(HUMAN). Risponsabilità di cumpurtamentu è strutturali à Cocaine Chronicu Esigen un induve una Cintura foroforativa ΔFosB e Calcium / Calmodulin-Dependent Protein Kinase II in u Nucleus Accumbens Shell (2013)

U fattore di trascrezioni ΔFosB è a proteina kinase II calciu / calmodulina-arricchita di u cervellu (CaMKIIα) sò indotti in u nucleo accumbens (NAc) per esposizione cronica à cocaina o à altri farmaci psicostimolanti di abusu, in cui e duie proteine ​​medenu risposte à sensibilizati . Benchè ΔFosB è CaMKIIα sia regulà l'espressione di u receptoru di glutamatu AMPA è a funzione in NAc, a formazione di spina dendritica nantu à neuroni spinaci medii NAc (MSNs), è a sensibilizzazione locomotoria à a cocaina, ùn hè micca veramente scurdata cunnessione tra queste molecole. Quì, dimostremu chì ΔFosB hè fosforilatu da CaMKIIα à a Ser27 stabilizzante proteina è chì CaMKII hè necessariu per l'accumulazione mediata da cocaina di BFosB in NAc ratu.

À u cuntrariu, mustremu chì BFosB hè sia necessariu è abbastanza per l'induzione di cocaína in u so chjassimentu di CaMKIIα in vivo, un effettu selettivu per D₁-Spe MSNs in a sottoregi di shell NAc.

Inoltre, l'induzione di spine dendritiche nantu à i MSN di NAc è a crescente reattività di u comportamentu à a cocaina dopu l'ufre-espressione NAc di ΔFosB sò sia dipendenti CaMKII.

È impurtante, dimustemu per a prima volta induzione di ΔFosB è CaMKII in a NAc di ivicani cocaichi umani, annunzendu e dumteghje possibili per l'interventu terapeuticu futuru. Questi dati stabilenu chì B FosB è CaMKII si impegnanu in un ciclu di feedforward positivo di tippu cellulare è cervellu-specificu cum'è un meccanismo chiave per regulà i circuiti di ricompense di u cervellu in risposta à cocaina cronica.

I MUVRINI

L'evidenza crescente sustene u penseru chì i cambiamenti nell'espressione genica contribuiscenu à i meccanismi di a tossicità.Robison è Nestler, 2011). Un mediatore impurtante di questi cambiamenti hè BFosB, un fattore di trascrizione di a famiglia Fos (Nestler, 2008). L'amministrazione cronica di praticamente ogni farmaci di abusu induce l'accumulo di lunga durata di BFosB in nucleo accumbens (NAc), una regione limbica essenziale per i comportamenti di ricompensa. SL'induzione di uch hè spiccica per a classe di neurone spinosi mediu NAc (MSN) chì esprime i recettori di dopamina D1. L'ufre-espressione inducibile di FosB in sti MSN di Dcnumx-type NAc aumenta locomotive è risposte gratificante à a cocaina è a morfina (Kelz et al., 1999; Zachariou et al., 2006), tra cui l'aumento di a autocusturazione di a cocaina (Colby et al., 2003). In più, u bloccu geneticu o virale di l'attività transcriptional di BFosB riduce gli effetti gratificanti di sti droghe (Zachariou et al., 2006), indicendu chì questu induzione cuntenuta di ΔFosB hè un mediatore criticu di e cambiamenti durevuli indotti in NAc da l'administrazione cronica di farmaci..

A stabilità insolita di B FosB (paragunà à tutte l'altre proteine ​​di a famiglia Fos) hè sia una prusita intrinseca di a molecula, a causa di u truncamentu di domini digratu chì sò presentati in FosB di lunghezza completa (Carle et al., 2007), è un prucessu regulatu. BFosB hè fosforilatu in vitro e in vivo in Ser27, è sta reazione stabilisce ulteriormente ΔFosB, ~ 10-fold, in cultura cellulare è NAc in vivo (Ulery-Reynolds et al., 2009). Benchè Ser27-Δ FosB hè statu dimustratu di esse un substratu per a caseina kinase-2 in vitro (Ulery et al., 2006), u so muvimentu di in vivo a fosforilazione rimane sconosciuta.

A proteina kinase II dependente di calciu / calmodulina (CaMKII) hè una serina / treonina kinase altamente espressa cui isoforme α è β formanu omu dodecameri è etero-holoenzimi in vivo, è sò essenziali per e molte forme di neuroplasticità (Lisman et al., 2002; Colbran è Brown, 2004). A CaMKIIα hè indotta selettivamente in a cunca di NAc cù anfetamina cronicaLoweth et al., 2010), è u blucamentu farmacologicu di l'attività di CaMKII in a cunca di NAc riduce a sensibilisazione di u comportamentu à l'anfetamina (Loweth et al., 2008) è cocainaPierce et al., 1998), mentri chì a sovraespressione virale di CaMKIIα in sta subregione NAc potenzia a sensibilisione locomotoria à e l'auto-amministrazione di l'anfetamina (Loweth et al., 2010). CaMKIIα pò affettà comportamenti di primu per modulazione di sottunità di receptoru glutamatu AMPA (Pierce et al., 1998), cum'è l'attività di CaMKIIα hè stata lungamente associata cù a funzione di i recettori AMPA è u sinaptic-targeting in parechje forme di neuroplasticità (Malinow è Malenka, 2002).

Questa letteratura dimostra diversi paralleli trà FosB è CaMKII: entrambi sò necessarii è sufficienti per multipli effetti comportamentali di droghe di abusi, sia di upregulate spine dendritica in vari tipi di cellule neuronali in vivo (Jourdain et al., 2003; Maze et al., 2010), è ambeddi esercitano almenu alcuni di i so effetti comportamentali per modulazione di i recettori AMPA (Kelz et al., 1999; Malinow è Malenka, 2002; Vialou et al., 2010). Malgradu questi paralleli, ùn ci hè nunda di cunnessione funzionale tra ΔFosB è CaMKII. Quì, stabilemu una regolazione reciproca tra ΔFosB è CaMKII, è dimustremu chì e duie proteine ​​formanu un loop D1 di tippu MSN-specificu in furmiculi NAc chì sò indotti da a cocaina è regulano una gamma di risposte di cocaina in vivo.

Andà à:

Materiale è Metodi

Esperimentu 1: Analisi Proteomica iTRAQ di Cutt di NAc è Cura di CocaínaFig 1A)

U ratu maschile à l'adulte (8 settimane) hè statu somministratu 20 mg / kg di cocaina o veicheria salina IP una volta per ghjornu per sette ghjorni. 24 hr dopu à l'ultima iniezione, a copertina NAc è u core furu microdissected (Fig 1A) e lampi ghjustu. L'analisi iTRAQ hè stata fatta cum'è descritta in precedenza (Ross et al., 2004; Davalos et al., 2010).

figura 1

Induzione specifica di gusci di CaMKII in NAc da cocaine

Esperimentu 2: Quantificà i cambiamenti di Proteina in Core Nucidentale è Core è Shell Dopo Cocaina Trattamentu (Fig. 1B-D)

U ratu maschile à l'adulte (8 settimane) hè statu somministratu 10 mg / kg di cocaina o veicheria salina IP una volta per ghjornu per sette ghjorni in camerine di locomotor E risposte locomotive à una sola iniezione di cocaina (5 mg / kg IP) è stata registrata in quegli animali trattati in precedenza cun cocaina (chjamata “cronica”) è una parte di quelli trattati cun una soluzione fisiologica (chiamata “acuta”), e risposte locomotorie a salina era solu registratu in l'animali crònichi trattati in serenità salina (chjamata "salina"). Assai locomotori sò stati effettuati cum'è descrittu (Hiroi et al., 1997). In breve, i ratti masculini adulti sò stati piazzati in scatole di annunziu campu open di 18 »× 24» PAS (San Diego Instruments) per 30 min da abituate, anu datu à una sola iniezione IP di salina è monitorata per un 30 min. iniezione IP unica di 5 mg / kg di cocaina è monitorata per 30 min.

24 hr dopu à sta iniezione finale, i ratti sò stati decapitati senza anestesia per evitare effetti di anestetichi nantu à i livelli di proteine ​​neuronali è fosfo-stati. I cervelli vennero tagliati in serie in una matrice 1.2 mm (Braintree Scientific) e il tessuto bersaglio è stato rimosso in tampone salina fosfato contenente inibitori di proteasi (Roche) e fosfatasi (Sigma Aldrich) usando un punzone di calibro 14 per nucleo NAc e un punzone di calibro 12 del rimanente u tessutu per cce Fig 1A) è immediatamente gelatu annantu à u ghiacciu asciutto. I campioni sò stati omogeneizati da una sonicazione leggera in tampone RIPA modificatu: base 10 mM Tris, cloruru di sodiu 150 mM, 1 mM EDTA, 0.1% dodecil sulfate di sodiu, 1% Triton X-100, 1% deossycholate, pH 7.4, protease e fosfatasi cum'è sopra. Dopu aghjunghje u tampone Laemmli, e proteine ​​sò state separate per i gradienti di poliacrilamide 4-15% (Criterion System, BioRad), è Western blot hè statu fattu cù u sistema Odyssey (Li-Cor) secondu i protocolli di u fabbricante.

Sperimentu 3: Quantificà Pruducazioni Di Proteine ​​in Rattenu NAc Core è Shell Dopo Cocaina Retirata (Fig 1E)

U ratu maschile à l'adulte (8 settimane) hè statu somministratu 10 mg / kg di cocaina o veicheria salina IP una volta per ghjornu per sette ghjorni. Nantu à u ghjornu dopu à l'iniezione finale, l'animali trattati cun una soluzione salina ne sò stati cagionati un'altra iniezione salina (chjamata "salina") è l'animali trattate con cocaina ne eranu altra iniezione salina (chiamata ritruzione di u giorno 14 o "14d WD") o un'unica iniezione di cocaina ( chiamatu "14d WD Chal" per a sfida). Una ora dopu à l'innulazione finale, l'animali sò stati decapitati è Western blotting nant'à Spirimentu 2.

Esperimentu 4: Quantificendu Prudent variazioni di Ratu Nac Core è Shell Dopo Cocaína Self-Administration (Fig. 2A – C)

I furmati sò stati furmati per autoreadministere 0.5 mg / kg / infusione di cocaina in sessioni di una ora sotto un programma fisso di rapporto 1 per nove giorni. Dopu nove sessioni di basa, i ratti sò stati spartiti in dui gruppi equilibrati da un ingaghju di cocaina in l'ultime dui sessioni. Un gruppu di ratti hà permessu autoguvernamentu a cocaina (0.5 mg / kg / infusione) in sessioni di una ora (accessu breve, ShA) mentre l'altru gruppu di ratti si autoguniava di cocaina in sessioni di sei ore (lì accede, LgA ) per dieci ghjorni in più (sessioni di escalazione).

E parti cerebrali sò state trattate per immunoistochimica cum'è descritta (Perrotti et al., 2004). I cervelli sono stati perfusati 18 – 24 hr dopu à l'ultima esposizione à un farmaco, causando u degradazione di qualunque proteina FosB residua in lunghezza tale da tutti l'immunoreattività rimanente riflette ΔFosB. Questa degrinazione hè stata cunfirmata da Western blotting, chì ùn hà mostratu nunda di cumunamentu cun un anticorpu dirittu contr'à u terminale C di FosB full-length chì ùn ricunnosce ΔFosB (dati ùn sò micca mostrati). Dopu avè sarrificatu i segmenti 35 µm, u numaru di os FosB cellule immunopositivi hè statu quantificatu da un osservatore accecatu in duie sezioni à traversu a NAc di ogni ratu è i valori medi per u campu 40 × sò stati poi calculati per regione per ogni animale. Ogni animali era consideratu una osservazione individuale per analisi statistica. Erenate di regioni di interesse cù Paxinos è Watson (Paxinos è Watson, 2007).

A quantificazione di l'immunoreattività di CaMKIIα hè stata fatta usendu un sistema Licor cum'è descrittu (Covington et al., 2009). L'intese integrate di CaMKII è GAPDH sò state determinate cun un software Odyssey. I risultati sò presentati cum'è valori d'intensità integrati per mm² è sò presentati cum'è mezu ± sem (n = 4 – 10 per gruppu). I valori per GAPDH sò stati utilizzati per fà u normalizà l'intensità di CaMKII per a so spessità è condizioni.

figura 2

Induzione di CaMKII in coppette NAc di topi in autocungani è addetti à cocaína umana

Esperimentu 5: Quantificà i livelli di proteine ​​in l'umani dipendenti da a cocaina (Fig. 2D)

prucedura

I tessuti di u cervello umanu postmortem sò stati ottenuti da a Banca Suicidiu Brain di Québec (Douglas Mental Health University University Institute, Montreal, Quebec, Canada). A cunservazione di u tessutu hè prubettu cum'è descrittu (Quirion et al., 1987). Brevi, una volta estratu, u cervellu hè messu nantu à u ghiaccio bagnatu in una scatula di Styrofoam è cundutu in i siti di Quebec Suicide Brain Bank. Emisferi sò immediatamente separati da un taglio sagittale in u mezu di u cervellu, staminu di u cervellu è u cerebellum. I vasi sanguigni, a glándula pineale, u plexu corduidu, a metà cerebellu, è a mità di u tretu cerebrale sò tipicamente dissezzati da l'emisferu sinistru ch'è poi si tagliaghja coronalmente in fette 1 cm. Quest'ultima metà u cerebellum hè tagliata sagittalmente in fette di u Spessu 1cm prima di congelà. I tessuti sò gelati in 2-metilbutane à −40 ° C per ~ 60 sec. Tutti i tessuti gelati sò tenuti separatamente in sacchi di plastica à −80 ° C per stà à longu andà. E regioni cerebrali specifichi sò spartite da fette coronali congelate nantu à una piastra d'acciaio inossidabile cù ghiaccio asciutto intornu per cuntrullà a temperatura di l'ambiente. U Blotting occidentale hè statu fattu cum'è descrittu in Spirimentu 2.

Corti

A coorta era fatta di masci 37 è di e donne 3, cù l'età trà l'anni 15 – 66. Tutti i sughjuli sò morti improvvisamente senza un prugrammu agonal prolungatu o malatie mediche lunghe. In ogni casu, a causa di a morte hè stata stabilita da l'Uffiziu di Coroner di Quebec, è un screnu tossicologicu hè statu fattu cun esemplari di tessuti per uttene infurmazioni nantu à a medicazione è l'usu di droghe illecite à u mumentu di a morte. U gruppu di sughjetti hè cuncessu individui 20 chì rispettavanu i criteri SCID-I per a dipendenza di a cocaina. U gruppu di cuntrollu era cuntinuatu di soggetti 20 senza storia di dipendenza di cocaine è senza diagnosi psichiatrica maiò. Tutti i sughjuli sò morti improvvisamente da cause chì ùn anu avutu influenza diretta nantu à u tessutu cerebrale. I gruppi sò stati abbinati per l'età media di u sughjettu, u ritardu di a refrigerazione è u pH. Per tutti i sughjetti, autopsie psicululiche sò state effettuate cum'è discugliatu anteriormente (Dumais et al., 2005), chì ci permetta di avè accessu à infurmazioni dettagliate di casi cusì psiculichi è medichi, è ancu altri dati clinichi è sociodemografici pertinenti. In breve, un intervistatore addestratu hà fattu a Intervista Clinica Strutturata per DSM-IV Disordini psichiatrichi (SCID-I) cun unu o più informatori di u defuntatu. Un pannu di i clinici hà rivisto i cali d'evidenza di SCID-I, casi di referenze, note di coronatore, è registrazioni mediche per avè a diagnosi psichiatrica cuncepente.

Esperimentu 6: Immunoprecipitazione di Cromatina per Razò NAc (Fig. 3A – C)

U ratu maschile à l'adulte (8 settimane) hè statu somministratu 10 mg / kg di cocaina o veicheria salina IP una volta per ghjornu per sette ghjorni. 24 hr dopu à l'ultima iniezione, Nucleu NAc è core hè statu microdissetti. L'immunoprecipitazione a cromatina (ChIP) hè stata fatta cumuna bilancieri NAl bilaterali di conchiglia o nucleo da sette ratti per gruppu in gruppi totali 14 (animali 98 totali, pools di cocaina 7, piscine 7 saline). I tessuti sò stati reticulati, lavati, è conservati à −80 ° C finu a cusita di cromatina da sonicazione. A cromatina tagliata hè stata incubata da l'ultimu ghjornu cù anticorpii precedentemente legati à perle magnetiche (Dynabeads M-280, Invitrogen). A IgG non immune era usata cum'è cuntrollu. Dopu avè cumercii retta inversa è purificazione di u DNA, qPCR hè statu adupratu per misà i livelli di ADN promotore CaMKIIα. I primers furunu disegnati per amplificà una regione chì cuntene una sequenza consensus AP-1 situata ~ 450 bp prima dell'inizio del sito di trascrizione (Avanti: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Reverse: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

figura 3

Induzione di CaMKIIα di BFosB di tippu cellulare è regiunale in vivo

Sperimentu 7: Misurazione di una Transcript di CaMKII è di l'Espressione di Proteine ​​cù a Sovraespressione BFosB specifica di a CellaFig. 3D)

Maci bitransgenichi maschili derivati NSE-tTA (linea A) × TetOp-ΔfosB (Linea 11) è NSE-tTA (linea B) × TetOp-FLAG-ΔfosB (linea 11) mouse (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Zachariou et al., 2006) sò stati cuncipitu è ​​cresciutu nantu à 100 µg / ml doxiciclina per sopprimà l'espressione B FosB durante u sviluppu. I littati eranu divisi à svezzamentu: a metà restava nantu à a doxiciclina è a mità era cambiata à l'acqua è l'ani è usatu 8 à 11 settimane dopu quandu l'effetti trascrizionali di BFosB sò maximaliKelz et al., 1999; McClung è Nestler, 2003). Per analisi trascrizionali, i surri sò stati rapidamente decapitati, è i cervelli sò stati rimpiazzati è postu nantu à u ghiaccio. Le dissezioni di NAc furunu scattate cù un punch dell'ago di calibro 14 e rapidamente congelati sul ghiaccio secco finché l'RNA non è stato estratto. L'isolamentu di l'ARN, qPCR, è analisi di dati sò state effettuate cum'è descrittu in precedenza (LaPlant et al., 2009). In breve, l'ARN hè statu isolatu cù u reagente TriZol (Invitrogen), purificatu dopu cù u kit micro RNAeasy da Qiagen, è hà verificatu a qualità cù u Bioanalizzatore Agilent. A trascrezzione inversa hè stata fatta in iScript (BioRad). qPCR hè stata fatta cun un sistema PCR 7900HT RT di Applied Biosystems RT cun i parametri di u ciculu seguenti: 10 min à 95 ° C; Cicli 40 di 95 ° C per 1 min, 60 ° C per 30 sec, 72 ° C per 30 sec; scaldatura graduata in 95 ° C per generà curve di dissociazione per a cunfirmazione di i prudutti unici di PCR. L'analisi immunoistochimica di l'espressione di proteina BFosB e CaMKIIα è stata fatta cum'è descritta in Spirimentu 4.

Esperimentu 8: Effetti di Intra-NAc D1 è D2 Antagonisti di Recettami Dopamina in Cambiamenti Di Proteine ​​Mediate da Cocaina (Fig. 3H)

I ratti chì anu da u genitiu (8 settimane) eranu attribuitu 10 mg / kg di cocaina o veicule salè (gruppo "veicolo") IP una volta per ghjornu per sette ghjorni. 30 min prima di ogni iniezione di cocaina, i ratti eranu IP amministrati sia l'antagonista di recettori D1 SCH 23390 (0.5 mg / kg, gruppo "D1 Ant"), o l'etagonopride di l'ARN antagonista di recettori D2 (0.5 mg / kg, gruppo "D2 Ant") o una iniezione di cuntrollu salina (gruppo "cocaina"). 24 hr dopu à l'iniezione finale, l'animali sò stati decapitati è proteine ​​quantificate da Western blotting cume Spirimentu 2.

Esperimentu 9: Effetti di A Sperperazione on FosB Mediata da AAV in Espressione Di ProteineFig. 4 A – C)

A chirurgia stereotassica hè stata fatta nantu à ratti maschili adulti (settimane 8) per injectà AAV-GFP (proteina fluorescente verde) o AAV-GFP-ΔFosB (Maze et al., 2010). U aghi di calibri 33 (Hamilton) furono impiegati per tutte l'ambulatori, durante i quali 0.5 µl di virus ad alto tasso purificato era infuso bilateralmente durante un periodo di tempo 5 min, seguita da un ulteriore periodo di riposo 5 dopo l'infusione. Tutte e distanze sò misurate in quantu à Bregma: 10 ° angulu, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = −6.7 mm. 14 ghjorni dopu a chirurgia, l'animali anu datu à una sola iniezione IP di 10 mg / kg di cocaina in camere di monitoraggio locomotive per valutare gli effetti comportamentali di .FosB sovrastra espressione. 24 hr dopu à sta iniezione finale, i ratti sò stati decapitati per Spirimentu 2, è a microdissessione tissutale hè stata fatta sottu guidà microscopia fluorescente per uttene GFP-positivi NAc tessuti. U Blotting Occidentale hè poi fattu cum'è Spirimentu 2.

figura 4

BFosB hè necessariu è basta per l'induzione di CaMKIIα à D1 mediata da ricevitore mediata da cocaina in cuttula NAc

Experimentu 10: Effetti di AAV-Mediata ΔJunD Overexpression on Cocaine-Dependent Protein ProteinFig. 4 D – F)

L'iniezione stereotassica di AAV-GFP o AAV-GFP-DJunD hè stata fatta cum'è Spirimentu 8. 14 ghjorni dopu à a chirurgia, l'animali anu amminuite 10 mg / kg di cocaina o veicolo IP via una volta per ghjornu per sette ghjorni in cameri di locomotive. E risposte locomotive à una sola iniezione di cocaina (5 mg / kg IP) o salina era annotata. 24 hr dopu à sta iniezione finale, i ratti sò stati decapitati, tessuti raccolti, è Western blots eseguitu cum'è in Spirimentu 9.

Sperimentu 11: In Vitru Prove di Kinase ProteinFig. 5A – D)

I CaMKIIα ricombinanti è ΔFosB sò stati purificati da e cellule di l'insettu (Brickey et al., 1990; Jorissen et al., 2007), è sò stati effettuati testi di proteine ​​kinasi (Colbran, 1993), cum'è ancu descrittu. Nanzu, CaMKII era preincubatu nantu à u ghiacciu cù 2.5 µM ​​(o cuncezione indista) di BFosB, 1 mM Ca²⁺, 40 mM Mg²⁺, 15 µM ​​calmodulina, è 200 mM HEPES pH 7.5. A fosforilazione hè stata principiata cù l'aggiunzione di 200 µM ​​ATP cù o senza [γ-³²P] ATP è permessu procedere per 10 min a temperatura ambiente (Fig 5A & B) o 2 min in ghiaccio (Fig 5C & D). I prudutti sò stati risolti da Western Blotting (Fig 5A & B) o cù autoradiogramma è contu di scintillazioni (Fig. B – D).

figura 5

BFosB hè un substratu putente per CaMKIIα

Esperimentu 12: Identificazione di Ser27 os FosB-Filazione di FosB (Fig 5E)

In vitro analisi di kinase sò state effettuate per Spirimentu 11Li proteine ​​sò stati separati da SDS-PAGE, è e bande chì correspondenu à ΔFosB sò state tagliate è sottuite à spettrometria di massa in tandem. L'assignazioni di m / z di i frammenti ionici rispettabili in tutti i pannelli sò etichettate sopra i picchi di ioni. Non tutti i ioni di u fragmentu sò etichettati à causa di limitazioni di spaziu. Generalmente, u testu per a etichetta di iionu di u fragmentu sò coloratu di neri, eccettu quandu confermanu o aghjunghje evidenze direttamente à a presenza di i siti di fosforilazione di u interessu, in quellu u casu sò marcati in rossu. L'evidenza di i prodotti di frammentazione di vertebbrichi è presentata in a lettura di sequenza di fosfopeptide cù u situ dettevatu di residuo di fosforilazione indicato in rossu cun unica lettera di aminoacido designazione. A descrizione numerica di i ioni di u fragmentu osservatu sò ancu marcati in a sequenza di peptidi cume ioni b è y. I fattori di zoom per e sezzioni di l'asse m / z per mostrà i ioni di u fragmentu di l'intensità inferiore sò marcati in cima di ogni spettra di massa di u fragment. I ioni di u fragmentu dimustrati in u pannellu H confermanu a presenza di l'isoformu fosforilatu Ser27, invece, in un mix di altre isoforme fosforilate in i siti Ser28, Ser31, Ser34 e Thr37. A presenza di ioni pa5, pa5-P, pb5 è pb5-P conferma unicamente a fosforilazione di u residu Ser27.

Experimentu 13: Quantificazione di Ser27 fosforilazione (Fig. 5F)

I peptidi standard sò stati cuncipitati mimendu e forme phospho è non-fosfo di Ser27 ΔFosB. Dopu a sintesi è a purificazione, ogni peptide idiotipicu "pesante" hè statu dissolutatu in un tampone di acetonitrile / acqua di 50 / 50 è mandatu per analisi di aminoacidi per determinà a concentrazione assoluta in a soluzione di pesa di peptide sintetica. Ciascun peptide "pesante" era poi infunditu direttamente in u spettrometru di massa 4000 QTRAP (MS) per determinare l'energia migliore di collisione per frammentazione di MS / MS e da due a quattro transizioni MRM. Dopu, i peptidi "pesanti" chiddi sò stati sottu à LCMS nantu à a QTRAP 4000 per assicurà a separazione peptidica. L'instrumentu era fattu in u modu triplo quadrupolu, cù Q1 impostatu nantu à u precursore specificu valore m / z (Q1 ùn hè micca scansione), è Q3 impostatu per u valore specificu m / z chì corrisponde à un fragmentu specificu di ddu peptide. In u modu MRM, una serie di reazioni singuli (precursor / fragment transizioni ionici induve l'energia di collisione hè sintinta per ottimizzà l'intensità di i ioni di u frammentu di interessu) sò stati misurati in modo sequenziale, è u ciclu (tipicamente 1 – 2 sec) hè stato messu in loop in tuttu tuttu u tempu di a separazione HPLC. E transizioni MRM sò state determinate da u spettri MS / MS di i peptidi esistenti. Due transizioni per peptide, curretta à iioni di i frammenti di alta intensità, sò poi fatti selezziunati è l'energia di collisione ottimizata per massimizzare a forza di u segnale di transizioni MRM cù software di automazione. I picchi risultati da peptidi standard è exposed FosB campioni espositi à CaMKII o cuntrollu sò paragunatu per determinà l'abbondanza assoluta di ogni forma peptidica in a reazione. L'analisi di i dati nantu à dati di LC-MRM hè fatta cù AB Multiquant software 1.1.

Sperimentu 14: Induzione di ΔFosB in CaMKII Overexpressing Mice (Fig 5G & H)

Topi transgenici chì sovraintestineranu T286D CaMKII (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012) è gruppi di lettere di tipu salvatoghju sò stati cullati in mancanza di doxiciclina per permessu l'espressione transgene. A so zitelli adulti eranu administrati 20 mg / kg di cocaina o IP salinaria una volta ogni ghjornu per i ghjorni 14. 24 hr dopu à l'iniezione finale, i animali sò stati decapitati, immunoistochimica è quantificazione di l'espressione FosB hè stata eseguita cum'è in Spirimentu 4.

Esperimentu 15: Effetti di Soprapressione B FosB Mediata in HSV è Inibizioni CaMKII à Spine Dendritiche NAcFig. 6A – E)

I mouse di maschi adulti (settimane 8) sò stati iniettilmente stereotaassi in NAc cù HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB (Olausson et al., 2006), HSV-GFPAC3I, o HSV-GFPAC3I-ΔFosB. In sti costrutti, AC3I, un inibitore basatu à peptidi di l'attività CaMKII, hè solidu à u C-terminal di GFP. GFPAC3I fu clonata da PCR cù u vitturariu pMM400 cuntene GFPAC3I cume un mudellu cù i seguenti primers: GFP-AC3I-F: 5 'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3' (clampNheIKozakmet); GFP-AC3I-R: 5 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3' (clampBspEIstop). U pruduttu PCR risultatu hè statu inseritu in i vettori PosN + + e p1005 + -Δ FosB cù i siti NheI è BspEI. U custru hè statu validatu da u sequenziu. E coordinate stereotassici eranu: angulu 1005 °, AP = + 10 mm, Lat = + 1.6 mm, DV = −1.5 mm (Barrot et al., 4.4). A perfusione è u segretamentu di u cervellu sò state fatti cum'è Spirimentu 4.

L'analisi di Spine hè stata fatta cum'è descritta (Christoffel et al., 2011). In breve, i segmenti dendritici 50 – 150 µm luntanu da u Soma sò stati scelti di casu da e cellule infette da HSV chì esprime GFP. E immagini sò state acquistate nantu à un confocal LSM 710 (Carl Zeiss) per analisi morfologica cù NeuronStudio cù l'algostimu di rayburst. NeuronStudio classifica spine cum'è sottile, funghi, o stubby basatu sui valori chì (1) ratio, (2) testa a collu, è (3) diametro capu. E spine cù un collu ponu esse classificate di sottu o di funghi, è quelli senza un collu significativu sò classificati com stubby. E spine cù u collu sò etichettate sottile o funghi à basu di u diametro di a testa.

figura 6

L'imbusione di l'attività di CaMKII prevene l'incrudizioni morfologichi è comportamentali di ΔFosB in NAc

Experimentu 16: Effetti di Overexpressione Di BOSB-Mediata HSV-E Inhibizione Di CaMKII in Responses di Cocaína (Fig. 6F)

I mouse di maschi adulti sò stati injectati cun virus cumu Spirimentu 15, è risposte locomutore à una singula iniezione 5 mg / kg di cocaina hè stata misurata per Spirimentu 9. I dati Locomotive sò espressi in u spechju totale di i fasciuli sopra 30 minu dopu à l'iniezione di cocaina.

Information Additional

A Case per l'Animentu

U rane Sprague Dawley maschile (250 – 275 g; Laboratori di Charles River) eranu logati di coppia. I soulini maschili C57BL / 6J da u sottu annu (u Laboratoriu Jackson) eranu un gruppu in u più di cinque animali per a cage. Tutti l'animali anu abituati à u stabilimentu animale per a settimana ≥1 prima di manipulazioni sperimentali è situate in camari cuntrullate di clima (23 – 25 ° C) in un ciclu di luce / oscurità 12 hr (si accende per 7: 00 AM) è acqua ad libitum. L'esperienze sò state pussibule secondu e linee di a Società per a Neuroscienza è u cummitariu istituzionale per a cura è l'usu di l'animali (IACUC) in u Sinai.

droga

I farmaci furunu administrati IP è dissolti in serra sterile, cum'è cocaina (5 – 20 mg / kg per 10 µl per i topi, per 1 ml per ratti, NIDA) è SCH 23390 o cloridrato di eticlopride (0.5 mg / kg per 1 ml, Tocris) . Per a chirurgia stereotassica, i surri sò stati anestetizzati cù un "cocktail" di ketamina (100 mg / kg) è xilazina (10 mg / kg) (Henry Schein) in serbo sterile.

Anticelli

CaMKIIα (totale): Ustate 05 – 532, 1: 5,000

CaMKII phospho-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (total): Cell Signaling 5G4, 1: 250

ΔFosB phospho-Ser27: Phosphosolutions, 1: 500

GluA1 (totale): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07 – 598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Analisi statistiche

Tutte e analisi statistiche sò state effettuate cù u pacchjulista prismica 6 (GraphPad). I test-t di Studente sò stati aduprati per tutte e cumparazioni di scambi parenti (indicati in Risultati in cui u valore t hè dato), è ANOVA a senso unico sono stati usati per tutti i paragoni multipli (indicati in sezione di risultati dove u valore F hè dato).

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Risposte alla lingua

Cocaína cronica induce CaMKII in a Shc di NAc

Parechji studii hà indicatu chì MSN in a copertina di NAc è in core anu risposti biochimichi è fisiologichi à l'esposizione cronica à droghe d'abusu (Kourrich è Thomas, 2009; Loweth et al., 2010) è chì e duie subregionie regolanu di modu differente comportamenti di ricerca di droghe (Ito et al., 2004). Determinare l'effetti diferenziali di a cocaina in i prutezenti proteici di a cunca NAc vs. core, usamu Multipginged Isobaric Tagging (iTRAQ) è tandem mass spectroscopy (MS / MS). I ratti chì anu adulti sò stati nigretti IP cù cocaina (20 mg / kg) o salina ogni ghjornu per i ghjorni 7; 24 hr dopu à l'ultima iniezione, a copertina NAc è u core furu microdissected (Fig 1A) e lampi ghjustu. E proteine ​​in questi campioni anu dopu quantificate da iTRAQ. Tutti e quattru isoforme CaMKII mostranu grandi incrementi di espressione dopu à u trattu di a cocaina, chì eranu specifici per a shell NAc paragunatu à u core. Parechje proteine ​​fosfatasi, inclusi PP1 subunità catalitiche è regulatorie è PP2A, chì sò anteriormente associati à vari substrati CaMKII in altri sistemi (Colbran, 2004), hà seguitu un mudellu simile. Queste scoperte anu avutu evidenze nova, imparziale chì u caminu di segnalazione di CaMKII hè regolatu primariu da a cocaina in NAc in un modu speculare.

Per validà questu ritrovu più quantitative, trattavu ratti cum'è sopra cun cocaina (à vari dosi) o salè è risposte locomuteri misurati à una cocaina (5 mg / kg) o dose sfida salina. L'esposizione ripetuta à 10 mg / kg di cocaina hà causatu u tippu tipicu di sensibilizazioni locomotorie (Fig. 1B). Ulteriori studii cun questu regimimentu di a dosazione dimustranu, cù l'uso di Western blotting, chì a cocaina ripetuta induce CaMKIIα selettivamente in a cunette NAc 24 hr dopu à l'innulzione finale di cocaina (Fig. 1C è D; p = 0.0019; F = 7.943; df = 29). In più, a fosforilazione di u substratu canonicu CaMKII Ser831 di a subunità GluA1 di u receptoru AMPA hè stata aumentata significativamente in shell di NAc è micca core (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28), mentre l'autofosphorylation CaMKIIα Thr286 ha un forte tendenza significativa versu l'induzione nant'à a shell (Fig. 1D). Parechji altri ricettori di glutamatu ùn sò micca stati affetti. A cuntrastu à sti misure di CaMKII, i stessi campioni di tessuti presentavanu induzione di osFosB in ambeddu shell (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) è core (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) di l'NAc (Fig. 1C è D), cunservante à i risultati precedenti (Perrotti et al., 2008).

Avendu parechji studii precedenti nantu à a regolazione di a cocaina di i recettori AMPA hà studiatu animali postu ~ 14 giorni di ritruquà da cocaina cronica (vedi Discussione), abbiamo ripetutu queste analisi biochimiche in stu momentu. Avemu scupittu chì, 14 ghjorni dopu à l'innulazione finale di cocaina, osFosB rimane elevatu in NAc (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), mentre nemmenu CaMKII nè a fosforilazione di GluA1 Ser831 restano aumentati (Fig 1E). Tuttavia, 1 hr dopu à una sola dose 10 mg / kg di cocaina, i livelli di CaMKII totali (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) e di GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; df = 27) a fosforilazione hè entrambi elevata à un grau simili à quelle truvate dopu a esposizione iniziale cocainaFig 1E). Questi dati segnalanu chì i neuroni di a shell di NAc sò primati per l'induzione di CaMKII durante i periodi allargati di astinenza, forse via l'appruntamento diretto di u promotore di u genu CaMKII (vedi Discussione). Inoltre, u fattu chì l'induzione BFosB hè più persistenti di l'induzione di CaMKII suggerisce l'esistenza di meccanismi supplementari, sì basati à cromatina o micca, chì esercanu un "freno" nantu à a regolazione di CaMKII, cum'è parlatu in a Discussione.

Per rafforzà ancu e sceglie osservazioni, abbiamo studiatu mudelli di autocunificazione di cocaina, chì implichi una apertura volitaria di droghe. Ratti d'essere adulti sò stati cunsiderati in brevi o in u lungu accessu à a cocaina; cum'è previsto (Ahmed è Koob, 1998), solu e cundizioni di accessu longu hannu causatu una automusione di u medicamentuFig 2A). BFosB hè statu indu in una misura maggiore di longhi vs. breve accesso à a cocaina in entrambi i shell NAc (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) è core (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17). À u cuntrariu, CaMKIIα era indotta in a cunca di NAc solu cù u lungu accessu à a cocaina (Fig. 2B è C; p = 0.0236; F = 4.957; df = 16). È interessante cunfrontà l'ingressu media di tutti i ghjurnati di cocaina in i bestii cu-e l'accessu corti (~ 12 mg / kg IV), animali di lunga distanza (~ 70 mg / kg IV), è animali trasmissi da experimentatori (10 mg / kg), dumandate perchè quest'ultima elicita una induzione robusta di BFosB è CaMKII, mentre l'accurtatu curtu ùn hà. Questa discrepanza hè probabilmente a causa di differenze in i picculi livelli di cocaina (a cocaina cun administratore di sperimentatore hè data cum'è una sola IP di bolu, mentri a cocaina auto-amministrata hè data in parechje doigme IV), o per e differenze di lunghezza di esposizione à u medicamentu (ghjorni 7 per experimentatore amministrazione, ghjorni 19 per a self-administration).

Malgradu a larga letteratura nantu à Δ FosB è CaMKII in azzione di cocaina, ùn ci sò studii di queste proteine ​​in i consumatori umani di cocaina. Quì, presentemu a prima prova chì i livelli di FosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) è CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32) vennu aumentati in NAc di l'omi dipende da cocainaFig. 2D, Table 1). Questi dati mostranu chì a nostra prova di l'induzione osFosB è CaMKII da cocaine in rodenti NAc hè clinicumente pertinente à a dipendenza umana da cocaína.

Table 1

A caratterizazione di e campioni da vittime-vittime cocaine umane è gruppu di cuntrollu di u casu

Δ FosB Regula CaMKII Transcription Selectively in D1-Type MSNs of NAc Shell

L'investimentu chì sia CaMKII è osFosB sò upregulated da a cocaina in u roditore NAc ci hà fattu determinà se ΔFosB puderebbe regulà a trascrizione di u gene CaMKII. Avemu riferitu in precedenza CaMKIIα cum'è un bersatu probabile per ΔFosB in un'analisi imparziale di microarray di NAc (McClung è Nestler, 2003), ma quest'ultima ùn hà validata più nant'à stu studiu. Prima hà adupratu ChIP quantitative (qChIP — ChIP seguitu da PCR quantitative) per determinà s'Δ FosB si leghe à u promotore di u genu CaMKIIα in NAc di ratti maschili adulti, è hà dettu notevule chì sta ligatura hè significativamente aumentata, da administrazione cronica di cocaina, in a copertina ( p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), ma micca u core, subregione (Fig 3A). Per capisce in più i meccanismi relativi à sta differenza specifica di a subregione in a cunnessione di BFosB a promotore CaMKIIα, abbiamo adupratu qChIP per caratterizà u statu di i modelli di istone in questa regione genomica. Studii precedenti hà dimostratu l'induzione di cocaina di a acetilazione di H3 à u promotore CaMKIIα in u NAc di mouse totaleWang et al., 2010). In cuntrastu, truvamu chì a cocaina diminuisce l'acetilazione di H3 in u promotore CaMKIIα selettivamente in core di NAcFig. 3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), senza cambiamenti apparenti in shell, cunsente cù alterazioni di cromatina specifichi di subregione al di là di a cunnessione di BFosB. qChIP per a marca repressiva, H3 lysine dimethylated 9 (H3K9me2), rivelò tendenze per diminuzioni in a subregioni di shell è di core (Fig. 3C).

Per stabilisce sì BFosB regolà a trascrezzione di CaMKIIα in vivo, usavemu dui linee bitransgenic di mouse chì inducebule sovrapresprimere Δ FosB specificamente in D1 vs. MSN di tipo D2 in un modu cunduttu da l'administrazione di doxiciclina in l'acqua potabile (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002). I mouse di u mastru adultu sovraintestuendu B FosB solu in MSN di tipo D1 avevanu livelli significativamente aumentati di mRNA CaMKIIα in NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), un effetto non visto in topi supra-esprimendo ΔFosB prevalentemente in MSN di tipo D2.Fig. 3D). L'aumento di CaMKIIα mRNA, indotta da l'espressione ΔFosB in DNNUMX-tipo MSNs, era accumpagnatu da un incremento in concomitante di CaMKIIα proteina in entrambi shell NAc (p = 1; t = 0.0030; df = 3.578) e core (p = 14) = 0.0392; df = 2.275; Fichi 3E è F). Quessi dati mostranu chì osFosB hè capace di fà mustrà l'espressione genica di CaMKIIα in MSN di tipo D1 in ambeddi sottopregioni, à puntu di sicuru Figura 3B suggerisce chì i cambiamenti di cromatina mediata da cocaina in u promotore CaMKIIα (per esempio, acililazione ridotta) impediscenu ΔFosB di upregulating CaMKII in a subregione di nucleo dopu a cocaina.

Perchè i nostri dati di mouse transgenici anu indicatu chì l'induzione uctionFosB di l'espressione genica di CaMKII hè specifica per MSN di tipu D1 in NAc, avemu cercatu dopu di determinà se a regolazione di CaMKII dipendente da cocaina richiede l'attivazione di u receptore di dopamina D1. À i topi masci adulti sò stati amministrati cocaina cronica o salina cum'è prima, ma 30 min prima di ogni iniezione, i topi in u gruppu di cocaina anu datu iniezione IP di salina, l'antagonista D1 SCH 23390 (0.5 mg / kg), o l'antagonista di u receptor D2 eticlopride (0.5 mg / kg). L'animali sò stati analizzati 24 ore dopu l'ultima iniezione di cocaina. Western blotting hà rivelatu chì l'antagonista D1, ma micca u D2, hà bluccatu cumpletamente l'aumentu mediatu da cocaina in osFosB (p <0.0001; F = 18.96; df = 18), cum'è riportatu in precedenza (Nye et al., 1995), è dinò in CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Fig. 3G è H). Questi dati supportanu l'ipotesi chì a cocaína aghjusta un aumentazione mediata da BFosB in l'espressione genica di CaMKII specificamente in MSN di tipo D1 di shell NAc. Sarebbe impurtante in i futuri studi à dimostrà direttamente quellu effettu specificu di tippu cellulare di a cocaina in l'espressione di CaMKII in a regione di u cervellu.

Δ FosB hè Necessaria è Suficiente per Induzione à la Cocaina di CaMKII in NAc Shell

Per uttene l'usu di i topi bitransgenichi, dopu studiatu u rolu di ΔFosB in mediazione di l'induzione di cocaina di CaMKIIα cù u trasferimentu di geni mediata viralmente in ratti. Avemu inieghjatu bilateralmente e particule virgine adeno-associate (AAV) in coperture NAc di ratsi maschili aduli (induve u scossu pò esse selettivamente destinatu) per sovraprimere u B FosB più GFP o GFP da solo. A bestia hè stata urdinata di una sola iniezione IP di 10 mg / kg di cocaina. L'animali sovraesprimendu FosB / GFP anu mostratu una risposta locomotoria aumentata paragunatu à l'animali sovraesprimendu GFP da solo (Fig 4A). 24 hr dopu a sola iniezione di cocaína, u tessutu NAc di GFP-positiu era scissu da questi animali da dissezione sottu à una fonte di luce fluorescente. Blotting occidentale di stu tessutu (Fig. 4B è C) rivelatu forte sovraespressione di osFosB oltre à un aumento significativu di tutela di CaMKIIα tutela di GFP (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), simile à l'induzione veduta cù l'administrazione cronica di cocaina. Inoltre, l'autofosforilazione di CaMKIIα a Thr286 (indicativu di l'attivazione enzimatica) hè stata aumentata di (FosB sovraespressione (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28), cume era fosforilazione di u substratu CaMKII, Ser831 di GluA1 (p = 0.0540; t = 2.012; df = 28), imitendu di novu e azzioni di cocaina cronica (Fig. 1C è D). Taken insieme, questi dati forniscenu evidenza ulteriore chì l'espressione ΔFosB in guscio NAc è sufficiente per sensibilizzazione locomotoria a cocaina e per induzione CaMKII e attivazione in questa sottoregione.

Avemu usatu un approcciu simile per determinà sì ΔFosB hè ancu necessariu per l'induzione mediata da cocaina di CaMKIIα in a cunca NAc. AAV hè statu adupratu per sovraesprimere una proteina JunD troncata, chjamata ΔJunD, chì hè un regolatore negativu di l'attivazione trascrizzionale Δ FosB (Winstanley et al., 2007) plus GFP o GFP da solo. Duie settimane dopu, quandu l'espressione di transgene hè massima, l'animali anu datu a cocaina (10 mg / kg) o solu salina tutti i ghjorni per i ghjorni 7, è testati per le risposte locomotorie à una sfida di cocaina (5 mg / kg) 24 hs dopu à l'ultima iniezione cronicaFig. 4D). ΔJurD sovraespressione hà impeditu a sensibilizzazione locomotoria à a cocaina, è hà ancu impeditu l'induzione è l'attivazione di CaMKIIα in coppula NAcFig. 4E è F; p = 0.0437; F = 2.997; df totale = 38), chì indica chì l'attività transcriptional ΔFosB è necessaria per l'induzione mediata da CaMKIIα mediata da cocaina in questa subregione. A curiosità, avemu trovu chì ΔJunD riduce livelli di ΔFosB sotto a limusità salina è cocaine-trattata (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), elevendu a novità di u FosB dipende da l'attività AP-1 per i so propri livelli di espressione.

CaMKII Phosphorylates FosB in Ser27

Praticà in vitro analisi di proteine ​​kinase, anu determinatu chì ΔFosB purificatu hè un substratu robusto per CaMKIIα. Incubazione di i so₆-Δ FosB cun CaMKIIα è ATP hà causatu un cambiamentu ascendente di a mobilità elettroforetica di ΔFosB (Fig 5A); i numerosi bande resultanti anu suggeritu più posti di fosforilazione. Simile in vitro analisi kinasi usando [γ-³²P] ATP hà incurvatu l'incorporazione di u fosfatu radiomarcatu in e bande BFosB spostate (Fig. 5B), dimustrendu a fosforilazione diretta di a proteina. Avemu generatu un anticorpu phospho-specificu à u Ser27 precedentemente caratterizzato di SerFosB (Ulery et al., 2006). Mentre questu anticorpu ùn produce micca un segnale contr'à estratti di cervelli chì cuntenenu NFosB fosforilato Ser27 (dati ùn sò micca mostrati), eri capaci di rilevà a fosforilazione Ser27 in in vitro analisi di kinasi usando CaMKII (Fig. 5B). L'analisi cinetica di a fosforilazione di CaMKII di osFosB indica chì si tratta di un substrato potente per la kinase (Fig. 5C), cù una K apparente_M di 5.7 ± 2.0µM è K_CAT di 2.3 ± 0.3min^-1. Quessi risultati sò paragunabili à parechji ben caratterizzati in vivo substrati di CaMKII (Colbran è Brown, 2004). Inoltre, abbiamo determinatu chì CaMKII phosphorylates FosB cun una stoichiometria di 2.27 ± 0.07 mol / mol (Fig. 5D), chì indica chì ci sò almenu trè siti di fosforilazione CaMKII in i Sò₆-Δ FosB proteina, in concordanza cu Fig 5A.

Per investigà i siti individuali di fosforilazione, avemu usatu analisi MS di e campioni di u nostru in vitro analisi kinasi. Fig 5E mostra una fosforilazione di BFosB a Ser27 precedentemente caratterizzata e in parechji siti addizionali (dati ùn sò micca mostrati). Data a caratterizazione funzionale precedente di Ser27, ci sò stati focalizzati nantu à stu situ generendu peptidi sintetichi etichettati mimendu i stati fosfo- e non fosfosu di Ser27, dopu usatu quantità noti di questi peptidi cum'è standard in analisi MRM di ΔFosB prima e dopo in vitro fosforilazione da CaMKII. Quantitativa successiva (Fig. 5F) cunfirma chì Ser27 hè un substratu putente per CaMKII. Questi risultati indicanu chì, trà parechje residui di fosforilati in osFosB, Ser27 hè un substratu particolarmente efficace per CaMKII.

CaMKII Mediates Accumulation di cocaina di ΔFosB in NAc Shell

Chì CaMKII pò fosforilà B FosB in vitro in un situ chì aumenta drammaticamente a so stabilità in vitro e in vivo (Ulery et al., 2006; Ulery-Reynolds et al., 2009), abbiamo determinatu sì l'attività di CaMKII controlla i livelli di ΔFosB in NAc in vivo. Per mette in palusita sta dumanda, prima usamu una linea di mouse per sovraesprimere un mutante indipendente da calciu di CaMKIIα (T286D) in regioni cerebrali multipli chì includenu NAc (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012). Avemu injectatu maschili adulti maschili mutati è tippi selvatichi adulte cun 20 mg / kg di cocaina o soluzione salina una volta al ghjornu per i ghjorni 14, dopu analizatu i animali un ghjornu dopu à l'iniezione finale. Avemu trovu chì i livelli basali di BFosB sò stati aumentati in l'animali mutanti in a cunca NAc (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), ma micca u core (Fig. 5G è H). Hè sorprendente chì l'induzione induve a cocaia da FosB sia bloccata in l'armi mutanti in a shell è in u core, annunzendu chì, ancu CaMKII pò regulà direttamente a stabilità FosB in coppula NAc, si pò mentà dinò à l'adminu di osFosB in vie di cocaine attivate in ambasciate NAc .

L'attività di CaMKII hè necessaria per a plasticità strutturata è u plasticu di u comportamentu di FosB

L'induzione di cocaina di spine dendritiche nantu à i MSN di NAc hè unu di i più adatti adattamenti indotti da droghe in a regione cerebrale, è tale induzione induve hè stata correlata cù risposte comportamentali sensibilizati à u medicamentu (Robinson è Kolb, 2004; Russo et al., 2010) è ripurtatu esse selettivu per MSN di tipo D1 (Lee et al., 2006). Avemu dimostratu di recente chì l'induzione di cocaina di e spine dendritiche in NAc hè dipendente da osFosB è u so prugramma trascrizzionale in valle (Maze et al., 2010). Benchè ci sia una letteratura approfondita nantu à a participazione di CaMKII in morfologia di e spine dendritiche è induzione in altre regioni di u cervellu è sistemi sperimentali (Jourdain et al., 2003; Penzes et al., 2008; Okamoto et al., 2009), u so rolu in a furmazione di spina di MSN NAc ùn hè micca studiatu. Dunque, avemu determinatu sì l'attività di CaMKII hè necessariu per l'induzione mediata da BFosB di spine dendritiche di MSN aduprendu l'ufre-espressione mediata da HSV di u peptide di inibitore CaMKII AC3I fuso a GFP, un costrutto dimustratu chì inibisce l'attività di CaMKII in vivo (Zhang et al., 2005; Klug et al., 2012). A sovraespressione virale di ΔFosB in cunchiglia NAc di topi adulti induce un aumentu significativu di a densità di spina dendritica MSN (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Fig. 6A è B) cum'è annunziatuMaze et al., 2010), è questu aumentu hè stata primurariamente primu da sottile (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) è di tippi zoppuli (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59) (ambeddi pensati per esse spine immature) (Fig. 6C – E). Un effettu ùn hè statu vistu in i spinali più maturi, in forma di funghi. Tuttavia, quandu GFP-AC3I era coespressu, l'induzione ΔFosB di spine hè stata completamente abbattuta (Fig. 6A – E), indicendu chì l'attività di CaMKII hè necessariu per l'induzione di BFosB di spine dendritiche in cunette NAc.

Dopu adupratu i stessi strumenti virali per determinà s'ellu hè necessariu attività CaMKII per l'effetti FosB su a sensibilità comportamentale à a cocaina. 72 hr dopu iniezione virale in guscio NAc, l'animali anu datu à una sola iniezione di 5 mg / kg di cocaina è a so attività locomotoria hè stata registrata. Cum'è ancu mostratu cù una sovraespressione più ampia di AAV di ΔFosB (Fig 4A), Sovraespressione mediata da HSV di BFosB aumentava a sensibilità locomotoria à a cocaina (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; Fig. 6F). Com'è induzione di e spine dendritiche, l'inibizioni di l'attività di CaMKII da coespressione di GFP-AC3I bloccò completamente l'incrudimentu mediatu da BFosB in a sensibilità di cocaina, indicendu chì l'attività di CaMKII hè necessariu per alterazioni ΔFosB indotte da effetti cunduciali di cocaína.

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Articulu discussione

U presente studiu elabora un novu muvimentu di rinfurzamentu induve a cocaina induce ΔFosB in NAc, chì upregulates a transcrizione di u gene CaMKIIα selettivamente in. CaMKIIα successivamente fosforila è stabilisce BFosB in una maghju cumulazione Δ FosB è in più induce CaMKIIα (induzione CaMKIIα) (Fig. 6G). A cullucazione di i livelli di e duie proteine ​​durante l'esposizione cronica à a cocaina allora contribuisce in modi essenziali à sensibilizà a risposta di u comportamentu à u medicamentu. Questa hè una ipotesi particularmente accattivante cume ΔFosB è CaMKII siavanu dimostratu nanzu chì anteriormente esse richiesti per a risposte comportamentali aumentate à a cocaina (Pierce et al., 1998; Peakman et al., 2003), è replichemu sta scuperta per ΔFosB in shell di NAc specificamente cun una avvicinazione virale (Fichi 4 e And66).

L'espressione transgenica B FosB in MSN di tipo D1 pò fà vede l'induzione di CaMKII sia in coperture NAc è in core di animali naïve-cocaina, in u cuntestu di cocaina, cumulazione di ΔFosB endogene, chì accade in ambeddi sottoregioni, induce l'induzione di CaMKII specificamente in NAc . Questa differenza puderia esse uguale à i livelli alti di B FosB indotta in u nostru mudellu bitransgenic, tuttavia, si pò riflette dinò a capacità di cocaina di alterà di modu differente u promotore CaMKIIα in coperture vs. core MSNs per promuve ΔFosB cunnessione in u primu o esclusu in quest'ultima subregione. Infatti, i nostri dati ChIP, chì rivelanu una deacetilazione mediata da cocaina in l'isoni à u promotore di u genu CaMKIIα solu in nucleo NAc, sustengono u impiegamentu di un meccanulu di cromatina. In linea cu sta ipotesi, xFosB sovraespressione in MSN di tipo D1 hà saputu dà induzione CaMKIIα ind'u core NAC in assenza di cocaina (Fig. 3F), suggerendu chì ci sò cambiamenti attivi di u promotore CaMKIIα chì prevenu questu induzione durante l'esposizione cronica di cocaina. A regulazione di u paisaghju di a cromatina à u promotore CaMKII potrebbe spieghje ancu perchè CaMKII hè indotta da una dose sfida di cocaina in ciuffu NAc di cunuri crjinichi-ritiranti di cocaina (Fig 1E) ma micca di l'animali senza drogheFig. 1D). Questu puderia rappresentà un effettu di "priming gene" epigenetica di ΔFosB (Robison è Nestler, 2011), è pò esse dunque un muvimentu moleculare di l'incubazione di a brama di cocaina (Pickens et al., 2011). Tuttavia, per chì stu cambiamentu di cromatina sia causalmente cunnessu à l'incubazione di a brama, duverà aumentà cù u tempu. Sarà interessante determinà s'ellu hè u casu, è studia sì altri gini mostranu una regulazione specifica di a subregione da FosB-dependente da a cocaina. Hè ancu impurtante fassi dinò chì u loop di avanguardia descrittu ùn purtà micca à un accumulazione senza fine di CaMKII o ΔFosB (Fig 1E); scopra u moltu "frenu" chì hà da quì un scopu impurtante di i futuri studi.

E funzioni cunnoscute di B FosB è CaMKII in parechji sistemi sperimentali è regioni di u cervellu convergu in parechji livelli (Fig. 6F). Entrambe e moleculi sò intimamente legati à a crescita di e spine dendritiche: CaMKII interagisce cù u citoscheletro di l'attina (Okamoto et al., 2009), regula a dimensione testa di u spine (Matsuzaki et al., 2004), è hè necessariu è basse per a mossa indotta da a plasticità in filopodi è in numeru di sinapsi in i culturi organittipichi di a porzione di l'ippocampu (Jourdain et al., 2003), wHile ΔFosB hè necessariu è basta per a furmazione dendritica indotta da a cocaina in NAc MSNs (Maze et al., 2010). Inoltre, entrambe e molecule sò state associate à a regolazione di i recettori di glutammatu AMPA. CaMKII ùn regula micca i livelli cumunali di sottunità di u receptoru AMPA, ma impone l'inserzione di i recettori AMPA in sinapsi è aumenta a conduttanza di u canale AMPA fosforilando GluA1 in Ser831 in neuroni piramidali ippocampali in cultura in vivo (cunsideratu in (Malinow è Malenka, 2002; Colbran è Brown, 2004)) Stu aumentatu trafficu di GluA1 per a sinapsi hè statu implicatu in l'azione cronica di cocaina.Boudreau è Wolf, 2005). Inoltre, i risposti comportamentali à l'attivazione di u receptore AMPA in NAc sò aumentati di CaMKIIα sovraespressione in un modu D1 di un receptor di dopaminaSinger et al., 2010). A sovraespressione specifica di D1 di longhi ghjornu di ΔFosB hè statu dimustratu di induce a transcrizione di GluA2 in NAc (Kelz et al., 1999), chì ammutisce le risposte AMPA mediate per GluA1, mentri chì mustremu quì chì a sovraespressione di osFosB à più breve termine, è ancu l'esposizione à più breve tempu di cocaina, ùn anu micca influenza nantu à sta subunità (Fig 1). Tuttavia, avemu trovu recentemente chì a surintpressione di FosB di breve tempu riduce, tuttavia, le risposte di l'AMPA in MSN di tipo D1 in NAc (Grueter et al., 2013). Questi dati suggeriscenu meccanismi temporaneamente distinti chì ponenu cusì una serie di neuroadaptazioni dipendenti di u tempu à a cocaina chì sò dinò à l'aiutu di i vari aspetti di a progressione di a dipendenza ùn sò ancu cumpresu. À u livellu di u comportamentu, sia CaMKII è ΔFosB sò necessarii per a sensibilizazioni locomotorie à a cocaina (veda sopra), è entrambe sò necessarie per a autocusturazione di cocaina in posti in rodenti (Colby et al., 2003; Wang et al., 2010), per cunsiderà chì e duie proteine ​​sò impurtanti per l'adattazioni comportamentali à tempu breve è parallele à l'esposizione à una droga, ancu cù meccanismi sottostanti in parte distinti. Presumibilmente, ΔFosB è CaMKII regolano tali adattamenti comportamentali cumplessi da cambiamenti in a funzione sinaptica di NAc, ancu se molte ulteriori travaglii sò necessarie per cunnessu direttamente fenomeni sinaptichi à cambiamenti comportamentali.

L'olenzenzia di CaMKII interagisce simultaneamente cun una varietà di proteine ​​associate à sinapse (Robison et al., 2005) chì si pensa chì regulanu a so urgiscenza à a densità postinapticu (PSD), un fenomenu suggeritu per esse impurtante per a plasticità sinaptica. In particulare, l'attualisazione di CaMKII cù a subunità GluN2B di u receptoru glutammatu di tipu NMDA hè stata dimustrata di recente per regularà sia a plasticità sinaptica sia l'apprendimentu (Halt et al., 2012). Mentre u peptide AC3I mimica u duminiu di autoinhibitory di CaMKII, è iniziisce impedisce attività catalitica enzimatica, blocca ancu interazioni proteina-proteina multipla (Strack et al., 2000; Robison et al., 2005). Dunque, l'effetti comportamentali è morfologichi di HSV-GFP-AC3I riportati quì pudianu esse accadutu per a riduttu di fosforilazione di proteine ​​target di CaMKII, cambiamenti in u targeting di CaMKII, o un cambiamentu di u rolu strutturale proposto da CaMKII in sinapsi (Lisman et al., 2002).

A restrizzione di u passà osFosB-CaMKII proposta nantu à a cunca NAc hè di particulare, cum'è un travagliu recente hà dimostratu parechje differenze fisiologiche trà u shell di NAc è u core in risposta à l'administrazione di cocaine, una nozione confirmata da i nostri dati imparati di iTRAQ (Table S1) . L'MSN in ciupercine NAc mostra una depressione in a capacità di fuzu dopu a cocaina cronica chì hè sustene per settimane, mentre MSN di core da i stessi animali affieganu un aumentu transitorio (1 – 3) a crescita di a capacità di fuoco chì torna à i livelli basali in settimane 2 (Kourrich è Thomas, 2009). Inoltre, parechje proteine ​​sinaptiche sò regolate di modu differente in a cunca di NAc vs. core di animali esposti à cocaina cronica, ancu GluA2 (Knackstedt et al., 2010). Cum'è l'anfetamina cronica induce CaMKIIα specificamente in a cunca NAcLoweth et al., 2010), ùn hè micca sorprendente chì truvamu un effettu simile cù a cocaina. Tuttavia, cum'è ΔFosB hè induita in a cunca di NAc è in core da a cocaina cronica (Perrotti et al., 2008), è da mostranu chì l'induzione di CaMKIIα in coperture hè, FosB-dipende, i nostri risultati ghjunghjenu novu evidenze di meccanismi trascrizzionali distinti à u promotore CaMKIIα tra queste duie regioni, chì sò responsabili per l'induzione selettiva di CaMKIIα in coperture.

Un grande travagliu di travaglii recenti si hè concentratu nantu à delineare differenze trà MSN di NAc di D1- è D2. Benchè sia i recettori D1 sia D2 sò implicati in l'effetti gratificanti di a cocaina (Sì, 2010), un travagliu recente dimostra chì l'attivazione optogenetica di MSN di tipo D1 aumenta risposte di comportamentu à a cocaina, mentre l'attivazione di DNNUMX-tipo MSN ha l'effettu contrariu (Lobo et al., 2010). Cume cun questu ritrovu, dure di u receptoru D1 è scpattu in a vittura di l'auto-amministrazione di cocaina (Caine et al., 2007), mentri chì D2 knockouts ùn sò micca (Caine et al., 2002). A amministrazione di agunisimu D1 direttamente in NAc scatena cumportendu a ricerca di cocaine in i paradigmi di ristabilimentu (Sì, 2010). A curiosità, st'effettu richiede D1-recettori-dependenti incremento di attività CaMKII in a cunca NAc, ma micca core ()Anderson et al., 2008), un risultatu chì integra benessu cù u passà N FosB-CaMKII di D1- è cuncevule specificu quì.

Avemu riferitu in precedenza chì Ser27 in Δ FosB pò esse fosforilatu da a caseina kinase-2 (Ulery et al., 2006), cusì, stabilemu quì CaMKII phosphorylates Δ FosB in questu è in altri siti cun cinetica è stoechiometria assai maggiore è pò replica a M maggiore apparente._r observatu per FosB (Fig 5A) cù esposizione à cocaina in vivo (Nestler, 2008). Sappemu già chì SerhNUMX fosforilazione aumenta a stabilità B FosB è l'attività transcriptional (Ulery et al., 2006; Ulery è Nestler, 2007; Ulery-Reynolds et al., 2009). I lavori futuri prufittenu oghji nantu à l'identificazione è e conseguenze funziunali di i siti novi di a fosforilazione di osFosB, indicati da u presentu studio.

U loop di avanzu-citazioni descrittu quì fornisce un novu meccanismo plausibile da chì l'admisioni ripetute di cocaina guidanu anomalie progressive in u CNA. Hè cusì, questu parcorsu biochimicu pò fornisce un obiettivu impurtante per l'interventu terapeuticu futuru in disordini di dipendenza. Perchè CaMKII hè omniprudente è necessariu per molte funzioni neuronali è comportamentali basali, l'usu direttu di inibitori CaMKII hè statu evitu perchè hè un trattamento di dipendenza. I nostri dati suggeriscenu chì l'azzioni più sottili di u meccanismu di l'induzione di CaMKII, chì hè specifia di un tippu individuale di cellula è di una subregione di i circuitu di ricompense di u cervellu, puderia dà un destinu terapeuticu chì evita i complicazioni di l'inibizioni sistemica di CaMKII.

Andà à:

Acknowledgements

Questu travagliu hà avale a suprana per l'invenzione di l'Istitutu Naziunale di l'abuso di droghe (EJN), di u Proteomics Center NIDA-Yale DA018343 (AJR è EJN) è di Hartwell Foundation (AJR). L'autori vogliono ringraziare Gabby Rundenko per u generosu donu di u FosB purificatu è Roger Colbran per u generosu donu di CaMKIIα purificatu.

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Vede ancu

1. Ahmed SH, Koob GF. Transizione da u moderatu à u troppu ingestu di droghe: cambia in un puntu di hedonicu. Scienza. 1998; 282: 298 – 300. [PubMed]
2. Anderson SM, Famous KR, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Bass CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: un ponte biochimicu chì unisce i sistemi accumbens di dopamina è glutammatu in cerca di cocaina. Nat Neurosci. 2008; 11: 344 – 353. [PubMed]
3. Boudreau AC, Wolf ME. A sensibilisazione comportamentale à a cocaina hè associata à l'aumentata espressione superficiale di i recettori AMPA in u nucleo accumbens. J Neurosci. 2005; 25: 9144 – 9151. [PubMed]
4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. Espressione è caratterizzazione di a subunità alfa di Ca2 + / calmodulinu-dependente da proteine ​​kinase II cù u sistema di espressione baculovirus. Biochem Biophys Res Commun. 1990; 173: 578 – 584. [PubMed]
5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. U funzioni di i recettori simuli di dopamina D2 in a autocuduzione di cocaina: studii cun toccituli mutanti per recettori D2 è novu D2 receptor antagonisti. J Neurosci. 2002; 22: 2977 – 2988. [PubMed]
6. Caine SB, Thomsen M, Gabriel KI, Berkowitz JS, Gold LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Mancunu di autocunzioni di cocaina in dattighjuli spp. J Neurosci. 1; 2007: 27 – 13140. [Articulu di u PMC] [PubMed]
7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. Meccanismi dipendenti e indipendenti di proteasomi per a destabilisazione di FosB: identificazione di domini di degradu FosB è implicazioni per a stabilità DeltaFosB. Eur J Neurosci. 2007; 25: 3009 – 3019. [PubMed]
8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Animali transgenici cù espressione genica inducible, puntata in u cervellu. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495 – 503. [PubMed]
9. Christoffel DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Russo SJ. A kinase IkappaB regula a scunfitta sociale da plasticità sinaptica è comportamentale indotta da u stress. J Neurosci. 2011; 31: 314 – 321. [Articulu di u PMC] [PubMed]
10. Colbran RJ. Inattivazione di Ca2 + / calmodulinu-dependente proteina kinase II da autofosforforazione basale. J Biol Chem. 1993; 268: 7163 – 7170. [PubMed]
11. Colbran RJ. Prutetta fosfatasi è calciu / calmodulinu-dipendente proteine ​​kinase II da plasticità sinaptica à fassi. J Neurosci. 2004; 24: 8404 – 8409. [PubMed]
12. Colbran RJ, Brown AM. Prutina kinase II calciu / calmodulinu-dipendente è plasticità sinaptica. Curr Opin Neurobiol. 2004; 14: 318 – 327. [PubMed]
13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. A sovraespressione specifica di u DeltaFosB di u tippu striatale di a cellula aumenta l'incitamentu per a cocaina. J Neurosci. 2003; 23: 2488 – 2493. [PubMed]
14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler EJ. Azzioni antidepressive di inibitori di histone deacetylase. J Neurosci. 2009; 29: 11451 – 11460. [Articulu di u PMC] [PubMed]
15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhshan B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC. Proteomica quantitativa di proteine ​​regolamentate da caveolin-1: caratterizzazione di polimerasi i è di u fattore di liberazione di trascrizzione / CAVIN-1 IN. Mol Cell Proteomics. 2010; 9: 2109 – 2124. [Articulu di u PMC] [PubMed]
16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Fattori di risicu per a fine di suicidiu in depressione maghjiale: un studiu caso-cuntrollu di comportamenti impulsivi è aggressivi in l'omi. Am J Psychiatry. 2005; 162: 2116 – 2124. [PubMed]
17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. B FosB modula in manera differenziale a funzione di via di dirittu è indirettu di u nucleo accumbens. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 in stampa. [Articulu di u PMC] [PubMed]
18. Stop, AR, Dallapiazza RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojcik S, Brose N, Silva AJ, Infernu JW. A cunnessione di CaMKII à GluN2B hè critica in consolidazione di memoria. EMBO J. 2012; 31: 1203 – 1216. [Articulu di u PMC] [PubMed]
19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. Topi mutanti FosB: perdita di induzione cronica di cocaina di proteine ​​relative à Fos è sensibilità aumentata à l'effetti psicomotori è gratificanti di a cocaina. Proc Natl Acad Sci US A. 1997; 94: 10397-10402. [Articulu di u PMC] [PubMed]
20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. U cuntrollu differenziale di a cumpagnia chì cerca a cocaina da u nucleo accumbens nucleo è conchiglia. Nat Neurosci. 2004; 7: 389 – 397. [PubMed]
21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Dimerizzazione è proprietà di legame di DNA di u fattore di trascrezioni DeltaFosB. Biochimica. 2007; 46: 8360 – 8372. [PubMed]
22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. Prutina kinase II calciu / calmodulina-dipendente contribuisce à a crescita di filopodi attività-dipende è a formazione di spina. J Neurosci. 2003; 23: 10645 – 10649. [PubMed]
23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, DJ Surmeier, Neve RL, Duman RS, Picatotto Nestler EJ. L'espressione di u fattore di trascrezioni deltaFosB in u cervellu cuntrulla a sensibilità à a cocaina. Natura. 1999; 401: 272 – 276. [PubMed]
24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. L'inibizione Genetica di CaMKII in Neuroni Strinidi Dorsali Medii Spini Riduce Le Sinapsi Excitatorie Funzionali e Migliora L'eccitabilità Intrinseca. PLoS One. 2012; 7: e45323. [Articulu di u PMC] [PubMed]
25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. L'addestramentu di l'extincione dopu a autocunuzione di a cocaina induce a plasticità glutamatergica à inibisce a ricerca di cocaina. J Neurosci. 2010; 30: 7984 – 7992. [Articulu di u PMC] [PubMed]
26. Kourrich S, Thomas MJ. Neuroni simili, adattamenti opposti: l'esperienza psicostimillante cambia di modu differente pruietà di cucculazione in core accumbens versus shell. J Neurosci. 2009; 29: 12275 – 12283. [Articulu di u PMC] [PubMed]
27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. AMPAR-Independent Effect of Striatal alphaCaMKII Promuva a Sensibilizazione di Cocaine Reward. J Neurosci. 2012; 32: 6578 – 6586. [Articulu di u PMC] [PubMed]
28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, SG Birnbaum, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ . U rolu di u fattore nucleare kappaB in l'ipersensibilità à u sforzu mediata hormone ovaranu in topi femminili. Biol Psychiatry. 2009; 65: 874 – 880. [Articulu di u PMC] [PubMed]
29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Formazione dendritica indotta da cocaina in D1 è D2 neurone impurtanti ricevitore dopamina cunnisciuta in u nucleo accumbens. Proc Natl Acad Sci US A. 2006; 103: 3399 – 3404. [Articulu di u PMC] [PubMed]
30. Lisman J, Schulman H, Cline H. A basa moleculare di CaMKII funziona in a memoria sinaptica è comportamentale. Nat Rev Neurosci. 2002; 3: 175 – 190. [PubMed]
31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, DM di Dietz, Zaman S, Koo JW, PJ Kennedy, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. A perdita specifica cella di u BDNF di a segnalazione di BDNF mima u cuntrollu optogeneticu di a ricompensa di cocaina. Scienza. 2010; 330: 385 – 390. [Articulu di u PMC] [PubMed]
32. JA Loweth, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. Neurosci Lett. 2008; 444: 157 – 160. [Articulu di u PMC] [PubMed]
33. JA Loweth, Cantante BF, Baker LK, Wilke G, Inamina H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. L'espressione transessuale di a proteina kinase II alfa-Ca2 + / calmodulina-dipendente in a nucleo accumbens aumenta rispondendu comportamentale à l'anfetamina. J Neurosci. 2010; 30: 939 – 949. [Articulu di u PMC] [PubMed]
34. Malinow R, Malenka RC. Traficore di recettori AMPA è plasticità sinaptica. Annu Rev Neurosci. 2002; 25: 103 – 126. [PubMed]
35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Basi strutturali di u potenzamentu a longu andà in spine dendritiche singuli. Natura. 2004; 429: 761 – 766. [PubMed]
36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. Cuntrollu di a furmazione di a memoria per mezu di l'espressione regolata di un transgene CaMKII. Scienza. 1996; 274: 1678 – 1683. [PubMed]
37. Maze I, Covington HE, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Meccanicu M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ. U rolu di primu essenziale di l'istone metiltransferasi G9a in plasticità indotta da cocaina. Scienza. 2010; 327: 213 – 216. [Articulu di u PMC] [PubMed]
38. McClung CA, Nestler EJ. A rregulazione di l'espressione genica è a ricumpensa di cocaina da CREB è DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208 – 1215. [PubMed]
39. Nestler EJ. Revisione. Meccanismi di transcrizzione di a dipendenza: u rolu di DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245 – 3255. [Articulu di u PMC] [PubMed]
40. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Studii farmacologici di a regolazione di l'induzione di l'antigeni cunnessa FOS cronica da a cocaina in u striatum è u nucleo accumbens. J Pharmacol Exp Ther. 1995; 275: 1671 – 1680. [PubMed]
41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. I ruoli di CaMKII è F-actin in a plasticità strutturale di e spine dendritiche: un'identità molecolare potenziale di un tagu sinapticu? Fisiologia (Bethesda) 2009; 24: 357 – 366. [PubMed]
42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB in u nucleo accumbens regula u comportamentu strumentale rinfurzatu da l'alimentu è a motivazione. J Neurosci. 2006; 26: 9196 – 9204. [PubMed]
43. Paxinos G, Watson C. U cervu di rats in coordinate stereotassici. 6th Edition. Amsterdam; Boston: Academic Press / Elsevier; 2007.
44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Inducible, espressione regiunale cerebrale specificu di un mutante negativu dominante di c-Jun in topi transgenici diminuisce a sensibilità à a cocaina. Brain Res. 2003; 970: 73 – 86. [PubMed]
45. Penzes P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. I segnali convergenti di CaMK è RacGEF controllanu a struttura è a funzione dendritica. Tendenze Cell Biol. 2008; 18: 405 – 413. [PubMed]
46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. Induzione di deltaFosB in e strutture cerebrali ricumpensate dopu u stress cronicu. J Neurosci. 2004; 24: 10594 – 10602. [PubMed]
47. Perrotti LI, RR Weaver, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, DJ Knapp, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Modelli distinti di induzione DeltaFosB in u cervellu da e droghe di abusu. Sinapse. 2008; 62: 358 – 369. [Articulu di u PMC] [PubMed]
48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hope BT, Shaham Y. Neurobiologia di l'incubazione di a brama di droghe. Trends Neurosci. 2011; 34: 411 – 420. [Articulu di u PMC] [PubMed]
49. Pierce RC, Quick EA, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. I secondi messaggeri mediati da calciu modulanu l'espressione di a sensibilizzazione comportamentale à a cocaina. J Pharmacol Exp Ther. 1998; 286: 1171 – 1176. [PubMed]
50. Quirion R, Robitaille Y, J Martial, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Autoradiografia di i recettori di u cervellu umanu chì utilizza parti di emisferi interi: un metudu generale chì minimizeghja l'artefatti tisuli. Sinapse. 1987; 1: 446 – 454. [PubMed]
51. Robinson TE, Kolb B. Plasticità strutturale associata à l'esposizione à droghe di abusu. Neurofarmacologia. 2004; 47 (Suppl 1): 33 – 46. [PubMed]
52. Robison AJ, Nestler EJ. Meccanismi transcriptionali è epigenetichi di a dipendenza. Nat Rev Neurosci. 2011; 12: 623 – 637. [Articulu di u PMC] [PubMed]
53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Interazioni multivalenti di proteine ​​chinasi II calciu / calmodulinu-dipendente cù e proteine ​​densità post-sinaptica NR2B, densin-180, è alfa-actinina-2. J Biol Chem. 2005; 280: 35329 – 35336. [PubMed]
54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ. Quantitativa proteica multiplexata in Saccharomyces cerevisiae cù i reagenti isobarici amobar-reattivi. Mol Cell Proteomics. 2004; 3: 1154 – 1169. [PubMed]
55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. A sinapse addicted: meccanismi di plasticità sinaptica è strutturale in nucleo accumbens. Trends Neurosci. 2010; 33: 267 – 276. [Articulu di u PMC] [PubMed]
56. Self DW. In: I Recettors Dopamina. Neve KA, editor. New York: Humana Press; 2010. pp. 479 – 524.
57. Singer BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. A sovraespressione transitorio virale-mediata di proteine ​​kinase II alfa-calciu / calmodulina-dipendente in u nucli accumbens nucleo porta a lunga regulazione funzionale di lunga durata di alfa-amino-3-hydroxyl-5 -methyl-4-isoxazole-propionate receptors: dopase di tipo dopamina-receptoru 1 è dipendenza di proteine ​​kinase A. Eur J Neurosci. 2010; 31: 1243 – 1251. [Articulu di u PMC] [PubMed]
58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. Meccanismo è regulazione di a proteina kinase II calcitale-dependente da u destinatu à a subunità NR2B di u receptoru N-metil-D-aspartate. J Biol Chem. 2000; 275: 23798 – 23806. [PubMed]
59. Ulery-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. A fosforilazione di DeltaFosB mediate a so stabilità in vivo. Neuroscience. 2009; 158: 369 – 372. [Articulu di u PMC] [PubMed]
60. Ulery PG, Nestler EJ. Regulamentu di l'attività transcriptional di DeltaFosB da a fosforilazione di Ser27. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224 – 230. [PubMed]
61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. A regolazione di a stabilità DeltaFosB di fosforilazione. J Neurosci. 2006; 26: 5131 – 5142. [PubMed]
62. Vialou V, et al. DeltaFosB in i circuiti di ricompensazione cerebrale media a resistenza à u rispettu di u stress è antidepressive. Nat Neurosci. 2010; 13: 745 – 752. [Articulu di u PMC] [PubMed]
63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. L'acetilazione H3 indotta da a cocaina è l'attivazione trascrizzionale di CaMKIIalpha in u nucleo accumbens hè critica per a motivazione di u rinfurzamentu di droghe. Neuropsychopharmacology. 2010; 35: 913 – 928. [Articulu di u PMC] [PubMed]
64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB regoleghja a corsa di a vola. J Neurosci. 2002; 22: 8133 – 8138. [PubMed]
65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Self DW, Nestler EJ. L'induzione DeltaFosB in a corticala orbitofrontale mediate a tolleranza à a disfunzione cognitiva indotta da cocaina. J Neurosci. 2007; 27: 10497 – 10507. [PubMed]
66. Zachariou V, CA Bolanos, Selley DE, Theobald D, MP Cassidy, Kelz MB, T Shaw-Lutchman, Berton O, LJ Sim-Selley, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Un rolu essenziale per DeltaFosB in u nucleo accumbens in l'azione di morfina. Nat Neurosci. 2006; 9: 205 – 211. [PubMed]
67. Zhang R, MS Khoo, Wu Y, Yang Y, CE Grueter, Ni G, Prezzo EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Canzone LS, Madu EC, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurevich VV, Salama G, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. L'inibizione di Calmodulin kinase II pruteghja da una malattia cardiaca strutturale. Nat Med. 2005; 11: 409 – 417. [PubMed]