Diabetoluggìa. 2017; 60 (8): 1502 – 1511.
Publicatu online 2017 May 20. doi: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1astrattu
Scopi / ipotesi
Overeating of grass dietary provoca obesità in l'omu è in i rodatori. Studi recenti in umani è roditori anu dimustratu chì l'addiction à i grasi comparte un mecanismu cumunu cù l'addiczione à l'alcohol, a nicotina è i narcotici in quantu à una disfunzione di i sistemi di recompensa cerebrale. Ci hè statu messu in risaltu chì una dieta alta in grassu (HFD) attenu a dopamina D2 receptore (D2R) di segnalazione in u striatu, un regulatore pivotale di u sistema di recompensa di u cervellu, risultatu in una surventazione edonica. È avemu raportatu prima chì u constituente bioattivu specificu di risu marrone γ-oryzanol attenuà a preferenza per un HFD via un cuntrollu hipotalamicu. Avemu dunque esploratu a pussibilità chì γ-oryzanol modulassi u funziunamentu di u sistema di ricumpensazione cerebrale in topi.
mètudi
I topi masculi C57BL / 6J alimentati cun HFD sò stati trattati oralmente cù γ-oryzanol, è i livelli striatali di molécule implicati in a signale D2R sò stati evaluati. Hè statu esaminatu l'impattu di γ-oryzanol nantu a metilazione di l'ADN di u promotore D2R è i cambiamenti sussegwenti in preferenze per i grassu di a dieta. Inoltre, l'effetti di 5-aza-2′-deoxycytidine, un potente inhibitore di l'ADN metiltransferasi (DNMTs), nantu a preferenza alimentaria, a signalazione D2R è i livelli di DNMTs in striatum sò stati investigati. L'effetti inhibitori di γ-oryzanol nantu à l'attività di DNMTs eranu valutati enzimaticamente in vitro.
Risposte alla lingua
In striatum da topi alimentati un HFD, a produzzione di D2Rs era diminuita per via di un incrementu in metilazione ADN di a regione promotore di a D2R. L'amministrazione orale di γ-oryzanol hà diminuitu l'espressione è l'attività di DNMTs, cusì rinuvendu u nivellu di D2Rs in u striatum. L'inhibizione farmacologica di DNMTs da 5-aza-2′-deoxycytidine hà amelioratu ancu a preferenza per i grasi dietetichi. In cunzistenza cun queste scuperte, i testi enzimatici in vitro anu dimostratu chì γ-oryzanol inhiba l'attività di DNMTs.
Cunclusioni / interpretazione
Avemu dimostratu chì γ-oryzanol ameliore l'ipermetilazione di DNA indotta da HFD di a regione promotore di D2R in u striatu di i topi. U nostru paradigma sperimentale mette in evidenza γ-oryzanol cum'è una sustanza antiobesità promettente cù a proprietà distinta di esse un novu modulatore epigeneticu.
Materiale elettronicu supplementare
A versione in linea di stu articulu (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) cuntene materiale supplementatu rivedutu da un peer, ma micca ineditatu, chì hè dispunibile per l'utilizatori autorizzati.
I MUVRINI
Manghjendu in individui obesi l'azzione, almenu in parte, i meccanisimi cumuni cù l'addiczione à l'alcohol, a nicotina è i narcotici [1]. In quantu à a regulazione ipotalamica è hormonale di l'appetitu, u sistema di ricumpensazione cerebrale, in particulare a signalazione di u receptore dopamine, hè strettamente ligatu à u cumportamentu alimentariu addictivu o edonicu [2]. Un studiu precedente in rati hà dimustratu chì u knockdown di a doppia striatale D2 receptore (D2R) da lentivirus mediata corto capillavore interferisce RNA rapidu induciu dipendenza cume dipendenza è cumpressione-cume cerca di [3]. A causa di a densità D2R ridutta, u striatum dorsale hè menu rispondente à a ricumpensa alimentaria cumparata cù i gruppi di cuntrollu magre in l'omi obesi è i rodatori [3-5]. In accordu di sta nozione, u TaqIA allele di u ANKK1 Locus di geni (chì codifica DRD2 / ankyrin ripeti è duminiu kinase chì cuntene 1), chì diminuite a produzzione striatale di D2R, hè assuciatu cun un fenotipu obesu in l'omu [6], mentre l'effetti di a perdita di pisu dopu a chirurgia bariatrica sò assuciati à a densità striatale D2R elevata [7]. Queste dati suggerenu assai l'impurtanza di a D2R striatale cum'è un novu scopu terapeuticu per u trattamentu di l'obesità. Eppuru, alcune droghe sviluppate chì anu agitu nantu à u sistema di ricumpensa di u cervellu hà causatu effetti avversi considerablei, cumpresi gravi prublemi psichiatrici, chì risultavanu in a so eventuale retirazzione da e cliniche [8].
E mudificazioni epigenetiche sò critichi micca solu per u sviluppu è a diffarenzazione, ma ancu perchè sorgiscenu cum'è un risultatu di i cambiamenti ambientali, cumpresi in a dieta è in u modu di vita [9]. Metilazione ADN hè un avvenimentu epigeneticu capu per a stabilità di l'espressione genica [9]. In i rati, l'esposizione materna à una dieta altamente grassa (HFD) intergenerabilmente altera a metilazione di l'ADN in u sistema di recompensa centrale in a crianza, chì porta à u cunsumu di HFD da i cuccioli [10]. In particulare, i metiltransferasi di DNA (DNMTs) ghjucanu un rolu criticu in a regulazione di u comportamentu alimentariu è di l'attività fisica [10, 11], suggerendu chì i DNMTs puderanu promettere target terapeutichi per a terapia di l'obesità-sindrome di diabete. Hè impurtante, alcune sostanze naturali derivate da l'alimentariu, cumprese l'acidu caffeic è l'epigallocatechin, sò cunnisciute per agisce cum'è inhibitori DNMT [12, 13].
Recentemente avemu dimostratu chì u γ-oryzanol, u componente bioattivu di risu marrone, una mistura di ester di l'acidu ferulicu è parechji fitosteroli, attenua a preferenza per i grasi dietetichi per via di una diminuzione di u stress reticulare endoplasmico (ER) hipotalamo [14]. In topi è cunigli, γ-oryzanol amministratu oralmente hè stata assorbita rapidamente da l'intestinu è distribuitu principalmente à u cervellu [15, 16]. Pighendu questi risultati inseme, i prudutti derivati da l'alimentariu naturali chì agiscenu nantu à u sistema nervoso cintrali puderia esse una alternativa à amminuà in modu sicuru di cumportamentu d'alimentariu in obesità. In questu cuntestu, avemu pruvatu l'ipotesi chì γ-oryzanol altereria u statu di metilazione di l'ADN in u sistema di ricumpensa di u cervellu, dendu à una attenzione di a preferenza per un HFD in topi.
mètudi
animali
Topi maschili C57BL / 6J di sette settimane ottenuti da Charles River Laboratories Giappone (Kanagawa, Giappone) sò stati alloggiati (3-4 per gabbia) in cundizioni specifiche senza patogeni à 24 ° C sottu una luce 12 h / 12 h / ciclu scuru. Dopu à una settimana di acclimatazione, i topi di 8 settimane sò stati abbinati à u pesu è divisi in dui o trè gruppi per sottumette ogni esperimentu. I topi anu permessu l'accessu liberu à l'alimentu è l'acqua. Tutti i sperimenti animali sò stati appruvati da u Cumitatu di Etica di l'Esperimenti Animali di l'Università di Ryukyus (N ° 5352, 5718 è 5943).
Amministrazione di γ-oryzanol è 5-aza-2′-deoxycytidine
Per valutà a preferenza per l'HFD, γ-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Giappone) hè stata amministrata à topi di 8 settimane da gavage durante a prova di scelta di l'alimentariu cum'è deskrittu in precedente [14, 17]. Per l'esperimenti altri, un HFD (D12079B; Dieti di Ricerca, New Brunswick, NJ, USA) chì contene 0.4% γ-oryzanol hè statu fabbricatu cum'è pellets. I cumpunenti di a dieta sò indicati in materiale Elettronicu Suplementariu (MES) 1. Dopu à 12 settimane d'alimentazione, i tessuti sò stati raccolti da u striatum è da l'ipotalamo. L'assunzione quotidiana di γ-oryzanol, stimata da l'assunzione media di alimenti di i topi, era circa 320 μg / g di pesu corporeu. E dosi di γ-orzanol sò state determinate cum'è discrittu prima [14]. A 5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) hè stata iniettata intraperitonealmente (0.25 μg / g di pesu corporeu) trè volte à settimana per 12 settimane [18].
Stima di preferenza per i grasi dietetici
Per valutà e preferenze per u grassu dieteticu, i testi di l'alimentariu furnì una scelta entre chow è HFD (D12450B è D12451; Dieti di Ricerca) cumu deskrittu in precedente [14]. I cumpunenti di a dieta sò indicati in Tabella ESM 1. In breve, i topi anu permessu l'accessu gratuitu à chow è HFD. E assunzioni di chow è HFD sò state misurate settimanalmente è analizate per i cambiamenti di preferenza per u grassu dieteticu. A preferenza HFD hè stata calculata secondu a formula: Preferenza HFD = [(ingesta HFD / ingesta totale di alimenti) × 100].
Seqüenza di bisulfitite per metilazione di DNA
U DNA hè statu purificatu cù un Kit DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN, Tokyo, Giappone). A soluzione di DNA hè stata mischiata cù NaOH 3 mol / l appena preparata, incubata a 37 ° C per 15 min e aggiunta a 5.3 mol / l urea, 1.7 mol / l bisolfito di sodiu è 4.9 mmol / l idrochinone. A soluzione hè stata sottumessa à 15 cicli di denaturazione a 95 ° C per 30 s e incubazione a 50 ° C per 15 minuti [19]. L'ADN trattatu cù bisulfita era purificatu utilizendu MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) è amplificato da PCR utilizando un KAPA HiFi HotStart Uracil + Kit PCR ReadyMix (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA) e primer intorno al sito CpG della regione promotore di D2R . A sequenza di primer era quella seguente: primer forward, 5′-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 ′; primer inversa, 5′-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 ′. In seguitu, e sequenze di adattatori sò state aggiunte è pulite cù Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Dopu, i campioni sò stati riuniti è carichi in un GS Junior (Roche Diagnostics, Tokyo, Giappone) per a sequenza sicondu u protocolu di u fabricatore. U nivellu di metilazione hè statu spressu cum'è u percentuale di citosine metilata in tutti i residui di citosine.
Analisi di l'attività DNMT
L'analisi di attività enzimatica DNMT hè stata realizata utilizando un kit di analisi EpiQuik DNA Methyltransferase Activity / Inhibition Assay Kit (Epigentek Group, Brooklyn, NY, USA) e il kit di analisi methyltransferase EPIgeneous (Cisbio Japan, Chiba, Japan) secondo i protokolli di u fabricatore.
Per valutà l'attività inhibitrice di ogni cumpostu nantu à a metilazione di l'ADN, a furmazione di S-adenosyl-l-omocisteina (SAH) hè stata misurata in presenza di ogni cumpostu (20 μmol / l per analisi di screening), S-adenosil metionina (SAM; 10 μmol / l) è substratu DNMT (4 ng / μl) a 37 ° C per 90 min. Per valutà a cinetica Michaelis-Menten, DNMT1 (20 μmol / l) hè stata incubata cù γ-oryzanol, SAM (5 μmol / l) è a concentrazione indicata di poli dI-dC à 37 ° C per 90 min. DNMT3a (100 μmol / l) è DNMT3b (100 μmol / l) sò stati incubati con γ-oryzanol, SAM (5 μmol / l) è a concentrazione indicata di poli dG · dC a 37 ° C per 120 min. I testi sò stati effettuati in quadruplicatu. A proteina estratta (0.75 mg / ml) è stata incubata con SAM (5 μmol / l), poli dI-dC (5 μg / ml), e poli dG · dC (5 μg / ml) a 40 ° C per 120 min, e A furmazione SAH hè stata misurata.
Analisi di attività di receptore-γ cunnessu à l'estrogenu
L'attività antagonistica potenziale di γ-oryzanol nantu à u recettore estrogenu-γ (ERRγ) hè stata valutata aduprendu u Sistema di Analisi Gamma Reporter Recettore Relativo à l'estrogeni Umani (INDIGO Bioscience, State College, PA, USA) secondu u protocolu di u fabricatore. In breve, e cellule reporter di mammiferi non umani chì esprimenu costruttivamente ERRγ attiva sò state esposte à e concentrazioni indicate di ogni cumpostu per 24 ore in triplicatu.
Western blotting
Questu hè stata realizata cum'è deskrittu prima [20] cù anticorpi contr'à D2R (1: 500, cunigliulu), traspurtore dopamine (DAT; 1: 500, cunigliulu), tirosina idrossilasi (TH; 1: 1000, cunigliulu) (AB5084P, AB1591P è AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, USA), trasduttore di segnale è attivatore di trascrizzione 3α (STAT3α; 1: 1000, cunigliulu), DNMT1 (1: 1000, cunigliulu), DNMT3a (1: 1000, cunigliulu) (numeri 8768, 5032 è 3598; Tecnulugia di segnalazione cellulare, Tokyo, Giappone), DNMT3b (1 μg / ml, rabbit), ERRγ (1: 1000, rabbit) è β-actina (1: 10,000, mouse) (ab16049, ab128930 e ab6276; Abcam, Cambridge, MA, USA).
PCR in tempu reale quantitative
L'espressione genica hè stata esaminata cum'è deskritta in precedente [14]. i livelli di ARNm sò stati nurmalizati à Rn18s (RNNA 18S). L'insemi di primer adupratu per l'analisi PCR in tempu reale quantitative sò summati in a Tabella ESM 2.
Analisi statistica
I dati sò espressi cum'è media ± SEM. ANOVA unidirezionale è ANOVA à misure ripetute seguitate da testi di paragone multiplici (metudu Bonferroni – Dunn) sò stati aduprati induve applicabile. Studiente t a prova hè stata aduprata per analizzà e differenze trà i dui gruppi. E sferenze eranu cunsiderate significativu à a p <0.05.
Risposte alla lingua
Inibizione farmacologica di DNMTs da 5-aza-dC attenuà a preferenza per u grassu dieteticu in i topi
In topi alimentati da HFD, metilazione ADN in a regione promotore di D2R in striatum era aumentata significativamente in comparativa cù topi alimentati cù una dieta chow (Fig. (Fig.1a) .1a). Per d 'altra banda, l'ipotalamic metylation DNA in a regione promotore di D2R era apparentemente più altu di quellu in striatum in dieta chow (p <0.01) (Fig. (Fig.1a, 1a, f) è ùn hè micca stata mudificata da u HFD (Fig. (Fig.1f) .1f). In topi alimentati da HFD, a metilazione di DNA aumentata in a regione promotore di D2R in u striatu hè stata normalizata per u trattamentu cù 5-aza-dC, un potente inhibitore di DNMT (Fig. (Fig.1a) .1a). In contraste, a metilazione di l'ADN in a regione promotora di D2R in l'ipotalamo ùn hè stata mudificata significativamente per trattamentu cù 5-aza-dC (Fig. (Fig.1f) .1f). In u striatum di i topi masci di 20 settimane nutriti di HFD per 12 settimane, i livelli di mRNA e proteine di D2R sò stati significativamente diminuiti (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l). In cuntrastu, livelli di receptori dopamine D1 (D1Rs, codificati da Drd1), chì agiscenu in modu oppostu à D2Rs su adenylyl cyclase e cAMP-mediata signatura intracelulare, non eranu cambiate (Fig. (Fig.1c) .1c). Inoltre, ùn ci hè stata cambiata in u nivellu di altre molécule ligate à a signalazione D2R, cum'è TH è DAT à u nivellu mRNA è / o proteina (Fig. (Fig.1d, 1d, e, k, m). Per d 'altra banda, ùn ci sò stati osservati cambiamenti apparenti in l'ipotalamo, cumpresu per D2R (Fig. (Fig.1g – m) .1g – m). In particulare, i niveli di proteina di D2R è TH in l'ipotalamo eranu assai più bassi di quelli in u striatum (Fig. (Fig.1l, 1l, m), possibbilmente riflettendu l'impurtanza relativa di a signalazione di u receptore di a dopamina in u sistema di ricumpensa di u cervellu cumparatu cù l'ipotalamo.
Per esaminà se a metilazione di l'ADN in a regione promotore di D2R altererebbe a preferenza per i grasi dietetichi, u comportamentu d'alimentazione di i topi trattati 5-aza-dC hè statu analizatu. Cumu era esperatu, 5-aza-dC hà aumentatu significativamente i livelli di mRNA è proteine per D2R in u striatu di topi alimentati da HFD (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l). Per d 'altra banda, ùn ci era nisun effettu nant'à i livelli di Drd1, Th e Slc6a3 (codificazione DAT) in u striatu, o nantu à livelli di Drd2, Drd1, Th e Slc6a3 in l'ipotalamo (Fig. (Fig.1c – e, 1c – e, g – m). Mentre chì i topi trattati cù veiculi preferianu l'HFD, a preferenza per l'HFD hè stata diminuita significativamente in i topi trattati cù 5-aza-dC (88% di i valori per i topi trattati in veiculu) (Fig. (Fig.1n) .1n). In cunsegna, u trattamentu cù 5-aza-dC reduciu u guadagnu in u pesu di u corpu (Fig. (Fig.11o).
γ-oryzanol diminuite i livelli di DNMTs in striatu di topi alimentati HFD
Cumu avemu raportatu prima [14], l'amministrazione orale di γ-oryzanol à topi maschili per gavage attenuò significativamente a preferenza per un HFD (93% di i valori per i topi trattati in veiculu) (Fig. (Fig.2a), 2a), risultatu in un attenuazione apparente di aumento di pesu di u corpu (Fig. (Fig.2b) .2b). Avemu dunque esploratu l'impattu putenziale di γ-oryzanol nantu a modulazione epigenetica di D2Rs in striatum.
In i mammiferi, ci sò trè DNMTs principali - DNMT1, 3a è 3b. Funzioni DNMT1 per mantene a metilazione di l'ADN, mentre chì DNMT3a è 3b ghjucanu un rolu in facilità a metilazione di ADN di novu [21]. Per spiegà l'impattu potenziale di γ-oryzanol in DNMTs in vivo, avemu evaluatu i livelli di DNMTs in u cervellu di topi alimentati da HFD. Eppuru chì l'HFD per se ùn avia alcun effettu nant'à i mRNA è i livelli di a proteina di DNMTs sia in u striatu sia in l'ipotalamo, a supplementazione cù γ-oryzanol hà diminuitu significativamente i livelli di DNMTs in striatum, ma micca in l'ipotalamo (Fig. (Fig.2c – e, 2c – e, g – i, k – n). Queste dati suscitate a pussibilità chì γ-oryzanol puderia regulà i livelli di DNMTs in modu specificu di striatum. In una moda simile, 5-aza-dC hà diminuitu significativamente i livelli di ARNm di DNMT3a è 3b di manera preferenziale in u striatu (ESM Fig. 1a – d).
In basa di un studiu precedente chì mostrava chì u livellu di mRNA di DNMT1 hè statu regulatu positivamente, almenu in parte, da u receptore nucleare ERRγ [22], avemu esaminatu l'effettu potenziale di γ-oryzanol nantu à l'attività ERRγ. In e cellule di mammiferu non umani esercitendu costitutivamente ERRγ attivu, 4-hydroxy tamoxifen, un potente agonistu inversu di ERRγ, hà diminuitu marcamente l'attività ERRγ. Da nutà, γ-oryzanol diminuì parzialmente l'attività ERRγ (una riduzione di circa 40% di u valore innatu) (Fig. (Fig.3a) .3a). Curiosamente, ERRγ hè statu spressu altamente in l'striatu ma micca in l'ipotalamo (Fig. (Fig.3b – d) .3b – d). U cuntrariu di a situazione per u striatum, γ-oryzanol hà aumentatu significativamente i livelli di proteine di DNMT1 solu in l'ipotalamo (Fig. (Fig.2k, 2k, l). Questi risultati puderanu esse spiegati, almenu in parte, da a nostra ricerca chì STAT3α, un regulatore pusitivu di u livellu DNMT1 [23], era espressamente abbundante in l'ipotalamo ma micca in u striatum (Fig. (Fig.33e – g).
Per valutà ulteriormente l'impattu di γ-oryzanol nantu l'attività di DNMTs in vivo, a furmazione di SAH, un pruduttu di metilazione di DNA è ancu un potente inhibitore di DNMTs, hè stata valutata in topi trattati cù γ-oryzanol alimentati da HFD. Ùn ci hè statu un cambiamentu significativu in a furmazione di SAH nè in u striatum nè in l'ipotalamo entre i rati alimentati HFD è i chow-fed (Fig. (Fig.2f, 2f, j). Notevolmente, γ-oryzanol diminuì significativamente a furmazione di SAH in striatum (Fig. (Fig.2f) 2f) ma micca in l'ipotalamo (Fig. (Fig.2j), 2j), chì suggerenu chì γ-oryzanol pò suprimi l'attività di DNMTs in modu striatu in ragazzi alimentati da HFD.
Analisi enzimatiche nantu à e proprietà inhibitori di γ-oryzanol per DNMTs in vitro
In seguitu, avemu valutatu l'impattu di γ-oryzanol nantu à l'attività di DNMTs in vitro. I potenzii inhibitori di γ-oryzanol, acido ferulico, 5-aza-dC, haloperidol (un antagonista di D2R rappresentante), quinpirole (un agonista di D2R rappresentante) è SAH contro DNMTs sono stati valutati. Cum'è un cuntrollu pusitivu, SAH attenuu fermamente l'attività di DNMTs in modu dipendente da a dosa (Fig. (Fig.4a – f) .4a – f) Cumu era esperatu, l'haloperidol è u quinpirole ùn anu dimustratu nisun effettu nant'à l'attività di DNMTs (ESM Fig. 2). Notevolmente, γ-oryzanol inibitò significativamente l'attività di DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol / l), 3a (IC50 = 22.3 μmol / l) è 3b (inibizione massima 57%) (Fig. (Fig.4d – f) .4d – f). In contru, l'attività inhibitiva di l'acidu ferulicu, un metabolite di γ-oryzanol, era assai più bassa di quella di γ-oryzanol (Fig. (Fig.44d – f).
Avemu investigatu ancu più pruprietà inhibitori di γ-oryzanol nantu DNMTs. A furmazione di SAH hè stata misurata per valutà l'attività inibitoria di γ-oryzanol in DNMTs in vitro. Dati nantu à a furmazione di SAH durante metilazione ADN mediata da DNMT indicanu un mudellu saturabile di cinetica Michaelis-Menten sia per a presenza è per assenza di γ-oryzanol (Fig. (Fig.4g – i) .4g – i). In a metilazione ADN mediata da DNMT1, l'analisi Eadie-Hofstee hà dimustratu chì γ-oryzanol ùn hà mostratu effetti nant'à u V aigle di furmazione SAH (veiculu, 597 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 619 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 608 pmol / min), mentre γ-oryzanol apparentemente aumentava u K m (veicolo, 0.47 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (Fig. (Fig.4j) .4j). Questi risultati suggerenu chì γ-oryzanol inhibe DNMT1 almenu in parte in modu cumpetitivu. Per d 'altra banda, per a metilazione ADN mediata da DNMT3a- è 3b, γ-oryzanol diminuì a V aigle di furmazione di SAH (DNMT3a: veiculu, 85.3 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b: veiculu, 42.3 pmol / min; γ -oryzanol 2 μmol / l; 28.0 pmol / min, γ-oryzanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / min) è, K m per sta reazione (DNMT3a: veiculu, 0.0086 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: veicolo, 0.0122 μg / ml; γ- oryzanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (Fig. (Fig.4k, 4k, l). Questi risultati suggeriscenu chì γ-oryzanol inhibe DNMT3a è 3b almenu in parte in modu micca cumpetitivu.
γ-oryzanol aumenta i livelli di D2R in striatu di topi alimentati HFD
Dopu avemu testatu a pussibilità chì γ-oryzanol aumentassi u cuntenutu striatale D2R per mezu di una inhibizione di DNMTs. In topi alimentati da HFD, l'amministrazione orale di γ-oryzanol hà diminuitu significativamente a metilazione di DNA striatale in a regione promotore di i D2Rs (Fig. (Fig.5a), 5a), mentre chì ùn hà micca fattu questu in l'ipotalamo (Fig. (Fig.5f) .5f). In accordu à sti scuperti, i livelli di mRNA è proteine di D2R eranu reciprocamente aumentati (Fig. (Fig.5b, 5b, g, k, l). Simile à a dati nantu à u trattamentu cù 5-aza-dC (Fig. (Fig.1), 1), ùn ci era micca effetti apparenti nantu à u nivellu di RNA è di a proteina Drd1, Th e Slc6a3 (DAT) in u striatu, è ùn hà micca effetti nant'à i livelli di Drd1, Th e Slc6a3 in l'ipotalamo (Fig. (Fig.5c – e, 5c – e, h – k, m).
Studi precedenti anu dimustratu chì i niveli di D2R è DNMT1 sò regulati da u stress è l'inflamazioni ER almenu in parte via NF-κB [17, 24, 25]. Avemu dunque esaminatu i livelli di i geni correlati à l'estress è à l'inflamazioni. Cumu a dimostratu prima [26], L'HFD hà spressu l'espressione di i geni chì codificanu TNF-α (Tnfa), proteina chemoattrattiva monocita – 1 (MCP-1) (Ccl2), Proteina omologica C / EBP (Chop), ER-localized DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) è a forma spliced di proteina X-box vinculante 1 (Xbp1s) in l'ipotalamo, ma micca in striatum (Fig. (Fig.6) .6). In particulare, a supplementazione di l'HFD cù γ-oryzanol hà diminuitu significativamente l'espressione aumentata di Ccl2, Chop, Dnajb9 e Xbp1s esclusivamente in l'ipotalamo, ma micca in striatum (Fig. (Fig.66).
Articulu discussione
A principale ricerca in u presente studiu hè chì γ-oryzanol agisce cum'è un potente inibitore DNMT in striato di topi, attenuando, almenu in parte, a preferenza per un HFD per via di a modulazione epigenetica di D2R striatale. In striatum da topi alimentati da HFD, i livelli di D2R eranu diminuiti significativamente, mentre chì quelli di D1R, TH è DAT ùn sò micca cambiati (Fig. (Fig.1b – e, 1b – e, k – m). Queste dati sò cunzistenti à a nozione chì a disregulazione di D2R striatale hà un rolu criticu in a percepzione di a ricumpenza alimentaria quandu nantu à un HFD, chì porta à una cunsumazione edonica di HFD in animali obesi [3]. In u studiu prisente, u trattamentu di i surci alimentati da HFD cù 5-aza-dC hà aumentatu significativamente i livelli di striatal D2R (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l) possibbilmente per via di una riduzione in u nivellu di metilazione di l'ADN in a regione promotore di D2R (Fig. (Fig.1a), 1a), e dunque attenuò a preferenza per u grassu dieteticu (Fig. (Fig.1n) .1n). Questa ricerca sustene ancu un rolu criticu di D2Rs striatali in a percepzione di a recompensa alimentaria quandu nantu à un HFD.
U nostru test in vitro hà dimustratu chì l'attività inhibitrice di γ-oryzanol contr'à DNMTs era apparentemente più forte di quellu di u so metabolitu acidu ferulicu (Fig. (Fig.4d – f), 4d – f), chì suggerisce l’impurtanza di a struttura cumpleta di γ-oryzanol per a so azzione inhibitrice nantu à DNMTs. In topi alimentati da HFD, i nostri studii suggerenu chì, dopu l'amministrazione orale, γ-oryzanol righjunghji u cervellu cum'è una struttura cumpletu è diminuite i livelli è e attività di DNMTs preferenzialmente in u striatum, cun una conseguente diminuzione di metilazione di DNA in a regione promotore di D2R in l'estriatum. Inoltre, i nostri studii in vitro anu dimustratu chì u γ-oryzanol agisce cum'è un antagonista parziale contru ERRγ, chì serve principalmente à un regulatore pusitivu per a produzzione DNMT1 [22], è di conseguenza diminuì l'attività di DNMT1 (Fig. (Fig.3a) .3a). Da ricordu, ERRγ era altamente spressu in u striatum ma micca in l'ipotalamo in i topi (Fig. (Fig.3b) .3b). Sti dati suggerenu chì γ-oryzanol hà u putenziale di diminuisce u livellu di mRNA di DNMT1, almenu in parte, per via di l'inibizione di ERRγ. In cuntrastu à a striatum, γ-oryzanol ùn hà mostratu alcun effettu nant'à u livellu di D2R in l'ipotalamo da i topi alimentati da HFD (Fig. (Fig.5g, 5g, k, l).
Per d 'altra banda, avemu dimustratu chì γ-oryzanol hà aumentatu significativamente i livelli di DNMT1 in l'ipotalamo ma micca in u striatum (Fig. (Fig.2k, 2k, l). Hè statu dimustratu chì STAT3 aumenta u cuntenutu di DNMT1 in cellule maligne di T-limfoma [23]. In particulare, avemu dimostratu prima chì γ-oryzanol aumentò significativamente a fosforilazione STAT3 indotta da leptina in l'ipotalamo da i topi alimentati da HFD [14]. Ci vole ancu à nutà chì STAT3α hè stata espressamente sustanzialmente in l'ipotalamo ma micca in u striatu in i surci (Fig. (Fig.3e – g) .3e – g). Queste dati ci tentanu di speculare chì a differenza apparente in effetti di γ-oryzanol in i livelli di DNMT1 tra l'ipotalamo è u striatu pò esse attribuita, almenu in parte, à u cuntenutu specificu di a regione di STAT3α è ERRγ in u cervellu di i topi ( Fig. (Fig.3b – g) .3b – g). Colettivamente, pare chì ci hè un mudellu reciprocu d'espressione di ERRγ è STAT3α trà u striatum è l'ipotalamo in i topi. In base à i nostri risultati, hè dunque ragionevule di speculare chì in striatum, induve a pruduzzione ERRγ hè abbundante, γ-oryzanol pò preferibbilmente diminuite u livellu di ARNm è l'attività enzimatica di DNMT1 cum'è regulatore negativu di ERRγ. In contraste, in l'ipotalamo, induve a produzzione di STAT3α hè dominante, uy-oryzanol pò aumentà preferenzialmente i livelli di DNMT1.
Un recente studiu hà dimustratu chì l'attenzione di a segnalazione striatale D2R indotta da un HFD disregula u cumportamentu d'alimentazione [3], suggerisce l'impurtanza potenziale di l'inibizione di DNMT striatali per u trattamentu di l'obesità. Per d 'altra banda, un studiu precedente hà dimustratu a pussibilità chì l'statu di metilazione di l'ADN di u genitore 4 di u receptore di melanocortina espressu in nuclei ipotalamici specifici puderia modulare e forme transgenerazionale di obesità in agouti viuli gialli viabili [27]. Ancu se più studii sò garantiti per elucidà i miccanismi sottostanti, sti studii suggerenu l'impurtanza di metilazione di DNA specifica per i tessuti, i geni è a sequenza in a fisiopatologia obesità indotta da HFD.
Avemu informatu di pocu tempu chì HFD hà aumentatu u livellu di D2R in l'isuli pancreatichi di topi [17, 24]. Hè probabile chì tale aumentazione hè mediata, almenu in parte, da l'estress è l'inflamazioni ER via NF-κB, perchè ci sò parechji elementi rispunsevuli à NF-κB in a regione promotore di D2R [17, 24]. Inoltre, un studiu recente hà dimustratu chì u TNF-α è IL-1β aumentanu u livellu è l'attività di DNMT1 in i tessuti adiposi da i topi alimentati da HFD [25]. Curiosamente, u presente studiu hà dimustratu chì HFD hà indu u stress ER è l'inflamazioni preferenzialmente in l'ipotalamo ma micca in u striatum (Fig. (Fig.6) .6). Meccanismi in profondità di metilazione e demetilazione di ADN specifichi di tessuti, di regione, è di situ in u nostru paradigma sperimentale deve aspittà più investigazione.
Nantu à u nostru rapportu previ dimustrendu chì γ-oryzanol attenua a preferenza per un HFD per via di regulazione ipotalamica di stress di ER in topi [14], γ-oryzanol rapprisenta ancu una pruprietà unica di amminisioni di disregulazione hedonica è metabolica di u cumpurtamentu di l'alimentazione. Perchè certi droghe anti-antiobesità chì sò stati sviluppati sò cunnisciuti per pruvucà effetti avversi critichi [8], hè previstu un approcciu naturale basatu in l'alimentazione versu u sistema di ricumpensa di u cervellu per trattà a sindrome di l'obesità-diabete in modu sicuru16]. In questu paradigma, γ-oryzanol hè un candidatu antiobesità promettente cù una proprietà distinta di esse un modulatore epigeneticu.
Acknowledgements
Ringraziemu a S. Okamoto (Università di u Ryukyus, Giappone) per avè riesaminatu u manuscrittu. Ringraziemu à M. Hirata, H. Kaneshiro, I. Asato è C. Noguchi (Università di Ryukyus, Giappone) per assistenza secretaria.
Abbreviations
| 5-aza-dC | 5-aza-2′-deoxicitidina |
| D1R | U receptore Dopamine D1 |
| D2R | U receptore Dopamine D2 |
| DAT | Trasportatore di dopamina |
| DNMT | ADN metiltransferase |
| ER | Reticululu endoplasmicu |
| ERR | U receptore in relazione à l'estrogeni |
| HFD | Dieta alta in grassu |
| SAH | S-Adenosil-l-homocisteina |
| SAM | S-Adenosil metionina |
| STAT3α | Trasduttore di segnu è attivatore di a trascrizione 3α |
| TH | Tyrosine hydroxylase |
Fonti
Disponibilità di i dati
I fugliali generati è / o analizati durante u studiu attuale sò dispunibuli da l'autore currispondente nantu à richieste raziunale.
Funding
Stu travagliu hè stata sustinuta in parte da Grants-in-Aid by Japan Society for the Promotion of Science (JSPS; KAKENHI Grant Numbers 15K19520 and 24591338), u Cunsigliu per a Scienza, a Tecnologia è l'Innovazione (CSTI), u Programma di Promozione di l'Innovazione Strategica Transministeriale. (SIP) 'Tecnologie per a creazione di agricultura, foresterie è pesca di a prossima generazione', a Lotte Foundation, a Fundazione Giappone per l'enzimologia applicata, a Nuova Energia è l'Organizazione per u Sviluppu di Tecnulugia Industriale (NEDO), u Prughjettu per a Formazione di a Rede di Scienze di Vita ) (Prefettura d'Okinawa, Giappone) è u Prughjettu di Promozione di Clustering Medici di a Prefettura d'Okinawa, Giappone, insieme cun un cuncessione di a Prefettura d'Okinawa per a prumuzione di medicina avanzata (Prefettura d'Okinawa, Giappone).
Dualità d'interessu
L'autori dicenu chì ùn ci hè una dualità d'interessu assuciatu à stu manuscrittu.
Declarazione di cuntribuzione
CK è HM dissenu a ricerca. CK è TK anu fattu l'esperimenti è analizanu e dati. TK, CS-O, CT, MT, MM è KA anu cuntribuitu à l'interpretazione di e dati. CK è HM anu scrittu u manuscrittu. Tutti l'autori cuntribuiscenu à l'interpretazione di dati. Tutti l'autori anu riunitu à rivisione u manoscrittu è appruvatu a so versione finale. HM hè u garantitore di stu travagliu, hà avutu accessu sanu à tutti i dati è piglia a rispunsabilità cumpleta di l'integrità di e dati è l'accuratezza di l'analisi di dati.
Footnotes
Materiale elettronicu supplementare
A versione in linea di stu articulu (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) cuntene materiale supplementatu rivedutu da un peer, ma micca ineditatu, chì hè dispunibile per l'utilizatori autorizzati.
Vede ancu
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