Recipients Dopamine D2 in disfunzioni di recompensa per l'addiction, è l'alimentu compulsivu in rattori obese (2010)

Comment: Stu studiu dimostra chì quandu un animale hè datu un accessu illimitatu, un forti rinfurzatore naturale (alimentu assai stimulante) pò causà una calata in i recettori D2. Questa calata hè stata vista in guasi tutti i topi, è hè accaduta abbastanza rapidamente. Quandu l'alimentu "assai gustosu" hè statu cacciatu, i topi anu rifiutatu di manghjà un chow normale. I surci anu cuntinuvatu à brusgià (quand'elli pudianu) malgradu l'accumpagnamentu di scosse elettriche cù u cunsumu alimentariu "assai gustosu".

• Studiu cumpletu

Nat Neurosci. 2010 di maghju; 13(5): 635-641. Pubblicatu in linea 2010 Marzu 28. doi:  10.1038 / nn.2519

astrattu

Avemu truvatu chì u sviluppu di l'obesità era accumpagnatu cù l'emergenza di un deficit progressivamente impegnatu in risposte di recompensa neurale. Cambiamenti simili in l'omeostasi di ricumpensa indotta da a cocaina o l'eroina sò cunsiderate cruciali in u scopu di a transizione da u casuale à a presa compulsiva di droghe. In cunsequenza, avemu detectatu un comportamentu alimentariu cumpetitivu in rati obesi, ma micca magre, misurati cum'è un cunsumu alimentariu palatable chì era resistente à a disrupzione da un stimulu cundizionatu aversivu. I receptori Striatali di dopamina D2 (D2Rs) sò stati downregulated in rati obesi, cum'è hè statu rapportatu in l'omi addicts a droghe. In più, i chjassi di D2R striatali mediati da lentivirus acceleranu rapidamente u sviluppu di déficits di recompensa simili à l'addiczione è l'iniziu di alimenti compulsivi chì cercanu in ratti cun accessu estensibile à l'alimentazione ricca di grassu. Queste dati dimustranu chì a cunsumazione eccessiva di l'alimentazione palatibile porta à risposti neuroadaptivi cume à l'addiction in circuiti di ricumpensa di u cervellu è conduce à u sviluppu di manghjà compulsivu. I meccanismi edonici cumuni ponu dunque sottumessi l'obesità è a dipendenza di e droghe.

I MUVRINI

L'alimentazione hè influenzata da piacè è ricumpensa, è uttene una ricumpensa alimentaria pò motivà putenzialmente u cunsumu1, 2. Tuttavia, i meccanismi hedonici chì contribuiscenu à l'obesità restanu mal capiti. In l'omu iperfagichi cù carenza congenita di leptina, l'attività in u striatum dorsale è ventrali, chì sò cumpunenti core di i circuiti di ricompensa cerebrale aumenta notevolmente in risposta à l'imaghjini di l'alimentu3, è a terapia di rimpiazzamentu di leptina attenueghja sia l'attività striatale sia u "piacè" di l'alimentu3 . Questu suggerisce chì u striatum hè impurtante in aspetti edonici di u comportamentu alimentariu. Hè statu dimustratu recentemente chì l'attivazione di u striatum in risposta à l'alimentu assai gustosu hè smussata in individui obesi paragunatu cù controlli magri4. Inoltre, l'ipofunzione di u striatum dorsale è l'aumentu di pesu à longu andà sò più pronunziate in l'individui cù l'allele TaqIA di u locus genicu DRD2-ANKK1, chì si traduce in una diminuzione di l'espressione di D2R striatale è hè statu dimustratu chì predispone l'individui à disordini di dipendenza da a sostanza4, 5 Queste e osservazioni simili anu purtatu à a pruposta chì i deficit in a trasfurmazione di a ricumpensa ponu esse un fattore di risicu impurtante per u sviluppu di l'obesità, è chì l'individui obesi pò cunsumà compulsivamente cibo gustosu per compensà l'iposensibilità di a ricumpensa6. Notevolmente, ùn hè chjaru se i deficit in a trasfurmazione di a ricumpensa sò constitutivi è precedenu l'obesità, o se u cunsumu eccessivu di cibo gustosu pò guidà a disfunzione di a ricumpensa è contribuisce cusì à l'obesità indotta da a dieta.

Una caratteristica definittiva di l'individui cù sovrappesu è obesi hè chì seguitanu à manghjà pisanti à pesar di a cunnisciuta cunsequenza negativa nantu à a salute è suciale. In effetti, assai individui sovrappesi manifestanu u desideriu di limità u cunsumu alimentariu, ma ancu luttanu per cuntrullà a so ingesta è cunsuma ripetutamente oltre e so esigenze energetiche7, 8. U sviluppu di un cumpurtamentu di alimentazione insensibile à u risultatu negativu hè analogu à u cumportamentu compulsivu di droghe vistu in i tossicodipendenti umani, chì hè altrettantu impermeabile à e cunsequenze negative9. Quì avemu investigatu l'effetti di l'accessu allargatu à una dieta palatabile di alta grassu nantu à a sensibilità di i sistemi di ricumpensa di u cerebro in i rati. Avemu esaminatu ancu u ligame trà a disregulazione edonica indotta da a dieta è l'emergenza di ricerca compulsiva d'alimentariu. Infine, avemu investigatu u rolu per D2R striale in queste risposte cumportamentali cume di l'addiczione.

I dèficiti di ricumpensa cum'è addiczioni in i rati obesi

Per pruvà l'effetti di l'accessu ristrettu o allargatu à una dieta gustosa ricca di grassi, avemu preparatu topi maschili Wistar (300-350 g) cun un elettrodu stimulante bipolare in l'ipotalamu laterale è li hà addestrati per 10-14 d in una prova discreta. Procedura di ricumpensa di stimolazione cerebrale di soglia attuale (BSR) finu à chì sò stabilite soglie di ricompensa stabili4. In a procedura BSR, i topi rispondenu vigorosamente per uttene un'autostimulazione elettrica gratificante per mezu di l'elettrodu di stimolazione interiore, cù l'intensità di stimolazione minima chì mantene u comportamentu di auto-stimolazione chjamata soglia di ricompensa10. Perchè e soglie di ricompensa restanu stabili è inalterate per tempi prolungati in condizioni di basi, sta procedura furnisce una misura sensibile di a reattività di i sistemi di ricompensa cerebrale. Dopu a creazione di soglie BSR stabili (definite cum'è variazione di <10% in soglie in trè sessioni consecutive), avemu attribuitu ratti à trè gruppi chì ùn anu mostratu nisuna differenza in pesi media di u corpu o soglie di ricumpensa trà gruppi. I trè gruppi anu avutu accessu differenziale à una dieta 'in stile caffetteria' custituita da alimenti gustosi densi in energia prontamente dispunibili per u cunsumu umanu (vede Metodi in Linea). I Topi avianu 0 h (topi solu chow; n = 9), 1 h (topi à accessu ristrettu; n = 11), o 18-23 h (topi à accessu allargatu; n = 11) accessu à a dieta per ghjornu per 40 ghjorni cunsecutivi. E diete di cafeteria sò cunnisciute per risultà in obesità indotta da dieta in ratti11. Tutti i topi avianu ancu accessu ad libitum à u chow di laboratorio standard, cù soglie di ricumpensa, guadagnu di pesu è assunzione calorica registrati in tuttu.

U pesu aumentò significativamente in i ratti cun accessu estensu à a dieta di a caffetteria in paragunà à i gruppi di chow-only o accessu restrittu (Fig. 1a). U pesu ancu tende à aumentà in i rati d'accessu restrittu cumparatu cù i rati chow-only, ma questu effettu ùn hà micca righjuntu significatu statìsticu. U sviluppu di l'obesità in rati di accessu estensu era assuciatu strettamente cun un déficit peghju in a funzione di ricumpensa cerebrale, riflessu in soggetti BSR progressivamente elevati (Fig. 1b). Perchè ùn ci sò state osservate differenzi di latenza di risposta per BSR trà i trè gruppi (Fig. Suplementaria Fig. 1), i deficit in u cumportamentu di comportamentu ùn ponu cuntà per questa osservazione. Caratteristiche simili in a funzione di ricumpensa cerebrale sò stati riportati in rati cun accessu estensu ma micca limitatu di cocaina intravenosa o di l'auto-amministrazioni di l'eroina12, 13, 14. Cusì, l'accessu estensu à l'alimentazione elevata in grassu palatabile pò induce déficits à l'addiction in a funzione di ricumpensa cerebrale, cunsiderata una fonte impurtante di motivazione chì pò guidà overeating è cuntribuisce à u sviluppu di l'obesità1, 6.

Figura 1: Disfunzione di aumentu di u pesu è di ricumpensa in rati cù accessu estensu à una dieta per a cafferia.

(a) Aumento di pesu mediu (± sem) in ratti chow-only, accessu limitatu è accessu allargatu (accessu × interazione di ghjornu: F39,702 = 7.9, P <0.0001; * P <0.05 paragunatu cù u gruppu chow-only, test post hoc). (b) Cambiamentu percentuale mediu (± sem) da i limiti di ricumpensa basale (accessu × interazione di u tempu: F78,1092 = 1.7, P <0.0005; * P <0.05 paragunatu cù u gruppu chow-only, test post hoc).

Quandu avemu esaminatu u cumportamentu d'alimentazione in dettaglio (Fig. 2), avemu truvatu chì l'ingaghjamentu caloric di u ghjornu era simile trà i rati à razza chow solu è à accessu restrittu (Fig. 2a, d). Invece, l'ingestimentu caloricu totale in i ratti cù accessu estensivu era guasi duie volte quellu di i rati à accessu restrittu è chow-only (Fig. 2a, d). Eppuru chì i rati à accessu restrittu è chow-only mantenu circa u stessu aportu caluricu di u ghjornu (Fig. 2a, d), i rati à accessu restrittu ottenenu solu ~ 33% di e so calorie di ogni ghjornu da chow (Fig. 2b, d), chì indicanu chì sviluppatu cumportamentu alimentariu binge-like è cunsumatu ~ 66% di a so ingestione caloria di u ghjornu durante a so sessione di accessu 1 h à a dieta di a caffetteria15 (Fig. 2d). I rati ad accessu estensu ottenenu solu una piccola frazzione (~ 5%) di u so ingrossu caloric totale da u chow (Fig. 2b); cunsumavanu a dieta di a cafeteria quasi esclusivamente (Fig. 2d). U cambiamentu in a preferenza dietetica in i gruppi di accessu restrittu è allargatu hè statu ancu riflessu in un marcatu aumentu di u consumu di grassu in paragunà cù i ratti chow-only (Fig. 2c è Fig. 2 Supplementary). In cunfuranza cù i rapporti precedenti16, ci era una tendenza à u cunsumu di a dieta di a cafeteria à diminuì cù u tempu in i rati di accessu estendu. Questu pò riflette u sviluppu di a tolleranza à a palatabilità di i prudutti alimentarii furniti in quantu à a dieta di a cafeteria in u tempu. Tuttavia, a preferenza per a dieta di a caffetteria versu u chow standard restava constantemente alta in questi ratti (Fig. 3 Supplementary). Queste dati dimustranu chì l'accessu estesu ma micca ristrettu à una dieta gustativa è ricca di grassu induce deficit di recompensa cum'è dipendenza da l'addiction, overeating è perdita di equilibriu energeticu homeostatic. Invece, l'accessu restrittu à l'alimentazione piacevule dà nascita à mudelli di cunsumazione simili à binge, ma ùn perturba l'equilibriu energeticu homeostaticu nè a funzione di ricumpensa cerebrale. Tuttavia, hè pussibule chì l'accessu restrittu à a dieta di a cafeteria per più di 40 ghjorni cunzuttivi induce un aumento di pesu significativu è una perturbazione di a funzione di ricumpensa cerebrale.

Figura 2: E mudelli di cunsumu in ratti cù accessu estensu à una dieta di cantina.

(a) Ingestimentu caluricu mediu (± sem) cutidianu in surci chow-only, accessu limitatu è accessu allargatu (accessu: F1,324 = 100.6, P <0.0001; tempu: F18,324 = 7.8, P <0.0001; accessu × interazione di u tempu: F18,324 = 4.6, P <0.0001; * P <0.05 paragunatu cù u gruppu chow-only, test post hoc). (b) Ingesta calorica media di u ghjornu (± sem) da chow (accessu: F2,504 = 349.1, P <0.0001; tempu: F18,504 = 5.9, P <0.0001; accessu × interazione di u tempu: F36,504 = 3.52, P <0.0001; * P <0.05 paragunatu cù u gruppu chow-only, test post hoc). (c) Ingesta calorica media di u ghjornu (± sem) da grassu (accessu: F2,486 = 118.7, P <0.0001; tempu: F18,486 = 8.8, P <0.0001; accessu × interazione di u tempu: F36,486 = 6.2, P <0.0001; * P <0.05 paragunatu cù u gruppu chow-only, test post hoc). (d) Paragone di l'ingestimentu caluricu tutale mediu (± sem), è di calorie cunsumate solu da chow, durante tuttu u periodu di accessu di 40 ghjorni (accessu: F2,54 = 25.0, P <0.0001; fonte di calorie: F2,54 = 1235.2, P <0.0001; accessu × interazione fonte calurica: F2,54 = 485.7, P <0.0001; *** P <0.001 paragunatu cù e calorie totali in u gruppu chow-only, ### P <0.001 paragunatu cù e calorie totali in u listessu gruppu di topi, test post hoc).

Dopu à 40 d, i topi ùn anu più permessu l'accessu à a dieta gustosa ma anu continuatu à avè accessu ad libitum à u chow di laboratorio standard. Avemu valutatu i limiti di ricumpensa è u cunsumu chow ogni ghjornu durante stu periodu forzatu di "astinenza". L'elevazioni in i soglii di ricumpensa persistevanu per almenu 2 settimane in i ratti d'accessu allargatu quandu ùn avianu più accessu à a dieta gustosa (Fig. 3a). Questu cuntrasta cù i deficit relativamente transitori (~ 48 h) in funzione di ricumpensa riportati in topi sottumessi à l'astinenza da a cocaina auto-amministrata13. Ci era ancu una diminuzione marcata di l'ingestione calurica (Fig. 3b) è una diminuzione graduale di u pesu corporeu (Fig. 3c) in ratti d'accessu allargatu, è in una misura minore in ratti à accessu ristrettu, durante stu periodu d'astinenza, cunzistenti cù raporti precedenti11, 15. Dopu à 14 d d'astinenza, i topi sò stati tombi è i piazzamenti di l'elettrodi sò stati determinati da a tinta di viola cresyl (Fig. 3d).

Figura 3: Disfunzione e ipofagia persistente di recompensa durante l'astinenza in i ratti cun accessu estensu à una dieta per a cafferia.

(a) Cambiamentu percentuale mediu da i limiti di ricumpensa di basi (± sem) durante l'astinenza da una dieta gustosa ricca di grassi (accessu: F2,112 = 3.7, P <0.05; tempu: F4,112 = 2.3, P> 0.05; * P <0.05 paragunatu cù u gruppu chow-only, test post hoc). (b) Ingesta calorica media (± sem) l'ultimu ghjornu di accessu à a dieta alta in grassu (basale) è durante u 14 d d'astinenza quandu solu u chow standard era dispunibule (accessu: F2,168 = 41.7, P <0.0001 ; tempu: F6,168 = 65.6, P <0.0001; accessu × interazione di u tempu: F12,168 = 38.3, P <0.0001; * P <0.05 paragunatu cù u gruppu chow-only, test post hoc). (c) Cambiamentu di u pesu mediu di u corpu (± sem) paragunatu cù u pesu di u corpu in l'ultimu ghjornu di accessu à a dieta alta in grassu (basale) è durante u 14 d d'astinenza quandu solu u chow standard era dispunibule (accessu: F1,126 = 37.2, P <0.0001; tempu: F7,126 = 3.1, P <0.01; accessu × interazione di u tempu: F7,126 = 40.9, P <0.0001; * P <0.05 paragunatu cù u gruppu chow-only, test post hoc). (d) Ricustruzzione istologica di a situazione di l'elettrodi stimulanti BSR in l'ipotalamu laterale di ratti chow-only (trianguli), accessu ristrettu (piazze) è accessu allargatu (cerchi).

D2R striatali in rati obesi: rolu in deficit deficit

Pruvemu dopu l'ipotesi chì u cunsumu eccessivu di una dieta gustosa da caffetteria puderia riduce a densità di D2R striatale, cuntribuendu à u sviluppu di l'iposensibilità di ricumpensa simile à a dipendenza. Una nova coorte di surci chow-only, accessu restrittu è accessu estensu hè stata permessa l'accessu à a dieta di a cafeteria finu à chì ci hè statu un incrementu statisticamente significativu in u pesu di u corpu in i ratti accessu estendu paragunatu à u gruppu chow-only (P <0.05 ; Fig. 4a). L'espressione striata di a forma riferita assai membrana glicosilata (~ 70 kDa) di a D2R era più bassa in i topi à accessu allargatu chè in i topi à accessu ristrettu o chow-only (Fig. 4b; vedi Metodi in Linea). Quandu avemu divisu i topi in ogni gruppu d'accessu in dui sottugruppi nantu à a basa di una divisione mediana di pesi corporei (leggeri o pesanti), avemu trovu una chiara relazione inversa trà u pesu di u corpu è l'espressione D2R striatale (Fig. 4a, c). Ùn avemu rilevatu alcuna diminuzione statisticamente significativa in l'espressione di e forme immature unglicosilate immature (~ 39 kDa) è glicosilate (~ 51 kDa) di u D2R (Fig. Supplementare 4) 17, chì indica chì l'espressione striatale D2R in ratti d'accessu allargatu hè probabilmente regulatu per mezu di meccanismi post-trascrizionali.

Figura 4: A crescita di pisu hè inversamente ligata à i livelli di D2R striatale.

(a) I ratti Chow-only, accessu restrittu è accessu allargatu sò stati suddivisi in dui gruppi per cundizione d'accessu basatu annantu à una divisione mediana di pesi corporei: leggeri (L) o pesanti (H). (b) Tuttu u cumplessu striatale hè statu raccoltu da tutti i topi è i livelli D2R in ogni gruppu misuratu da western blotting. A banda D2R associata à a membrana hè stata risolta à 70 kDa, è u cuntrollu di carica di proteine ​​hè visualizatu sottu (β-actina, 43 kDa). L'immunoblotti à lunghezza intera sò mostrati in Figura Supplementaria 12. (c) Quantità relative di D2R in u striatum di ratti chow-only, access limitati è accessi estesi sò stati quantificati da densitometria (F2,6 = 5.2, P <0.05, principale effettu di l'accessu; * P <0.05 è ** P <0.01 paragunatu cù u gruppu chow-only-L).

In seguitu, per pruvà a rilevanza funzionale di a riduzione di a dieta indotta in D2R striatale per a funzione di ricumpensa cerebrale, avemu cuncepitu è ​​validatu un vettore lentiviral per rializà un ARNA interfering shortpin per capelli (shRNA) in modu di sconfigure D2R (Lenti-D2Rsh; Fig. 5 è Fig Figliu suplementariu 5). I soglie di recompensa cumincianu à aumentà in i rati trattati cun Lenti-D2Rsh quasi immediatamente dopu avè permessu un accessu estensivu à a dieta di a cafeteria, mentri i soggetti di ricumpensa rimanianu inalterati in rati di accessu estensiu trattati cun un vettore lentivirus vacu (Lenti-control) durante u periodu relativamente cortu. d'accessu à a dieta di a cafeteria (14 d; Fig. 6a). I latenzi di risposta ùn eranu inalterati in i dui gruppi di rati, chì dimostranu chì questu effettu ùn era micca secondariu à i deficiti in u rendiment di u compitu (Fig Fig. 6 Supplementary). I soglie di ricompensa eranu inalterate ancu in i ratti trattati cun Lenti-D2Rsh o Lenti-control chì avianu accessu à chow solu in u stessu periodu (Fig. 6b).

Umbuli sò stati persistentemente elevati durante un 15 extra d di astinenza quandu tutti i rati anu avutu accessu solu à u chow standard (Fig. 7 Suplementariu). L'abbattimentu di D2R striatale hà dunque aumentata a vulnerabilità à l'ipofunzione di ricumpensa indotta da a dieta, ma ùn hà micca alteratu l'attività di basa di i sistemi di ricumpensa cerebrale.

Figura 5: Raccolta mediata da Lentivirus di l'espressione D2R striatale.

(a) Rapresentazione grafica di e zone striate in cui Lenti-D2Rsh era sovraespressu. Circuli verdi in l'emisferu striatale sinistro riprisentanu i lochi in i quali sò state destinate infusioni virali. A tinta verde in l'emisferu striatu dirittu hè una tinta immunochimica rappresentativa per a proteina fluorescente verde (GFP) da u cervellu di un rat Lenti-D2Rsh. (b) Immunoblot rappresentativu di a diminuzione di l'espressione D2R in u striatum di topi Lenti-D2Rsh. L'immunoblotti à lunghezza intera sò mostrati in Figura Supplementaria 13. (c) Quantità relative di D2R in u striatum di ratti Lenti-control è Lenti-D2Rsh, quantificati per densitometria (* P <0.05 paragunatu cù u gruppu Lenti-control, test post hoc ). (d) L'infezzione di e cellule gliali in u striatu da u vettore Lenti-D2Rsh ùn hè stata rilevata. A tinta verde hè GFP da u virus; u rossu hè u marcatore astrocitu glial fibrillary acidic protein (GFAP); i nuclei cellulari sò messi in risaltu da a tintura DAPI in turchinu. E frecce bianche indicanu una zona lucalizata di gliosi truvata solu in u situ di iniezione di virus in u striatum è micca in i tessuti circostanti in cui u virus hè diffusu. Ancu in questa zona, nimu di l'astrociti sò GFP-pusitivi. E frecce gialle in a maghjina ingrandita mettenu in risaltu i tipichi astrociti negativi GFP chì sò stati rilevati. (e) Alti livelli di infezioni neuronali in u striatu da u vettore Lenti-D2Rsh. A tinta verde hè GFP da u virus; rossu hè u marcatore nucleare neuronale NeuN; i nuclei cellulari sò messi in risaltu da a tintura DAPI in turchinu. E frecce gialle in l'immagine ingrandita mettenu in evidenza i neuroni GFP-positivi è NeuN-positivi in ​​u striatum. (f) Una maghjina di ingrandimentu superiore di un neurone infettatu viralmente (GFP-pusitivu) in u striatum di topi Lenti-D2Rsh chì mostra e caratteristiche morfologiche tipiche di i neuroni spinosi mediani.

Figura 6: Rabbattimentu di striatale D2R aumenta a vulnerabilità di ricumpinsà a disfunzione in ratti cun accessu estensu à una dieta per a cafferia.

(a) Cambiamentu percentuale mediu (± sem) da soglie di ricumpensa basale in ratti Lenti-control è Lenti-D2Rsh chì avianu un accessu allargatu à a dieta di a cafeteria per 14 ghjorni consecutivi (virus: F1,156 = 5.9, P <0.05; tempu: F13,156 = 2.2, P <0.05; virus × interazione di u tempu: F13,156 = 2.2, P <0.05; #P <0.05, effettu d'interazione). (b) Cambiamentu percentuale mediu (± sem) da i soglii di ricumpensa basali in ratti Lenti-control è Lenti-D2Rsh chì avianu accessu solu chow. (c) Ingesta calorica media (± sem) di ratti durante 14 d di chow solu o accessu allargatu (accessu: F2,28 = 135.6, *** P <0.0001). (d) Aumento di pesu mediu (± sem) durante 14 d di chow solu o accessu allargatu (accessu: F2,28 = 96.4, P <0.0001; *** P <0.001, effettu principale di l'accessu).

Avemu trovu chì l'apportu caloricu (Fig. 6c) è l'aumento di pesu (Fig. 6d) eranu simili in i Lenti-D2Rsh è i gruppi di controllo Lenti-corrispondenti in cundizioni di chow-only o access-Extended (Fig. Supplementari 8 è 9). Cusì, u colpu striatale D2R ùn hà alteratu nè preferenza per a dieta di a cafeteria nè un ingrossu caluricu totale quandu l'alimentazione gustosa era liberamente dispunibule per u cunsumu.

Manghjà obligatoria in i rati obesi: rolu per a striatale D2R

Dopu avemu pruvatu l'ipotesi chì l'alimentu compulsivu pò emergere in topi cun accessu allargatu à a dieta di a caffetteria è chì i deficit in a segnalazione striatale D2R puderebbenu cuntribuisce à questu effettu. Una nova coorte di surci chow-only, accessu restrittu è accessu allargatu hè stata permessa l'accessu à a dieta di a caffetteria per> 40 d finu à chì aumenti di pesu statisticamente significativi si sò accaduti in i ratti estesi (P <0.05 paragunatu cù i ratti chow-only; dati micca mustratu). Tutti i trè gruppi di topi sò stati poi permessi solu 30 minuti d'accessu per ghjornu à a dieta di a caffetteria per 5-7 d in una camera operante finu à chì un assunzione stabile hè stata ottenuta (definita cum'è variazione <10% in assunzione quotidiana). A metà di i topi in ogni cundizione d'accessu allora sò stati esposti à una luce (stimulu cundiziunatu) accoppiata à a consegna di scossa di i pedi (gruppu punitu), mentre chì i topi rimanenti in ogni gruppu sò stati esposti à a luce cue in assenza di scossa di i pedi (gruppu impunitu ). U ghjornu di a prova, avemu esaminatu l'effetti di l'esposizione à a luce cue solu nantu à u cunsumu gustosu di alimenti (Fig. 7; vedi Metodi in Linea). Avemu trovu chì l'ingestione calorica media durante e sessioni di basi di 30-min era più alta in i ratti chow-only è à accessu ristrettu chè in i ratti d'accessu allargatu (Fig. 7a, b). Questu suggerisce chì i ratti chow-only è accessu restrittu binged nantu à l'alimentu gustoso durante e sessioni intermittenti di accessu 30-min, riflessu in u fattu chì questi topi cunsumanu ~ 40-50% di a so aportazione calurica ogni ghjornu, tipicamente ~ 100 kCal, durante queste sessioni (Fig. 7a, b). À u cuntrariu, i topi à accessu allargatu parenu resistenti à sviluppà stu cumpurtamentu alimentariu simile à binge, forse perchè a so storia di accessu quasi illimitatu à l'alimentu gustosu per> 40 ghjorni consecutivi hà stabilitu mudelli di manghjà chì eranu relativamente inflessibili da cambià. U ghjornu di a prova, ùn avemu osservatu effetti statisticamente significativi di cue light replay nantu à u cunsumu alimentariu in i ratti impuniti da i gruppi chow-only, accessu restrittu o accessu allargatu quandu paragunatu cù l'assunzione durante u periodu di basi (Fig. 7a). A luce cue sola ùn hà dunque micca una salienza motivazionale. In i ratti puniti, a luce di cue accumpagnata da scossa hà diminuitu significativamente l'ingestione gustosa di alimenti in i ratti chow-only è accessi ristretti. Tuttavia, a luce cue ùn hà avutu alcun effettu nantu à l'ingestione gustosa di alimenti in i ratti d'accessu allargatu, mostrendu chì u so cunsumu era insensibile à i segni ambientali avversivi chì prevedenu l'adversità. U consumu di energia di basi in i ratti d'accessu allargatu era più bassu di quellu in l'altri gruppi. Tuttavia, perchè l'assunzione di chow durante i periodi di tempu simili era assai inferiore (Fig. 7d), hè improbabile chì questu rappresenti un "effettu di pavimentu" chì confonda i nostri risultati. Inseme, i nostri dati sustenenu l'idea chì u cumpurtamentu alimentariu cumpulsivu pò emergere in ratti à accessu allargatu in un modu analogu à a presa compulsiva di cocaina vistu in ratti cù una storia di accessu allargatu à a droga18.

Figura 7: Risposte cumpatibile cume per l'alimentazione gustosa.

(a) Mediu (± sem) cunsumu di dieta gustosa in ratti impuniti durante e sessioni di basi di 30-min è u ghjornu di a prova quandu i topi sò stati esposti à un stimulu condizionatu neutru chì ùn era micca precedentemente accoppiato cun scossa nociva di u pede (accessu: F2,20 = 5.2, P <0.05; #P <0.05 paragunatu cù i topi solu chow). (b) Mediu (± sem) cunsumu di dieta gustosa in ratti puniti durante e sessioni di basi di 30-min è u ghjornu di a prova quandu i topi sò stati esposti à un stimulu cundiziunatu chì era precedentemente accoppiato cun scossa nociva di u pede (accessu: F2,21 = 3.9 , P <0.05; cue: F1,21 = 8.6, P <0.01; accessu × interazzione cue: F2,21 = 4.7, P <0.05; * P <0.05 paragunatu cù l'assunzione durante a sessione di basi, #P <0.05 paragunatu cù surci chow-only). (c) Mediu (± sem) cunsumu di dieta gustosa durante e sessioni di basi di 30-min è u ghjornu di a prova in ratti Lenti-control è Lenti-D2Rsh chì avianu prima un accessu solu chow o allargatu à una dieta di cafeteria (cue: F1,26, 29.7 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <30 paragunatu cù l'assunzione durante e sessioni di basi, test post hoc). (d) Cunsumu mediu (± sem) chow durante e sessioni di basi 2-min è u ghjornu di a prova in ratti Lenti-control è Lenti-D1,26Rsh chì anu avutu prima chow solu o accessu allargatu à una dieta di cafeteria (cue: F44.9 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <XNUMX paragunatu cù l'assunzione durante e sessioni di basi, test post hoc).

Infine, avemu esaminatu l'effetti di u stimulu cundiziunatu assuciatu à a punizione nantu à l'ingestimentu alimentariu in i ratti Lenti-control è Lenti-D2Rsh chì avianu avutu prima accessu à chow solu o accessu allargatu à a dieta di a caffetteria (ratti da Fig. 6). Avemu trovu chì l'assunzione di alimenti gustativi di basa durante e sessioni di basa di 30-min era altrettantu alta (~ 40 kCal) in tutti i quattru gruppi (Fig. 7c). Inoltre, u cunsumu totale di chow di ghjornu (in a gabbia di casa) era simile trà tutti i quattru gruppi di topi durante e sessioni di condizionamentu è u ghjornu di a prova (Fig. Supplementaria 10). U 14 d di l'accessu precedente à a dieta di a caffetteria ùn era dunque micca sufficiente per bluccà u comportamentu di manghjà cum'è binge in un modu simile à quellu vistu in ratti chì avianu> 40 d accessu allargatu à a dieta di a caffetteria (Fig. 7a, b). L'aversivu stimulu di luce cue hà disturbatu l'ingestione gustosa di alimenti in topi Lenti-control è Lenti-D2Rsh chì avianu prima un accessu solu chow (Fig. 7c). Similmente, u stimulu cundiziunatu avversivu hà disturbatu l'ingestione gustosa di alimenti in i topi Lenti-cuntrollu chì avianu prima 14 d un accessu allargatu à a dieta di a caffetteria. À u cuntrariu, u stimulu cundiziunatu avversivu ùn hà avutu alcun impattu annantu à u cunsumu gustosu di alimenti in i topi Lenti-D2Rsh chì avianu prima 14 d accessu allargatu à a dieta di a caffetteria (Fig. 7c). E soglie BSR sò rimaste significativamente elevate in questi topi quandu sò stati registrati 48 h dopu a sessione di prova, mentre chì e soglie restavanu stabili è inalterate in l'altri trè gruppi di topi

(Fig suplementaria 11). Per verificà chì a resistenza à a suppressione indotta da a stimula cundutta di l'alimentazione palatibile in i rati di accessu estensu Lenti-D2Rsh ùn era micca sicundaria à una deteriorazione in i processi di condizionamento classico, avemu testatu l'effetti di l'estimu cundizionatu aversivu nantu à u cunsumu di chow standard menu palatabile in tutti i quattru gruppi di rates. In cuntrastu à u cunsumu di cumbattimentu simile à l'alimentazione gustosa, avemu truvatu chì tutti i quattru gruppi di topi cunsumavanu pocu chow (~ 2 kCal) durante e sessioni basi di 30 min (Fig. 7d) è chì l'ingestimentu di chow era disrupted in i quattru gruppi da una magnitudine similar à l'esposizione à u stimulu cundizionatu aversivu (Fig. 7d). Queste dati dimustranu chì u colpu di D2R striatali accelerà significativamente l'emergenza di un manghjà cumplicativu cum'è manghjà palatable, ma solu in i ratti cun una storia di accessu estensivu. In più, perchè l'alimentazione compulsiva hè stata rilevata solu in i ratti Lenti-D2Rsh chì avianu elevati soggetti BSR, l'ipofunzione di ricompensa indotta da a dieta pò esse un precedente necessariu per l'emergenza di ricerca compulsiva d'alimentariu.

Articulu discussione

A facilità d'accessu à l'alimentariu elevatu in grassu hè cunsideratu cum'è un fattore di risicu ambientale impurtante per l'obesità19. Avemu trovu chì l'accessu allargatu à una dieta di stile di cafeteria assai palatable hà risultatu in una cunsumazione eccessiva è u guadagnu di pesu in cunghjunzione progressiva cù i soggetti di BSR in i rati. Questu effettu nantu à i soggetti di BSR pò esse spiegatu diminuendu gradualmente a reattività di i circuiti di ricumpensa cerebrale, una interpretazione coherente cù u fattu chì a restrizione alimentaria è a perdita di pesu pò aumentà20, mentre chì l'alimentazione eccessiva acuta pò diminuisce transitivamente21, rispondendu per BSR in rati. Questa ricerca rappresenta una estensione di u travagliu chì mostra chì l'alimentazione eccessiva aguda di i rati attraversu un tubu d'alimentazione intragastrica21, è a distensione gastrica o infusione di glucagon intravenosa chì imite a sazietà postprandiale22, 23, 24, diminuisce a risponde per a ricumpenza BSR hipotalamica laterale è aumenta risposte simili à l'aversione stimulazione25. I travaglii previ anu dimustratu ancu chì i rati di alimentazione di forza ripetutamente attraversu i tubi intragastrici finu à chì u so pesu hè aumentatu da ~ 200 g diminuite in modu simule i tassi di risponde per BSR, un effettu chì persiste finu à chì u pesu di u corpu hè normalizatu23. Cum'è in questi risultati in i rati, risponde à i misgi per a BSR laterale hypothalamic hè stata inibita da l'alimentazione previa à a satirazione26, dimustrendu chì l'interazzioni trà a funzione di ricumpensa di u cervellu è u statu metabolicu sò cunservati è cusì sò probabili ancu in l'omu. A facilità d'accessu è a cunsiquenza di manghjà di dieti in stile cafeteria in l'omu hè cunsideratu un impurtante contribuente ambientale à l'epidemie di l'obesità attuale in e società occidentali19. I nostri dati mostranu chì l'ipofunzione di ricompensa si sviluppa in i rati chì alimentanu volitivamente una dieta gustativa di a caffetteria simile à quella cunsumata da l'omu è chì stu effettu diventa progressivamente peghju, mentre guadagnanu più pesu. In particulare, tutti i ratti cun elevazioni di u limitu di recompensa ≥20% avianu l'elettrodi BSR situati à ~ 500 μm di u fornix dorsolateralmente. A sensibilità di i neuroni cunnessi à a recompensa in questa zona hè aumentata da restrizzioni alimentari in modu chì hè sensibile à l'hormone derivata di grassu leptina, è sta regione cerebrale hè cunsiderata un sustrato impurtante per a ricumpensa alimentaria27. I circuiti cerebrali che regulanu l'edonica alimentaria sò dunque inibiti da segnali postestestivi chì predicheghjanu sacietà, coerenti cù studi recenti di imaghjine umane che mostranu chì a distensione gastrica28 e il peptide fattore postprandiale derivato da intestino YY3-36 (PYY) 29 modulano l'attività di e regioni di u cervellu. implicati in a trasfurmazioni di recompensas Inoltre, i sistemi di ricompensa sò inibiti ancu da un aumento eccessivu in pesu. I rapporti recenti indicanu chì a leptina circulante, un regulatore chjave di l'equilibriu energeticu, pò penetrarà in i tessuti cerebrali è inibisce l'attività di i circuiti di ricumpensa3, 27, 30, 31.

I deficit di ricumpensa in ratti in sovrappesu ponu riflettere diminuzioni contradattive in a sensibilità di basa di i circuiti di ricompensa cerebrale per opporsi à a so stimolazione eccessiva da cibo gustosu. Tali ipofunzione di ricumpensa indotta da a dieta pò cuntribuisce à u sviluppu di l'obesità aumentendu a motivazione per cunsumà diete "obesogeniche" di ricumpensa alta per evità o alleviare stu statu di ricumpensa negativa6, 32. Questu puderia spiegà l'ipofagia chì avemu osservatu in accessu allargatu surci è à un gradu minore in surci à accessu ristrettu quandu l'alimentu gustosu hè statu ritiratu è solu u chow menu gustosu era dispunibule. Un tale scenariu hè ancu cunstante cù i dati di studii di imaging cerebrale umanu in cui l'attivazione smussata di u striatum in risposta à l'alimentu assai gustosu, in particulare in l'individui cù polimorfismi genetichi pensati per diminuisce l'espressione di D2R striatale, hè assuciatu à un aumento di pesu à longu andà4. Ùn hè statu chjaru se tale iposensibilità à a ricumpensa in l'individui obesi si manifesta prima di u sviluppu di l'obesità è in relazione solu cù fattori genetici ('sindrome di carenza di ricompensa') o se l'alimentazione eccessiva pò causà interruzzioni in l'elaborazione di ricompense. I nostri dati dimostranu chì l'accessu allargatu à alimenti gustosi ad alta energia è successivi blunts eccessivi premianu a sensibilità è ponu dunque rappresentà un impurtante meccanismu hedonicu chì prumove u sviluppu di l'obesità. Una disfunzione di ricumpensa simile à quella ripurtata quì in topi obesi hè ancu rilevata in topi cù una storia di accessu allargatu à l'autoamministrazione intravenosa di cocaina o eroina, ma micca in quelli chì anu una storia di accessu limitatu12, 13, 14. Inoltre, a transizione da A ricerca casuale à compulsiva di droghe hè stata pruposta per risultà da un tentativu di alleviare u statu persistenti di una diminuzione di ricumpensa indotta da sta disfunzione di ricumpensa indotta da droghe12, 32, 33. Cusì, i nostri dati indicanu chì l'obesità è a dipendenza da droghe ponu sparte meccanismi hedonici sottostanti.

A downregulation di a spressione striatale D2R hè una risposta neuroadaptiva notevuli à u cunsumu di cibo palatable. In effetti, e riduzioni di a densità striatale D2R si vedenu in individui sopravvaluti4, 34 è rodenti35, 36. Inversu, l'individui cù anorexia nervosa anu elevata D2R37 striatale, è a perdita di pesu in individui obesi dopu una chirurgia bariatrica (bypass gastrico) è associata a elevata densità D2R striatale D28R. U polimorfisimu di geni riferitu cum'è l'alelo TaqIA A1 risulta in diminuzione di a densità striatale D2R, e individui chì portanu stu allele sò soprapresentati in populazioni obese4. L'allele TaqIA aumenta dinò a vulnerabilità à l'alcool, l'upioide è l'addiction stimulanti psicomotorie38. E riduzioni in a densità striatale D2R accadute sia per fattori genetichi custitutivi sia per via di cunsumazione pò dunque cuntribuisce à i miccanismi neurobiologichi di l'obesità. Avemu trovu chì i livelli striatali di l'isoforma 70 kDa D2R, pensati à riflettere a D2R associata à a membrana, eranu inversamente correlati à u pesu corporeo in rati da gruppi chow-only, access-ristrettu è accesso estensivo (Fig. 4). L'abbattimentu di l'espressione striatale D2R, più prominente in u striatus dorsolaterale (Fig. 5), hà fattu chì i soggetti BSR crescenu quasi immediatamente dopu l'esposizione à a dieta di a cafeteria. Diminuzione di l'espressione D2R striatale dunque accelerà rapidamente l'emergenza di l'ipofunzione di ricompensa in rati cun accessu estensu à alimenti altamente palatabili, una ricerca consistente in i dati di imaging di u cervellu umanu chì indicanu chì i deficit in densità striatale D2R contribuiscenu à ricumpinsà l'ipofunzione in individui obesi4.

Trè caratteristiche di i ratti Lenti-D2Rsh sò ancu notevuli. Prima, ancu se u colpu D2R striatale cumminatu cù un accessu estensivu à a dieta palatabile hà risultatu in elevazione di i soggetti di BSR, ùn ci era nisuna diffarenza in l'apportu caloricu o a crescita di pisu in questi rati in comparatione cù i rati di cuntrollu. Questu puderebbe riflette u fattu chì i rati anu avutu solu 14 d d'accessu à a dieta di a cafeteria; periodi più longu d'accessu puderanu avè risultatu in un aumento di pesu più altu in u tempu, simile à a più grande suscettibilità à l'aumento di pesu vistu in l'omu cun un déficit in signalazione D2R striatale4. Tuttavia, l'avantaghju di limità l'accessu à a dieta di a caffetteria à solu 14 d hè chì i rati knockdown cun accessu estensu eranu l'unicu gruppu per mostrà alti soggetti di BSR, è questu ci hà permessu di valutà u rolu potenziale di l'ipofunzione di ricumpensa in u sviluppu di compulsivi. manghjà (vede quì sottu). Siconda, i soglii di BSR sò stati stabili è ùn eranu inalterati in i ratti di colpu chì avianu accessu solu à chow. Questu indica chì l'espressione D2R striatica ridutta sola ùn era micca abbastanza per induce l'iposensibilità di ricumpensa; invece, pareva interagisce cù a cunsumazione di manghjà piacevule per accelerà l'emergenza di stu statu di sensibilità ridutta à a recompensa. Altri risposti adattativi in ​​i circuiti di ricumpenza cerebrale ponu dunque inizià l'iposensibilita di ricumpensa in rati cun accessu estensu à a dieta di a cafeteria. In questa mente, osservemu chì a bromocriptina agonista D2R riduce i livelli di circulazione di leptin39, è a leptina inibisce l'alimentazione almenu in parte inhibendu e regioni striatali chì cuntrolanu e risposte edoniche per l'alimentazione3, 30, 31. Cusì, hè pussibule chì a downregulation di D2R striatale in risposta à l'aumentu di u pesu di u corpu aumenta a signalazione di leptina è accresce cusì l'effetti inhibitori di questa adipokine nantu à i sistemi di recompensa cerebrale. Infine, avemu nutatu chì avemu dirigitu i nostri vectors lentivirus versu u striatum dorsolaterale. Ciò era principalmente per ragiuni tecnichi, postu chì u piazzamentu laterale di cannulae per a consegna di virus in u striatu ci hà permessu di allughjà ancu l'elettrodu di stimulazione hypothalamic in casa per a determinazione di u limitu di BSR. Cusì, hè pussibile chì u targeting di D2R per knockdown in altri spazii di u striatum, in particulare i spazii dorsomediali è ventrali (nucleus accumbens core and shell), puderia avè altimatu i soggetti di BSR ancu in assenza di a dieta gustosa.

U striatu dorsolaterale hè statu assai implicatu in l'apprendimentu di tippu di abitudine stimulu-risposta, cume si riflette in u sviluppu di un comportamentu cunsumatoriu chì hè insensibile à a svalutazione da l'alimentazione precedente à a sazietà o da accoppiamento cù stimuli nocivi40. Targeting predominantemente u striatum dorsolaterale, averiamu pussutu abbattere populazioni di D2R chì regulanu a vulnerabilità di u topu à u sviluppu di manghjà cumpressiva. In cunfurmità cù un rolu per i D2Rs striatali in cumpurtamenti compulsivi, l'allele TaqIA di u genus locus DRD2-ANKK1 umanu-chì risultati in bassa densità D2R striatale5, blunts l'attivazione striatale in risposta à l'alimentu gustativu4 è eleva a vulnerabilità à l'obesità4-hè ancu assuciatu cù deficit in l'apprendimentu per evità azzioni cun cunsequenze negative41. A perdita di u cuntrollu inibitorio di u comportamentu chì pò avè un risultu negativu hè una caratteristica caratteristica sia di l'obesità sia di a dipendenza da droghe, in cui i comportamenti consumatori persistono malgradu conseguenze sociali, sanitarie o finanziarie negative. U comportamentu chì piglia cocaina in topi cù una storia di ingestione estensiva di droghe pò diventà inflessibile è resistente à a perturbazione da un stimulu condizionatu aversivu chì prevede un esitu negativu (scossa di u pede) 18. Similmente, i topi chì avianu prima accessu à una dieta gustosa ricca di grassi passeranu più tempu in un ambiente aversivu (luminosu) per uttene l'alimentu gustosu di i topi chì ùn avianu micca sperienza cù a dieta42. Avemu trovu chì u cunsumu gustosu di alimenti in surci cù accessu allargatu à a dieta di a caffetteria era simule insensibile à un stimulu condizionatu avversivu. Cunsistente cù un rolu per i D2Rs striatali in questu effettu, manghjà cum'è compulsivu hè statu trovu in i topi striatali D2R chì anu avutu prima 14 d un accessu allargatu à a dieta di a cafeteria ma micca in i gruppi di cuntrollu. Da una prospettiva di neurocircuitria, l'accessu allargatu à l'alimentu gustosu pò scatenà a plasticità in i percorsi corticostriatali, rendendu cusì l'animali più vulnerabili à u sviluppu di cumpurtamenti cumpulsivi, cù deficit in a segnalazione striatale D2R chì migliora stu prucessu. In effetti, a densità D2R striata ridutta in l'individui obesi hè correlata cù u metabolismu riduttu in e zone corticali prefrontali è orbitofrontali43 chì esercitanu un cuntrollu inibitorio nantu à u comportamentu44.

In particulare, u cunsumu cumpetitivu cum'è manghjà palatabile hè statu rilevatu solu in i rati di colpu chì eranu già stati accessu à a dieta di a cafeteria, è micca in rati di cuntrollu chì anu allargatu l'accessu à a dieta di a cafeteria per u stessu periodu, nè in i rati knockdown chì avianu. accessu solu à chow. A sfarenza principale trà i ratti knockdown cù accessu estensu previ è à l'altri gruppi era u so sogliu BSR persistentemente elevatu. Puderia riflette l'urighjini neurobiologiche cumuni di l'ipofunzione di ricumpensa è l'emergenza di un manghjà cumplicativu, chì sò fenomenalmente coincidenti ma indipendenti. Alternativamente, l'ipofunzione di recompensa indotta da a dieta pò serve com'è sustrato per u rinfurzamentu negativu chì facilita u sviluppu di manghjà cumplicante cum'è 14, 32, 33. Qualunque sia u meccanisimu sottostante, i nostri risultati dimostranu chì una risposta compulsiva cumpetente à l'addiction per l'alimentazione palatabile pò emergerà in rati obesi, è indicanu chì i deficit in a signalazione striatale D2R aumentanu a vulnerabilità à u sviluppu di stu cumpurtamentu.

In riassuntu, avemu truvatu chì una stimulazione eccessiva di i sistemi di ricumpensa di u cervellu à traversu u cunsumu eccessivu di l'alimentazione gustosa è densa di energia induce un profundo statu di ricumpensazione à l'iposensibilità è u sviluppu di una cumulazione cumparativa. Questi risposti di cumportamentu malattivu in i rati obesi probabbilmente sorgenu di déficits induciati da a dieta in a signalazione D2R striatale. U cunsumu di droga di abusu diminuisce in modu simile a densità striatale D2R, induce un profundo statu di ipofunzione di ricumpensa è provoca l'emergenza di cumportamentu cumplicativi di droghe. I nostri risultati, dunque, supportanu u travagliu precedente4, 19, 42, 45, 46, 47 per indicà chì l'obesità è l'addipendenza di a droga puderanu nasce da risposte neuroadaptive similari in i circuiti di ricumpensa cerebrale.

mètudi

Rati.

I razzi maschili Wistar chì pesanu 300 – 350 g à l'iniziu di l'esperimenti sò stati ottenuti da u fiumu Charles. À l'arrivu, i rati eranu allughjati individualmente à a temperatura custante nantu à un ciclu di luce scuru 12-h (luci in 2200 h). I rati eranu permessi l'accessu ad libitum à u pozzu di acqua di laboratori standard è l'acqua per a durata di l'esperimentu. Tutte e prucedure sò stati appruvati da u Cumitatu Istituzionale di Cura è Uso di l'animali di Scripps Florida, è i rati sò stati trattati in cunfurmità cù e linee stabilite da l'Instituti Naziunali di Salute in quantu à i principii di a cura di l'animali.

Procedure chirurgiche.

I rati preparati cù l'elettrodi stimulanti di BSR sò stati prima anestetizzati per inalazione di 1-3% isoflurane in ossigenu è posizionati in un quadru stereotaxico (Kopf). L'elettrodi Bipolari BSR (11 mm di lunghezza) sò stati implantati in l'ipotalamo laterale posteriore (anteroposterior, −0.5 mm da bregma; mediolaterale, ± 1.7 mm da linea mediana; dorsoventrale, 8.3 mm da dura; incisore bar era adattato a 5 mm sopra la linea interaurale ) 47. I ratti riceventi iniezioni di virus sò stati ancu disposti cun canule di guida bilaterali (23 gauge, 14 mm long) posizionate sopra u striatum (anteroposterior, 2.8 mm da bregma; mediolateral, ± 3.1 mm da linea media; dorsoventral, −2.4 mm da dura) 48 e pieno cù stiletti 14-mm. Quattru viti di craniu in acciaio inox è acrilicu dentale mantenevanu l'elettrodu è cannulae in locu. A ferita chirurgica hè stata trattata cun antibioticu topicu una volta ogni 12 h per 5 d dopu a chirurgia. I razzi sò stati permessi 7 – 10 d à ricuperà da a cirurgia è poi sò stati furmati in a prucedura di u limitu di BSR.

Prucedura BSR.

I rati sò stati furmati per risponde à l'estimulazione di BSR secondu una prucedura discreta di umbra attuale di prova discreta simile à quella descritta in altrò10, 14. In breve, i livelli attuali di BSR sò variati in alternanti serie descendenti è ascendenti in passi 5-μA. In ogni sessione di test, quattru serie alternanti discendenti / ascendenti sò stati presentati. U limitu per ogni serie hè stata definita cum'è u puntu mediu trà duie intensità di corrente consecutiva per a quale i rati anu rispostu in almenu trè di i cinque prucessi, è duie intensità di corrente consecutivi per a quale i rati ùn anu micca rispostu in trè o più di i cinque prucessi. U limitu tutale di a sessione hè statu definitu cum'è a media di u sogliu per e quattru serie individuale. Ogni sessione di prova hè stata apprussimatamente 30 min in durata. I soggetti stabili di BSR sò stati definiti cum'è ≤10% variazione in u sogliu per 5 ghjorni cunziguranti, generalmente stabiliti dopu 10 – 14 d di furmazione. A latenza di risposta per ogni sessione di test hè stata definita cum'è a latenza di risposta media di tutti i prucessi durante a quale una risposta positiva.

Imballaggio virali è consegna.

L'ARN di hairpin cortu hè statu mandatu è espressu costitutivamente aduprendu u sistema vettoriale pRNAT-U6.2 / Lenti (GenScript). E particelle virali sò state preparate secondu u protocolu di u fabbricante. In breve, e cellule HEK 293FT sò state trasfettate cù u vettore chì cuntene l'inseritu shRNA (5'-GGATCCCGCGCAGCAGTCGAGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCTCGACTGCTGCGCTTTTTTCTCACACTCGAG-3 ') o u vettore vacante, più ViraPower Packaging Mix (Invitrogen) rimpiazzatu per 72 h. U Supernatante hè statu poi raccoltu è cuncentratu per ultracentrifugazione (24g, rotore Beckman Coulter SW 76,755 TI., 32 min, 90 ° C) è u titeru virale hè statu determinatu da una classificazione di cellule attivate da fluorescenza secondu e istruzioni di u fabbricante. U virus hè statu aliquotatu è almacenatu in scatuli prutetti di luce à -4 ° C finu à l'usu.

I ratti cun soggetti BSR stabili ricevianu iniezioni virali bilaterali in trè siti in l'estriatu di ogni emisferu cerebrale (2 μl per iniezione, 1 μl min-1, 1 min tra iniezioni, un totale di sei iniezioni per rata). I rati eranu permessi à almenu ricuperazione 2 – 3 d da iniezioni intrastriatali prima chì a valutazione di u limitu di BSR hè stata ripresa. A valutazione di u limitu di BSR di ogni ghjornu hà continuatu per 33 d dopu l'iniezzioni di virus per assicurà a massima putenza di D2R striatale hè stata ottenuta prima di permette à l'accessu di rati à a dieta di a cafeteria. Ùn ci era micca differenzi in i soglie di BSR trà i ratti Lenti-control è Lenti-D2Rsh durante questi 33 d (datu micca mostrati).

Immunoblottu.

I surci sò stati ammazzati circa 1 h dopu u so accessu regularmente à a dieta di a cafeteria, è u cervellu hè stata rapidu rapidu. Sezioni di cervellu di ~ 1-2 mm di spessore sò state preparate usando una matrice coronale cerebrale (intervallu di fette 1-mm; Plastici One) nantu à un blocco di ghiaccio, e punches di tessuto di striatum dorsale (bregma: ~ 2.2 à −0.26 mm). I punches di tessuto striatale sò stati racolti rapidamente, raghjunati è conservati à -80 ° C finu à l'usu. I mostri individuali sò stati scongelati nantu à u ghjacciu è una quantità ugguale di tessuti striatali sò stati riuniti nantu à a basa di una split mediana di u pesu dipende da i gruppi d'accessu (rati 7-10 per piscina). U tessuto era resuspended in 500 μl tampone RIPA ghiaccio (Thermo Scientific) contenente ortovanadate di sodio, inhibitori di cocktail fosfatasi 1 e 2 (Sigma-Aldrich), leupeptina e pepstatina prima di l'omogeneizzazione. I lisati di tessuti sò stati bolliti per 10 min in buffer di mostra è caricati in 4% –20% o 10% Tris-glicina SDS gels (Invitrogen). A proteina hè stata trasferita à membrani di nitrocelulosa, bluccata per 1 h à ~ 23 – 25 ° C (5% latte seccu senza grassu è 0.2% Tween-20 in PBS, pH 7.4), è incubata in anticorpi primari durante a notte à 4 ° C. I seguenti anticorpi primari sò stati diluiti in soluzione di bloccu: D2R mouse monoclonal (Santa Cruz, 1: 100) o β-actin mouse monoclonal (Santa Cruz, 1: 200). U reagente Chemiluminescent ECL hè aghjuntu dopu incubazione cù anticorpi secondari conjugati da perossasi di rapa (Amersham, 1: 2,000). A forma matura associata à a membrana di D2DR (~ 70 kDa) 17, 49 hè stata normalizzata à un cuntrollu di carica di proteine ​​(β-actina; 43 kDa) è quantificata per densitometria usando u software NIH Image J.

Analisi immunochimica.

I rati eranu anesteticati è trascardialmente perfused cun 4% paraformaldehyde in PBS (pH 7.6). U cervellu hè statu rimosu, postfixed durante a notte è guardatu in sucrosu (soluzione 30% in PBS, pH 7.4) per almenu 72 h. Sezioni di tessuti congelati (spessore 30 μm) sò stati raccolti da un microtomu è bluccatu (3% BSA, 5% serum di capra normale è 0.3% Triton X-100 in PBS) per 1 h à ~ 23 – 25 ° C. I seguenti anticorpi primari anu aghjuntu à a suluzione di bloccu è incubati durante a notte in 4 ° C: policlonal di pollo à GFP (Abcam, 1: 1,000); coniglio monoclonale à GFAP (Millipore, 1: 1,000); mouse monoclonali à NeuN (Millipore, 1: 1,000). I sezioni sò stati incubati cù anticorpi secondari coniugati fluorescenti cù ~ 23 – 25 ° C: tintura anti-pollo – 488-nm (Jackson ImmunoResearch, 1: 1,000), anti-coniglio – 594-nm tintura (Invitrogen, 1: 1,000 ), è anti-mouse – 594-nm tintura (Invitrogen, 1: 1000). E sezzioni sò stati muntati cù i supporti di muntatura di Vectashield chì cuntenenu DAPI (Vector Labs) è coperto. L'imaghjini sò stati purtati aduprendu un microscopiu fluorescente Olympus BX61 (obiettivu 2) o un microscopiu confocal Olympus (obiettivi × 10 è × 100).

Procedura di alimentazione.

I ratti eranu allughjati individualmente nantu à i letti di carta (cinturini alfa; Documenti di Specialità Shepherd) per impediscenu chì i prudutti alimentari sianu contaminati cù materiale di letta solta. A dieta di a caffetteria era composta da pancetta, salsiccia, cheesecake, torta di libbra, gelatina è cioccolata, pesati individualmente prima di mette in piazza. L'alimenti di a dieta di a cafetteria sò stati purtati in ricette chjucchi di metalli. Ogni uttellu alimentariu, cumpresu u chow di laboratorio standard, sò stati pesati à a fine di a sessione d'alimentazione. L'ingressu caluricu da i diversi macronutrienti hè statu calculatu utilizendu l'infurmazione nutrizionale furnita da u fabricatore.

Suppressione Cue indotta di u cumpurtamentu di alimentazione.

E procedure di alimentazione si sò svolte in camere operanti attenuate da u sonu identiche in dimensioni à quelle usate in l'esperimenti BSR. I topi sò stati piazzati in una camera operante è avianu accessu à a dieta di a cafeteria o chow per 30 min. I prudutti alimentari sò stati consegnati in picculi recipienti metallici. Tutti l'articuli alimentari sò stati pesati prima è dopu e sessioni di alimentazione, chì sò state effettuate durante u periodu normale di alimentazione di i topi. U cunsumu di Chow hè statu valutatu da u cunsumu di 45-chow pellets identichi in cumpusizione à u chow furnitu in e gabbie di i topi. I topi sò stati poi permessi 30 minuti d'accessu per ghjornu à a dieta di a caffetteria finu à chì un assunzione stabile hè stata ottenuta (definita cum'è variazione di <10% in assunzione quotidiana), chì richiede 5-7 d. Dopu a stabilizazione di l'ingestione gustosa di alimenti durante stu periodu di basi, i topi in ogni cundizione d'accessu sò stati attribuiti à dui gruppi: puniti (quelli chì ricevenu scossa di u pede) è impuniti (chì ùn ricevenu micca scossa di u pede). I topi sò stati dopu sottumessi à quattru sessioni di cundiziunamentu in ghjorni cunsecutivi in ​​a stessa camera operante in a quale avianu avutu prima accessu à l'alimentu gustosu. Durante e sessioni di condizionamentu 30-min una luce cue (stimulu condizionatu) hè stata attivata per 10 min, spenta per 10 min, è poi riaccesa per 10 min. I topi puniti anu ricevutu scossa di u pede solu durante a presentazione di a luce cue (0.5 mA per 1.0 s; stimolazioni 10 cù intervalli ~ 1-min). I topi impuniti sò stati presentati cù a luce cue in u listessu modu, ma senza a consegna di scossa di u pede. U ghjornu di a prova, u ghjornu dopu à l'ultima sessione di condizionamentu, i topi in i gruppi puniti anu ricevutu scossa intermittente di u pede (cinque stimolazioni in totale) accoppiata cù l'attivazione di a luce cue per 5 min. I topi impuniti sò stati torna esposti à a luce cue in assenza di scossa di u pede. Dopu à u periodu di punizione 5-min, à tutti i topi sò stati permessi l'accessu à l'alimentu gustosu per una sessione di 30-min cù l'stimulu cundiziunatu attivatu intermittentemente (10 min cue light on, 10 min cue light off, 10 min cue light on).

Analisi statistica.

I soglie di ricumpensa baseline sò stati definiti cum'è u valore di umbulu mediu per u 5 d prima di l'accessu à a dieta di a cafeteria per ogni sughjettu. I limiti di ricompensa sò stati espressi cum'è u cambiamentu percentuale da u valore di u limitu di basa. Dati nantu à u percentuale di i valori di u limitu di ricumpenza basica, a crescita di pisu, u cunsumu caloricu è u cunsumu caluricu da u grassu sò stati analizati da analisi di dui fattori, misure ripetute di varianza, cù accessu (solu chow, accessu ristrettu o accessu estensu), fonte di caloria ( dieta standard per chow o caffetteria), virus (Lenti-control o Lenti-D2Rsh) è cue (accoppiatu o unpaired con punizioni) cum'è i fattori entre i temi è u tempu cum'è u fattore in-soggetti. Quandu appropritatu, l'effetti principali in l'analisi di varianza sò stati ulteriormente analizati da testi post hoc di Bonferroni. Tutte l'analisi statistiche sò stati realizati cù u software GraphPad Prism.

Vede ancu

Vede ancu

Corespondenza à:

· Paul J Kenny ([email prutettu])