Cdk5 Fosforilati Dopamine D2 Receptore è Attenuates Downstream Signaling (2013)

Citation: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 Receptor è Attenuates Downstream Signaling. PLoS ONE 8 (12): e84482. doi:10.1371/journal.pone.0084482

Scrittori: James Porter, Università di North Dakota, Stati Uniti d'America

Received: Mai 20, 2013; Accettate: Novembre 14, 2013; Publicatu: December 31, 2013

Drittijiet di u copyright: © 2013 Jeong et al. Questu hè un articulu d'accessu apertu distribuitu sottu i termini di u Creative Commons Attribution License, chì permette l'usu senza restriction, distribuzione è ripruduzzione in qualsiasi sustegnu, basta chì l'autore originali è a fonte sò accreditati.

Funding: Stu travagliu hè statu sustinutu da i sussidi (NRF-2012R1A2A2A01012923 è NRF-2012R1A4A1028200) da u guvernu coreanu (MSIP) è ancu sustinutu in u quadru di u prugramma di cooperazione internaziunale gestitu da NRF di Corea (2012K2A1A2033117 è Istitutu di Ricerca Brain BRI) (BRI) U prugramma di ricerca di basa di MSIP (2031-415). SKP hè statu un destinatariu di l'Alleanza Naziunale per a Ricerca in Schizofrenia è Depressione (NARSAD) 2004 è 2006 Young Investigator Awards. I finanziatori ùn anu avutu un rolu in u disignu di studiu, a raccolta di dati è l'analisi, a decisione di publicà, o a preparazione di u manuscrittu.

Interessi rivali: I autori anu dichjaratu chì ùn ci n'hè interessu contraria.

I MUVRINI

A signalazione di dopamina hè implicata in diverse funzioni cerebrali cumprese a coordinazione di u mutore, u cuntrollu di l'umore è i meccanismi di ricumpensa [1]. Un cumpunente maiò di a segnalazione di dopamina in i vertebrati hè esercitatu da i neuroni spinosi medii striatali (MSN) chì esprimenu selettivamente un sottogruppu di recettori di dopamina è ricevenu input dopaminergicu principalmente da l'area tegmentale ventrale (VTA) è a substantia nigra (SN).) [2]. I receptori di dopamina sò receptori G accoppiati à a proteina (GPCR) cù sette domini transmembrana è custituiti da dui sottotipi, Recettori D1-like è D2-like, chì medianu l'azzioni reciproche in a signalazione di dopamina [1]. Per esempiu, i receptori di dopamina D1-like (D1, D5) attivanu l'adenyyl cyclase attraversu G_αs è aumentanu u livellu intracellulare di cAMP, ma i receptori di dopamina D2-like (D2, D3, D4) inibiscenu adenylyl cyclase attraversu G_αi è diminuite u livellu intracellulare di cAMP [1], [3].

Trà i receptori di dopamina, u receptore D2 (DRD2) hè implicatu in a fisiopatologia di parechji disordini psichiatrici maiò cumprese l'esquizofrenia è a dipendenza da droghe. [4], cusì chì parechje droghe antipsicòtiche almenu parzialmente mira DRD2. Hè cunnisciutu ancu chì l'attività DRD2 correlate bè cù e cunsequenze cumportamentali di droghe di abusu in mudelli animali. [5]. L'antidepressivi è l'efficacità stabilizzatrice di l'umore sò stati ancu ligati à alterazioni in l'espressione di a superficia cellulare di DRD2 o signalazione intracellulare downstream mediata da PKA, ERK è GSK3. [1], [4], [6]. Malgradu questi roli critichi per DRD2 in u cervellu, i meccanismi regulatori detallati chì conferinu eterogeneità è cumplessità à e proprietà DRD2 ùn sò micca cumplettamente capiti.

E linee di evidenza cunvergenti indicanu chì parechje mudificazioni posttraduzionali sò implicate in a fine-tuning di l'attività DRD2. A glicosilazione estensiva di DRD2 hè stata rivelata in i primi studii di etichettatura di foto-affinità [7], è a furmazione di ligami disulfuru in DRD2 hè statu ancu identificatu cum'è una mudificazione impurtante per u ligand binding [8]. Inoltre, i siti di fosforilazione di DRD2 sò stati inizialmente identificati da in vitro analisi cù radioisotopi, chì furnisce rotte per diverse vie di regulazione mediate da diverse kinasi [9]. Infatti, a protein kinase C (PKC) regula a mobilizazione mediata da DRD2 di calcium intracellulare è modula l'interazzione di DRD2 cù e proteine ​​​​cytoskeletal. [10]. A fosforilazione da GPCR kinase 2 (GRK2) regula i mudelli di resensibilizazione indotta da agonisti di DRD2 [11].

A chinasi dipendente da ciclina 5 (Cdk5) hè una serina / treonina kinase diretta da prolina chì hà attività preferenziale per l'espressione specifica di u cervellu di i so attivatori essenziali, p35 è p39 [12]. Cdk5 hè implicatu in vari prucessi neuronali cumprese a migrazione neuronale è a guida assonale, è i topi nulli Cdk5 è p35 mostranu difetti in stratificazione corticale. [13]. Ricertamenti, hè statu dimustratu chì a fosforilazione di WAVE1 è ephexin da Cdk5 regula a morfogenesi di a spina dendritica. [14]. Inoltre, Cdk5 regula ancu i livelli di espressione di a superficia di u receptore NMDA, NR2B è i currenti NMDA mediati da NR2A. [15], [16]. Hè nutate chì parechje evidenza suggerenu una relazione intima trà Cdk5 è u sistema di dopamine. Cdk5 fosforila a tirosina idrossilasi (TH), regulendu a so stabilità, è cusì mantene l'omeostasi dopaminergica [17]. In i neuroni postsinaptici, quandu u residuu T75 di dopamina è a fosfoproteina-32kD regulata da AMP ciclicu (DARPP-32) hè fosforilata da Cdk5, pò inibisce l'attività PKA è cusì antagonizà a segnalazione PKA mediata da dopamina DRD1. [18]. Curiosamente, quandu a cocaina, un agonista indirettu di i recettori di dopamina, hè amministrata cronicamente in i rati, i livelli di mRNA è di proteine ​​​​di Cdk5 aumentanu in neuroni spinosi medii. [19]. In u cullettivu, Cdk5 pare esse implicatu in adattazioni sinaptiche indotte da droghe. In questu studiu, mostremu una interazzione funzionale di DRD2 è Cdk5 chì estende ancu u rolu di Cdk5 in a signalazione di dopamina.

Materiale è Metodi

Anticelli

Serums anti-coniglio sò stati risuscitati contr'à peptidi chì cuntenenu phospho-serine 321 (pS321) di u terzu ciclu intracellulare di DRD2 (D2i3). Phospho-peptide, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), hè stata utilizata per fà una colonna cunjugata à peptide per a purificazione di affinità (20401, PIERCE). L'anticorpu anti-pS321 hè statu arricchitu da un sistema di purificazione di affinità secondu l'istruzzioni di u fabricatore. L'anticorpu fosfo purificatu hè statu guardatu in PBS cù 0.1% azide di sodiu è 0.1% gelatina. L'anticorpu anti-mouse anti-Cdk5 (sc-249) è l'anticorpu anti-rabbit anti-p35 (sc-820) sò stati utilizati per u Western blotting è l'immunocitochimica di Cdk5 / p35. L'anticorpu anti-mouse anti-GFP (sc-9996) hè statu usatu per l'immunoprecipitation è Western blotting di DRD2-GFP. Anticorpo anti-coniglio anti-FLAG (sc-807), anticorpo anti-coniglio anti-HA (sc-805), anticorpo anti-topo anti-GST (sc-138) e anticorpo anti-topo anti-GAPDH (sc- 32293) sò stati acquistati da Santa Cruz Biotechnologies.

animali

U mouse p35 knockout era un rigalu gentile da u duttore Katsuhiko Mikoshiba in RIKEN Brain Science Institute in Giappone è utilizatu per a cultura di neurone primaria. I set di primer per a genotipizazione eranu 5'- GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC è 5'- TCCATCT GCACGAGACTAGT cum'è deskrittu prima. [20]. I topi ICR è i ratti Sprague Dawley sò stati usati per a preparazione di lisatu di u cervellu. Tutte e prucedure di l'animali sò stati appruvati da u Cumitatu Istituziunale di Cura è Usu di l'Animali di l'Università di Scienza è Tecnulugia di Pohang.

Costruzioni di Plasmidi

L'isoforma lunga DRD2 umana in un vettore di plasmidi EGFP-N1 è u terzu ciclu intracellulare di DRD2 (212-373 residui di aminoacidi inclusi i 29 residui di aminoacidi supplementari unichi per l'isoforma longa DRD2) in un vettore di plasmidi pFLAG-CMV-2 sò stati usati. U Cdk5 umanu hè stata inserita in un vettore di plasmidi pCMV-HA è p35 umanu hè stata inserita in un vettore di plasmidi pcDNA 3.1. U Cdk5 umanu hè statu inseritu sottu un promotore di citomegalovirus (CMV) inseme cù p35 umanu in un vettore pcDNA 3.1 per fà una custruzzione di doppia espressione (Cdk5 / p35) per immunocitochimica, analisi di internalizazione di u receptore, [XNUMX]³⁵S]-GTP_γTest di legame S, test di legame radioligand e test immunoenzimatico cAMP.

In Vitru Assai di kinase

IP-linked in vitro L'analisi di kinase hè stata realizata cum'è seguita. Un intero cervello di topo è stato lisato in 3 mL di tampone di lisi di eritrociti (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) da 20 colpi di un omogeneizzatore Dounce per ottenere un omogeneizzatore cerebrale. . I lisati sò stati incubati in ghiaccio per 30 min, sonicati è centrifugati à 16,000 × g per 10 min. I supernatanti sò stati immunoprecipitati cù l'anticorpu anti-rabbit anti-p35 per ottene un cumplessu Cdk5/p35 attivu. Complesso Cdk5/p35 e proteina di fusione GST purificata è stata miscelata con adenosina 5′-triposfato, [γ-³²P] (NEG-502H, PerkinElmer) è incubata in buffer kinase (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT) per 1 h à a temperatura di l'ambienti [18], [21]. U cumplessu Cdk5 / p25 purificatu (14-516, Millipore) hè statu ancu usatu per in vitro analisi kinase cum'è descrittu sopra. U buffer di carica di mostra 2 × hè aghjuntu à a mistura di reazzione è bollita à 100 ° C. I campioni sò stati sottumessi à SDS-PAGE è u gel seccu hè statu valutatu per autoradiografia.

Cromatografia liquida (LC) - Analisi di spettrometria di massa (MS) / MS

A proteina GST-D2i3 ricombinante hè stata analizzata da LC-MS / MS dopu IP-linked in vitro analisi di kinase. Avemu realizatu l'identificazione di peptidi di dati LC-MS / MS cù X!!Tandem (versione Dec-01-2008). Ogni schedariu di dati RAW hè statu prima cunvertitu in mzXML utilizendu a pipeline trans-proteomica (TPP; versione 4.3). I scans MS / MS in i mzXML cunvertiti sò stati allora sottumessi à a ricerca contr'à a basa di dati di a sequenza di a proteina di u mouse UniProt (release 2010_07) cumprese a sequenza GST-D2i3 cù X!! Tandem. A tolleranza hè stata stabilita à 3 Da per ioni precursori è 2 Da per ioni fragmentati. A specificità di l'enzima per a tripsina hè stata utilizata. Opzioni di modificazione variabile sò state utilizzate per a carbamidometilazione di cisteina (57.021 Da), l'ossidazione di metionina (15.995 Da), l'idrolisi di asparagina (0.987 Da) è a fosforilazione di serina (79.966 Da).

Immunoprecipitazioni

L'immunoprécipitation a été effectuée sur les lisés cellulaires dans le tampon de lise ELB. L'anticorpu anti-GFP hè statu aghjuntu à i lisati è incubatu per 3 h à 4 ° C. L'immunocomplessi sò stati purificati cù a proteina-A agarose. I precipitati sò stati incubati cù un tampone di carica di campioni SDS per 30 min à 37 ° C, è sottumessi à SDS-PAGE è Western blots.

Assai di pull-down GST

10 µg di GST purificata è GST-D2i3 sò stati incubati cù lisatu di cervellu di ratto per 1.5 h à 4 ° C. 30 µL di perle Sepharose 4B coniugate con glutatione (GSH) (17-0756-01, GE Healthcare) equilibrate con tampone di lisi sono state aggiunte e incubate per 1 ora supplementare. I perle sò stati cullati per centrifugazione à 2,000 ×g e sciacquate con tampone di lisi 4 volte [22], [23]. I precipitati sò stati analizati da Western blotting utilizendu anticorpi anti-Cdk5 è anti-p35.

Immunocitochimica

Le cellule HEK 293 trasfettate e i neuroni striati coltivati ​​su vetrini sono stati lavati una volta con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e fissati per immersione in paraformaldeide/PBS fredda 4% per 30 min. L'anticorpu primariu hè statu diluitu in a suluzione di bloccu (2% serum cavallu è 1% Triton X-100 in PBS). L'anticorpu anti-mouse Alexafluor-647-conjugated (A20990, Invitrogen) è l'anticorpu anti-rabbit Alexafluor-568-conjugated (A11011, Invitrogen) sò stati usati com'è anticorpi secundari. Hoechst sò stati usati per a tintura di nucleu. L'imaghjini sò stati ottenuti da microscopia confocale (Olympus, FluoView-1000).

Assai di Internalizazione di u Receptor

24 h dopu a trasfezzione, e cellule sò state trattate cù quinpirole 1 µM (Q102, Sigma) per 30 min è 90 min à 37 ° C. E cellule sò state sospese in 2 mL di PBS freddo è aliquote di 200 µL sò state utilizzate per ogni reazione. I trattamenti di droga sò stati realizati à a temperatura di l'ambienti per 3 h à e seguenti concentrazioni; 3 nM [³H]-spiperone (NET-565, PerkinElmer), sulpiride 3 µM (895, TOCRIS), aloperidolo 10 µM (H1512, Sigma). idrofobu [³L'H]-spiperone è stato utilizzato per etichettare i recettori totali espressi e il sulpiride idrofilo è stato utilizzato per sostituire i recettori membranosi legati [1].³H]-spiperone signali. I signali di u receptore associati à a membrana sò stati calculati sottrattendu i valori di u receptore intracellulare da i valori totali di u receptore espressi. E cellule sò state filtrate nantu à un filtru GF/B (Millipore) è lavate 3 volte cù tampone di lavaggio (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). I filtri sò stati secchi è a radiuattività residuale hè stata misurata cù un contatore di scintillazione di liquidu [24].

Preparazione di a membrana cellulare

Le cellule confluenti in piatti di cultura da 100 mm dopo a trasfezione sono state lavate con PBS freddo e raccolte in 1 mL di tampone HME (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl.₂, EDTA 1 mM). I lisati omogeneizzati sò stati centrifugati cù 500 × g per 15 min è i supernatanti sò stati successivamente centrifugati cù 36,000 × g per 30 min. Pellets ri-sospesi in buffer HME sò stati utilizati per i saggi.

[³⁵S]-GTP_γS Essai de liaison

Le frazioni di membrana cellulare sono state pre-incubate con quinpirole 1 µM (Q102, Sigma) nel tampone di analisi (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA è 0.01 mM GDP) per 10 min. [³⁵S]-GTP_γS (NET-030H, PerkinElmer) hè statu aghjuntu à a cuncentrazione finale di 3 nM in 30 µL è ulteriormente incubatu per 90 min. 170 µL di tampone ghiacciato (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, è 0.1 mM GTP) hè statu aghjuntu per piantà a reazione. I membrane sò stati filtrati nantu à un filtru GF / B (Millipore) è lavati 3 volte cù tampone di lavaggio (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). I filtri sò stati secchi è a radiuattività hè stata misurata cù u contatore di scintillazione [25], [26].

Essai de liaison de radioligand

Les membranes cellulaires préparées sont incubées à 0.01 nM.³H]-spiperone (NET-565, PerkinElmer) e concentrazioni crescenti di quinpirole (Q102, Sigma) per 30 min nel tampone di analisi (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). I membrane sò stati filtrati nantu à un filtru GF / B (Millipore) è lavati 3 volte cù tampone di lavaggio (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). A reazione hè stata terminata da una filtrazione rapida attraversu filtri GF/C. A radiuattività residuale hè stata misurata cù un contatore di scintillazione liquida [27]-[29].

Test immunoenzimatico cAMP

Le cellule HEK 293 trasfettate sono state pretrattate con 10 µM di rolipram (R6520, Sigma) per 1 h, e poi trattate con 0.1 µM di forskolina (F6886, Sigma) e concentrazioni crescenti di quinpirole (Q102, Sigma) per 30 min. I neuroni striatali coltivati ​​primari sono stati trattati con 10 µM di rolipram per 1 h, e poi 1 µM di dopamina per 1 h. [22]. I lisati cellulari sò stati preparati cù HCl 0.1 M è i livelli di cAMP sò stati rilevati da un kit immunoassay enzimaticu cAMP (Sapphire Bioscience) seguendu l'istruzzioni di u fabricatore.

Neurone striatale di cultura primaria

L'area striatale hè stata isolata da u cervellu embrionale di u mouse (E15). U tissutu dissecatu hè statu dissociatu in media essenziale minima (MEM) (11095, Invitrogen) chì cuntene 0.25% tripsina (T4549-100, Sigma) è 0.1% DNase I per 6 min à 37 ° C. E cellule sò state risuspendute in i media di plating (MEM cù 0.01 M HEPES (pH 7.4) è 10% (vol / vol) di cavallu di serum (16050-122, GIBCO)). I neuroni sò stati cultivati ​​per 7 ghjorni in vitro (DIV 7) in MEM cun supplementu B27 (17504-044, Invitrogen) prima di esse applicatu à l'immunoassay enzimaticu cAMP.

Risposte alla lingua

Cdk5 fosforila a serina 321 in u terzu ciclu intracellulare di DRD2 in vitro

Per identificà novi substrati Cdk5, avemu realizatu una ricerca sistematica utilizendu (S / T) PX (K / H / R) cum'è e sequenze di cunsensu di ricunniscenza Cdk5. [30] è identificatu DRD2 cum'è un sustrato candidatu. A sequenza di cunsensu, cumpresa a serina 321, si trova in u terzu ciclu intracellulare di DRD2 (D2i3) induve sò stati implicati diversi mecanismi regulatori. [3], [10], [11]. A sequenza hè cunservata evolutivamente in DRD2 in vertebrati, chì implica una impurtanza funziunale di u residuu (Fig. 1A).

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Figura 1. Cdk5 fosforila serina 321 in u terzu ciclu intracellulare di DRD2 in vitro.

(A) Allineamentu di a sequenza di aminoacidi chì mostra e regioni cunservate di u DRD2 da diverse spezie (ombreggiate). U situ potenziale di fosforilazione Cdk5 hè indicatu da un asteriscu. (B) IP-linked in vitro analisi chinasi con proteine ​​GST-D2i3 e GST-D2i3 ricombinanti mutanti. U cumplessu Cdk5 / p35 arricchitu da l'estrattu di u cervellu di u topu da l'immunoprecipitazione anti-p35 hè stata utilizata per e reazzioni di cinasi. Un autoradiografu di proteine ​​​​fosforilate hè mostratu cù Coomassie colorazione blu brillanti di u stessu gel. A punta di freccia indica un signalu radiuattivu currispundente à GST-D2i3s è a punta di freccia aperta indica i signali radioattivi da p35. (C) Spettru MS / MS di u frammentu di peptide fosforilatu di D2i3. I mudelli di frammentazione teorichi sò mostrati sottu à u spettru. Trà tutti i frammenti di ioni, i ioni y- è b-detecati sò denotati in u spettru. U y₆ è y₇ Ioni indicanu fermamente a fosforilazione di serina 321. (D) In vitro analisi di chinasi cù cumplessu Cdk5 / GST-p25 purificatu cù proteine ​​​​mutanti GST-D2i3 è GST-D2i3. E proteine ​​​​fosforilate sò state mostrate in un autoradiografu, inseme cù a tintura blu brillanti di Coomassie. A punta di freccia indica u signale radioattivu currispundente GST-D2i3 è a punta di freccia aperta indica i segnali radioattivi da GST-p25.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Per valutà a capacità di Cdk5 à fosforilà D2i3, avemu realizatu IP-linked in vitro saggi di cinasi chì utilizanu un cumplessu Cdk5 / p35 attivu arricchitu da lisatu di u cervellu di u topu da l'immunoprecipitazione p35 cù proteine ​​​​GST-D2i3 ricombinanti purificate (residui aminoacidi 212-373) cum'è substrati. Avemu osservatu segnali di fosforilazione in e proteine ​​purificate GST-D2i3 è GST-D2i3 S297A, ma u signale hè statu significativamente diminuitu cù GST-D2i3 S321A (Fig 1B). Per verificà ulteriormente a fosforilazione di serina 321 in u GST-D2i3, avemu realizatu analisi LC-MS / MS di i campioni da IP-linked. in vitro analisi di chinasi cù spettrometria di massa LTQ XL. In modu coerente, i fosfo-peptidi chì currispondenu à a massa di phospho-serine peptides 321 sò stati recuperati (Fig 1C). Cunsiderendu chì l'acquistu dipendente da dati durante l'analisi LC-MS / MS tende à detectà proteine ​​​​abbundanti in u campione [31], sta dati suggerisce chì u residu di serine 321 hè u situ di fosforilazione dominante di Cdk5 in a regione D2i3. Per pruvà a fosforilazione diretta di serina 321 in u GST-D2i3 da Cdk5, in vitro L'analisi di chinasi utilizendu un cumplessu Cdk5 / GST-p25 purificatu cù proteine ​​​​GST-D2i3 ricombinanti purificate hè stata realizata. Avemu identificatu un signalu di fosforilazione significativu in u GST-D2i3 chì era assente in u GST-D2i3 S321A (Fig 1D). Inseme, questi risultati indicanu chì u residuu D2i3 S321 hè un mira preferenziale per a fosforilazione mediata da Cdk5.

Cdk5 fosforila la serina 321 in a terza ansa intracellulare di DRD2 in cellule

Per identificà a fosforilazione di a serina 321, avemu risuscitatu anticorpi specifichi per a fosfo-serina 321 (pS321). Samples da l'IP-linked in vitro L'analisi di kinase sò stati analizati da Western blotting cù l'anticorpu anti-pS321. Blots hà dimustratu una banda distinta in a reazione kinase chì era dipendente da GST-D2i3 (Fig. 2A). Per verificà a fosforilazione potenziale di serina 321 in DRD2 da Cdk5 in cellule, l'immunoprecipitati anti-GFP da cellule HEK 293 chì esprimenu DRD2-GFP è DRD2 S321A-GFP cù o senza HA-Cdk5 è p35 sò stati analizzati da Western blotting cù anti-GFP è anticorpi anti-pS321. I segnali caratteristici di banda sbavata da l'anticorpu anti-GFP chì sò cunnisciuti per esse dovuti à una glicosilazione eccessiva di DRD2 sò osservati solu in a presenza di DRD2-GFP, è l'anticorpu anti-pS321 hà rilevatu segnali DRD2 simili solu cù l'espressione Cdk5/p35.Fig 2B) [7]. Per verificà più a fosforilazione di serina 321 da Cdk5, D2i3 (FLAG-D2i3) è a forma mutante di D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) sò stati generati. FLAG-D2i3 è FLAG-D2i3 S321A espressi cù o senza HA-Cdk5 è p35 in cellule HEK 293 sò stati analizati da un test di mobilità SDS-gel. Un significativu cambiamentu di mobilità dipendente da Cdk5 hè statu osservatu per FLAG-D2i3, ma micca per FLAG-D2i3 S321A (Fig 2C). Avemu ancu valutatu u livellu di fosforilazione di DRD2 à Ser321 nantu à stimulazione agonista. E cellule HEK 293 chì esprimenu u cumplessu DRD2-GFP è Cdk5/p35 sò stati stimulati da quinpirole, è l'immunoprecipitati anti-GFP da i lisati cellulari sò stati analizati da Western blotting utilizendu anticorpi anti-GFP è anti-pS321. Avemu trovu chì a fosforilazione mediata da Cdk5 di DRD2 à Ser321 ùn era micca affettata da l'estimulazione agonista, chì pareva diversa da fosforilazione mediata da GRK è PKC (Fig 2D) [32], [33]. Inseme, questi risultati indicanu chì Cdk5 pò fosforilà u residu di serina 321 di DRD2 in l'ambiente cellulare.

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Figura 2. Cdk5 phosphorylates serine 321 in u terzu ciclu intracellulare di DRD2 in cells.

A fosforilazione mediata da Cdk5 di a serina 321 hè stata analizata cù l'anticorpu anti-pS321. (A) Campioni da IP-linked in vitro L'analisi di cinasi cù e proteine ​​​​GST-D2i3 sò stati analizati da Western blotting (WB) cù anticorpi indicati. I punte di freccia indicanu GST-D2i3s. (B) DRD2-GFP è DRD2 S321A-GFP sò stati espressi cù o senza HA-Cdk5 è p35 in cellule HEK 293. L'immunoprecipitati anti-GFP sò stati analizati da Western blotting utilizendu anticorpi anti-GFP è anti-pS321. U bracket indica signali DRD2 è a punta di freccia aperta indica signali non specifichi da l'immunoprecipitates anti-GFP. '% input' hè u voluminu % di lisatu tutale per una reazione IP. I signali Cdk5 endogeni debuli sò stati indicati da asterischi. (C) Analisi di mobilità in gel. E cellule HEK 293 trasfettate come indicato sono state analizzate da Western blot. (D) E cellule HEK 293 trasfettate sò state trattate cù quinpirole è l'immunoprecipitati anti-GFP sò stati analizati da Western blotting cù anticorpi anti-GFP è anti-pS321. La pointe de flèche ouverte indique des signaux non spécifiques des immunoprécipités anti-GFP.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 Complex è DRD2 sò Fisicamente Associati

Avemu investigatu l'interazzione fisica potenziale trà u cumplessu Cdk5 / p35 è DRD2 perchè parechji sustrati Cdk5 sò cunnisciuti per esse fisicamenti assuciati cù u cumplessu Cdk5 / p35. [23], [34], [35]. Prima, l'esperimentu di pull-down GST hè statu realizatu. A proteina GST-D2i3 recombinante purificata hè stata incubata cù lisatu di u cervellu di ratto è i precipitati pull-down GST sò stati analizati per Western blotting. Cum'è mostra in Fig. 3A, Cdk5 è p35 endogeni sò stati identificati in i precipitati pull-down, chì indicanu una interazzione fisica trà DRD2 è u cumplessu Cdk5 / p35 (Fig. 3A). Inoltre, HA-Cdk5 è p35 sò stati rilevati in l'immunoprecipitati anti-GFP da lisati di cellule HEK 293 chì esprimenu DRD2-GFP è Cdk5/p35 (Fig 3B). Inoltre, avemu realizatu analisi immunocitochimiche è osservatu chì DRD2-GFP, HA-Cdk5 è p35 mostranu signali significativi di co-localizazione in l'area membranosa di e cellule HEK 293 (Fig 3C, pannelli superiori). Avemu ancu investigatu a co-localizazione di DRD2 è Cdk5 / p35 in u cuntestu neuronale. In coerenza, DRD2-GFP hà dimustratu ancu una co-localizazione significativa cù Cdk5 è p35 endogeni in i neuroni striatali cultivati ​​(DIV7), chì sustene ancu i ligami funziunali trà DRD2 è Cdk5 / p35 (Fig 3C, pannelli di fondu). I risultati indicanu chì DRD2 è Cdk5 / p35 ponu formate un cumplessu è cusì sustene a nozione chì DRD2 hè un sustrato fisiulogicu di Cdk5.

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Figura 3. Cdk5 / p35 pò furmà un cumplessu cù DRD2.

(A) Test pull-down GST utilizendu a proteina GST-D2i3 recombinante purificata cù estratto di cervellu di ratto. I precipitati di pull-down GST sò stati sottumessi à l'analisi Western blotting. 'Bead' indica u precipitatu pull-down senza proteini GST. (B) Immunoprecipitation di DRD2 è Cdk5 / p35 complex. L'IP anti-GFP da lisati da cellule trasfettate sò stati sottumessi à l'analisi Western blotting. U bracket indica signali DRD2 è a punta di freccia aperta indica signali non specifichi da l'immunoprecipitates anti-GFP. Una macchia sovraesposta per l'inputs hè ancu mostrata à a diritta. (C) Analisi immunocitochimiche di DRD2 è Cdk5 / p35. E cellule HEK 293 chì esprimenu DRD2-GFP è Cdk5 / p35 sò stati macchiati cù anticorpi anti-Cdk5 è anti-p35 (pannelli superiori). DRD2-GFP hè stata espressa solu in i neuroni striatali cultivati ​​è macchiati cù anticorpi anti-Cdk5 è anti-p35 (pannelli inferiori). Hoechst sò stati usati per a tintura di nucleu. A barra di scala hè 5 µm. Tutte l'imaghjini sò stati ottenuti cù a microscopia confocale (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

A fosforilazione mediata da Cdk5 di DRD2 Attenuate l'attività di u Receptor

Hè statu informatu chì a fosforilazione modula e proprietà critiche di i GPCR cum'è l'accoppiamentu di a proteina G, l'internalizazione di u receptore, a localizazione intracellulare è l'associazione cù proteine ​​​​modulatori. [9], [11], [24]. AL'internalizazione di u receptore induva da gonisti hè un prucessu regulatore criticu di trasduzione di signali. Avemu investigatu a modulazione mediata da Cdk5 di l'internalizazione DRD2. Les cellules HEK 293 exprimant DRD2-GFP et DRD2 S321A-GFP avec ou sans Cdk5/p35 ont été incubées avec 1 µM de quinpirole pour induire l'internalisation DRD2 stimulée par l'agoniste.Fig. 4A). [³I segnali di H]-spiperone di e cellule chì esprimenu DRD2-GFP sò stati significativamente ridotti à u trattamentu di quinpirole di 30 min è ricuperati à 90 min. Curiosamente, [³I segnali di H]-spiperone di DRD2-GFP è Cdk5/p35 chì esprimenu cellule sò stati ancu ridotti à 30 min di trattamentu cù quinpirole, ma ùn sò micca recuperati à 90 min.Fig. 4A, seconda sezione). Da l'altra parte, [³I segnali di H]-spiperone di e cellule d'espressione DRD2 S321A-GFP sò stati ridotti à 30 min è recuperati à 90 min, indipendentemente da a co-espressione cù Cdk5 / p35. Studi precedenti anu dimustratu chì u DRD2 internalizatu ricicla torna à a membrana plasmatica dopu stimulazione agonista prolongata. [11]. Tcusì pare chì a fosforilazione mediata da Cdk5 di DRD2 hè implicata in i prucessi di resensibilizazione dopu l'internalizazione DRD2 indotta da agonisti.

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Figura 4. A fosforilazione mediata da Cdk5 attenuate l'espressione di a superficia DRD2 è a signalazione downstream.

(A) Espressione di superficie DRD2 misurata da [³Essai de liaison à l'H]-spiperone. Les cellules HEK293 transfectées ont été stimulées avec 1 µM de quinpirole pour le temps indiqué et récoltées, suivies de 3 nM.³Trattamentu H]-spiperone per 3 h. A radiuattività hè stata misurata è i signali di a superficia sò stati calculati. E barre d'errore rapprisentanu a media ± SE (n = 8; *p<0.05, **p<0.01; ANOVA unidirezionale cù Dunnett post hoc test: paragunate tutte e colonne versus colonna di cuntrollu). (B) [³⁵S]-GTP_γS essai de liaison. A membrana cellulare hè stata preparata da e cellule trasfettate cum'è indicatu. I preparati di membrana sò stati incubati cù 1 µM di quinpirole seguita da 3 nM.³⁵S]-GTP_γS per 90 min. E barre d'errore rapprisentanu a media ± SE (n = 8; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; One-way ANOVA cù Bonferroni post hoc test: paragunate tutte e coppie di colonne). (C) Quinpirole-compétition [³Essai de liaison à l'H]-spiperone. I preparati di membrana da cellule trasfettate sò stati incubati cù 0.01 nM.³H]-spiperone è cuncentrazione crescente di quinpirole per 30 min. A regressione non lineale hè stata ottenuta da GraphPad. E barre d'errore indicanu a media ± SE (n = 3). (D) Saggi immunoenzimatici cAMP in cellule HEK 293 trasfettate. E cellule trasfettate sò state pretrattate cù 10 µM di rolipram per 1 h, è successivamente co-trattate cù 0.1 µM di forskolin è cuncentrazione crescente di quinpirole per 30 min. A regressione non lineale hè stata ottenuta da GraphPad. E barre d'errore rapprisentanu a media ± SE (n = 4; **p <0.01; à duie code t- prove). (E) I neuroni striati coltivati ​​da embrioni di tipo selvatico e p35 knockout (DIV 7) sono stati trattati con 10 µM di rolipram per 1 h seguita da 1 µM di dopamina per 1 h. E barre d'errore rapprisentanu a media ± SE (n = 4; **p<0.01; à dui coda t- prove).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Avemu ancu valutatu un cambiamentu potenziale di l'accoppiamentu di a proteina G stimulata da agonisti à DRD2 assuciatu à a fosforilazione mediata da Cdk5 utilizendu [³⁵S]-GTP_γS essai de liaison [25], [26]. DRD2-GFP è DRD2 S321A-GFP cù o senza Cdk5 / p35 sò stati espressi in cellule HEK 293. Les membranes ont été préparées et stimulées avec 1 µM de quinpirole et ont ensuite permis [³⁵S]-GTP_γS incorporazione. DRD2-GFP è Cdk5 / p35 chì esprimenu a membrana cellulare hà mostratu significativamente alterata [³⁵S]-GTP_γLiaison S par rapport à toutes les autres membranes cellulaires (Fig 4B). Questi risultati indicanu chì a fosforilazione mediata da Cdk5 regula a diminuzione di a legame di a proteina G stimulata da agonisti à DRD2.

Inoltre, quinpirole-cumpetizione [³I saggi di legame di H]-spiperone sò stati eseguiti per investigà qualsiasi cambiamentu potenziale in l'affinità agonista à DRD2 da a fosforilazione mediata da Cdk5. vincolazione cumpetitiva di [³H]-spiperone nantu à u trattamentu di cuncintrazioni crescente di quinpirole à a preparazione di a membrana da trasfettatu hè stata misurata. Legation concurrente du quinpirole et du [³H]-spiperone à DRD2-GFP è DRD2 S321A-GFP hà fattu logK simili_i valori (-9.789 per DRD2-GFP; -9.691 per DRD2 S321A-GFP), chì indicanu chì l'affinità di ligand à DRD2 ùn hè micca significativamente affettata da a fosforilazione mediata da Cdk5 à DRD2 (Fig 4C).

A fosforilazione mediata da Cdk5 riduce a via di segnalazione DRD2-cAMP

In seguitu, avemu investigatu se a mudificazione di DRD2 da Cdk5 affetta i camini di signalazione downstream. Avemu monitoratu l'inibizione mediata da DRD2 di a produzzione di cAMP stimulata da forskolina da adenylyl cyclase in e cellule chì esprimenu DRD2-GFP è DRD2 S321A-GFP utilizendu immunoassay enzimaticu cAMP. E cellule chì esprimenu DRD2 anu mostratu livelli diminuiti di cAMP in risposta à quinpirole in una manera dipendente da a dose. Notevolmente, a co-espressione di Cdk5 / p35 riduce significativamente l'inibizione massima di a furmazione di cAMP (Fig 4D, pannellu manca). Per d 'altra banda, in e cellule d'espressione DRD2 S321A-GFP, e formazioni di cAMP sò state efficacemente inibite in risposta à u trattamentu di quinpirole indipendentemente da l'espressione di Cdk5 / p35.Fig. 4D, panel right). Questi risultati indicanu chì a fosforilazione mediata da Cdk5 di DRD2 attenua l'attività inibitoria di DRD2 nantu à a via di segnalazione cAMP downstream. Per cunfirmà ulteriormente i fenomeni in un ambiente più fisiologicu pertinenti, avemu fattu usu di neuroni cultivati ​​primari da embrioni knockout carenti in p35, un attivatore essenziale di Cdk5. I neuroni striatali coltivati ​​primari sò stati trattati cù 1 µM di dopamina è analizzati da immunoassay enzimaticu cAMP. I neuroni da i topi knockout p35 mostravanu livelli ridotti di cAMP cumparatu cù i neuroni di tipu salvaticu quandu stimulati cù dopamina (Fig 4E). TInseme, avemu cunclusu chì a fosforilazione mediata da Cdk5 di DRD2 risulta in una diminuzione di u tonu inibitoriu nantu à a via cAMP esercitata da DRD2.

Articulu discussione

Avemu identificatu DRD2 cum'è un sustrato novu di Cdk5. A fosforilazione pare chì diminuisce l'espressione di a superficia di DRD2 affettendu u destinu di DRD2 dopu l'internalizazione di u receptore riducendu cusì DRD2 G_i-coupling è via di cAMP a valle. Siccomu u residuu di fosforilazione S321 esiste in l'isoforme DRD2 longa è corta, u mecanismu prupostu in stu studiu pò esse un modu generale di regulazione in a signalazione mediata da DRD2..

DRD2 in i neuroni spinosi medii ùn hè micca solu cunsideratu cum'è un subtipu maiò di u receptore di dopamina, ma hè ancu ricunnisciutu per a so suscettibilità à i cambiamenti di dispunibilità in risposta à stimuli ambientali. A desensibilizazione indotta da l'agonisti è a resensibilizazione di DRD2 sò state largamente studiate [11], [24]. In particulare, una quantità di studii anu dimustratu chì l'effetti di l'esposizione psicostimulante cronica, cum'è a cocaina è l'anfetamina, chì elevanu u livellu extracellulare di dopamina in a sinapsi striata, sò accumpagnati da cambiamenti dinamichi di DRD2 postsinapticamente. [36]. In effetti, l'utilizatori cronichi di cocaina sò cunnisciuti per avè ridotti i livelli di DRD2 in l'area striata, è a dispunibilità di DRD2 in u nucleus accumbens (NAcc) mostra una correlazione negativa cù i cumpurtamenti di ricerca è rinforzu di droga in topi è primati. [37]-[39]. Questi risultati indicanu chì a funziunalità di DRD2 hè assai suscettibile à a regulazione adattativa o compensatoria in risposta à diversi stimuli cumprese l'esposizione cronica di droghe. I nostri risultati mostranu chì u residuu S321 in u terzu ciclu intracellulare di DRD2 pò esse fosforilatu da Cdk5, chì risultatu in una diminuzione di l'influenza inhibitoria di DRD2 nantu à a via cAMP. Questa interazione prupone un novu mecanismu regulatore assuciatu à Cdk5 in i neuroni dopaminocettivi chì puderia esse ligata à a natura dinamica di a dispunibilità di a superficia DRD2.

Si deve esse nutatu chì Cdk5 hè cunnisciutu per esse un cumpunente chjave in a mediazione di cambiamenti adattativi di l'ambienti neuronali. Per esempiu, l'alterazioni strutturali è funziunali di spine dendritiche in i neuroni di u circuitu limbicu sò una di e cunsequenze di l'esposizione ripetuta di psicostimulanti. [40]. Questi cambiamenti sò accumpagnati da diversi cambiamenti molecolari cumprese l'induzione di a proteina di legame di l'elementu di risposta cAMP (CREB) è ΔFosB, fattori di trascrizione chì mostranu una regulazione durabile in risposta à l'amministrazione cronica di cocaina. [41], [42]. Impurtante, Cdk5 hè un mira di ΔFosB [19], è parechji cumpunenti critichi implicati in a dinamica di a spina dendritica, cum'è PSD-95, p21-activated kinase (PAK), β-catenina è spinophilin, sò stati signalati cum'è substrati Cdk5. [43]-[46]. Coerentemente, manipulazioni genetiche o farmacologiche di l'attività Cdk5 suscitanu alterazioni di a morfologia di a spina dendritica è risposti cumportamentali à a cocaina, chì implicanu roli critichi per Cdk5 in i cambiamenti molecolari è morfologichi di i circuiti di dopamina mesolimbica. [47], [48]. I nostri risultati chì mostranu chì DRD2 hè un novu mira di Cdk5 furnisce una visione supplementaria di i cambiamenti adattativi di u sistema di dopamina in risposta à l'esposizione cronica di droghe per via di a successiva regulazione di Cdk5 mediata da ΔFosB pò induce un aumentu tonicu in a fosforilazione di DRD2. . Inoltre, DRD2 hè cunnisciutu per affettà numerosi prucessi cellulari, cumprese a regulazione di e camini di cAMP è MAP kinase è avvenimenti trascrizionali downstream. [42], [49]. Cusì, i risultati in stu studiu puderianu micca solu rapprisentanu una regulazione diretta di DRD2 da Cdk5, ma ancu furnisce una nova visione di e risposte adattative di u sistema di dopamina à l'esposizione cronica di droghe.

Contributions Autor

Cuncepitu è ​​cuncepitu l'esperimenti: JJ YUP DH SKP. Eseguite l'esperimenti: JJ YUP DKK YK. Analizatu i dati: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Reagenti / materiali / strumenti di analisi cuntribuiti: YHS. Scrive a carta: JJ SKP.