PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
astrattu
Alterazioni indotte da cocaina in espressione genica causanu cambiamenti in morfologia neuronale è comportamentu chì pò basà a dipendenza da cocaina. Abbiamo identificatu un rolu essenziale per a dimetilazione di l'insette 3 lysine 9 (H3K9) e di la lisina dimetiltransferasi G9a in plasticità indotta da cocaína. L'administrazione ripetuta di cocaina hà riduttu i livelli globali di dimethylation di H3K9 in u nucleo accumbens. Ta so riduzione in metilazione di l'istone era mediata da a repressione di G9a in sta regione cerebrale, chì era regolata da u fattore di trascrezzione indotta da cocaina ΔFosB. Usendu mutagenesi cuniziale è trasferimentu di geni mediata viralmente, avemu scupittatu chì a regolazione di G9a da a plasticità di u nucleo accumbens di neurone è aumentata a preferenza per a cocaina, in u stabilimentu di un rolu primu per a metilazione di l'istone
I MUVRINI
L'esposizione ripetuta di cocaina hè carattificata da cambiamenti persistenti in l'espressione genica è alterata morfologia neuronale in u nucleo accumbens (NAc), un elementu di primu passu di i circuitu di ricompense di u cervellu (1-2). U rimodellamentu di a cromatina hè impurtante in cambiamenti trascrizionali aberenti in questa regione di u cervellu chì ponu à l'altura di l'aspetti di a dipendenza da cocaina (3-9). A regolazione di cocaina di a struttura cromatina in u NAc risultati, in parte, da cocaine-inducee modifiche indotti da a macchinaria enzimatica cromatina, daveri cambiamenti in acetilazione di istone è fosforilazione (4, 7-9); in ogni casu, i ruoli per l'enzimi chì controllanu a metilazione di l'istone ùn sò micca stati investigati.
Una recenti analisi di prumuzioni à u larghezza di u genomu utilizendu l'immunoprecipitazione di a cromatina accumpagnata à i microarrays (ChIP-Chip) ha identificatu mudelli alterati di istessa repressiva H3 lisina 9 (H3K9) e 27 (H3K27) metilazione in promotori di geni specifici in NAc à urdinazione ripetuta.6). Abbene profilatu parechje metiltransferasi lysine (KMTs) è demetilasi (KDMs) chì sò cunnisciuti per controllà H3K9 o metilazione H3K27 (Fig. 1A). Solamente dui enzimi, G9a è GLP, presentavanu a regula trascrizzionale persistenti 24 ore dopu l'adunazione ripetuta di cocaina, quandu l'espressione di i dui geni era significativamente sgradgitu. Perchè G9a è GLP catalizzanu in maniera specifica a dimetilazione di H3K9 (H3K9me2), a so discregulazione di cocaina hè in concordanza cù u calatu globale diminuitu di H3K9meXme2 globale osservatu in stu momentuFig 1B). À u cuntrariu, i livelli globali di metilazione di H3K27 eterocromatica sò rimasti inalterati da l'esposizione ripetuta di cocainaFig. S1 per supportà materiale online). A causa di i so elevati livelli di attività catalitica sia in vitro e in vivo (10), avemu prupusitu di investigà in più a significatività funzionale di a repressione di G9a dopu esposizione ripetuta di cocaina in a Nac. I livelli di proteina G9a, cume i livelli di a so mRNA, sò stati significativamente ridotti 24 ore da a ripetizione di cocainaFig S2). L'espressione G9a di mRNA hè stata ridotta di 35% in a NAc, l'analisi immunoistochimica hà rivelatu una riduzione di 15% più modesta in i livelli di proteina G9a, cunquistendu cù a diminuzione osservata di 21% in H3K9me2 dopo amministrazione ripetuta di cocainaFig 1B). L'espressione di l'ARNm G9a hè ancu sgualmente regolata in sta regione cerebrale per 20% dopu l'automisione ripetuta di cocaine (Fig S3).
Per identificà se i cambiamenti in H3K9me2 eucromaticu sò correlati cù alterazioni di u genoma in a espressione genica in a NAc, ci sò state analisi di microarray per esaminà i profili di l'espressione genica indotta da una dose sfida di cocaina in animali cù o senza storia di esposizione di cocaina. elenchi di geni in Tabelle S1 – S3). L'animali chì anu ricevutu ripetuta cocaina mostranu drammaticamente l'aumentu di l'espressione genica 1 un'ora dopu una sfida di cocaina in comparazione cù l'animali trattati acutiFig 1C). Questa espressione genica aumentata hà sempre succedutu in risposta à una sfida di cocaina data dopu a settimana 1 di ritruquà da cocaína ripetuta. Cuntinuu cun i rapporti precedenti, una piccula percentuale di geni (~ 10%) hà mostratu risposte transcriptionali desensibilizzati seguendu l'admisioni ripetute di cocaina (Fig 1C; vede Table S1) (5). Per investigà direttamente u ruolo di a regolazione di G9a in l'espressione di i geni migliorata osservata dopu a cocaina ripetuta, i topi si primavanu iniezioni intra-NAc di vettori di Herpes simplex virus (HSV) esprimenti GFP o G9a è sò stati trattati cù salina o cocaina ripetuta per determinà se G9a sovraespressione era abbastanza per bloccà a ripetizione cocaina induceva u sumentu di l'espressione genica. Da un serie di geni 12 selezziunati à casu chì mostranu livelli elevati di espressione à causa di cocaina ripetuta, abbiamo osservatu chì G9a riduce significativamente l'espressione aumentata di 50% di questi geni (Table S4).
Per identificà eventi trascrizionali di a ripartenza chì mediatenu a ripresa ripetuta induce da a cocaina da l'espressione di G9a, abbiamo investigatu un rolu possibile per ΔFosB, un produttu di giunzione altamente stabile di u gene immediatamente precoce fosB. BFosB s'accumula in a NAc dopu a spunzione ripetuta à cocaine, induve hè stata lì à una maggiore ricompensa di cocaina (11). BFosB pò agisce cume un attivatore transcriptional o repressore a seconda di u gene target.3, 5, 6, 12). Utenu NSE bitransgenictTA × tetOP-ΔFosB toghjetti, in cui l'espressione BFosB pò esse indotta selettivu in NAc è u striattu dorsale di l'animali adulti13), avemu esaminatu l'impattu di on FosB espressione per a regulazione di cocaina di H3K9me2 è KMTs in a NAc. XFosBserexpressione era basta per riduce i livelli di entrambi H3K9me2 (Fig 1D) Espressione G9a (Fig 1E), cusì imitando l'effetti di cocaína ripetuta. In cuntrastu, ΔFosB ùn hà micca riduttu l'espressione di GLP in sta regione cerebrale, è ùn hà micca impattu su SUV39H1 è EZH2, i principali enzimi trimetilanti per H3K9 è H3K27, rispettivamente (Fig S4). Per confermà questi dati cù un sistema indipendente di sovraespressione di B FosB, i topi adulti adulti selvaggi sò stati inceputi bilateralmente intra-NAc di vectors di Adeno-associati (AAV) esprimenti GFP o ΔFosB. L'overpressione virale-mediata di ΔFosB hà diminuitu i livelli di espressione di G9a in sta regione cerebrale (Fig 1E).
Una tale regulazione pronunciata è specifica di G9a ci hà spintatu à studiare se l'alterazione di l'espressione di G9a in maniera specifica in neuroni NAc regula risposte comportamentali à a cocaina. I topi salvatichi cumparavano iniezioni intra-NAc di vettori HSV esprimenti GFP o G9a è sò poi analizzati aduprendu un paradigma preferenziale di un locu bè condizionatu di cocaína, chì fornisce una misura indiretta di ricompensa di droga. L'espressione virale di G9a in neuroni NAc hè stata cunfirmata in seguitu di testu comportamentale (Fig. 2A). A sovrapressione di G9a hè diminuita significativamente per a cocaina in comparazione cù l'animali sovraesprimendu a GFP (Fig 2B), è aumentatu i livelli H3K9me2 in a NacFig 2C). Sopraespressione di un mutante cataliticuu mortu di G9a (G9aH1093K) (14) ùn hà micca influenzatu a preferenza di cocaine (Fig 2B) è ùn hà micca influenzatu i livelli di H3K9me2 in a regione cerebrale (Fig 2C).
Per studà in più u vulintà di u rolu di G9a in i effetti comportamentali di a cocaina, è più specificamente di mimà a riprissione ripetuta induceva a cocaina da l'espressione di G9a in a Nac, G9a adultafl / fl toghjii (14) riceve iniezioni intra-NAc di vettori AAV esprimendu Cre recombinase o GFP cume un controllo. AAD-Cre knockdown di G9a in a NAc, chì hè statu cunfirmatu immunoististimicamente (Fig S5), hà aumentatu significativamente l'impatti di a cocaina in esperimenti di condizionamentu di u locu è ridutu i livelli di H3K9me2 in a NacFig. 2D, E). Un inibitori farmacologicu dispunibuli di G9a è GLP, BIX01294 (15-16), hè stata usata per accertà s'ì l'inibizioni enzimatica anzi simula incù risposte comportamentali à a cocaina. In verità, l'inibizione farmaculogica di G9a è GLP aumenta significativamente a preferenza per a cocaina è hè diminuita H3K9me2 in a NacFig. 2F, G).
L'administrazione ripetuta di cocaina aumenta a densità di e spine dendritiche nantu à i neuroni spinosi medii NAc (17), un prucessu associatu cù cambiamenti funziunali à e sinapsi glutamatergiche eccitatorie nantu à sti neuroni (18-19) e risposte comportamentali sensibilizati à u medicamentu (17, 20). Cusì ipotiziuu chì a regolazione di l'attività G9a in a Nc da a cocaína ripetuta puderia mediate a capacità di a cocaina di regulà a densità di spina dendritica di neuroni NAc. Utilizendu immunoprecipitazione di a cromatina (ChIP) cun un anticorpo anti-G9a, anu individuatu parechji diti di geni putativo G9a in a Nac, ciascuna chì prima era implicata in plasticità dendritica indotta da cocaina (Fig. 3A) (20-26). Avemu scupittatu chì l'amministrazione ripetuta di cocaina diminuissi significativamente a cunnessione di G9a, oltre à i livelli di H3K9me2, à questi promotori di geni (Fig 3B). À cuntrastu, l'amministrazione acuta di cocaina hà ricrutatu rapidamente G9a per alcuni di stessi promotori di geni, cundinariu à l'aumentata espressione di G9a osservata in a ora NAc 1 dopu à una dose acuta di cocaina (Fig S6). Benchè a rilegatura di G9a à i promotori di u gene specifichi cunnessi cun cambiamenti in a so espressione, ùn hè micca chiaru se tali eventi sò mediate da livelli livelli globali di G9a in u NAc è / o da e differenze in reclutamentu di G9a dopu à acuta vs. amministrazione ripetuta di cocaina.
Basatu annantu à a regolazione di G9a di parechji geni di piglialità in u NAc, abbiamo studiatu direttamente se a manutenzione di l'espressione di G9a in sta regione di u cervellu dopu à un trattatu ripetutu di cocaine hè stata basta per bluccà a furmazione dendritica indotta da cocaina Utilizendu un protocollo di trattamentu di cocaina chì hà statu dimostratu chì prumove induzione di u spina dendritica in a Nc (20), avemu esaminatu a densità di e spine in animali injectati cù HSV-GFP o HSV-G9a. In cunfurmazione cù i risultati in precedenza, hà segnu un aumento significativu di densità di spina dendritica in a NAc dopu à u trattu di cocaina, un effettu chì era chjatu cumplessu da G9a sovraespressione (Fig 3C). Saldamenti G9a sovraespressione ùn hè micca bastatu per diminuire a densità di spina dendritica di NAc in assenza di cocaina. Per complementà questi dati, G9afl / fl I topi ricevuti iniezioni intra-NAc di HSV-Cre è densità di spina era quantificati è paragunati à l'animali riceventi HSV-GFP in assenza di cocaina. Knockdown di espressione G9a hà aumentatu significativamente a densità di e spine nantu à i neuroni spinosi medii NAc (Fig 3C).
Dà l'evidenza chì u calentimentu di G9a in a NAc dopu a cocaína ripetuta hè mediata da ΔFosB, ci sò successu verificatu chì questu fattore di trascrezione sia ancu implicatu in a regolazione di spine dendritiche NAc. Ancu se ΔFosB ùn hè ancu micca stati cunnessi causalmente à tale plasticità dendritica, parechji di i so biti, cumprì Cdk5 è NFκB, sò stati implicati (20-23), è l'espressione persistenti di FosB in neuroni NAc currelate cù a crescita di densità di spina dendritica dopu ripetutu di cocaína (27). Prima, avemu trovu chì l'induzione di FosB in topi bitransgenichi in assenza di cocaina, chì hà rigistratu l'espressione di G9a è H3K9me2 (Fig. 1D, E), diminuì G9a cunnessione à parechji genitori di plasticità, chì parechji avianu dinò ostintatu diretti di BFosB stessa (Fig 3D) (3, 6). Successivamente hà mostratu chì a sovraespressione virale di ΔFosB in a NAc hà aumentatu significativamente a densità di spina dendritica in condizioni basali, simule à quellu osservatu dopu a ripetizione di cocainaFig 3E). À l'inversu, l'espressione eccessiva in l'AC di DJunD, una proteina mutante negativa dominante che antagonizza l'attività transcriptional alFosB, ha bloccato l'abilità di ripetere la cocaina per aumentare la formazione di spina dendritica in NAc (Fig 3C).
A nostra osservazione chì BFosB regula l'espressione di G9a in a NAc, è chì ΔFosB è G9a regolanu alcuni di stessi geni bersaglio, ci ha pussutu esaminà altre interazioni tra ΔFosB e G9a. Dopu a cocaina acuta, quandu i livelli di G9a sò stati aumentati, a cunnessione di G9a à a fosB U gene hè statu aumentatu, mentre dopu a ripetuta cocaina, quandu l'espressione di G9a era soppressa, G9a s'impegna in a fosB u gene era diminuitu (Fig. 3A). Questa diminuzione di G9a ligame dopu ripetuta cocaina ùn era micca osservatu per c-fos, induve a ligatura di G9a aumenta di cocaina ripetuta (Fig S7). Quellu hè cunsigliale cù u fattu chì, à diffe fosB, c-fos hè repressu, micca indotto, per esposizione cronica psostostimolante (5). L'ubpressione di FosB in toghjetti bitransgenichi bastò per scardà significativamente a cunnessione di G9a à fosb gen (Fig 3D). Inoltre, G9a sovraespressione hè stata basta per riduce l'aumentu di l'espressione Δ FosB dopu a ripetizione di cocainaTable S4). Questi dati suggeriscenu un ciclo di autoreglulazione chì G9a limita inizialmente l'induzione di ΔFosB da l'amministrazione acuta di cocaina. Tuttavia, cume ΔFosB si accumula cù a ripetizione di medicamentu ripetuta, reprimisce G9a è aumenta di conseguenza a so propria induzione ulteriore.
In conclusione, avemu dimostratu chì a metilazione di a lisina di l'istone in a NAc hè implicatu critica in a regulazione di l'espressione genica neuronalizazione in risposta à a cocaina. A repressione di G9a è H3K9me2 dopu l'amministrazione ripetuta di cocaina promuove una preferenza di cocaina, in parte, attraverso l'attivazione trascrizzionale di parechji geni cunnisciuti chì regulanu forme aberenti di plasticità dendritica. Acquisizione di una più bona comprensione di i geni regolati da tali meccanismi migliorerà a nostra cunniscenza di a basa biologica cumplessa di a tossicità è di aiutà a sviluppu di trattamenti più efficaci di patologie addictive.
Materiale è Metodi
Animali è trattamenti
A micca u diversu indicatu, i topi furmuti quattru à cinque per a gabbia in una colonia cù una luce 12 luce / ciclo scuro (accende da 7: 00 AM à 7: 00 PM) a temperatura constante (23 ° C) ad libitum accesso à l'acqua è à l'alimentu. Tutti i protocolli animali eranu approvati da IACUC sia in UT Southwestern Medical Center sia in Mount Sinai School of Medicine.
Per sperienze di cocaina [immunohistochemitry, western blotting, PCR quantitativa (qPCR), analisi di microarray è immunoprecipitazione di cromatina (ChIP)], sò stati impiegati topi C8BL / 10J di 57- à 6. L'animali anu avutu iniezioni quotidiane di una oe «saline» (curamenti 7 saline, ip), cocaina 'acuta' (curamenti 6 salè + un trattu 20 mg / kg cocaina-HCl, ip) o 'cocaina ripetuta (trattamenti 7 20 mg / kg cocaina-HCl, ip). I topi sò stati sacrificati in una ora 1 o in 24 ore dopu à u trattamentu finale. Per studii di microarray, l'animali sò stati trattati quotidianamente cù a satura "salina" (trattamenti salina 15, ip), cocaina "acuta" (trattamenti 14 salè + trattamento 1 20 mg / kg cocaina-HCl, ip), cocaina "ripetuta + acuta" Trattamenti 7 salina + Trattamenti 8 20 mg / kg cocaina-HCl, ip) o 'cocaina ritirata + acuta ripetuta (trattamenti 7 20 mg / kg trattamenti di cocaina-HCl + 7 soluzione salina + 1 challenge treatment 20 mg / kg cocaine-HCl, ip) è sò stati sacrificati 1 ora dopu à a cura finale. In sperienze comportamentali, i surci si eranu abitabilmente posturati dopu chirurgia è sò stati trattati cun 10 mg / kg di cocaina-HCl, ip cume si spiega più in basso. Per analisi dendritica di e spine è validazione di microarray in seguitu di l'infezione HSV-GFP è HSV-G9a-GFP, i topi sò stati trattati cù 'salina' (curamenti 5 saline, ip) o 'cocaina ripetuta' (trattamenti 5 20 mg / kg cocaina-HCl, ip ) nant'à i ghjorni di 3, cum'è stu prugettu di iniezione hè statu dimustratu di aumentà a densità di u spine nantu à i neuroni di u nucleo accumbens (NAc) in un calendario di espressione di transgenu di u virus di l'herpes simplex (HSV)Rinnovazione complementare S1). I razzi usati per l'analisi dendritica di a spina vena furzanu sacrificati 4 ore dopu à l'ultimu trattamento.
Per induce una deletizione locale di a transcription G9a restritta à neuroni NAc, usamu topi mutanti homozigotesi per un allele G9a flossed, chì sò stati descritti in dettu altrove (S2). A ricombinazione indotta da Cre dà l'eson di 22 à u splicing fora di trame di 25 iniziendu a decadenza mediata da nonsense di a trascrizione mutata. Abbiamo usatu G9a toghjii floxed chì eranu completamente backcrossed à i topi C57BL / 6J. I topi sò stati iniettilmente sterilizzati in a CNA cù i vettori adeno-associati (AAV) (serotipu 2) esprimenti GFP o Cre-GFP tra l'età di 7 e 10 settimane. L'analisi immunoistochimica hè stata usata per verificare l'efficienza di a ricombinazione mediata da Cre Supplemental Fig. S5). Avemu usato AAV animali injettati 21 ghjorni post-chirurgica perchè a ricombinazione in i topi floxed G9a era stabile è massimu in stu stasu di u tempu, cuscrittu in i rapporti publicatiS3-S4). L'esperimenti di sovraespressione di G9a è JunD anu avutu in modu simule cù uvettori di virus HSV esprimendu GFP, G9a-GFP di tipo selvaticu, G9aH1093K-GFP cataliticuamente mortu o ΔJunD-GFP S2 per i dettagli nantu à u sviluppu di G9a costrutti). I mouse Uverexpressu HSV sò stati impiegati ghjorni 3 post-chirurgia, perchè a sovraespressione era massima in stu momentu, cum'è osservatu per immunoistochimica. A causa di a natura transientale di l'espressione HSV, è di a natura assai più stabile di l'espressione AAV, i vettori HSV sò stati impiegati in sperienze chì richiedenu espressione transgene veloce è breve, mentre i vettori AAV sò stati usati in sperienze chì necessitavanu periodi estesi di transgenu. Entrambi i vettori sò stati dimustrati, in i grandi studii precedenti, per infettà solu i corpi di cellule neuronali in a zona cerebrale iniettu, senza alcuna infezione di neuroni affuntari o eferenti.
Per e sperienze comportamentali chì utilizanu un inibitore farmacologicu G9a / GLP, BIX01294 (25 ng / μl), i topi sò stati impianti steraticu cun duie mini-pompe sottutanute, oltre à cannule di guida bilaterali, in a NAc. E Mini-pompe anu attivate 12 ore prima di l'installazione iniziendu a consegna continua (0.25 μl / ora) di ogni veicolo (5 idrossipropil β-ciclodextrina) o farmaco per i ghjorni 14, durante i quali è stata effettuata valutazioni comportamentali.
Per sperienze di soppressione ΔFosB [western blotting, qPCR, and ChIP], maschile bitransgenic NSE-tTA × tetOP-ΔFosB i topi sò stati aduprati (10 settimana-vecchio), per chì, in assenza di derivata tetraciclinata doxiciclina (settimane 8 di doxiciclina), l'animali mostravate espressione strumentale striata di u strFosBS5). L'espressione di FosB in sti topi hè stata cunfirmata per mezu di qPCR. Per cunfurmà e scoperte usando NSE-tTA × tetOP-ΔFosB topi, tippi selvatici 8-week-old C57BL / 6J toghjetti maschii sò stati iniettilmente sterilizzati intra-NAc cun vettori AAV esprimenti GFP o ΔFosB-GFP. I vettori AAV anu aduprati, in questu casu, per assicurà l'espressione Δ FosB massima a settimane 8 post-chirurgica, permettendo un paragone diretto tra topi overexpress and FosB infettati viralmente e bitransgenici. A sovraespressione virale hè stata cunfirmata usando qPCR à e settimane 8 post-chirurgia (I punzoni NAg-gauge NAc sò stati dissecati sottu u situ di l'iniezione). AAV-GFP è AAV-ΔFosB-GFP toghjii in eccessione chì ùn anu micca usati per qPCR sò stati cunsiglati cù soluzione salina (trattamenti 15 salina, ip) o cocaina ripetuta (trattamenti 14 14 mg / kg cocaina-HCl, ip) da a settimana 30 post- chirurgia. 6 ghjorni dopu à u trattamentu finale, i cervelli sò stati piazzati cù 4% paraformaldehyde, sezionatu nantu à un vibratome è usatu per analisi dendritica spina.
Analisi Western blot
I punzetti NAc a calibri 14 furunu presi da sezioni coronali 1 mm ottenute usando una matrice cerebrale d'acciaio inossidabile del mouse e sò stati sonicati in tampone di lisi 1 M HEPES (1% SDS) contenente inibitori di proteasi e fosfatasi. 10-I campioni 30 μg di proteina totale sò stati elettrofore annantu à i geluri 18% SDS. E proteine sò state trasferite in membrane PVDF è incubate cù un anti-H3K9me2 (monoclonalu di mouse, 1: 500), anti-β-tubulina (monoclonal mouse, 1: 60,000), istone anti-total H3 (coniglio policlonale, 1: 5,000) anti-GFP (adupratu per verificà l'espressione virale uguale in tessuti perforati) (coniglio policlonale, 1: 1000), anti-H3K27me3 (coniglio policlonale, 1: 500) o anticorpi anti-actina (monoclonalu di mouse, 1: 60,000) 4 ° C (tutte le membrane sò stati bloccate in latte 5% o 5% albugenu serum bovinu). E membrane sò allora incubate cù anticorpi secondari etichettati perossidasi (1: 15,000-1: 60,000 dipende da l'anticorpu primariu adupratu) è e bande sò state visualizzate aduprendu u substratu SuperDignal West Dura. I fasci sò stati quantificati cù NIH Image J Software è chì e fasce H3K9me2 vennu normalizati cù qualchì attina o β-tubulina è per istone globale H3 per controllà per u caricu uguale. A cocaina ripetuta ùn hà micca influenza nantu à i livelli di actina (Fig S8) o istone tutu 3 (Fig S1) in u NAc. Inoltre, l'infezione HSV-G9a-GFP è HSV-G9aH1093K-GFP ùn hà micca dighjà impurtatu per i livelli cumpiuti di β-tubulina in a NacFig S8).
Immunohistochemistry
I topi sò stati sedati cun una dose letale di cloral idratu è perfusati cù 4% paraformaldehyde prima di esse analizzati da immunoistochimica sola o doppia cum'è descritta in precedenza (S6). Brevi, cervelli post-fissati sò stati incubati à a temperatura d'ambiente di notte à 30% saccarosu prima di esse sezionati à 35 μm (cervelli usati per analisi dendritica di spina sò stati sizzulari nantu à un vibratome à sizzioni 100 μm in mancanza di 30% m saccarosu). E sezioni NAc libere-galleggianti sò state lavate cù 1X PBS, bloccate (serumu 3% normale d'asino, 0.1% tritonX, 1X PBS) è dopu incubatu cù anti-GFP (pollo policlonale, 1: 8000) e / o anti-G9a (coniglio policlonale , 1: 500) anticorpi in a soluzione di bloccaggio. E Sezzioni analizzate per e spine dendritiche sò state incubate cù un anticolu policlonale anti-GFP à 1: 200. Dopu à l'incubazione di a notte, i sezioni NAc sò stati lavati volte 3 per minuti 10 cù 1X PBS, seguita da incubazione cù Cy2 è / o Cy3 anticorpi secondari fluorescenti in soluzione di bloccaggio 1X PBS per 2 ore. E sizzioni aduprate per studii morfologichi sò stati incubati in l'anticorpu secondariu da a notte à a temperatura d'ambiente. A co-pigmentazione nucleare hè stata fatta incubendu sezioni in 1X PBS contenenti DAPI (1: 50,000) per i minuti 10. E Sezioni vennu lavati dinò, seguitu da disidratazione di l'etanolu è muntatu cù DPX. Tutte e rùbbriche sò state ripigliate cù a microscopia confocal.
Isolamentu di l'ARN è qPCR
I punzoni bilaterali NAc di calibru 14 sò stati omogeneizzati in Trizol è trattati secondu e istruzioni di u fabbricante. L'ARN hè statu purificatu cù e colonne RNAesy Micro è a spettroscopia hà cunfirmatu chì e razioni RNA 260/280 è 260/230 eranu> 1.8. U RNA hè statu poi trascrittu inversamente aduprendu un Kit iScript Bio-Rad. cDNA hè statu quantificatu da qPCR cù SYBR Green. Ogni reazione hè stata eseguita in duplicatu o triplicatu è analizzata seguendu u metudu ΔΔCt cum'è descrittu in precedenza aduprendu gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) cum'è cuntrollu di normalizazione (S7). Vede tavula supplementare S5 per sequenze di primu mRNA.
Analisi di microarray di DNA
Quattru gruppi (replica biologica indipendente 3 per gruppu) sò stati utilizzati per u studiu di microarray, per un total di microarrays di 12. Nantu à un'ora dopu à l'ultima iniezione di cocaina, l'animali sò stati rapidamente decapitati è u cervello hè stato rialzatu è postu nantu à u ghiaccio. Le dissezioni di NAc furunu impiegate usando un punch dell'ago di calibro 1 e sono stati rapidamente congelati sul ghiaccio secco finché l'RNA non è stato estratto. I pugni bilaterali sò stati cumparati da quattru animali per replica, per un surghju di surcuri per gruppu. L'isolamentu di l'ARN, a so trasfurmazione di micromelie, è l'analisi di dati sò state effettuate cum'è descrittu in precedenza (S8). In breve, RNA hè statu isolatu è purificatu cum'è descrittu sopra è hè statu verificatu per a qualità aduprendu u Bioanalizzatore Agilent. A trascrizione inversa, l'amplificazione, l'etichettatura è l'ibridazione à i matrici Illumina MouseWG-6 v2.0 sò state effettuate aduprendu procedure standard da u core microarray di UT Southwestern. I dati grezzi sò stati sottratti è quantilizzati nurmalizati cù u software Beadstudio. I dati nurmalizati sò stati analizzati cù u software GeneSpring è i genelisti sò stati generati aduprendu criteri di significazione di un cutoff di cambiamentu di 1.3 accoppiati cun un cutoff di valore p non strettu di p <0.05.
Mantenemu un alto gradu di fiducia in questi dati per diverse ragioni. Prima, tutti gli animali sò stati trattati, trattati è uccisi à tempu, in e listessa situazione. Inoltre, tuttu u RNA è a trasfurmazione di array, hè stata fatta in a stessa tempu. Dopu, abbiamo effettuatu matrici triplicate è hà riunitu più animali per ogni campione di matrice, minimizendu ciò chì hè u minimu in u variazione di l'individualità è aumentendu a putenza statistica.S9). A terza parte, i criteri di analisi di dati aduprati per u nostru studiu sò cunsiglii da u prugettu di Control di qualità di MicroArray, chì quessi criteri sò stati validati per furnisce un altru gradu di riprodubilità intersite è di ripruducibilità inter e intraplatformiS10-S11).
Custruizione di vettori virali
A causa di e restrizioni di dimensioni virali di l'inserzione di vene, i sequenzii codificanti per i selvatici G9a (G9a) o G9a cataliticamente morti (G9aH1093K) sono stati subclonati in u plasmidiu bicistronic p1005 + HSV che esprime GFP sottu u controlu di u promotore umanu di citomegalovirus precoce immediato (CMV) l'inserzione hè stata ~ 9 kb, chì supera a dimensione massima di l'inserzione per i vettori AAV-3.96). U promotore IE2 / 4 guida l'espressione di G5a. I frammenti sò stati subclonati in u plasmidiu bicistronic p9 + HSV tramite ligature di estremità smuttate cù PmeI trattatu Klenow è G1005a digeritu da EcoRI (da pcDNA9) è p3.1 + CIP trattato seguendu digestion EcoRI. Per a pruduzzioni di HSV-DJunD-GFP, a sequenza codificante di DJunD affiancata da i siti di restrizzione EcoRI hè stata generata da PCR aduprendu oligonucleotidi di primatura chì cuntenenu u situ di EcoRI. U pruduttu PCR hè statu allora ligatu in u situ EcoRI di u vector p1005 +. L'espressione lucale di Cre recombinase in neurone NAc hè stata ottenuta da una partenza di gene mediata viralizante cun un vettore AAV cum'è descrittu (S12). A GFP o una cunfusione N-terminale di GFP à Cre era subclonata in un vettore AAV-2 ricombinante chì cuntene un promotore CMV cun una sequenza accettatrice di donatori è un segnale di poliadenilazione. Tutte e inserzioni di i vettori sò stati cunfirmati da dideoxy-sequencing. I vettori virali sò stati generati cù un metudu senza triplo-trasfezione, senza aiutu, cum'è descrittu in precedenza (S13). U virus purificatu hè statu ricordatu à −80 ° C. A qualità virale hè stata valutata da u titulu infettivu valutatu in cellule HEK293. I virus AAV-ΔFosB-GFP sò stati preparati similmente. Per HSV-Cre, l'espressione Cre hè stata guidata da un promotore IRES, contrapò à u promotore IE4 / 5, in modo da minimizà l'espressione Cre è prevene a tossicità neuronale (vede S14 per a custruzzioni virali). In tutti i casi, a sovraespressione virale era validata, entrambe in vitro e in vivo cun qPCR, è anu stati cunfirmati virus da immunoistochimicamente cunfirmati per mostrà l'espressione limitata à NAc dopu à chirurgia.
Chirurgia Stereotassica
Sottu a ketamina (100 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg) anestesia, i topi sò piazzati in un strumentu stereotassicu à picculi animali, è a superficie craniale hè stata esposita. A aghjunghje di a siringa di trenta tre furzate hè stata usata per infondà bilateralmente Xnum μl di virus in u NAc à un angulu 0.5 ° (AP + 10; ML + 1.6; DV - 1.5) à un ritmu di 4.4 μl / min. L'animali chì ricevevanu iniezioni di HSV pudianu ricuperà per i ghjorni di 0.1 dopu à a chirurgia, mentri i surdaghji aduprati per test di comportamentu chì ricevevuli vettori AAV foru ricusati per i ghjorni 2 prima di esse sottoposti à condizionu di u locu. Queste volte sò cunsunanti cù i periodi di espressione transgene mediata viralmente per i dui vettori. Per e perfusioni di BIX20, ciascuna di e duie mini-pompe sò state posizionate sottucurdaneamente ind'è u spaziu di u mouse. I piazzamentu di e cannule sò stati ottenuti perforendu dui bucche craniali sottu sopra u NAc, è da a consegna di a cannula da bregma (AP + 01294; ML + 1.5; DV - 1.0). I topi puderanu ripiglià da a chirurgia per 5.4 à 4 giorni prima di principià a procedura di condizionamentu di u locu per a cocaína, cume si spiega più in basso.
Situazione privata
A prucedura di condizionamentu di u locu hè stata svolta cum'è descritta in precedenza, cù e modifiche seguentiS7). In breve, 3 ghjorni dopu l'infusioni intra-NAc di HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP o HSV-GFP, i topi sò stati piazzati in e camere di condizionamentu, chì consistenu di trè ambienti distinti. I topi chì mostranu una preferenza significativa per una di e duie camere di condizionamentu sò stati esclusi da u studiu (<10% di tutti l'animali). I gruppi di condizionamentu sò stati allora equilibrati per adattassi per ogni pregiudiziu di a camera chì pò ancu esiste. In i ghjorni successivi, l'animali sò stati iniettati cù soluzione salina è cunfinati in una camera dopu meziornu per 30 minuti è dopu iniettati di cocaina (10 mg / kg, ip) è cunfinati per 30 minuti in l'altra camera a sera per 2 ghjorni (dui salina è dui accoppiamenti di cocaina). U ghjornu di a prova, i topi sò stati rimessi in l'apparecchiu senza trattamentu per 20 minuti è testati per valutà da chì parte anu preferitu. E risposte locomotorie à a cocaina sò state valutate per via di rotture di fasci in e camere accoppiate da cocaina per assicurà l'efficacia di u trattamentu di a droga. Per esperimenti AAV è BIX01294 CPP, hè statu impiegatu un protocolu pocu mudificatu. L'animali sò stati novamente iniettati cù salina o cocaina (10 mg / kg, ip) è cunfinati in camere specifiche per sessioni di 30 minuti, ma invece sò stati cundiziunati solu una volta à ghjornu per 4 ghjorni, seguitatu da a prova u ghjornu 5 (l'animali sò stati cundiziunati a sera è i trattamenti di condizionamentu sò stati alternati). Per tutti i gruppi, a locomozione di basa in risposta à a salina hè stata valutata per assicurà chì a locomozione ùn sia micca stata influenzata da u trattamentu virale o inibitore.
Autocuduzione di cocaina intravenosa
I busi Long-Evans adolescenti maschili, pesanti 230 – 250 g à l'iniziu di l'esperimentu, sò stati ottenuti. Hè stati ospitati in un ambientu cuntrullatu d'umidità è di temperatura, in un ciclu d'umanu / darku di l'ore 12 inversu (luci spentate à 9: 00 am) cù ad libitum accesso à l'alimentu è l'acqua. A i ratti fu permessu acclimatarsi in u so novu ambiente è sò stati trattati quotidianamente per 1 settimana prima di l'iniziu di l'esperimentu. Tutte e procedure sò state svolte in accordu cù l'Istitutu Naziunale di a Guida di a Salute per a Cura è l'Utilizzo di Animali di Laboratoriu è sò stati approvati da u Cummissiunu per a Cura è Uusu di u Mount Sinai. L'apparecchimentu per autocumità hè equipaghjatu di fasci infrarossi per mesurà u comportamentu locomotor. L'auto-amministrazione hè stata fatta cum'è descritta in precedenza (S15-S16) cù cateteri impiantati in a vena ghjugulare ghjusta sottu isofluranu (2.4-2.7%) anestesia. I cateteri sò stati lavati cù 0.1 ml di una soluzione salina chì cuntene 10 U eparina è ampicillina (50 mg / kg). Dopu à una settimana di recuperu da a chirurgia, a furmazione di auto-amministrazione hà iniziatu durante a fase scura di u cicculu luce / scuru. L'animali anu permessu l'accessu di 3 ore ogni ghjornu à a cocaina (0.75 mg / kg / infusione) in un calendariu fissu di rinfurzamentu di ratio-1 (FR1), induve 1 stampa di leva attiva hà purtatu à una sola infusione di droga. I Ratti anu stabilizatu a so assunzione di cocaina dopu à 6 ghjorni (variazione <15% di a percentuale di risposta per 3 ghjorni consecutivi, cù almenu 75% chì rispondenu à a leva rinfurzata). 24 ore dopu a sessione finale di autoamministrazione, i topi sò stati rapidamente decapitati, i cervelli sò stati rapidamente rimossi è trasformati per l'isolamentu di l'ARN è qPCR.
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
I pugni NAc freschi sò stati formaldehyde incrociati è preparati per ChIP cum'è descrittu in precedenza (S17-S18) cù modifiche minori. In breve, I punzoni NAc di scala 4 14 per animalu (animali 5 cumparati per campione) sò stati raccolti, reticulatu cù 1% formaldeidee è tempestatu cù 2 M glicina prima di congelà à -80 ° C. 1 giorno prima di campionare sonicazione, pecora anti-coniglio / mouse (dipende da l'anticorpu di precipitazione) I branelli magnetici IgG sono stati preparati incubendu perline magnetiche adatte con l'anti-G9a (grado di coniglio policlonale ChIP) o anti-H3K9me2 (grado monoclonale del mouse) anticorpi durante a notte à 4 ° C sottu rotazione constante in soluzione di blocco. A sonicazione tissutale è a custione di a cromatina sò state effettuate cum'è descritta in precedenza (S17). Dopu à a sonicazione, cuntrussioni uguali di cromatina sò stati trasmessi à i nuovi tubi è ~ 5% di i prudutti finali sò stati salvati per serviziu com'è "entrate" controlli. Dopu un lavu accuratu è una resuspensione di e miscele cunghiate bead / anticorpu, u quantità uguale di miscule di anticorpi / perle (~ 7.5 μg anticorpu / campione) sò stati aggiunti à ogni campione di cromatina è incubatu per ~ 16 ore sottu rotazione constante a 4 ° C. I campioni sò stati ulteriormente lavati è invertiti incrociati à 65 ° C durante a notte dopu prima purificazione di u DNA cù un kit di purificazione di PCR. Dopu à a purificazione di u DNA, i campioni sò stati sottoposti à qPCR è sò stati normalizzati à i so cuntrolli "input" adatti cum'è descrittu in precedenza (S17). L'immunoprecipitazioni di IgG normali à u mouse à u mumentu di u anticugolu policlonale anti-IgG di rossu anu ancu fattu per cuntrullà l'arricchimentu di l'amplificazione di u signal. Adenina fosforibosyltransferasi (APRT) hè stata usata cum'è un cuntrollu negativu per a sperimentazione di soppressione di cocaina è ΔFosB. Vede Tavola supplementare S5 per sequenze di primu promotore.
Analisi di spina dendritica
Per studia u rolu di G9a in a regolazione di a morfologia neuronale in vivo, usamu i metudi descritti precedentemente cù i cambiamenti seguenti (S1). A trè ghjorni dopu à l'iniezione di HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (tutti i virus sò stati aduprati in i surcelli selvatici C57Bl / 6J), o HSV-Cre-GFP (usata in G9afl / fl i topi), quandu l'espressione virale era massima, i topi sò stati perfusati, i cervelli sò stati crioprotettati è successivamente sbanditu à 100 μm in un vibratome. E sezzioni anu successivamente impunessu usendu un anticorpu contr'à GFP cume era descrittu sopra (veda Immunohistochimica). Per valutà l'effetti di G9a sovraespressione è knockout nant'à i numeri di spina, oltre à l'effettu di ΔJunD sovrapressione, abbiamo misuu u numaru di spine nantu à approssimativamente 1 – 2 neurite per neurone pari à almeno 299 μm di dendriti secondarie da GFP-esprimente NAc neuroni spinosi (MSNs). Dà chì MSN sò morfologicamente distinti da altre populazioni neuronali in a NAc, è ancu i rapporti anziani chì indicanu chì l'HSV infetta primariamente neuroni DARPP-32 in a regione cerebrale (S19), avemu fiducia chì e MSN sò state valutate esclusivamente in sti studi. Per ogni animali, esaminamu i neuroni ~ 6-8 in animali 3 – 4 per gruppu (gruppi 7), dopu chì un valore mediale fu ottenutu per ogni animali per analisi statistica. L'esperienze pensate per esaminà l'effetti di a sovraespressione di BFosB nantu à a densità di spina di NAc sò stati trasportati simile à quellu descrittu sopra, cù l'eccezione chì i vettori AAV sò stati usati per espressà GFP o ΔFosB-GFP per periodi prolungati (8 settimane). Tutte e immagini di HSV sò state catturate cù un microscopiu confocal cù u scopu di l'immersione in oliu 100X (e immagini AAV sò state catturate cù un obiettivo d'immersione oliu 63X). E immagini sò state acquistate cù u spiccà attaccatu à l'unità arbitraria di 1 è una dimensione di cornice 1024 × 1024. A lunghezza dendritica hè stata misurata cù u software NIH Image J, è i numeri di spina sò stati contati à ciuri da u sperimentatore primariu, cume i diapositivi sò stati codificati prima di scansione sperimentale. A quantità media di spine per 10 μm di dendrite hè stata calculata.
Analisi statistica
Un'ANOVA di u dutru sensi sò state mustrate per determinà l'importanza per a preferenza di un locu condicionatu è l'analisi dendritica di u spine cù più di duie gruppi. I test t di Studente sò stati aduprati per altri confronti chì includenu qPCR, western blotting, analisi dendritica di spine, paragunendu HSV-GFP à HSV-Cre in G9afl / fl topi, analisi di microarray (vede sopra) è esperimenti di immunoprecipitazione di cromatina. I test di studiente pianificati sò stati aduprati dopu à l'analisi ANOVA bidirezionale di a densità di a spina dendritica dopu a sovraespressione di osFosB cun cunferma di l'effetti principali significativi di u trattamentu è di u virus. Tutti i valori inclusi in a figura leggende rapprisentanu media ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Analisi statistiche dettagliate per Figgi. 1-3 in u testu di primu si dà in: Figura dettagliata Leggende cumprendu statistiche.
Footnotes
Certificu chì nisunu di i materiali inclusi in u manoscrittu intitulatu U RU Essenziale Di L'Htona Metiltransferasi G9a In Plastilità Indotta Da Cocaina sò stati publicati o furmati in altrò, ancu in Internet.
Tuttu u travagliu chì implichi l'usu di animali hè statu piazzatu in conformità cù linee guida istituziunale è IACUC sia in l'Università di u Texas Southwestern Medical Center è in Mount Sinai School of Medicine.
Riferimenti è Noti
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