J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.
Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.
surghjente
U Dipartimentu di psichiatria, u Centru di Neuroscienza di Base, l'Università di Texas in u Centru Cumpagnia Tudente, Dallas, Texas 75390-9070, USA.
astrattu
U fattore di trascrezioni DeltaFosB (cunnisciutu ancu FosB2 o FosB [forma breve]) hè un mediatrice impurtante di a plasticità à longu andà indotta in u cervellu da una esposizione cronica à parechji tipi di stimuli psicoattivi, cumpresi droghe di abusu, u stress è crisi elettroconvulsive . Una caratteristica distinta di DeltaFosB hè chì, una volta indotta, persista in u cervellu per periodi longhi di tempu, in mancanza di ulteriore stimolazione. I meccanismi sottu à sta apparente stabilità, tuttavia, sò rimasti scunnisciuti. Quì, dimostremu chì DeltaFosB hè un fattore di trascrezzione relativamente stabile, cù una emivita di circa 10 h in cultura cellulare. Inoltre, dimostremu chì DeltaFosB hè una fosfoproteina in u cervellu è chì a fosforilazione di un restu serina altamente conservatu (Ser27) in DeltaFosB li pruteghja da a degradazione di u proteasomal. Offremu parechje righe di prova chì suggeriscenu chì sta fosforilazione sia mediata da caseina kinase 2. Queste scervie constituenu a prima prova chì DeltaFosB hè fosforilata è dimostra chì a fosforilazione contribuisce à a so stabilità, chì hè u core di a so capacità di mediata adattamenti duraturi in u cervellu.
I MUVRINI
U fattore di trascrezioni ΔFosB, designatu ancu FosB2 o FosB [forma corta], hè una varianta di a cunta terminale C terminusu da u gene immediatamente precoce fosb (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu è Nathans, 1991; Yen et al., 1991). Come FosB di lunghezza completa, ΔFosB ha un domini di basa di a lega di DNA è una cerniera di leucina da cui dimerizes cù proteine di Jun per formà proteina attivatore-1 (AP-1) complessi fattore di trascrizzione, chì regulanu l'espressione di molti geniMorgan è Curran, 1995; Rylski è Kaczmarek, 2004). Malgradu mancanza di una parte di u duminiu di transactivation truvatu in u terminale C di FosB, ΔFosB funzioni sia chì sia un attivu transcriptional putente è repressore in cellule colturate è in u cervellu (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu è Nathans, 1991; Chen et al., 1997; McClung è Nestler, 2003; Kumar et al., 2005).
ΔU FosB hè indotto à i livelli alti in a maniera specifica di regione in u cervellu dopu a crònia, ma ùn hè acuta, esposizione à una varietà di stimuli psicoattivi, cum'è u stress, certe lesioni, antipsicotici è antidepressivi, droghe di abusu è ricchezze naturali (Hope et al., 1994b; Hiroi è Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Bing et al., 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Andersson et al., 2003; Colby et al., 2003; Peakman et al., 2003; Perrotti et al., 2004; Zachariou et al., 2006). L'induzione di FosB hè stata curretta direttamente à l'effetti di funziunali di parechji di sti stimuli nantu à u cervellu. A perseveranza di BFosB ancu in assenza di stimolazione ulteriore li distingui da tutti l'altri fattori di trascrizione di a famiglia Fos, chì sò indotti velocemente in risposta à stimuli acuti, si deinavanu di ritornu à i livelli basali in pochi ore, è mostranu generalmente desensibilizazione dopu stimolazione cronicaHope et al., 1992; Daunais et al., 1993; Persico et al., 1993; Hiroi è Graybiel, 1996; Perrotti et al., 2004). Hè rendendu ΔFosB un candidatu attraente per mediazzià certi di i cambiamenti duraturi in l'espressione genica chì sò à u livellu di l'adattazioni neurali stabili causate da certi stimuli cronici.
Perchè a presenza prolungata di FosB si faci in mancanza di ulteriore induzione di u so mRNA (Chen et al., 1995), avemu speculatu chì, à dispusizione di FosB di lunghezza completa è di tutte l'altre proteine di a famiglia Fos, chì sò intrinseci instabili, ΔFosB pò esse un fattore di trascrezzione insolitamente stabile (Hope et al., 1994b; Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001; McClung et al., 2004). In più, analisi di l'immunoblotting di u tissu cerebrale acuta-versus stimulatu cronicu suggerìu chì ΔFosB si trasformò in apparente Mr (massa molecolare) da ∼33 kDa in a condizione acuta à ∼35 – 37 kDa durante un trattamentu cronicu (Hope et al., 1994a; Chen et al., 1995). Perchè ùn ci sò evidenze per a existenza di mRNA supplementari chì pudianu codificà per queste varie isoforme, ci hè ancu speculatu chì ΔFosB hè modificatu posttranslazionalmente è chì forse ciò contribuisce à a so stabilità insolita. À attualità, parechje analisi biochimiche di u fatturatu o modifiche post-traduziunali di ΔFosB sò state dichjarate. L'obiettivo di stu travagliu era di determinà se ΔFosB hè una fosfoproteina è se a fosforilazione svolge un rolu in a so stabilità.
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Materiale è Metodi
Linee di cellule di mammiferi è costrutti di DNA.
E cellule PC12 (Clontech, Mountainview, CA) furunu cultivate in DMEM ad alto glucosu cun L-glutammina (L-Gln) è complementati cù sèmu fetale bovinu 5% (FBS), sèmu cavallu 10% (sia da Invitrogen, Carlsbad, CA) , 100 U / ml penicillina, è 100 μg / ml streptomicina (ambi da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). E cellule HeLa (American Type Culture Collection, Manassas, VA) furunu cultivate in DMEM à elevu glucosu cun L-Gln è supplementati cù 10% FBS, penicillina, e streptomicina. Entrambe e linee di cellule sò state mantenute à 37 ° C in un 5% CO umido2 atmosfera.
Per e transfezioni transitorie cun DNA, e cellule PC12 o HeLa sò state piantate nantu à piatti di sei buche (ricoperti di collagene I per cellule PC12) in modo da ghjunghje a confluenza 90 – 100% u ghjornu dopu è sò trasfettati cun Lipofectamine 2000 (Invitrogen). In alcune sperienze (vede Figgi. 1⇓⇓⇓⇓⇓-7), ΔFosB hè statu transientemente espressu in cellule PC12 per via di un'infezione cù l'urevule recombinante di l'herpesi simplex (HSV).
I cDNA di FosB è FosB sò stati ottenuti da i nostri proprii costrutti pTetop (Chen et al., 1997), è subcloned in un vector pcDNA3.1 (Invitrogen). Queste costruttive pcDNA3.1-os FosB / FosB sò state usate per l'espressione in cellule di mammali è cume un mudellu per mutageneise diretta à u situ. A HSV-ΔFosB ricombinante hè stata preparata cum'è descritta nanzuNeve et al., 1997), è a preparazione hà u titulu di UM1 × 108 pfu / ml.
Pruvincia di pulse-chase.
Circa 24 h dopu à l'infezione / transfezione, e cellule (PC12 o HeLa) in piatti di sei buche furte lavate 2 à 3 volte cù 2 ml di PBS è incubate à 37 ° C per ∼1 h in 2 ml di CEM / Met-free DMEM (Invitrogen) integratu cù XBSUM%% FBS (Hyclone, Logan, UT) per scaricà i flussi intracellulari di Met è Cys. À a fine di stu periodu di "fame", e droghe (s'è anu da trattà una cella) eranu e le cellule sò state etichettate (pulsu) cù 5 – 12 μCi di 35M Protein Labeling MixPerkinElmer, Wellesley, MA) per ∼1 h a 37 ° C per etichettà tutte e proteine appena sintetizzate. Nant'à u postu, u radiomuntariu hè statu cacciatu cù lavu di e cellule duie à trè volte cù 2 ml di PBS, è a 35Erenu seguite e proteine marcate cù S (caccia è), rimpiazzendu u mezu cù un mezu "freddo" (non radiuattivu), accumulatu di 5% FBS è raccolta di e cellule in diversi punti di tempu. I trattamenti cellulari sò stati mantenuti per tutta a caccia. Tutte e cifre di sti sperienze mostranu quantità iniziali simili di e varie proteine per ottimizà e cumparazioni di i so tassi di rotazione.
Animali è trattamenti croniche elettroconvulsivuli.
I sobri maschii Sprague Dawley (200 – 300 g; Laboratori Charles River, Kingston, RI) furunu trattati una volta ogni ghjornu cù crisi elettroconvulsive (ECS) per 7 – 9 d. ECS hè statu fattu cum'è discu precedentemente (Hope et al., 1994a) cù un Ugo Basile (Comerio VA, Italia) Unità ECS cù i seguenti settori: frequenza, impulsi 100 / s; pulsu cù, 0.5 ms; durata di shock, 1.0 s; è l'attuale 75 mA. E animali di cuntrastu falsu sò stati trattati in parallelo ponendu l'applicazione di l'elettrodi di clip auricolari senza alcun corsu elettricu.
32 P etichettatura metabolica.
Per a etichettatura di a fette di u cervellu, i ratti sò stati decapitati, i cervelli si erigenu rapidamente, è 300 μm fette corticali frontali sò stati preparati cun un microslicatore DSK (Ted Pella, Redding, CA). Le fette sò state incubate in i tubi di plastica in 2 ml di CSF artificiale carente di fosfatu (ACSF) è mantenuti à 30 ° C sottu u so bumblione constante è dolce cun O2/ CO2 miscela (Hemmings et al., 1989). Le fette (duie fette per tubu) sò state etichettate cù 1.3 mCi per 8 – 10 h in presenza o assenza di acidu okadaic (100 ng / ml). À a fine di questu incubazione, i fette sò stati lavati almenu tri volte cù ACSF fredda è poi omogeneizati cù sonicazione in 250 μl di test di radioimmunoprecipitazione fredda (RIPA) tampone [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v ) Igepal, 0.5% (w / v) deossicolato di sodiu, 0.1% (w / v) SDS, 1 mm EDTA] integratu prima di l'usu cù SDS finu à 0.6%, cocktail inibitori di proteasi per cellule di mammiferi (usatu à 5 μl / ml; Sigma-Aldrich), cocktail di fosfatasi inibitori I è II (usati in 1: 100; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF, e 2% glicerol. L'omogeneizati eranu dopu bolliti per 15 min è pulitu per centrifugazione in 15,000 × g per 15 min. A concentrazione di proteine in i supernatanti resultanti hè stata valutata cù u test di proteina BCA (Pierce, Holmdel, NJ).
di l ' 32L'etichettamentu di e cellule coltivate, ∼24 h dopu à l'infezione / transfezione, cellule hè stata lavata à due à tre volte cù mezu senza fosfati è incubati in stu mezu per ∼1 h. Dopu à u periodu di fame, 0.2 – 0.3 mCi di 32PH3PO4 (PerkinElmer) vennu aghjunti à ogni pozzu, è e cellule sò state etichettate per 4 – 12 h secondu u tippu di sperimentu (vedi Fichi. 1 – 7 per e specifiche). Celle sò poi lavate tri volte cù PBS è lissate nantu à u ghiaccio per 15 min cù 50 μl di tampone RIPA supplementata. I lisati sono stati raccolti da a raschiatura è sò stati passati 10 volte à traversu un labellu 25 ga per tagliare u DNA, bollito per 10 min, è centrifugatu à rpm 15,000 per 15 – 30 min a 4-27 min a XNUMX ° C. I lisati sfruttati (supernatanti) sò stati trasferiti in un novu tubu è un test di proteina BCA (Pierce) hè statu fattu. Tutte e figure di questi esperimenti mostranu quantità simili di proteine totali di tippu salvadore (WT) è SXNUMXA Δ FosB per ottimizà e cumparazioni di i so livelli di fosforilazione relativa.
Trattamenti chimici è di cultura cellulare.
L'acitu di Okadaic (OA; Sigma-Aldrich) fu dissolto in etanolu è hè usatu à una concentrazione finale di 100 ng / ml. 5,6-Dichloro-1-β-d-ribofuranosyl-benzimidazole (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) è stata disciolta in dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich) e usata in coltura cellulare a una concentrazione finale di 50 μm. L'esperimentu (Sigma-Aldrich) hè statu dissolutatu in l'acqua è adupratu à a concentrazione finale di 200 μm. Calphostin-C (Biomol) hè stata dissolta in DMSO è usata à 0.2 μm, mentri u forbolu 12-myristate 13-acetate (PMA; Promega, Madison, WI) è statu dissolutatu in DMSO è usatu à 0.1 μm. i peptidi inibitori micorriolati-autocamtide-2-related (m-AIP; Biomol) è disciutu in acqua è usatu à una concentrazione finale di 1 è 10 μm. L'inibitori di a proteina kinase à spettu largu H-7 è H-8 (Biomol) sò dissolti in acqua è utteniti à una concentrazione finale di 150 è 200 μm, rispettivamente. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) è epoxomicin (Peptides International, Louisville, KY) sò stati saldati in DMSO è aduprati à una concentrazione finale di 12.5 è 7.5 μm, rispettivamente. In tutti i sperienze, DMSO (veicolo) hè statu aghjuntu à e cellule necessarie per mantene una quantità costante di DMSO in i trattamenti. Per 32Pruvemi d'etichettatura P, i farmaci sò stati aghjunti subitu davanti à l'etichetta è mantenuti per u restu di u periodu di etichettatura. Per e sperienze di pulsu-caccia, i farmaci sò stati aghjuntu à u mumentu di Cys / Met "famelia", mantenuti in u periodu di etichettatura, è poi aghjunti torna in mezu à a caccia. L'inibitori di u proteasoma eranu spicilati in ogni 3 – 4 h per tutta a caccia per compensà u rapitu di fatturazione di sti peptidi.
OpFunB immunoprecipitazione, immunoblotting, è autoradiography.
Per e immunoprecipitazioni, i lizati sò stati diluiti 1: 5 cù RIPA lisciu per portà a concentrazione SDS giù à 0.1% prima di procedere cù immunoprecipitazione (IP). Per limità a cunnessione nonspecifica, i lizati sò stati prima eliminati immunoprecipitendu cun IgG non immune è una proteina G-Sepharose (Sigma-Aldrich) per almenu 4 h. BFosB era poi immunoprecipitatu da i lisati puliti aduprendu un anticorpo policlonal caprunu chì ricunnosce un epitopo interno presente in FosB è ΔFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) in 0.5 – 1 μg IgG per 10 – 50 μg IgG per 300 μg (0.5 – 4 μg di proteina totale) in un volumu tutale di 8 ml. I IP furmati dolcemente à 15 ° C su un rotore per almeno 4 h è poi 3000 μl di proteina G-Sepharose è stata aggiunta è IPs sò stati mescolati per almenu un altru XNUMX h. I IP sò stati filettati da spinning à XNUMX × g per 3 – 5 minu à 4 ° C, lavatu trè volte cù 0.5 ml di pianta fredda RIPA è duie volte cù PBS fredda chì cuntene 0.1% Tween 20. L'IP è stato poi resuspenduto in 0.5 ml di PBS freddo, trasferiti, pelletati in un novu tubu, e proteine immunoprecipitate sòvate allora eluite da l'aggiunzione di 15 – 25 μl di 2 × riducente tampone campione di proteina Laemmli ×. Stu protocolu IP hà avutu a precipita specifica è efficace di quasi tutti i BFosB in u lysate. E proteine immunoprecipitate sò state sottoposte à SDS-PAGE caricàvule l'intera IP in un gelu di Criteru 12.5% Tris-HCl (Bio-Rad, Hercules, CA), è poi trasmissu nantu à PVDF o nitrocellulosa. Dopu u trasferimentu, a membrana era asciugata d'aria è 32P- è 35E bande di proteina radiolabelata S sò state osservate da autoradiografia cù u film autoradiograficu Kodak (Rochester, NY), è cù fosforimimazione cù una tempesta (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager. Totu (unphosphorylated è phosphorylated) ΔFosB in lysate cellulare o omogenati di u cervellu hè statu rilevatu da immunoblotting di una proteina immunoprecipitata (cù a stessa membrana utilizata per rileva i 32Proteina P-etichettata), o di quantità à parta di lysate / homogenate proteinu sottu à SDS-PAGE è trasferitu per PVDF o nitrocellulose. A membrana hè stata primariamente bloccata incubandola cù u latti seccu 1% (p / v) non grassu (Bio-Rad) in PBS cumplutu cù 0.1% (v / v) Tween 20 (Sigma) per 1 h a 25 ° C. A membrana hè stata allora immunolottata di notte à 4 ° C cù u nostru stessu anticolu anticolu policlonalu anti-FosB cunitu generatu à fiancata di aminoacidi 1 – 16 di FosB / ΔFosB (usato in 1: 10,000). Dopu l'incubazione primaria, e membrani sò stati lavati quattru volte per 5 min cù tampone di bloccaggio, è poi incubatu à 25 ° C per ∼1 h cun un capu d'ugG anti-coniglio capra cunugatu à a perossidasi rafia (utilizatu à 1: 5000 in buffer bloccante, da Vector Laboratories, Burlingame, CA). E membrane sò allora lavate tri volte per 10 min cun tampone di bloccaggio è una volta per 5 min cun PBS. E bande di proteina ΔFosB Totale sò state visualizzate nantu à u filmu MR Kodak da chemiluminescenza migliorata (Pierce) è / o da l'identificazione di fluorescenza cù i reagenti ECL-Plus (Amersham Biosciences) e tempesta PhosphorImager.
Sopraespressione è purificazione di BFosB ricombinante da e cellule insetti.
BFosB era sovraespressu in cellule di insetti Sf9 cume una proteina N tesa hexa-His-Nt-His (N-His (6) Δ FosB) usando u sistema di espressione baculovirus Bac-à-Bac (Invitrogen) e seguendu l'istruzioni di u fabbricante. In breve, l'ADNc di FosB (residui 2 – 237) preceduta da a variabilità N-terminale di affinità MGHHHHHHAG è stata subclonata in u vector pFASTBacTM1, chì hè stato utilizzatu per generà baculovirus ricombinante. Celle di Sf9 sò state infettate cù u virus recombinante, è N-His (6) ΔFosB hè purificatu da i lisati di e cellule per parechji passi cromatografici chì includenu cromatografia di affinità cù una colonna di nichel (Qiagen, Valencia, CA), scambio anionu utilizendu una colonna mono-Q (Amersham). Bioscience), è sclusione di dimensioni cù una colonna di filtrazione di gel (Amersham Biosciences).
In vitro studi di fosforilazione.
In vitro e reazioni di fosforilazione per l'analisi di i tempi è l'analisi stoechiometria sò state effettuate in un volume di 30 μl contenenti substratu 10 μm (N-His (6) Δ FosB o un substrato di controllo positivo), 250 μm ATP, e 1 μCi / μl [γ-32P] ATP, u tampone fornitu da u fabbricante di kinasi, è una di e cinasi chì seguite: CK2 (20 ng / μl; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / μl; Upstate), PKC (1.6 ng / μl; Calbiochem) o p70S6K (2.5 mU / μl; upstate). E reazioni di i tempi sò state effettuate rimuovendo aliquote aliquote 5 μl dalla soluzione di reazione ai punti temporali designati e aggiungendo un uguale volume di 4 × riducente buffer di campione di proteina Laemmli. I parametri cinetichi Michaelis-Menten per a reazione CK2 sono stati determinati sottu a condizioni empiriche definite di situazione stabile lineare. Queste reazioni sò state effettuate per 15 min in un volume di 10 μl contenenti enzimu 2 ng / μl, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [γ-32P] ATP, è N-His (6) ations FosB concentrazioni chì vene da 2.5 – 30 μm. Tutte e reazioni sò state effettuate à 30 ° C in un bagnu d'acqua. Dopu avè SDS-PAGE è colorazione di u gelu cù Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad), u gel hè statu seccatu, è 32L'incorporazione di P-fosfatu hè stata valutata da analisi di fosforimimazione (vedi sùbbule, Quantificazione di dati, calculi, e statistiche).
Mappa di fosfopeptidi bidimensionale è analisi di fosfoamino.
Entrambi sti analisi sò stati eseguiti cum'è descrittu da Ploegh and Dunn (2000). Brevi, frammenti di geli secchi contenenti 32P-labeled ΔFosB (o da in vitro o reazioni o da immunoprecipitate di cellule metabolicabilmente etichettate), sò state sfratti, reidratate, lavate, è sottuite à una digestione tryptic. U supernatantu chì cuntene i prudutti di a digestione tryptica hè statu liofilizzato è u liofilatu lavatu parechje volte è resuspendutu in 10 μl di tampone d'elettroforesi, pH 1.9. U campione (3 μl) hè statu maceratu nantu à una piastra di cromatografia in sottu strato di cellulosa (TLC) (Analtech, Newark, DE) è separata in una dimensione da elettroforesi è l'altra dimensione da TLC ascendente. E mappe fosfopeptidi chì si truvavanu sò state visualizzate per autorejadiografia è fosforimurazione. Per l'analisi di u fosfoamino, 2 μl di i digerimenti tryptichi chì eranu resuspenduti in tampone di elettroforesi sò stati clivati cù l'idrolisi di HCl à 105 ° C per 25 min in 3 m HCl sottu N2 atmosfera. A reazione hè stata fermata da una diluzione di sei volte in acqua, è a miscuglia era liofilizzata. U lyofilatu hè stato resuspendutu in 5 μl di tampone di elettroforesi, pH 1.9, è macatu annantu à una piastra TLC di cellulosa cù i normi phospho-Ser, -Thr è -Tyr. L'elettroforesi era fatta per mezu à a mità di a lunghezza di a piastrella TLC cù tampone di elettroforesi, pH 1.9, è dopu a piastra fu trasferita in u tampone pH 3.5, è l'elettroforesi hè stata cumpletata. I standard di u fosfoamino-acidi sò stati visualizzati cù a spruzzatura di a piastra TLC cù una solu di ninhydrina 1% (v / v) in acetone, è 32I campioni di aminoacidi P-labillizati sò stati visualizzati da autorieografia è da fosforimaggiu.
CK2α indotta per siRNA.
Avemu usatu un metudu di interferenza RNA per selective knock-down i livelli di CK2 (Di Maira et al., 2005). E cellule PC12 sò state piantate nantu à piastre à sei pozzette nantu à u collagene I per ghjunghje a cunfluenza di UM70-80% u dopu ghjornu, quandu sò stati trasfettati transitoriu cù 20 nm (concentrazione finale) di siRNA nontargeting o siRNA nontargeting o siRNA dirigitu versu l'ARNt subunità α di Ratto CK2, usando 5 μl dell'agente di trasfezione SilentFectin (Bio-Rad) è seguendu l'istruzioni di u fabbricante. Circa 24 h dopu, e cellule sò state trasfettate transitive cù idFosB plasmide, cum'è dichjaratu sopra. Circa 24 h dopu (∼48 h dopu a transfezione di siRNA), e cellule sò state sottoposte à o 32P etichittamentu metabolicu o analisi pulse-chase cum'è discu sopra. I quattru siRNA CK2α sò stati aduprati cù risultati simuli: 5′P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ′, 5′P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3 ′, 5′P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3 ′, 5′P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU3 ′ (Dharmacon, Lafayette, CO). Comu un cuntrollu negativu, usamu Silenziu cuntrollu negativu #3 siRNA da Ambion (Austin, TX). A misura di CK2 knock-down hè stata monitorata da un immunoblotting cù un anticorpo policlonale anti-CK2 (catalogu # 06-873 da Upstate) da un lugatu à una diluizione 1: 1000. β-Tubulula era usata cume un cuntrollu di carregamentu è scuppiatu cun un anticorpo monoclonalu (catalogu # 05-661 da Upstate) da un lugatu à una diluizione 1: 20,000.
Mutagenesi indirizzata in situ.
A mutazione di Ser27 in Ala o per Asp hè stata fatta usando un kit di mutagenesi rapida cambiata in situ (Stratagene, La Jolla, CA) è seguendu l'istruzioni di u fabbricante. Per introdurà e mutazioni Ser27 in a proteina Δ FosB del mouse, sò stati utilizzati i seguenti inzignatori mutagenesi. Ser27 to Ala: (primer inverso) 5′GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 ′. Ser27 to Asp (primu avanti) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 ′. I basi mutati sò in grassu, è u codone Ser27 hè in corsu.
Bioinformatica.
I siti potenziali di fosforilazione è cinasi per ΔFosB sò stati ricercati sottumendu a sequenza di proteine mouse in basa di dati specializati chì includenu ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost et al., 2004), è NetPhosK (Blom et al., 2004).
Quantificazione di i dati, calculi è statistiche.
A quantità di proteina presente in PVDF o membrana di nitrocellulosa hè stata quantificata cun Storm PhosphorImager è u software rappresente accompagnatu di ImageQuant (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). In a cultura cellulare è a cera di a fosforilazione a fetta cerebrale, i valori ottenuti per u 32A proteina P-etichettata era dopu spartita per i valori ottenuti per osFosB cumunale, è espressu in quantu. In u in vitro studi di fosforilazione, a quantità di 32ΔFosB etichettatu P per mole di BFosB (stoechiometria) hè statu calcolatu cum'è discu precedentemente descrittu (Sahin et al., 2004). Tutte e misure sò state pigliate in una linea di linealità di u strumentu adupratu. I parametri cinetichi sò stati calcolati cù u mudellu Michaelis-Menten, per chì V = VMax[S] / ([S]+KM) è VMax = k2[ETotal]. A metà vita (t1/2) di ΔFosB è FosB sò state stimate da i graffiti pulse-chase (usando a regressione nonlineare chì più adatta i punti di dati) è risponde à u tempu à chì a quantità di proteine rimanente hè 50% di l'originale. In tutte e figure, i risultati mustrati sò rappresentativi di almenu 2 à 3 sperienze indipendenti. In tutti i grafici, i dati mustrati sò i media ± SEMs (3 ≤ n ≤16). A significatività statistica di e differenze hè stata valutata aduprendu un unpaired t testu, corregitu per cumparanze multiple, è l'asteraie indica p ≤ 0.05.
A versione precedenteA Sèculu Sette
Risposte alla lingua
BFosB hè un fattore di trascrezioni insolitamente stabile
Benu avemu speculatissimu nanzu chì BFosB hè un fattore di trascrezzione relativamente stabile (Nestler et al., 2001), una analisi diretta di u profilu di fatturaghju di a proteina ùn hè ancu realizzata. Per mette in ballu questu questione, avemu cundutate sperienze pulse-chase usendu cellule PC12, chì sò state largamente usate cum'è una linea di cellule like-neurone, in chì ΔFosB era espressu transientemente per via di l'infezione cù un virus di l'herpes simplex (HSV-ΔFosB). Proteine ghjuvinthe sintetizzate sò state etichettate metabolicamente cù 35S-Met / Cys, è u mudellu di degradazione di 35S-etichettatu FosB (35S-Δ FosB) hè stata monitorata da l'immunoprecipitendu da i lizati di e cellule ottenute à parechji punti tempu dopu a rimozione di l'aminoacidi radiomarcati. L'analisi di l'immunoprecipitate da SDS-PAGE è l'autoradiografia hà rivelatu chì a emivita di ΔFosB in cellule PC12 è ∼10 h (Fig. 1). Queste scoperte mostrano chì a emivita di ΔFosB hè più altu chè di a maggior parte di i fattori di transcription inducibili (vedi Discussione), annantu à FosB di lunghezza completa, chì a so vita di mezu vita in cultura cellulare hè stata segnalata per ∼90 min (Dobrazanski et al., 1991; Carle et al. 2004). In più, vale a vene notà chì a degradazione di FosB ùn rientra micca in una curva di decadimentu exponenziale di u primu gradi, ma hè bifasicu, inseguendu cù un ritmu di degradazione più lente. Questu suggerisce l'esistenza di più di una spezie B FosB è / o più di una strada di degradazione.
Vede a versione grande:
Figura 1.
BFosB hè un fattore di trascrezioni insolitamente stabile. A emivita di BFosB hè ∼10 h in cultura cellulare. B FosB era espressu in cellule PC12 da una o infezione cù HSV-BFosB o transfezione transitorio cù idFosB-contenenti plasmidiu, e cellule sò state sottoposte à impulsi-chase esperimenti cum'è descrittu in Materiali è Metodi. I risultati equivalenti sò stati ottenuti indipìcenza di u metudu adupratu per sopresspressà ΔFosB. A figura mostra u corsu di tempu (è autoradiogrammu rappresentativu) di a degradazione di BFosB. I dati tracciati sò a media ± SEM di almenu punti di dati individuali 15 ottenuti da almenu 5 esperimenti indipendenti. À u cumparazione, a vita di murtalunatura riportata di FosB piena hè indicata.
BFosB hè una fosfoproteina in u cervellu
Abbiamo ipotizzatu chì a modificazione post-traduzionale di BFosB possa contribuire à a so stabilità apparente. Perchè a fosforilazione hè stata dimostrata per modulà l'attività di i fattori di trascrezioni in molti modi, annantu à a so stabilità Desterro et al., 2000; Whitmarsh and Davis, 2000), avemu studiatu sì ΔFosB hè una fosfoproteina. À questu scopu, l'espressione di osFosB fu indotta in u cervinu di rati usando ECS cronica, un trattamentu cunnisciutu per induce alta quantità di BFosB, in particulare in corteccia frontali (Hope et al., 1994a). Un ghjornu dopu à l'ultimu trattimentu ECS, quandu i livelli di FosB rimanganu alti, fette sottu corticali frontali sò stati preparati è etichettati metabolicamente 32P-ortofosfatu. Un inseme paralelu di fette ùn era micca radiolabelatu, è sò stati aduprate per scopre i livelli ΔFosB cumuni. Dopu l'immunoprecipitazione cù un anticolu specificu anti-FosB / Δ FosB è a separazione di e proteine immunoprecipitate cù SDS-PAGE, fosforilata 32ΔFosB etichettatu P hè statu rilevatu per l'autoradiografia, mentri u B FosB totale hè statu rilevatu da immunoblotting. Questa analisi hà rivelatu chì BFosB hè fosforilatu in u cervellu, cum'è evidenziatu da una specifica 32A banda P-labillizata di ∼35 kDa presente in i campioni di cervelli trattati cronicamente, ma hè virtualmente nundettabile in i cuntrollu trattati da simulazione (Fig. 2A). Quellu hè cunsiste cù u fattu chì, in mancanza di stimolazione cronica, i livelli basali di BFosB sò assai bassi. A specificità di a reazione immunoprecipitazione hè illustrata da a mancanza di signale in u precipitatu IgG non immune.
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Figura 2.
BFosB hè una fosfoproteina in u cervellu. AΔFosB hè fosforilatu in u cervellu. U B FosB endogeni hè statu inditu in u cervellu di i rati da u trattu crònicu ECS cume hè descrittu in Materiali è Metodi. I tagli corticali frontali sò stati mimetalmente etichettati cù 32PH3PO4 per diverse ore. Dopu l'omogeneizazione di e fette, Δ FosB era immunoprecipitatu, è ΔFosB fosforilatu (32P-ΔFosB) hè statu rilevatu da l'autoradiografia (pannellu superiore). Totu FosB in immunoprecipitate non radiuattivu hè statu rilevatu da immunoblotting (pannellu di fondu). Com'è cuntrollu negativu, l'immunoprecipitate di un animali simulatu-trattatu è di una IgG non immune. B, I siti di fosforilazione candidati è cinasi cù i puntegni di previsione cumplicativi per a sequenza di proteina ΔFosB di mouse sò stati ottenuti da analisi bioinformatica. I siti candidati cù i punteggi di previsione più alti sò evidenziati in a sequenza di proteine è listati in a tabella. U duminiu di basa DNA (di basa) è a cerniera di leucina sò in grassu in a sequenza di proteine. C, DA fosforilazione di BFosB aumenta cù l'inhibitore OAS di Ser / Thr fosfatasi. C, 32I livelli di P-ΔFosB in immunoprecipitate da fette corticali frontali etichettate in mancanza (Ctr) o presenza di 100 ng / ml OA (grafico e pannello superiore) sò stati rilevati da autoradiografia. U pannellu inferiore mostra FosB totale truvatu in l'immunoprecipitate da fette senza marcate per immunoblotting. DI celluli PC12 sò stati infettati cù HSV-BFosB o HSV-LacZ (vector) è metteghjelati cù 32PH3PO4 in assenza (Ctr) o a presenza di 100 ng / ml OA. 32I livelli di P-ΔFosB in immunoprecipitate sò stati rilevati da autoradiografia (grafico, pannellu superiore). U pannellu inferiore mostra FosB totale truvatu in lizati cellulari da immunoblotting.
Come un primu passu versu a chiarucazione di e kinase (s) è situ (s) sò implicati in a fosforilazione di BFosB, avemu sottu à a so sequenza di aminoacidi à parechji analisi bioinformatiche. Questu hà rivelatu chì, ancu se BFosB ùn hà nant'à i siti candidati à Tsoforilazione di Tyr, cuntene parechji siti Ser / Thr kinase cuncentri, inclusi trè siti CaMKII, trè siti CK2, è dui siti PKC cù i punteggi di previsione di phosphorylation assai altiFig. 2B). Se, cum'è prevede a bioinformatica, ΔFosB hè fosforilatu solu nantu à i residui Ser o Thr, allora a so fosforilazione deve esse significativamente modulata da l'attività di Ser / Thr fosfatasi. Per pruvà sta ipotesi, avemu etichettatu cunghjetti corticali frontali cù 32P-orthophosphate in presenza o assenza di OA, un inibitore Ser / Thr proteina fosfatasi. Come mostra in figura 2C, OA hà fattu un grande incrementu (∼2.5-fold) in 32P-ΔFosB. Hà causatu ancu un piccolo aumentu di i livelli di B FosB cumunali, chì sò in concordanza cù i rapporti antichi chì lìcianu gli effetti cancerogeni di OA in a so capacità di inducei parechji genitori immediati cum'è proteine Fos (Miller et al., 1998; Choe et al., 2004). U risultatu netto hè un incremento globale significativu (∼60%) in i livelli ΔFosB fosforilati.
Dopu, investigavamu se, in e cellule PC12, chì sò più favuribili à a manipolazione sperimentale, ΔFosB hà mostratu un mudellu di fosforilazione simile à quello chì si vedi in u cervellu. Avemu espressu B FosB in cellule PC12 da infezione cù HSV-ΔFosB è metabolicillamente etichettatu e cellule cù 32P-orthophosphate in presenza o assenza di OA. L'espressione di successu è l'immunoprecipitazione di a proteina da e cellule infette cù HSV-BFosB hè dimostrata da a presenza sia in l'immunoblottu (Fig. 2D, pannello inferiore) è l'autoradiografu (pannellu superiore) di una banda ∼35 kDa, assente in a cellule infettevuli. Cum'è osservatu in u cervellu, OA hà causatu un picculu incrementu di i livelli Δ FosB totali, ma un incremento assai più altu (circa dopu) 32P-ΔFosB, cundutendu in un significativu (∼50%) aumento netu di a fosforilazione ΔFosB. Inoltre, in concordanza cù a previsione bioinformatica, u trattamentu di e cellule PC12 cun un inibitori di Tyr fosfatasi ùn hà micca causatu cambiamenti significativi in 32Livelli di P-ΔFosB (dati ùn sò micca mostrati). Insemi, questi risultati annunzianu chì BFosB hè fosforilatu nantu à i residui Ser è / è Thr in u cervellu è in e cellule PC12 è hà confermatu l'ultimu cum'è un sistema di cultura di cellule in cui studia in più i profili di fosforilazione è di degradazione di ΔFosB.
CK2 ma ùn PKC o CaMKII phosphoryila B FosB in vitro
Cum'è discu sopra, analisi di a secrezzione di aminoacidi ΔFosB hà rivelatu elevati risultati di previsione per i siti di fosforilazione CK2, PKC, e CaMKII. Per determinà chì di queste cinasi pudete fosforilà B FosB, avemu conduttu una serie di in vitro reazioni di fosforilazione cù quinasi purificate è ΔFosB ricombinante purificatu. Come mostra in figura 3A, di i trè candidati kinasi, solu CK2 phosphorylated ΔFosB in un modu significativu. Inoltre, parechji altre kinasi sò stati testati (per esempio, GSK3 è p70S6K) ma ùn sò micca successi à a fosforilazione significativa di BFosB (dati ùn sò micca mostrati). A caratterizzazione addizionale di a reazione CK2 per analisi di i cursi di tempu hà rivelatu chì questa kinase pò catalizà l'incorporazione di ∼0.5 molu di fosfatu per mole di ΔFosB (Fig. 3B). U fattu chì CK2 pò fosforilà BFosB in vitro a un stoechiometria significativu (∼50%) hè suggestive di una reazione pertinente fisiologicamente. Dopu, sò studiatu a cinetica di questa reazione incubendu CK2 in presenza di quantità crescenti di B FosB purificati, è avemu determinatu chì CK2 fosforilates ΔFosB con a Vaigle di 5.8 pmol · min-1 · Μg-1 di l'enzima, a KM di 18.4 μm, è a kgattu di 0.2 / s (Fig. 3C). I valori impurtati per sti parametri cinetichi supportanu ancu a rilevanza fisiologica di sta reazione. Per esempiu, u KM di CK2 per DARPP32, unu di i so migliori substrati cunnisciutu, hè 3.4 μm, è kgattu hè ∼0.3 / s (Girault et al., 1989); u KM per i spazii ATP da ∼10 – 40 μm (Cochet et al., 1983; Silva-Neto et al., 2002), è chì per a casinò varieghja da ∼10 – 50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin et al., 1987). Insemi, questi dati mostranu chì ΔFosB hè un substratu bona fede per CK2 in vitro.
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Figura 3.
CK2 ma ùn PKC o CaMKII phosphoryila B FosB in vitro. L'autoradiografu (pannellu superiore) mostra u pruduttu fosforilatu, è u gelu maculatu di Coomassie (pannellu di fondu) mostra FosB totale presente in a reazione. AΔ FosB purificatu ricombinante hè statu sottu à in vitro a fosforilazione da i vari candidati kinasi (3 di i quali sò mostra). BL'analisi di i tempi è l'analisi stoechiometrica indichi chì CK2 pò fosforificare l'FosB in vitro cun una stoichiometria di ∼50%. CL'analisi cinetica di a reazione CK2 hà rivelatu chì BFosB hè una bona fede in vitro substratu. A linearizzazione di a reazione hè mostra in una trama duvia-reciproca (u fondu), ma i parametri cinetichi sò stati derivati da a curva Michaelis-Menten (sopra).
CK2 modula a fosforilazione è a stabilità di Δ FosB in cellule intatte
Per valutà a rilevanza fisiologica di a fosforilazione mediata da CK2 di ΔFosB, avemu effettuatu una mappazione comparativa di fosfopeptidi cù in vitro oryFosB fosforilatu è PC12-cell-phosphorylated. Dopu una eluzione di SDS-PAGE è gel 32P-ΔFosB (da u in vitro reazioni o da l'immunoprecipitate di 32Cellule P marcate), a proteina hè stata digerita cù tripsina, è i fosfopeptidi chì eranu fatti sò stati sottu à a separazione bidimensionale. Quest'analisi hà rivelatu chì u principale fosfopeptide da a reazione di CK2 comigrò cun unu di i dui principali fosfopeptidi da u B FosB fosforilatu in cellule PC12Fig. 4A), mentri chì i fosfopeptidi chì sò partuti da a reazione PKC è CaMKII (dati ùn sò micca mostrati) ùn anu micca. C'è stata una seconda fosfopeptide Δ FosB presente in a mappa da e cellule PC12, ma a causa di l'impossibilità di una chjaes è avemu testata per generà un fosfopeptidu simile. in vitro, ùn sapemu oghje micca sì questu secondu fosfopeptide cuntene un situ di fosforilazione diversu da l'altru fosfopeptide o chì raprisenta un peptide trypticu distintu chì cuntene u stissu situ di fosforilazione.
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Figura 4.
CK2 modula a fosforilazione è a stabilità di Δ FosB in cellule intatte. ACK2 ma micca PKC sembra phosphorylate Δ FosB in cellule. Carte di fosfopeptidi bidimensionali di ΔFosB fosforilate da CK2 o PKC in vitro o per e cellule PC12 intatti. Le frecce mostranu a comigrazione di u peptide fosforilatu CK2 ma micca u fosforilatu PKC unu cù unu di i fosfopeptidi ΔFosB ottenuti da e cellule PC12. BA fosforilazione inFosB in cellule PC12 aumenta cunsidendu e cellule cù u piacere CK2 attivatore spermina (SP) è diminuitu da un trattu cù l'inhibitore CK2 DRB. In cuntrastu, a fosforilazione di osFosB in cellule PC12 ùn hè micca influenzata da un trattamentu cù un attivatore PKC (PMA) o calfostin-C (Calph) inibitore specificu di PKC. Un autoradiogramma rappresentativu (pannellu superiore) è un immunoblot (pannellu inferiore) sò presentati. C – F, Effettu di l'attività CK2 in a stabilità BFosB. I dati mostranu a rotazione di tempu (è autoradiogramma rappresentativu) di a degradazione di BFosB. Cellule PC12 esprimendu transientemente FosB sò stati sottu à sperienze pulse-chase fatti in assenza o presenza di l'inibitore CK2 DRB (C), spermina CK2 attivatore (D), o l'inibitore di a kinase spettrale larga H-8 (E), chì era adupratu per cuntrullà l'effetti nonspecifici di DRB. F, Effettu di abbattenu a subunità catalitica di CK2 in a stabilità ΔFosB. Celle di PC12 sò state trasfettate cù un siRNA nontargeting (Ctr) o siRNA avà CK2α di ratu è 24 h trasfettatu cun un plasmide ΔFosB. U pannellu di vechju raffigura imunoblotti di lizati integrali chì mostranu l'effettu di siRNA CK2 in i livelli di proteina CK2 è ΔFosB. L'immunoblottu corrispondente per β-tubulina hè dimustratu cum'è un controllo di carica.
Per indirizzà in più a rilevanza fisiologica di CK2 cum'è ΔFosB kinase, abbiamo trattatu with FosB-esprimendo cellule PC12 cù duie droghe chì modulanu attività CK2. Come mostra in figura 4BA fosforilazione di BFosB hè micca diminuita cù u travagliu di e cellule PC12 cù l'inibitore CK2 permeable à cellula DRB (Meggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995), è aumentatu di un trattu cù a poliamina spermina, cunnisciuta per esse un putente attivatore CK2 (Cochet è Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983). À u cuntrariu, u trattamentu di e cellule PC12 cù a calphostin-C inibitore PKC (Kobayashi et al., 1989; Tamaoki et al., 1990) o l'attivatore PKC PMA (Schmidt è Hecker, 1975; Beh et al., 1989) ùn hà micca causatu cambiamenti significativi in a fosforilazione di BFosB. In u PMA, u leggeru (è micca significativu) aumenta di 32P-ΔFosB puderia esse spiegata da un incremento di i livelli Δ FosB cum'è dighjà questu medicamentu; in realtà, hè statu ripurtatu chì l'èteri di fórbol inducei l'espressione di parechje proteine di a famiglia Fos, cum'è FosB (Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). Inoltre, u trattamentu di e cellule cù u inibitore specificu cell-permeable CaMKII m-AIP (Ishida è Fujisawa, 1995; Stevens et al., 1999) hà ancu micca causatu una diminuzione di fosforilazione di osFosB (dati ùn sò micca mostrati). Insemi, sti risultati sò in cunsuneria cù i nostri in vitro risultati è indichi chì in cellule intatte ΔFosB hè probabilmente fosforilatu da CK2 ma ùn PKC o CaMKII. U fattu chì l'inibizioni di CK2 ùn impegni micca completamente a fosforilazione di osFosB indica l'esistenza di siti di fosforilazione supplementari in a proteina.
Successivamente, ci sò state viste à sì chì CK2 abbia un rol in u fatturatu di BFosB è cusì in a so stabilità. A stu scopu, avemu conduttu esperimenti pulse-chase uttenendu treated FosB-espressing cellule PC12 trattati o in CK2 inibitori o CK2 attivatore utilizzati in u studiu di fosforilazione. Come mostra in figura 4C, a curazione di e cellule cun inibitore CK2 DRB hà avutu un impattu significativu nantu à a rotazione di rotazione di osFosB, evidenziata da u cambiamentu di forma di a so curva di degrinazione, da bifasicu a curva chì hè più vicinu a quella di un decadimento esponenziale. À u viceversa, a presenza di a spermina CK2 attivatore hà causatu una diminuzione significativa di u tassi di degrinazione di ΔFosB, chì hà portatu à l'accumulazione di a proteina durante e prime ore di a caccia (Fig. 4D).
Com'è u casu di parechji attivatori è inibitori kinasi, spermina è DRB ponu effetti umani chì dinò fora di a modulazione di l'attività CK2. In fatti, DRB hè statu dimustratu chì inibisce u fattore di trascrizione IIH (TFIIH) -sociated kinase (Yankulov et al., 1995), chì si verifica inibizione di a transcrizione RNA polimerasi II-mediata. Perchè st'effettu puderia influenzà a stabilità di BFosB, analizzàvemu l'effettu di l'inibitore di spazia à spezia larga H-8 (Hidaka è Kobayashi, 1992) per u fatturatu BFosB à una concentrazione (200 μm) cunnisciuta chì inibisce TFIIH-kinase associata ma micca CK2 (Yankulov et al., 1995). Come mostra in figura 4EU trattamentu cù H-8 ùn hà micca incalzatu u fattu di rotazione di BFosB. Simili risultati sò stati ottenuti cun H-7, un altru inibitore di spazie spaziale sputiche, adupratu à una concentrazione chì inibisce a kinase associata à TFIIH ma micca CK2 (dati ùn sò micca mostrati). Questi dati supportanu ancu a interpretazione chì a riduzione di a stabilità di BFosB causata da DRB hè più probabile attribuibile à l'inibizioni di CK2.
Per stabilì ulteriormente u rolu di CK2 in u fatturatu ΔFosB, abbiamo studiatu e conseguenze di l'abbattimentu di CK2 via siRNA. Avemu effettuatu sti sperienzii usendu cellule PC12 chì eranu cumu trasfettate cù siRNA di cuntrollu (nontargeting) o di un siRNA chì si dirige à l'ARNm di a subunità catalitica di CK2 di ratu (CK2α) e 24 h dopu transfettatu cun ΔFosB. Come mostra in figura 4Fa cunfusione di CK2α siRNA in modu efficiente è specificu scemparat i livelli di proteine CK2α senza influenzà i livelli di BFosB (pannello superiore). L'analisi di pulse-chase ha rivelatu chì u abbattimentu di CK2 hà avutu un incremento significativu di os FosB tasso di rotazione, chì evidenziava a più rapida degradazione di la proteina. U fattu chì l'inibizione di l'attività CK2 (sì per mezu di un trattu di DRB o di siRNA) aumenta u fatturatu di BFosB è pò dà a sparizione di u cumpunente di ritardu lente di a curva bifasica, mentre l'attivazione CK2 aumenta a fase lenta di a curva, fornisce un forti supportu per l'idea chì CK2 svolge un rolu in a regolazione di a stabilità di BFosB.
CK2 fosforila B FosB in Ser27
Per cuminciare à identificà i situi in BFosB fosforilati da CK2, anu fattu analisi di fosfo-aminoacidi di ΔFosB recombinante fosforilati da CK2 in vitro è di BFosB fosforilatu in cellule PC12. Questi sperienze anu rivelatu chì, in i dui casi, u solu fosfo-aminoacidu detvertitu hè statu fosfo-seriu (Fig. 5A). Sta scuperta, cun a stechiometria ottenuta per u CK2 in vitro reazione di fosforilazione (∼50%) (Fig. 3B) è a presenza di solu unu spot significativu nantu à a mappa CK2 fosfopeptide (Fig. 4A), suggerisce chì a fosforilazione di CK2 di ΔFosB hè prubabilmente limitata à un unicu restu di serina. Questa conclusione hè cunsiste cù l'analisi di u sferentu di fosforilazione di cunsensu (Fig. 2B), chì prognunisce solu un candidatu serine, ie Ser27, per CK2. L'analisi taxonomica hà rivelatu chì Ser27 hè assai conservatu da l'evoluzione di i membri di a famiglia Fos (Fig. 5B), suggerendu chì si pò tene una funzione fisiologica impurtante.
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Figura 5.
CK2 Phosphorylates FosB on Ser27. AAnalisi di fosfoamino à CK2-fosforilati (in vitro) ΔFosB cellulare-fosforilatu PC12 dimustrendu chì, in i dui casi, u restu maghju fosforilatu hè a serina. BL'analisi di e spezie incrociate di a secrezzione di aminoacidi di FosB / BFosB hà rivelatu un'alta conservazione di Ser27 à i membri di a famiglia Fos da umanu à zebrafish (dark highlight). Tuttavia, u restu acidu à a posizione + 3, chì hè necessariu per u situ di consensus CK2, ùn hè micca conservatu (luce evidenziatu). CI celluli HeLa sò stati transfettati transitoriamente cù eitherFosB (WT) di tipo salvaje o ΔFosB con una mutazione puntuale per sostituì Ser27 con Ala (S27A). E Celle sò state etichettate metabolicamente cù 32PH3PO4 è trattatu cù veìculu o cù spermina (SP) per attivà CK2. Un autoradicogramma rappresentativu (pannello superiore) è un immunoblot (pannellu inferiore) di l'immunoprecipitate Δ FosB ottenuti sò mostrati. L'immunoprecipitate di cellule mock-transfectate (vector) hè mostra.
Per determinà sì Ser27 hè fosforilatu in osFosB, mutavamu stu restu in Ala, è analizzàvule e conseguenze nantu à u statu di fosforilazione di a proteina. A stu scopu, avemu usatu cellule HeLa (chì ponu esse trasfettate cù una maghjine più alta) per esprimà di modu transitariu WT o S27A mutante ΔFosB. Circa 24 h dopu a transfezione, e cellule sò state etichettate metabolicamente cù 32P-ortofosfatu, è lizati di cellule integrali sò stati preparati. Dopu l'immunoprecipitazione è u SDS-PAGE, 32P-ΔFosB hè statu rilevatu per autorejadiografia è os FosB cumplessu per immunoblotting. Come mostra in figura 5C (Pannellu inferiore), ΔFosB ùn hè statu micca rilevatu in a cellule trasfettate da vene, mentre e cellule transfette cù un mutante WT o S27A osFosB hanno espressu con successu a proteina. Avemu scupatu chì a mutazione S27A hà causatu una significativa (∼30%) riduzione in 32P-ΔFosB livelli (Fig. 5C, pannellu superiore è grafico), chì indica chì in cellule viventi, ΔFosB hè fosforilatu nantu à Ser27. In un sforzu per stabilisce sì in e cellule Ser27 hè infatti fosforilatu da CK2, hà parvenutu a capacità di l'attivatore CK2 di modulare la fosforilazione di WT e S27A ΔFosB. Comu avemu observatu in precedenza in cellule PC12 (Fig. 4B), u trattamentu di e cellule HeLa cù spermina hà aumentatu significativamente a fosforilazione di a proteina WT. U fattu chì questu effettuu sia diminuitu significativu da a mutazione S27A (Fig. 5C) sustene l'interpretazione chì Ser27 in ΔFosB hè un substratu fisiologicu per CK2.
A fosforilazione di Ser27 regula a stabilità di BFosB
Avendu stabilitu chì a stabilità di FosB hè diminuita quandu CK2 hè inibita è migliorata quandu CK2 hè attivatu (Fig. 4), è chì CK2 fosforila u B FosB in Ser27 (Fig. 5), avemu predettu chì a prevenzione di a fosforilazione di stu situ deve destabilisà a proteina. L'esperienze pulse-chase fatte cun cellule HeLa esprimenti transitoriamente WT o mutante S27A ΔFosB hanno rivelato che, cum'è previsto, la mutazione S27A ha causato un aumento significativo del tasso di degradazione di FosB, e una diminuzione concomitante nella vita di mezzo vita della proteina (Fig. 6A). Dopu, investigavamu si questu meccanismo di regolazione si sviluppa ancu in a linea di cellule PC12 più neuronica. Quessi sperienze anu rivelatu chì, cum'è avemu observatu in le cellule HeLa, a mutazione puntuale S27A causa una drammatica diminuzione in a vita di mezza vita di ΔFosB in cellule PC12 (da ∼11 a ∼4 h)Fig. 6B). U fattu chì sta destabilization hè simile à quellu causatu da CK2 inibizione o knock-down (Fig. 4) dà più appoghju à l'idea chì a fosforilazione mediata da CK2 di Ser27 regula a stabilità di BFosB. L'evidenza addizionale di u rolu regolatore di a fosforilazione di Ser27 su u fatturatu di a proteina turnoverFosB fu ottenuta usando una mutazione Ser27 fosfomimetica à Asp (S27D). A mutazione S27D hè cunsiderata fosfomimetica, perchè mette un grande gruppu caricatubile negativamente (carboxilu) à l'amminuichidi 27 è metti in parte a fosforilazione di Ser27. Come mostra in figura 6C, a mutazione S27D hà causatu l'effettu opposu di a mutazione S27A è hà davutu una proteina significativamente più stabile di a proteina WT. Altrimenti à l'effettu ottenutu dopu a attivazione CK2 (Fig. 4D), a mutazione S27D hà avutu cumunamentu è cusì aumentò i livelli di osFosB durante e prime ore di caccia.
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Figura 6.
A fosforilazione di Ser27 regula a stabilità di BFosB. A, C, Analisi di pulse-chase chì mostra l'effettu di a fosforilazione Ser27 à a frequenza di rotazione di ΔFosB. Vengono mostrati u profilu di degradazione è a mezu vitale stimata di FosB (WT) di natura salvatica, di u mutante Ser27 à Ala (S27A), e di u mutante fosfimimeticu Ser27 à Asp (S27D). I stessi risultati sò stati ottenuti in cellule HeLaA) e cellule PC12 (B, C).
A fosforilazione Ser27 stabilisce BFosB impedendu a sua degradazione di proteasomal
Per inizià a chiarucazione di u meccanismo per chì a fosforilazione di Ser27 stabilisce ΔFosB, abbiamo studiatu l'abilità di l'inibitori di proteasoma MG132 (Palombella et al., 1994; Tsubuki et al., 1996) è epoxomicin (Hanada et al., 1992; Kim et al., 1999) per modulate a tassi di degradazione di WT è S27A mutante ΔFosB. L'esperienze per impulsi-caccia è stata condotta usando cellule PC12 infettate da un HSV ricombinante esprimente WT o S27A Δ FosB e trattati con DMSO o con uno di i due inibitori di proteasoma. Questi sperienze anu rivelatu chì ancu u ritmu di degradazione di a proteina WT hè relativamente insensibile à a presenza di unu di i dui inibitori di proteasomaFig. 7A), quellu di u mutante S27A hè sensibile à queste droghe (Fig. 7B). Hè indichiatu chì, à differenza di a proteina WT, u mutante S27A hè un bersatu di degradazione di u proteasomal. In verità, u trattamentu di e cellule cun MG132 o epoxomicin hà arginatu cum'è pienu l'effettu di a mutazione S27A nantu à a percentuale di degradazione di ΔFosB, evidenziata da un aumentu di a vita di mutu di u mutante S27A da ∼4 ∼9 h per MG132 e ∼12 h XNUMX h per epoxomicin (Fig. 7B). Insemi, questi risultati mostranu chì a fosforilazione di BFosB in Ser27 protegge a proteina da a degradazione di u proteasomale è hè cusì essenziale per a so stabilità insolita.
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Figura 7.
A fosforilazione di Ser27 stabilisce Δ FosB impedendu a sua degradazione di proteasomal. A, B, Analisi di pulse-chase cù cellule PC12 infettate da HSV chì mostranu u profilu di degrinazione è a vita media stima di BFosB di natura salvaticaA) o S27A ΔFosB (B) in mancanza o a presenza di unu di i dui inibitori di proteasoma [MG132 è epoxomicin (Epoxo)]. Notà u fattu chì nè u medicu hà un impattu significativu nantu à u fatturatu di BFosB di tippu salvaticu, mentre u trattamentu di e cellule cù un inibitore di u proteasoma ha determinatu a stabilizzazione di S27A ΔFosB. C, Un mudellu per u rolu di a fosforilazione Ser27 in a capacità di BFosB di mediate a plasticità cerebrale a lungu tempu. Una volta indotta, una porzione di FosB hè stabilizzata in u cervellu da a fosforilazione mediata da CK2 di S27. Quì si ottiene in a so accumulation, chì a so risultò in cambiamenti duraturi in l'espressione genica. Queste cambiamenti stabili in l'espressione genica contribuiscenu à adattamenti comportamentali stabili. È u cuntrastu, a defosphorylation di S27 da i fosfatasi Ser / Thr PP1 e / o PP2A si traduce in una destabilisazione di a proteina è in a so elaborazione di u maceteru proteasomale.
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In questu studiu, dimostremu chì BFosB ha una vita di mezu vita di ∼10 h in cultura cellulare, chì rende stabile paragunatu cù FosB piena di lunghezza è a maggior parte di altri fattori di transcription inducibili, chì a so vita media in a cultura cellulare cum'è pochi minuti è raramente supere 3 h (Hann è Eisenman, 1984; Dobrazanski et al., 1991; Roberts è Whitelaw, 1999; Ferrara et al., 2003; Hirata et al., 2004). Inoltre, truvamu chì BFosB hè fosforilatu in u cervellu è chì a so fosforilazione hè sensibile à l'inibitore PP1 / PP2A acidu okadaic. I nostri studii di cultura cellulare dimustranu chì a stabilità di B FosB hè modulata da CK2, cù attività più alta CK2 stabilendu a proteina. Infine, i nostri risultati ghjunghjenu chì CK2 fosforila BFosB in un serina terminale altamente cunservata (S27) è dimostra chì a fosforilazione di S27 protegge ΔFosB da degradazione proteasomale. Propunemu dunque un mudellu chì a fosforilazione di BFosB su S27 da CK2 è un meccanismo di regolazione critica di u fatturatu di ΔFosB (Fig. 7C). Questa stabilizazione mediata da fosforilazione di BFosB hè funziunariamente impurtante, chì e livelli elevati di B FosB in regioni particulari di u cervellu sò stati mustrati per regulà direttamente numerosi geni neuronali in vivo è di esercità putenti effetti comportamentali in mudelli animali di parechje patologie neuropsichiatrichi (vedi Introduzione).
Benchè a fosforilazione sia un modu rapidu è reversibile di regulà l'attività trascrizzionale di certi fattori di trascrezione, cume CREB (proteina da cunnessione di l'elemento di risposta cAMP) (Bohmann, 1990), modulà a degradazione di i fattori di trascrezioni prevede una forma ancu di più putente (meno facilmente reversibile) di a regolazione (Desterro et al., 2000). I fattori di trascrezioni chì l'attività funzionale hè regolata à u livellu di a so degradazione includenu NFκB (Desterro et al., 2000), c-Myc (Sears et al., 1999), è c-Fos (Ferrara et al., 2003), trà altri. In molti casi, a fosforilazione hè un regolatore di più di a stabilità di un fattore di trascrezione, cum'è hè dimostratu per c-Fos (Okazaki è Sagata, 1995; Tsurumi et al., 1995), Antigen-FN-1 Related (Fra-1) (Vial è Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe et al., 2001), c-Jun (Fuchs et al., 1996), JunB (Fuchs et al., 1997), ATF2 (Fuchs et al., 2000), è p53 (Buschmann et al., 2001). I nostri studii aghjunghjenu cusì BFosB à sta lista di fattori di trascrezione chì a so attività funzionale hè regolata cù a so stabilità dipende da u fosforilatu.
CK2 hè una kinase Ser / Thr onnipresente è costitutivamente attiva chì hà> 300 presupposti sustrati identificati finora è implicata in più processi biologichi, inclusa a morte cellulare è a sopravvivenza (Litchfield, 2003; Unger et al., 2004), risposte à l'accentu di u stress cellulare (Yanagawa et al., 1997; Kato et al., 2003), è riparazione di u DNA è rimodellamentu di a cromatina (Barz et al., 2003; Krohn et al., 2003). Più di un terzu di i substrati putativi di CK2 sò proteine chì sò implicate in a regolazione di l'espressione genica (Meggio è Pinna, 2003). In fatti, CK2 hè statu dimustratu esse una cinasa nucleare prominente (Krek et al., 1992) (per revisione, vede Yu et al., 2001) è di interagisce cù i domini di bZIP di parechji fattori di trascrezione (Yamaguchi et al., 1998). A fosforilazione mediata da CK2 hè ancu dimostratu chì modulate a degradazione (o migliora o scende) di parechje proteine, annantu à l'IkB (Schwarz et al., 1996), PTEN (Torres è Pulido, 2001), lente di la connexina (Yin et al., 2000), proteina associata à a cromatina HMG1 (Wisniewski et al., 1999), è parechji fattori di trascrezioni cume HMGB (Stemmer et al., 2002), Myf-5 (Winter et al., 1997), è c-Myc (Channavajhala è Seldin, 2002). CK2 hè più impurtante in u cervellu (Alcazar et al., 1988; Girault et al., 1990), è a so attività hè stata implicata in parechji aspetti di a funzione cerebrale, cumpresu a sopravvivenza neuronale (Boehning et al., 2003), differenziazione (Nuthall et al., 2004), funzione di canale ionicu (Jones è Yakel, 2003; Bildl et al., 2004), è una potenziazione à longu andà è una plasticità neuronale (Diaz-Nido et al., 1992; Lieberman è Mody, 1999; Reikhardt et al., 2003).
Malgradu sta evidenza crescente di u rolu di CK2 in a regolazione di a funzione neuronale, pocu hè cunnisciutu nantu à ciò chì controlla a so attività. Si pensa à CK2 di esse constitutivamente attivu, cù una regolazione di a so capacità di fosforifà substrati specifici basandosi principalmente in cambiamenti in a so localizazione intracellulare (eg, citosol vs nucleo) (Ahmed è Tawfic, 1994; Yu et al., 1999). Queste informazioni suscitanu una questione impurtante riguardu ciò chì i segnali sò richiesti per induce una accumulazione di BFosB in u cervellu dopu a stimolazione cronicaFig. 7C). Un requisitu hè ripetutu attivazione di fosB gene è induzione di ΔFosB mRNA (Chen et al., 1995). I nostri dati indichi chì a fosforilazione di CK2 di ΔFosB hè critica per a so stabilità, suggerendu chì un secondu signale pò esse necessariu per gli effetti à longu andà di BFosB sull'espressione di i geni, vale à dì, un segnale chì stimula a fosforilazione di proteine da CK2. Questu puderia impurtà l'attivazione di CK2 da qualchì mecciu scunnisciutu o a so traslocuzione versu u nucleo. L'alternativa, a fosforilazione di CK2 di ΔFosB pò esse constitutiva, tali chì cum'è a proteina Δ FosB si traduce in risposta à ogni stimulu, una parte di questu ottiene fosforilata è stabilizzata, cusì cun stimolazioni ripetute si accumula in alti livelli in neuroni affettati.
I nostri risultati ghjunghjenu chì CK2 è S27 ùn sò, probabilmente, solu l'unicule kinase è situazione impurtante di a fosforilazione di BFosB, perchè nè l'inibizioni di CK2 nè a mutazione S27A pussutu impedisce completamente a fosforilazione di BFosB. Hà u sensu, u fattu chì a mutazione S27A traduce una riduzione di 30% in phospho-osFosB argumenta chì S27 è un situ principale di fosforilazione di a proteina. Sò, comunque, indagendu altre pinesi kinasi è siti di fosforilazione nantu à ΔFosB. In definitiva, sarà impurtante analizzà a fosforilazione di S27 è qualsiasi altri siti di fosforilazione in ΔFosB in cervello in vivo dopu à vari tipi di stimolazioni croniche, per esempiu, cù l'usu di spettrometria di massa o anticorpii fosfospecifici.
Come sopra citatu, S27 in ΔFosB hè altamente conservatu tutta in evoluzione è à mezu à altre proteine di famiglia Fos. Tuttavia, u situ cunsensu per CK2 ùn hè micca: cum'è mostra figura 5B, solu FosB / Δ FosB (è u xenologu di Zebrafish), ma micca c-Fos o Fra-2, postu un restu acidu à + 3, un determinante di primu di a fosforilazione di CK2 (Marin et al., 1986; Meggio et al., 1994). Dunque, a mancanza di fosforilazione di CK2 su S27 pò spieghjere perchè e altre proteine di a famiglia Fos ùn sò micca stabili cum'è ΔFosB. Tuttavia, questu ùn spiega perchè FosB piena di lunghezza, chì hà u situ di consensus CK2 cum'è ΔFosB, ùn hè micca stabilizatu. Ùn sapemu se FosB piena di lunghezza hè fosforilata da CK2 per questo residu conservatu. I soli segnalazioni di FosB (Skinner et al., 1997) è c-Fos (Okazaki è Sagata, 1995; Chen et al., 1996) a fosforilazione descrive i siti in a regione C-terminale di queste proteine, chì sò assenti in ΔFosB. A fosforilazione potenziale di FosB full-length è altre proteine di famiglia Fos da CK2 necessita investigazione diretta. Tuttavia, ancu se sò fosforilate, l'altre proteine di a famiglia Fos sò cunnosce per contene motivi in i so C termini chì targetizanu e proteine per una degradazione rapida (Papavassiliou et al., 1992; Jariel-Encontre et al., 1997; Acquaviva et al., 2002). Per esempiu, hè statu dimustratu chì un distinu di residui ∼21 presenti in u terminale C di tutte e proteine di a famiglia Fos, ma assente in ΔFosB, agisce cum'è un domini destabilisante per c-Fos (Acquaviva et al., 2001). Avemu scupittatu chì ancu sta sequenza faci da destabilisce FosB piena di lunghezza (Carle et al., 2004), a mancanza di stu duminiu in BFosB ùn justificheghja micca solu a so stabilisazione. Invece, a cumbinazione di a mancanza di stu duminiu C terminus è a fosforilazione Ser27 pare cunsiderà appena a differenza di circa u cinque volte in a stabilità trà osFosB è FosB.
Benchè a degradazione di e proteine di a famiglia Fos sia complessa è ùn sia micca piense cumpressa, a degrado di proteasomal pari à a via principale implicata (Salvat et al., 1999; Acquaviva et al., 2002; Ferrara et al., 2003). I dati presentati quì, in u quali inibitori di proteasomale ùn alteranu micca u significatu di a degradazione di BFosB, argumentanu chì, à tempu da e altre proteine di famiglia Fos, ΔFosB elude il proteasoma di 26S, è questu svolge un rol primu in a so stabilizzazione. Propunemu dunque un schema per chì a stabilità migliorata di BFosB sia attribuibile à a combinazione di dui fattori principali: (1) l'absenza di un duminiu destabilisante C-terminale è (2) a fosforilazione di S27 da CK2.
Riassuntu, u presentu studiu furnisce una visione meccanistica nantu à u perchè Δ FosB, un pruduttu di u gene immediatamente pricipal fosB, hè, cun u altri membri di a famiglia Fos, una proteina relativamente lunga. Ancu se altre proteine di a famiglia Fos sò pensate di mediatiche accuglamentu rapidu ma transitorio di stimuli-trascrizzione (Morgan è Curran, 1995), a stabilità relativa di BFosB conferisce à questu a capacità di mediata cambiamenti trascrizzionali duraturi più indotti da a stimolazione cronica. Questu sustene u penseru chì BFosB funziende cum'è un cuntrollu moleculare sostenutu in u cervellu, trasformendu lentamente risposte acute in adattamenti croniche. L'identificazione di Ser27 fosforilazione cum'è un meccanismu centralizante per a stabilità di BFosB apre nuove vie per u sviluppu di mezzi per regulà a funzione di ΔFosB è in questu modulate i so effetti à longu andà à a plasticità neurale è comportamentale.
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Footnotes
- Ricevutu 21 di Novembre, 2005.
- A revisione hà ricevutu u Xennju 21, 2006.
- Accepted April 2, 2006.
- Questu travagliu hè statu supportatu da l'Alleanza Naziunale per a Ricerche nantu à Schizofrenia è u Premiu Young Investigator Award di PGU, un Premiu Istitutu Naziunale per l'abusu di droghe (NIDA) à u Serviziu di Ricerca Naziunale à PGU, è bourse da u Istitutu Naziunale di Salute Mentale è NIDA à EJN ringrazia u Dottore James Bibb per a so aiutu cù i in vitro i test di fosforilazione, dott. Ming-Hu Han per l'aiutu in a preparazione di fette cerebrali usate per l'etichettatura metabolica, è Dr. Rachael Neve per l'aiutu in l'imballu di i HSV ricombinanti.
- Indirizzu attuale di G. Rudenko: Istitutu di Scienze di a Vita è Dipartimentu di Farmacologia, Università di Michigan, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
- A cumpondenza deve esse indirizzata à Eric J. Nestler, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070. Email: [email prutettu]
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- Sufrepressione striatale di {Delta} FosB riprova Movimenti involuntarii indotti da Levodopa cronicu Journal of Neuroscience, 26 Può 2010, 30(21):7335-7343
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- Vulnerà durevuli à a ripresa di u comportamentu di ricerca di metamfetamina in i topi mutanti neurotropichi di fattore di linea cellula gliale U Journal FASEB, 1 lugliu 2007, 21(9):1994-2004
- U Fattore Transcrizzione Protein-1 Activator in Carcinogenesi di Epitelio Respiratorio Ricerca di Cancro Moleculare, 1 Februaru 2007, 5(2):109-120
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