di mRNA ΔFosB e FosB su un unica cocaina o iniezione fisiologica data a toacchi senza cocaina è chì hannu sperimentatu quessi dopu à 28 ghjorni di ritruvamentu (vede Fig 1A). Relativamente à una sfida salina, una sfida di cocaina induce un rapidu aumentu di livelli di ΔFosB è FosB mRNA à tutti i trè punti tempu sia in NAc sia in CPu di animali naïve da cocainaFig. 1D. Misure ripetute da un modu ANOVA per puntu di tempu; Bonferroni post-testi ^{^}p <0.05). In NAc, avemu osservatu una induzione più grande di osFosB è FosB mRNA in animali sperimentati da cocaina paragunatu cù animali senza naïve di cocaina dopu a sfida di cocaina, l'effettu hè significativu à 90 min mentre, à u cuntrariu, l'inducibilità di ΔFosB è FosB mRNA in CPu era significativamente diminuite in animali sperimentati da cocaina (Fig. 1D. Bonferroni post-testi ^%p = 0.08, * p <0.05).

A caratterizazione di i percorsi di segnalazione di a tramuntana in NAc è CPu di ratti sperimentati da cocaina

Un possibile spiegazione per a cambiazione di induttibilità di u Fosb u gene in NAc è CPu dopu un prucedimentu crunulente di prima cocombina hè chì una storia lontana di esposizione à cocaina puderebbe induce cambiate duranti in i vie di segnalazione chì sò in amontu di Fosb induzione di u genu tali chì una sfida di cocaína induce dopu u gene à un gradu aberrante. Per studà sta ipotesi, si sò analizzati i dui fattori di trascrezzione, SRF è CREB, chì sò stati dimustranti recentemente per esse richiesti per l'induzione di cocaina di ΔFosB in queste regioni di u cervellu (Vialou et al., 2012) assai cù a proteina kinasi di amriti, ERK è AKT, ancu implicati in l'azione di cocaina (Valiente et al., 2000; Lu et al., 2006; Boudreau et al., 2009). Ùn pudemu micca scopre cambiamenti in i livelli cumuni o fosforilati di sti vari proteine ​​chì puderianu spiegà a cambiabilità induca Fosb osservatu, senza inclusi cambiamenti in SRF, CREB, o AKT (Fig 2B, C). A mancanza di cambiamentu in pSRF è pCREB in NAc in risposta à una sfida di cocaina hè cunsiste cù un raporsu recente, chì hà truvatu entrambi indotti significativamente da solu da cocainaVialou et al., 2012).

  

figura 2

Effetto di esposizione cronica precedente di cocaina in cascate di segnalazione moleculare in u upstream in NAc è CPu

In NAc è CPu d'animali senza droghe, 20 min dopu à una prima esposizione à i farmaci (Fig 2A), una sola sfida di cocaína hà diminuitu i livelli di pERK42 / 44 (Fig 2B, C. T-test di Studiente à duie code: * p <0.05). Ci sò rapporti precedenti di livelli di pERK aumentati in queste regioni dopu l'amministrazione acuta di cocaina (Valiente et al., 2000). Questu hè difficilu à paragunà à altre pagine chì sò esaminate a fosforilazione di ERK in NAc durante u ritiratu da iniezioni ripetute di cocaina (Boudreau et al., 2007; Shen et al., 2009), cum'è in u nostru studiu pERK hè statu quantificatu dopu à 28 ghjorni di ritruvazione è dopu à una sfida di cocaina o solu. Relativamente à l'animali senza droghe chì sperimentanu cocaina per a prima volta, a ri-esposizione à a cocaina in ratti sperimentati da cocaina, dopu à 28 ghjorni di ritruvamentu, hà causatu un aumentu significativu di i livelli pERK42 / 44 in CPu (Fig 2B, C. Due test di studiente di coda: * p <0.05).

Paesaggio cromatinariu in Promotore di u genu Fosb in NAc è CPu di ratti sperimentati da cocaina

Abbiamo investigatu dopu se cambiamenti in Fosb l'induttibilità genica hè associata cù alterazioni in a so struttura di cromatina. ChIP è stata fatta in NAc è CPu aduprà anticorpi diretti contr'à trè forme ben caratterizzate di modifiche di l'istone: trimetilazione di Lys4 di l'istona H3 (H3K4me3) associata à l'attivazione di u gene, è H3K27me3 e H3K9me2 associati a repressione genica. Abbiamo analizzatu cunigliu senza cocaina è chì anu avutu l'esperienza dopu i ghjorni di 28 di ritruvà, senza o cù una iniezione di sfida di cocaina, cù l'animali esaminati 1 hr più tardiFig 3A). In NAc, ùn truvemu micca cambiamenti significativi in ​​a attaccamentu di e tutte e sette cambiamenti di istone à a Fosb promotore di u gene in mancanza di una sfida di cocaina, ancu se ci era una tendenza per i livelli ridotti di H3K9me2 (Fig. 3B-D. A prova a t di Studjendu à due coda. ^#p = 0.2 paragunatu cù i rispettivi controlli Naïve di droga). Stu effettu diventò significativu dopu una sfida di cocaína è era specificu per a regione prugna di u promotore proximal di u gene (Fig. 3C. * p <0.05). Mentre i livelli di H3K9me2 sò assai bassi in certi geni, u Fosb u promotore di u genu mostra i livelli apprezzabili di sta marca in NAc in e condizioni di cuntrollu (Maze et al., 2010, dati ùn sò micca mostrati). À u cuntrariu, in CPu, truvamu piccule ma significative diminuzioni di a vinculazione di H3K4me3, è l'incremento in a vincula H3K27me3, à Fosb prufessiunore in mancanza di una sfida di cocaina, effetti peri dopu a sfida (Fig. 3D. * p <0.05).

  

figura 3

Effetto di esposizione cronica precedente di cocaina in priming epigenetica di u Fosb gene in NAc è CPu

E lighjiamo dopu cunnessu Pol II à Fosb u gene, basatu annantu à risultati recenti in cultura cellulare, chì u stalling di Pol II à TSSs, chì hè caratterizatu per a so fosforilazione à Ser 5 in a so regione di ripetizione CTD, hè associatu cun priming di geni (vedi Introduzione). Hà cusì analizzà Pol II-pSer5 cunnessione à Fosb in quattru regioni distinte di u gene (Fig. 3B). Questa analisi hà rivelatu un arricchimentu significativu di Pol II-pSer5 à a Fosb un gene à a so regione promotore prossimu è intornu à u so TSS in NAc di animali sperimentati da cocaina, dopu à un prelevamentu prolungatu, in mancanza di una sfida di cocaina paragunatu à i controlliFig 3E. * p <0.05). Stu arricchimentu ùn era micca apparente in duie regioni di u corpu genicu di Fosb, coerente cù Pol II stalling descrittu in sistemi sperimentali più semplici. Hè interessanti chì, dopu à una sfida di cocaína, Pol II-pSer5 restò ancu segni di arricchimentu, ancu da ùn più micca più significativamente, à u Fosb regione promotore prossimuFig 3E. ^%p = 0.1), ma torna à i livelli di cuntrollu in TSS. I risultati in CPu eranu più variabili, senza un mudellu chjaru di a ligatura di Pol II-pSer5 osservata.

Articulu discussione

U presente studiu offre una nova visione di a regulazione durata di Fosb settimane dopu a cessazione di l'esposizione ripetuta à a cocaina. Ci dimustremu chì l'amministrazione cocaina precedente cria vene Fosb un gene più inducibile in NAc, cundizendu in un accumulo più veloce di ΔFosB à a nova esposizione à u medicamentu. Vista a preponderanza di l'evidenza chì l'induzione di FosB in NAc media a reazioni di comportamentu sensibilizzati à a cocaina (Nestler, 2008), i nostri risultati ghjunghjenu un novu meccanettu per u restituzione più rapida di tali risposte sensibilizzate dopu à un prelevu prolungatu.

Abbiamo dimostratu chì l'induzione migliorata di ΔFosB in NAc hè associata à cambiamenti di cromatina in u Fosb un gene chì puderia esse primu per una maggiore induzione. Cusì, mustremu l'amministrazione Pol II aumentatu à e promoter proximal è e regioni TSS di u gene chì sò presu dopu à settimane 4 di ritruquà da l'amministrazione cocaina prima cronica. Stu arricchimentu di Pol II à a TSS hè persa rapidamente quandu si tratta di sfida da cocaina è Fosb induzione, cunsegna cù un mudellu in cultura cellulare chì Pol II hè stallatu da liberu da TSS à a attivazione di u genu (vedi Introduzione). Una sfida di cocaína induce ancu una diminuzione rapida di a cunnessione di H3K9me2 — un segnu di repressione genica - à a Fosb promotore. À u cuntrariu, ùn simu truvatu nisuna induzione duratura di parechji fattori di trascrezione, o di e so chinasi in istante, chì si sapenu mediate Fosb induzione cù cocaina. Questi risultati supportanu a nostra ipotesi chì l'induzione migliorata di ΔFosB in NAc hè mediata per priming epigenetticu di u Fosb un gene è micca via una regolazione di upstream di eventi in upstream.

E risultati assai diversi sò stati ottenuti per CPu. Ùn ci hè stata prova di Pol II stalling Fosb in ratti sperimentati da cocaina nanzu à una sfida di cocaina, ancu se ci era piccule ma significative modifiche di istone cunsegnanti à a repressione di i geni: l'aumentazione di a ligula H3K27me3 è a diminuzione di a ligure H3K4me3. Ùn ci era dinò nisun cambiu in fattori di trascrezzione à u luntanu o cinasi cunsegna cù u diminuitu Fosb induzione. Queste scoperte suggerenu chì, dopu l'amministrazione cronica di cocaina, modifiche epigenetiche servenu per smantellà Fosb induttibilità genica in CPu, in cuntrastu à l'amoramentu vistu in NAc. Tuttavia, mentre quessi effetti ripisce upon FosB induzione mRNA dopu ri-esposizione à cocaina, ùn ci hè micca perdita di cumulo di proteina FosB. U meccanismu sottu à quellu paradossu richiede oghje investigazione.

Più generalmente, i nostri risultati supportanu un mudellu induve l'alterazioni in u paisaghju di a cromatina à i geni specifici in risposta à l'amministrazione cronica di cocaina servenu per primatura o smuntari ddi geni per a so induzione successiva dopu à una ri-esposizione à u medicamentu. Queste variazioni di cromatina, chì ponu esse cunsultate cum'è «cicatrici epigenetiche», saranu mancate in l'analisi di i livelli di mRNA in u stadiu stabile di geni. In questu modu, a caratterizazione di l'epigenoma di a dipendenza promette di rivelà infurmazioni fresche nantu à a patogenesi moleculare di u disordine, chì ponu esse minata per u sviluppu di novi trattamenti.

Acknowledgements

Vede ancu