Proc Natl Acad Sci US A 2005 Februaru 1; 102(5): 1737-1742.
astrattu
A cocaina, una droga di abusu, aumenta i livelli di dopamina sinaptica in u striatum bluccà a ricaptazione di dopamina à i terminali assoni. A chinasi dipendente da ciclina 5 (Cdk5) è u so attivatore p35, proteine implicate in a fosforilazione di i sustrati in i neuroni postmitotici, sò stati trovati regulati dopu l'esposizione cronica à a cocaina. Per esaminà ulteriormente l'effetti di l'induzione di Cdk5 è p35 nantu à a signalazione di dopamina striatale, avemu generatu duie linee di mouse transgeniche indipendenti in quale Cdk5 o p35 era sopraespressa specificamente in neuroni. Riportemu quì chì l'aumentu di l'attività di Cdk5, per via di p35 ma micca di sopraespressione Cdk5, porta à l'attenuazione di a signalazione di dopamina mediata da cocaina. L'aumentu di a fosforilazione mediata da Cdk5 di dopamina è fosfoproteina regulata da cAMP, massa moleculare 32 kDa (DARPP-32) à Thr-75, hè stata accumpagnata da una fosforilazione diminuita di DARPP-32 à Thr-34. L'aumentu di a fosforilazione mediata da Cdk5 di a kinase kinase 1 regulata da u signale extracellulare à Thr-286 hè stata accumpagnata da una diminuzione di l'attivazione di a kinase regulata da u segnu extracellulare 1/2. Questi effetti anu cuntribuitu à l'attenuazione di a fosforilazione indotta da cocaina di a proteina di legame di l'elementu di risposta cAMP, è ancu à una induzione minore di c-fos in u striatum. Questi risultati sustenenu l'idea chì l'attività di Cdk5 hè implicata in l'espressione genica alterata dopu l'esposizione cronica à a cocaina è dunque impacta i cambiamenti duraturi in a funzione neuronale sottostante a dipendenza da cocaina.
A cocaina aumenta i livelli di dopamina sinaptica in u striatum è altera l'espressione genica in i neuroni dopaminocettivi attivendu e vie intracellulari chì propaganu u signale iniziale da u receptore di dopamina D1 à u nucleu (1). L'esposizione cronica à a cocaina regula in più parechji fatturi di trascrizzione, chì risultanu in i cambiamenti di longa durata in l'espressione genica chì si pensanu à l'adattamenti neuronali in a dipendenza da cocaina (2). ΔFosB, identificatu cum'è un tali fattore di trascrizione (3), hè statu dimustratu per rinfurzà a risposta cumportamentale di l'animali à a cocaina (4, 5). Per quessa, l'identificazione di i geni di destinazione chì sò regulati da l'induzione di ΔFosB hè prevista di cuntribuisce à una capiscitura più grande di u meccanismo moleculare sottostante a dipendenza da cocaina. Recentemente, u trattamentu cronicu di l'animali cù a cocaina hè statu dimustratu per regulà l'espressione di a kinase 5 dipendente da ciclina (Cdk5) è u so attivatore p35 in u striatum attraversu l'induzione di ΔFosB (6, 7).
Cdk5 hè un membru di a famiglia Cdk di serine / treonine kinases. A cuntrariu di l'altri Cdks chì sò regulatori principali di a progressione di u ciculu cellulare, Cdk5 hè principalmente implicatu in a fosforilazione di i sustrati in i neuroni postmitotici. (8). A specificità neuronale di l'attività Cdk5 hè ottenuta per via di l'associu cù i so attivatori, p35 o p39, chì sò principarmenti espressi in neuroni postmitotichi.8). In più di u rolu essenziale di Cdk5 in u sviluppu di u cervellu (9, 10), it hè statu ancu implicatu in a trasmissione dopaminergica in u cervellu postnatale (11, 12). L'inibizione di l'attività di Cdk5 risulta in una liberazione di dopamina aumentata in u striatum, chì indica una funzione presinaptica di Cdk5 cum'è regulatore negativu di liberazione di dopamina. (11). Inoltre, Cdk5 modula l'efficacità di a segnalazione di dopamina postsinaptica fosforilando a fosfoproteina regulata da dopamina è cAMP, massa molecolare 32 kDa (DARPP-32) à Thr-75, chì converte DARPP-32 in un inibitore di chinasi dipendente da cAMP (PKA) (12).
Queste osservazioni suggerenu chì Cdk5 è p35 sò regulatori downstream di l'attivazione prolungata di a signalazione di dopamina dopu l'esposizione cronica à a cocaina è dunque in a dipendenza da cocaina. Per indirizzà ulteriormente u rolu di Cdk5 nantu à a signalazione di dopamina striatale, avemu generatu duie linee di mouse transgeniche in quale Cdk5 o p35 hè stata sopraespressa specificamente in neuroni sottu u cuntrollu di u promotore p35. I nostri risultati indicanu chì l'attività di Cdk5 hè stata regulata cù livelli aumentati di proteina p35 ma micca di proteina Cdk5, chì suggerenu chì u livellu di proteina p35 hè limitante per l'attività Cdk5. Avemu furnitu quì in vivo evidenza chì l'aumentu di l'attività di Cdk5, per via di a sovraespressione di p35, porta à l'attenuazione di a signalazione di dopamina mediata da cocaina à u nucleu per via di una inibizione di a PKA è di e cascate di kinasi regulate da u signale extracellulare (ERK).
Materiale è Metodi
Anticorpi. L'anticorpi policlonali à Cdk5 (C-8) è p35 (C-19) sò stati acquistati da Santa Cruz Biotechnology. L'anticorpi dipendenti da fosforilazione è indipindenti à ERK kinase (MEK) 1/2, ERK1/2, è cAMP-response element-binding protein (CREB) sò stati ottenuti da Cell Signaling Technology (Beverly, MA). L'anticorpi di fosfo-Thr-34 DARPP 32 (13), fosfo-Thr-75 DARPP-32 (12), totale DARPP-32 (12), è c-fos (14) sò stati usati cum'è descrittu. Un anticorpu à l'actina hè statu acquistatu da Sigma.
Animali sperimentali. Prima avemu clonatu u genu p35 di u mouse Cdk5r1, chì codifica a proteina p35, è hà carattarizatu a so struttura genomica (15). Per generà u mouse transgenicu cù l'overespressione neuronale di p35 (Tgp35), u 6-kb EcoRI-EcoU frammentu RI chì cuntene a regione di promotore di 1.2 kb hè statu subclonatu in un plasmide pGEM9Z(-), è un tag 45-bp derivatu da SV40 hè statu inseritu in u KpnI situ in aval di u poli (A+) signale (Fig. 1A). L'etichetta cuntene a SpeI situ per genotipu di l'animali. U frammentu di 6 kb hè statu escisatu da u plasmide è purificatu, seguitu da l'iniezione pronucleare di u transgene per generà i topi transgenici. Per esaminà u prufilu d'espressione di u transgene sottu u cuntrollu regulatori di u promotore p1.2 35-kb in vivo, un mouse transgenicu doppiu (Tgp35; p35–/–) hè statu generatu in più utilizendu una strategia di ripruduzzione in dui passi da quale u mouse Tgp35 hè stata rigenerata in un fondo p35-null endogenu. L'altri mudelli di mouse utilizati in stu studiu includenu p35+/–, p35–/–, Cdk5+/–, è un mouse transgenicu cù sovraespressione neuronale di Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). I genotipi di questi topi sò stati determinati da l'analisi di Southern blot o PCR nantu à DNA genomicu isolatu da e biopsie di coda. I topi sò stati allughjati sottu un ciculu di 12 ore di luce / 12 ore di bughju. Tutta l'assistenza hè stata data in cunfurmità cù e linee di l'Istituti Naziunali di Salute nantu à a cura è l'usu di l'animali di laboratori è sperimentali.
Analisi Southern Blot. L'ADN genomicu estratto da biopsie di coda hè statu digeritu cù EcoRI è SpeI, elettroforesi nantu à un gel di agarose 0.9%, è trasferitu nantu à una membrana di nylon. A membrana hè stata hibridizata cù un primu aleatoriu 32Sonda marcata P a 42 ° C durante a notte. La sonda 485-bp per genotipizzazione di topi p35 knockout (p35–/–) e Tgp35 è stata generata da PCR usando i seguenti primers: 5′-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3′ e 5′-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3′. A membrana hibrida hè stata lavata duie volte in 2 × SSC / 0.1% SDS à 42 ° C per 10 min, è duie volte in 0.1 × SSC / 0.1% SDS à 65 ° C per 20 min, è esposta à film di raghji x.
Trattamentu di droga. A cocaina (Sigma) hè stata dissolta in saline sterile. L'animali sò stati injected ip-injected with cocaine (15 mg / kg) o un voluminu uguale di salina à l'età di 3 mesi è uccisi da decapitazione in diversi punti di tempu (15, 30, 60, è 120 min) dopu l'iniezione. I cervelli sò stati rapidamente eliminati è rinfriscati in PBS ghiacciatu. I striata sò stati poi disseccati è sottumessi à l'analisi di u Nordu o Western blot. Per l'analisi immunoistochimica, e sezioni striatali sò stati ottenuti da i topi 2 h dopu l'iniezione.
Analisi Northern Blot. L'RNA tutale hè stata estratta da a striata cù reagenti TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) è sottumessu à l'analisi Northern blot cum'è descrittu (18). Per a rilevazione di c-fos mRNA, un fragmentu di 189 bp di c-fos cDNA di u mouse hè stata utilizata cum'è sonda cum'è descritta (19). I livelli di c-fos mRNA sò stati quantificati per mezu di a densità ottica di a banda specifica utilizendu un sistema di analisi di l'imaghjini cù u software di imaghjini nih, Versione 1.62.
Analisi Western Blot. I tessuti striatali sò stati sonicati in 1% SDS è bolliti per 10 min. A cuncentrazione di prutezione in ogni mostra hè stata determinata da l'analisi di a proteina BCA (Pierce). Quantità uguali di prutezione sò stati separati da SDS / PAGE prima di esse trasferitu nantu à una membrana di nitrocellulose. I membrani sò stati bluccati in 1 × PBS chì cuntenenu 5% di latte scrematu è 0.05% Tween 20 è incubati cù anticorpi primari durante a notte à 4 ° C. L'incubazione cù IgG anti-mouse o rabbit (Sigma) cunjugata à peroxidase hè stata realizata à a temperatura di l'ambienti per 60 min. Un signalu hè statu rilevatu da a chimiluminescenza rinfurzata (Pierce), è e densità ottiche di e bande sò state quantificate cum'è descrittu sopra.
Assai Cdk5 Kinase. I lisati striatali sono stati preparati con un tampone di lisi costituito da 50 mM Tris·HCl, pH 7.4/50 mM NaCl/5 mM EDTA/1% Triton X-100/1mMDTT/1 mM fenilmetilsulfonil fluoruro/1 μg/ml aprotinina/1 μg ml di inibitori di leupeptina/fosfatasi (miscela di inhibitori di fosfatasi I è II, Sigma). I lisati sò stati immunoprecipitati cù anticorpi anti-Cdk5 (C-8) o anti-p35 (C-19). L'immunoprecipitati Cdk5 sò stati preparati per incubazione di 300 μl di lisatu (corrispondente à 300 μg di proteina) cù l'anticorpu anti-Cdk5 (3 μg) durante a notte à 4 ° C seguita da una incubazione ulteriore cù 25 μl di perle di Protein A-agarose (50). % slurry in u buffer di lisi; Santa Cruz Biotechnology) per 3 h à 4 ° C. Per a preparazione di immunoprecipitates p35, 500 μl di u lisatu (currispondente à 1 mg di proteina) hè stata incubata cù l'anticorpu anti-p35 (3 μg) cum'è descrittu sopra. L'immunoprecipitati sò stati lavati duie volte cù u tampone di lisi è duie volte cù un tampone kinase cunstituitu da 50 mM Tris·HCl, pH 7.4/5 mM MgCl2/1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, resuspende in 60 μl di u buffer kinase. L'attività chinasi hè stata misurata usendu l'istone H1 cum'è sustrato (18).
Immunohistochemistry. I topi sò stati anestetizzati da iniezioni ip di avertin (250 mg / kg, Fluka) è perfusi transcardialmente cun tampone di fosfatu di sodiu 0.1 M, pH 7.4, seguitu da Streck Tissue Fixative (Streck Laboratories, La Vista, NE), un fixative non-crosslinking. I cervelli dissecati sò stati ulteriormente fissati in u stessu fissativu durante a notte à 37 ° C. Allora, i cervelli sò stati incrustati in paraffina, tagliati in sezioni coronali di 5 μm di spessore è sottumessi à immunoistochimica cù a tecnica di cumplessu avidin-biotin-peroxidase (Vector Laboratories) cù diaminobenzidine cum'è sustrato. I sezzioni sò stati incubati cù un anticorpu policlonali purificatu per affinità contr'à c-fos durante a notte à 4 ° C. A specificità di tintura hè stata valutata per omissione di l'anticorpu primariu.
Risposte alla lingua
Generazione di topi transgenici cù sovraespressione neuronale di p35. U transgenu utilizatu per ottene l'espressione neuronale aumentata di p35 comprendeva u frammentu di 6 kb di u gene p35 di u mouse clonatu chì cuntene u promotore di 1.2 kb è tutta a sequenza codificante di p35 (Fig. 1 A). I genotipi di topi sò stati determinati da l'analisi Southern blot usendu una sonda chì hè stata cuncepita per distingue i topi p35–/– è Tgp35 da i topi di tipu salvaticu (Fig. 1 A e B). Per esaminà l'espressione transgene sottu u cuntrollu di u promotore p1.2 35-kb, avemu generatu topi transgenici doppiu (Tgp35; p35–/–) in quale l'espressione p35 hè stata guidata solu da u transgene. L'espressione p35 in i topi Tgp35; p35–/– hè stata osservata solu in u cervellu (Fig. 1C), induve u mudellu di espressione spaziale era simile à quellu di i topi di tipu salvaticu (Fig. 1D). A mancanza di p35 hè stata dimustrata per risultatu in una struttura di stratificazione anormale in a corteccia cerebrale è l'ippocampu di i topi (10). Tuttavia, i topi Tgp35; p35–/– anu dimustratu una salvezza cumpleta di u fenotipu cerebrale p35–/– (Fig. 1E). Questi dati indicanu chì u promotore p1.2 35-kb cuntrullava l'espressione di u transgene cù un prufilu d'espressione simili à quellu di p35 da u gene p35 endogenu.
U Livellu di Proteina p35 Limita a Tariffa per u Regulamentu Up di l'Attività Cdk5. Avemu esaminatu l'effetti di dosa genetica di i geni chì codificanu p35 è Cdk5 nantu à l'espressione di proteine in estratti striatali da p35–/–, p35 +/–, wild-type, Tgp35, Cdk5 +/–, è TgCdk5 topi à l'età di 3 mesi. I livelli di proteina p35 è Cdk5 correlavanu bè cù i dosages di geni, rispettivamente (Fig. 2 A e B). I topi Tgp35 anu dimustratu un aumentu di ≈1.6 volte in u nivellu di proteina p35 cumparatu cù i topi di tipu salvaticu, mentre chì i livelli di proteina Cdk5 ùn eranu micca affettati da i diversi livelli di proteina p35. I topi TgCdk5 anu dimustratu un aumentu di ≈1.9 volte in u livellu di proteina Cdk5 cumparatu cù i topi di tipu salvaticu, mentre chì i livelli di proteina p35 ùn sò micca affettati da i diversi livelli di proteina Cdk5. Per esaminà l'effetti di diverse quantità di proteina p35 nantu à l'attività Cdk5, Cdk5 hè stata immunoprecipitata da estratti striatali cù l'anticorpu anti-Cdk5 è l'attività kinase hè stata misurata. In listessu modu, per esaminà l'effetti di diverse quantità di proteina Cdk5 nantu à l'attività kinase, p35 hè stata immunoprecipitata da estratti striatali cù l'anticorpu anti-p35, è l'attività kinase hè stata misurata. L'attività Cdk5 hè correlata bè cù u livellu di a proteina p35 ma micca cù u livellu di a proteina Cdk5 (Fig. 2 C e D). Questi risultati indicanu chì a quantità di proteina p35 hè un fattore limitante di freccia per l'attività Cdk5. Avemu dunque usatu topi Tgp35 per investigà l'effetti di l'attività aumentata di Cdk5 nantu à a signalazione di dopamina striatale.
A fosforilazione indotta da cocaina di DARPP-32 à Thr-34 hè attenuata in i topi Tgp35. A funzione di DARPP-32 dipende da u so statu di fosforilazione in parechji siti (20). PKA fosforila DARPP-32 a Thr-34, mentre Cdk5 fosforila DARPP-32 a Thr-75. Cusì, avemu esaminatu u statu di fosforilazione di DARPP-32 in estratti striatali da i topi di tipu salvaticu è Tgp35. U livellu di fosfo-Thr-75 DARPP-32 era più altu in i topi Tgp35 (Fig. 3A; 1.6 ± 0.2 volte sopra u valore di i topi di tipu salvaticu). Dopu avemu valutatu l'effetti di l'attività aumentata di Cdk5 nantu à a signalazione di dopamina striata. Avemu esaminatu l'attivazione di PKA indotta da cocaina in topi Tgp35 analizendu u statu di fosforilazione di DARPP-32 à Thr-34. U livellu di fosfo-Thr-34 DARPP-32 hè statu aumentatu in i topi di tipu salvaticu 15 minuti dopu l'iniezione di cocaina (Fig. 3B; 1.8 ± 0.2 volte sopra u livellu basale). Tuttavia, l'effettu di a cocaina nantu à a fosforilazione Thr-34 di DARPP-32 hè statu attenuatu in i topi Tgp35 (1.2 ± 0.3-fold sopra u livellu basale). Questi risultati indicanu chì un aumentu di l'attività di Cdk5 attenuava l'attivazione di PKA indotta da cocaina probabilmente per via di a fosforilazione di DARPP-32 à Thr-75 (6, 12). Hè ancu pussibule chì un aumentu di l'attività presinaptica Cdk5 porta à una diminuzione di a liberazione di dopamina, è chì questu cuntribuisce à l'effettu ridutta di a cocaina. In particulare, una sola iniezione di cocaina ùn hà micca affettatu i livelli di a proteina p35 è Cdk5 è ancu l'attività kinase (Fig. 3 C e D). Questu hè in cuntrastu cù un studiu precedente in quale l'esposizione cronica à a cocaina hè stata dimustrata per regulà l'espressione di p35 è Cdk5 (6).
Up-Regulation of Cdk5 Activity Attenuates Cocaine-Induced Activation of ERK1/2. Evidenze recenti indicanu chì l'attivazione di u receptore di dopamina in u striatum attiva ancu altre cascate di signalazione, cumpresa a via ERK (21, 22), chì hà un rolu impurtante in a risposta comportamentale à a cocaina (23). Avemu dunque esaminatu se l'attività di Cdk5 puderia influenzà l'attivazione indotta da cocaina di a via ERK. L'attivazione di a via ERK hè stata osservata dopu l'iniezione di cocaina in estratti striatali da topi di tipu salvaticu, cum'è evidenti da a fosforilazione aumentata di MEK1 / 2 à Ser-217 è Ser-221 (1.5 ± 0.2 volte sopra u livellu basale) è di ERK1. /2 à Thr-202 è Tyr-204 (fosforilazione ERK2: 1.5 ± 0.2 volte sopra à u livellu basale) (Fig. 4 A e B). Tuttavia, l'attivazione indotta da cocaina di MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2 volte sopra u livellu basale) è di ERK1 / 2 (fosforilazione ERK2: 1.2 ± 0.2 volte sopra u livellu basale) hè stata attenuata in i topi Tgp35 (Fig. 4 A e B). Inoltre, i livelli basali di fosfo-ERK1 / 2 eranu più bassi in i topi Tgp35 (0.8 ± 0.2 volte sottu à u valore di i topi di tipu salvaticu), mentri sta tendenza ùn era micca statisticamente significativa. Questu ultimu risultatu pò esse attribuitu à a fosforilazione dipendente da Cdk5 di MEK1 à Thr-286, risultante in una diminuzione di l'attività catalitica.24). Per valutà sta pussibilità, avemu esaminatu u statu di fosforilazione di MEK1 à Thr-286 è truvamu chì livelli più alti di phospho-Thr-286 MEK1 eranu prisenti in estratti striatali da i topi Tgp35 (Fig. 4C; 1.3 ± 0.1 volte sopra u valore di i topi di tipu salvaticu). Inoltre, u statu di fosforilazione di MEK1 à Thr-286 ùn hè statu alteratu da una sola iniezione di cocaina, in cunfurmità cù a scuperta chì l'attività di Cdk5 ùn hè micca stata affettata da u trattamentu (Fig. 3D).
A propagazione di a signalazione di dopamina à u nucleu hè attenuata da l'attività aumentata di Cdk5. L'attivazione indotta da cocaina di più cascate di signalazione chì implicanu PKA è ERK porta à l'attivazione successiva di u fattore di trascrizione CREB in u nucleu per via di a so fosforilazione in Ser-133 (22, 25). Per investigà se l'effetti inibitori mediati da Cdk5 nantu à e cascate di attivazione PKA è ERK ponu cunverge nantu à a fosforilazione di CREB in u nucleu, avemu esaminatu u statu di fosforilazione di CREB in Ser-133 in estratti striatali da i topi salvatici è Tgp35. U livellu basale di fosfo-CREB era più bassu in i topi Tgp35 (0.7 ± 0.1 volte di u valore di i topi di tipu salvaticu) (Fig. 5). In risposta à l'iniezione di cocaina, u nivellu di fosfo-CREB hè statu aumentatu in u striatu di i topi di tipu salvaticu (1.5 ± 0.1 volte sopra à u livellu basale), ma sta risposta à a cocaina hè stata attenuata in i topi Tgp35 (1.2 ± 0.1-). piegate sopra u livellu basale) (Fig. 5).
A fosforilazione di CREB à Ser-133 aumenta a so attività trascrizionale via un elementu di risposta cAMP in a regione promotore di certi geni, cumpresu u genu c-fos (26). Dunque, avemu esaminatu l'induzione di c-fos in u striatu di i topi di tipu salvaticu è Tgp35 dopu l'iniezione di cocaina. In i topi di tipu salvaticu, u nivellu di c-fos mRNA hà aumentatu à un valore di piccu (1.8 ± 0.2 volte sopra à u livellu basale) 30 min dopu l'iniezione di cocaina, è dopu turnatu à u livellu basale da 120 min dopu l'iniezione (Fig. 6 A e B). Tuttavia, i livelli di c-fos mRNA eranu ≈30% più bassi in i topi Tgp35 cà in i topi di tipu salvaticu finu à 30 minuti dopu l'iniezione (Fig. 6 A e B). L'induzione minore di c-fos in i topi Tgp35 hè stata ulteriormente corroborata da l'immunoistochimica (Fig. 6 C-F). L'amministrazione di cocaina hà aumentatu l'immunoreattività di c-fos, fortemente in e parti dorsomediali-dorsocentrali di u striatum è debbuli in e parti laterali, sia in i topi di tipu salvaticu sia in i topi Tgp35. Tuttavia, l'aumentu indottu da cocaina in u numeru di cellule c-fos-immunopositive hè stata notevolmente attenuata in u striatum di i topi Tgp35 (Fig. 6G). Inseme, questi risultati indicanu chì l'incrementu mediatu da a cocaina di a segnalazione di dopamina striatale à u nucleu hè stata inibita in i topi Tgp35, un risultatu prubabile di l'attività Cdk5 aumentata.
Articulu discussione
Cdk5 è u so attivatore p35 sò stati identificati cum'è geni di destinazione chì sò regulati da l'esposizione cronica à a cocaina. (6). Riportemu quì l'evidenza chì l'aumentu di l'attività di Cdk5, per via di a regulazione di p35 piuttostu cà di a regulazione di Cdk5, porta à l'attenuazione di a segnalazione di dopamina mediata da cocaina in i neuroni striatali. Per esaminà e cunsequenze di l'espressione up-regulated di Cdk5 o p35 nantu à a signalazione di dopamina striatale, sò state analizate duie linee di topi transgenici, i topi TgCdk5 è Tgp35. Avemu trovu chì l'attività Cdk5 era regulata in proporzione à un livellu aumentatu di proteina p35, ma ùn era micca affettatu da un livellu aumentatu di proteina Cdk5. U nostru rapportu precedente hà ancu dimustratu chì l'attività di Cdk5 in u cervellu di u topu TgCdk5 era più bassa chè in u cervellu di u topu salvaticu quandu l'attività hè stata misurata cù l'immunoprecipitati Cdk5 (17), chì suggerenu chì l'overexpression Cdk5 risultati in un livellu aumentatu di Cdk5 monomericu se u nivellu p35 ùn hè micca aumentatu. Questi risultati indicanu chì u nivellu di a proteina p35 hè un fattore limitante per l'attività Cdk5.
I topi Tgp35 mostranu una induzione minore sia di a fosforilazione CREB sia di c-fos in u striatum dopu l'iniezione acuta di cocaina, suggerendu chì a risposta striatale à a cocaina hè stata inibita da una crescita di l'attività Cdk5. L'attenuazione di a segnalazione di dopamina mediata da cocaina in i topi Tgp35 hè stata prubabilmente ottenuta per via di l'inibizione mediata da Cdk5 di più cascate di segnalazione chì implicanu DARPP-32, PKA è ERK. L'amministrazione di cocaina hà aumentatu a fosforilazione di PKA di DARPP-32 à Thr-34 in topi di tipu salvaticu, mentre chì sta risposta hè stata attenuata in topi Tgp35. A fosforilazione PKA di DARPP-32 à Thr-34 hè stata dimustrata per inibisce l'attività di a proteina fosfatasi 1 (PP1), l'enzima rispunsevule per a defosforilazione di Ser-133 di CREB (27). Cusì, l'attività PP1 ùn saria micca antagonizzata via a via DARPP-32 / PP1 in i topi Tgp35.
L'attivazione indotta da cocaina di ERK1/2 hè stata ancu attenuata in i topi Tgp35. Ci hè parechji meccanismi distinti per quale Cdk5 puderia inibisce l'attivazione indotta da cocaina di ERK1/2. Prima, a fosforilazione dipendente da Cdk5 di DARPP-32 à Thr-75 puderia inibisce PKA, purtendu à l'inibizione sussegwenti di qualsiasi attivazione MEK1/2 mediata da PKA chì hè necessaria per l'attivazione ERK1/2. Un studiu recente hà ancu truvatu chì a fosforilazione di DARPP-32 à Thr-34 hè necessaria per l'attivazione mediata da cocaina di ERK1 / 2 per via multipli chì implicanu a regulazione indiretta di l'attivazione di MEK, è ancu a regulazione di a fosfatasi arricchita in striata, una tirosina. fosfatasi chì agisce direttamente nantu à ERK1/2 (28). U sustegnu per questa pussibilità hè suggeritu da a scuperta chì a fosforilazione indotta da cocaina di MEK1 / 2 à Ser-217 è Ser-221 hè stata abulita in i topi Tgp35. Un'altra via prubabile hè per via di a fosforilazione Cdk5-dipendente di MEK1 à Thr-286, chì risulterebbe in una diminuzione di a so attività catalitica è porta à l'inibizione di l'attività ERK1/2.24).
L'inibizione di l'attività di Cdk5 in u striatum hè stata dimustrata per potenziate l'effetti comportamentali di u trattamentu cronicu di cocaina in l'animali (6). In cunfurmità cù l'ipotesi chì a regulazione di l'attività di Cdk5 pò cuntribuisce à l'adattazione neuronale per contru à l'effetti di l'amministrazione ripetuta di cocaina. (6), avemu trovu chì a fosforilazione mediata da Cdk5 di DARPP-32 è MEK1 hà cuntribuitu à l'attenuazione di l'attivazione indotta da a cocaina di ERK1 / 2, risultatu in l'induzione minore di fosforilazione CREB è c-fos in u striatum. I nostri risultati sustenenu l'idea chì l'aumentu di l'attività di Cdk5, per via di a regulazione p35, pò cambià l'espressione genica in u striatum dopu l'esposizione cronica à a cocaina. Questu pò accade per cambiamenti in l'attività di i fatturi di trascrizzione cum'è CREB è c-fos. Cusì, l'attivatore Cdk5 p35, in virtù di i so effetti limitanti di freccia nantu à l'attività di Cdk5, pò cuntribuisce à cambiamenti à longu andà in a funzione neuronale sottu à a dipendenza da cocaina..
Acknowledgments
Ringraziemu Dr. Mary Jo Danton, Philip Grant, è Sashi Kesavapany per a lettura critica di u manuscrittu. Stu travagliu hè statu sustinutu da National Institutes of Health Grant Z01DE00664-05 (à ABK), US Public Health Service Grant DA10044, è cuncessioni da a Fundazione Simons, a Fundazione Peter J. Sharp è a Fundazione Picower (à PG).
Fonti
Abbreviations: Cdk5, cyclin-dependent kinase 5; ERK, kinase extracellular regulated signal; DARPP-32, dopamina è fosfoproteina regulata da cAMP, massa moleculare 32 kDa; PKA, chinasi dipendente da cAMP; MEK, ERK kinase; CREB, proteina di legame di elementi di risposta cAMP.
Vede ancu
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