L'insulina attiva i receptori di l'insuline (InsRs) in l'ipotalamo per signalà a sazietà dopu un manghjà. In ogni casu, l'incidenza crescente di l'obesità, chì si traduce in livelli cronicamente elevati di insulina, implica chì l'insulina pò ancu agisce in i centri cerebrali chì regulanu a motivazione è a ricumpensa. Riportemu quì chì l'insulina pò amplificà a liberazione di dopamina (DA) dipendente da u potenziale di l'azzione in u nucleus accumbens (NAc) è u caudate-putamen attraversu un mecanismu indirettu chì implica interneuroni colinergici striatali chì esprimenu InsRs. Inoltre, duie diverse manipulazioni di dieta cronica in i ratti, a restrizione alimentaria (FR) è una dieta obesogenica (OB), alteranu in modu oppostu a sensibilità di a liberazione di DA striatale à l'insulina, cù una risposta rinfurzata in FR, ma perdita di risposta in OB. Studi di cumportamentu mostranu chì i livelli di insuline intactu in a cunchiglia di NAc sò necessarii per l'acquistu di preferenza per u gustu di una suluzione di glucose. Inseme, sti dati implicanu chì a signalazione di l'insulina striata aumenta a liberazione di DA per influenzà e scelte alimentari.

Hè ben stabilitu chì un aumentu sustinutu di l'insulina di plasma durante è dopu un manghjà attiva i receptori di l'insuline (InsRs) in l'ipotalamo, chì furnisce un feedback negativu à i circuiti appetiti chì diminuiscenu più manghjà.^{1, 2, 3}. L'insuline cérébrale est dérivée principalement des cellules β pancréatiques, avec un transport actif du plasma au cerveau à la barrière hemato-encéphalique.^{4, 5, 6, 7, 8}, ancu s'ellu ci hè una evidenza crescente per a sintesi è a liberazione di l'insulina neuronale^{1, 9}. Notably, expression of InsRs is not confined to the hypothalamus, although the function of extra-hypothalamic InsRs remains unresolved^{1, 2, 3}. Data l'incidenza crescente di l'obesità è di a diabetes di tippu II, in quale i livelli circulanti di insulina sò perpetuamente elevati è u trasportu di l'insulina cerebrale è a sensibilità di u receptore sò diminuite.^{3, 8, 10, 11}, hè criticu per capiscenu a funzione di l'insulina in e regioni cerebrali chì regulanu a motivazione è a ricumpensa. E regioni cerebrali d'interessu particulare includenu u nucleus accumbens (NAc), chì media l'effetti gratificante di l'alimentariu è di e droghe.^{12, 13}, è u caudate-putamen (CPu), chì ghjoca un rolu in i cumpurtamenti basati nantu à l'abitudine è a brama¹³. InsRs sò spressi in queste regioni, cù a più alta densità chì si trova in u NAc^{3, 14}; InsRs sò ancu espressi da i neuroni dopamine (DA) in u midbrain, cumprese quelli in l'area tegmentale ventrale (VTA) è substantia nigra pars compacta (SNc)¹⁵. Brain insulin levels are proportional to plasma insulin concentrations and to body adiposity^{6, 7, 8}, chì porta à l'ipotesi chì l'insulina puderia agisce à InsRs in queste regioni di u cervellu per influenzà a ricumpensa alimentaria^{3, 16, 17}.

Studi precedenti in sinaptosomi striatali, cellule eterologiche, fette di cervello e in vivo anu dimustratu chì l'attivazione di l'insuline di InsRs porta à un aumentu di l'assunzione di DA da u trasportatore DA (DAT)^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. Stu prucessu implica a via di signalazione PI3 kinase^{19, 20}, è risultatu in l'inserzione di DAT in a membrana plasmatica¹⁹. I livelli di insulina circulante modulanu dinamicamente l'attività DAT striatale, cù una diminuzione di l'assunzione di DA è l'espressione di a superficia DAT vistu in mudelli animali di diabete è dopu a restrizione alimentaria (FR)^{20, 21}. L'aumentu dipendente da l'insulina in l'attività DAT hè statu dimustratu per diminuisce a concentrazione di DA extracellulare evocata ([DA]_o) in the VTA²³, riflettendu un cambiamentu in l'equilibriu trà a liberazione è l'assunzione di DA. In cunfurmità cù u rolu stabilitu di l'insulina in a sazietà, a microiniezione acuta di insulina in VTA pò diminuisce a ricumpensa alimentaria.^{23, 24}, mentri i topi mancanti di InsR in i neuroni VTA è SNc DA mostranu un ingestimentu di cibo aumentatu è diventanu obesi²⁵. Ancu l'insulina pò induce a depressione à longu andà di l'input excitatory à i neuroni VTA DA²⁴, dinò in cunfurmità cù un rolu in a sazietà, l'esposizione à l'insulina pò ancu aumentà a freccia di u neurone DA, possibbilmente diminuendu a liberazione di DA è l'inibizione mediata da l'autoreceptor.²⁵. L'effettu netu di l'insulina nantu à a liberazione di DA striata hè dunque difficiule di predicà. En effet, les résultats des études sur l'influence de l'insuline sur la libération striatale de DA ex vivo fette¹⁹ è l'effettu di a microinjection locale di l'insulina in u NAc nantu à a ricumpensa alimentaria²⁶ parenu esse contradictori. Per risolve questu, avemu valutatu a liberazione è l'assorbimento di DA assonale in u microambientu intactu di u NAc è u CPu in ex vivo fette striatali utilizendu voltammometria ciclica di scansione rapida (FCV), è determinatu l'effetti di a signalazione di l'insulina in u NAc nantu à u cumpurtamentu di ricumpensa in vivo.

I nostri studii mostranu chì l'effettu primariu di l'insulina in NAc è CPu hè di rinfurzà a liberazione di DA, malgradu un aumentu simultaneo di l'assunzione di DA. Questa regulazione dinamica di a liberazione di DA implica un aumentu dipendente da l'insulina in l'excitabilità di interneuroni colinergici striatali (ChIs), chì porta à una liberazione di DA rinfurzata per l'attivazione di i receptori nicotinici di acetilcolina (ACh) (nAChRs). L'influenza di l'insulina nantu à ChIs è in a liberazione di DA hè mediata da InsRs. In particulare, l'effettu di l'insulina nantu à a liberazione di DA hè amplificatu in fette da i ratti FR, ma smussatu in i ratti nantu à una dieta obesogenica (OB). Questi dati mostranu l'amplificazione di a liberazione di DA in ex vivo fette da l'insulina portanu à a prediczione chì l'insulina puderia agisce cum'è un signalu di ricumpensa in vivo. Infatti, studii comportamentali paralleli dimustranu un rolu di l'insulina in a cunchiglia di NAc in u condizionamentu di u gustu. Inseme, sti risultati indicanu un novu rolu per l'insulina cum'è un signalu di ricumpensa chì pò influenzà a scelta di l'alimentariu

L'insulina chì agisce à InsRs aumenta a liberazione di DA striatale evocata

Esame iniziale di evocati localmente [DA]_o monitoratu cù FCV in ex vivo fette striatali da ratti cun ad libitum (AL) l'accessu à l'alimentariu è l'acqua hà revelatu a scuperta inespettata chì l'applicazione aguda di l'insulina in una gamma di concentrazioni fisiologicamente rilevanti.^{1, 4} aumentatu à impulsu unicu evucatu [DA]_o (Fig. 1a-c), cù insulina EC₅₀ valori (a cuncentrazione à a quale l'effettu era a mità massima) di 2-12 nM (Fig. 1b). Evocatu aumentatu [DA]_o hè stata particularmente surprenante, postu chì questu era accumpagnatu da un incrementu significativu di a rata massima (V_aigle) per l'assunzione mediata da DAT in ogni sottoregione (Table 1), chì portaria à una diminuzione competitiva in evocata [DA]_o, cum'è infurmatu prima^{22, 23}. Invece, avemu trovu chì evocatu [DA]_o hè stata amplificata massima 20-55% da 30 nM insulina; a regione cù u più grande effettu proporzionale era a cunchiglia NAc, chì hè a subregione striatale cù a più alta espressione InsR.^{1, 14}. Slices esposti à l'insulina 30 nM in cundizioni identiche ùn anu micca cambiatu in u cuntenutu di DA striata (Supplementari Fig. 1a), chì implica chì l'insulina altera a regulazione di liberazione dinamica, invece di simplificà a sintesi DA. In particulare, l'effettu di l'insulina nantu à [DA] evocata_o hè stata persa à concentrazioni suprafisiologiche ≥100 nM (Fig. 1b). Stu ùn era micca un risultatu di cresce attività DAT overtaking libbirtati, comu l 'effettu di insulin on V_aigle hè ancu persu à queste cuncentrazioni (Table 1). In generale, sti dati mostranu chì in u microambientu striatale intactu, l'effettu predominante di l'insulina nantu à [DA] evocatu._o hè di aumentà a liberazione, malgradu un aumentu simultaneo di l'absorzione di DA.

  

  

(a) Media evocata à impulsu unicu [DA]_o in NAc shell, NAc core è CPu prima è dopu l'insulina (Ins) illustrata per 30 nM; barre d'errore omesse, ma vede (b); frecce indicanu u tempu di stimulu. L'insulina aumentata evocata [DA]_o in shell (da 55±10%), core (da 37±5%) è CPU (da 20±4%) (***P<0.001). (b) L'effettu di l'insulina era dipendente da a cuncentrazione in una gamma fisiologica (1-30 nM) in cunchiglia (n= 22-24, F_5,133= 14.471, P<0.001), core (n= 36-76, F_5,308= 16.318, P<0.001) è CPU (n= 30-62, F_5,253= 13.763, P<0.001), ma persu à ≥100 nM. (c) Representative recordings of peak-evoked [DA]_o versus u tempu in un locu unicu in u core NAc in l'absenza di l'applicazione di droga (Con), durante l'applicazione di l'insulina (30 nM) o quandu l'insulina hè stata applicata in presenza di un inhibitore InsR HNMPA (5 μM). (d) Peak-evoked mediu [DA]_o dati chì mostranu a prevenzione di l'effettu di l'insulina (30 nM) da HNMPA, l'antagonista InsR S961 (1 μM) è l'inibitore PI3K LY294002 (1 μM), ma micca da l'inibitore IGF-1R PPP (1 μM) (n= 29-76; P>0.9 versus insulin alone). For Fig. 1a-d, n= numeru di siti per subregione da 3-6 rati per ogni droga o cuncentrazione di insulina; ANOVA unidirezionale, test di significazione onesta di Tukey (HSD). Vede Supplementari Fig. 1b, c per i dati di shell NAc è CPU.

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Perchè l'insulina pò ancu agisce à i receptori di u fattore di crescita insulin-like 1 (IGF-1Rs), ancu s'ellu à cuncentrazioni chì supere 100 nM (ref. 1), avemu cercatu di cunfirmà chì l'effettu di rinfurzà di l'insulina nantu à [DA] evocatu._o era dipendente da l'InsR. Questu hè statu u casu, cum'è l'effettu era impeditu da un inibitore InsR intracellulare, l'acidu hydroxy-2-naphthalenylmethylphosphonic (HNMPA), è da un antagonista InsR, S961, ma micca da un inhibitore selettivu di IGF-1R, picropodophyllin.²⁴ (PPP; Fig. 1c, d e Supplementari Fig. 1b, c). Dopu avemu esaminatu l'implicazione di PI3 kinase, chì inizia a via di signalazione rispunsevule per a regulazione dipendente da l'insuline di u DAT.¹⁹. À una cuncentrazione di 1 μM, l'inhibitore P13K LY249002 solu ùn avia micca effettu nantu à u piccu evocatu [DA]_o or V_aigle (n= 29-76 siti (NAc core) per droga, P> 0.05, analisi unidirezionale di varianza (ANOVA); dati micca mostrati), ma hà impeditu l'effettu di l'insulina nantu à [DA] evocatu._o in tutte e sottoregioni striatali (Fig. 1d e Supplementari Fig. 1b, c).

Localizzazione di InsR su assoni DA e ChIs

L'aumentu osservatu in V_aigle per l'assorbimento di DA con livelli fisiologici di insulina implica la presenza di InsR sugli assoni DA, così come i risultati precedenti in varie preparazioni striatali^{18, 19, 20, 21, 22}. Ancu se l'espressione funzionale di InsRs nantu à i neuroni DA midbrain hè stata dimustrata^{15, 23, 24, 25}, L'espressione di InsR su assoni DA striatali non è stata riportata. Avemu trattatu questu cù l'immunoistochimica. L'immunoreattività di InsR densa in tutto lo striato ha limitato la valutazione quantitativa della localizzazione di InsR sugli assoni DA, che sono stati identificati da immunoreattività per un enzima di sintesi DA, tirosina idrossilasi (TH). Per quessa, avemu aduttatu un protocolu rappurtatu prima²⁷, chì implicava cuntà InsR puncta chì si sovrapponeva cù i profili TH + in vista normale di l'imaghjini è cuntà di novu dopu chì l'imaghjini InsR hè stata rotata solu da 90 °. Se l'apparente sovrapposizione di i profili InsR è TH+ ùn era micca specificu, sta prucedura duveria dà cunti statisticamente simili sia normali sia 90 ° fora di fase. Tuttavia, questa analisi hà dimustratu una diminuzione di a sovrapposizione di InsR puncta cù i profili TH + di 14±9% (n= 42 campi, P<0.01, accoppiate à duie code t- prova; dati non mostrati), confermando la presenza di InsR sugli assoni DA. Più intrigante, però, l'immunomarcatura InsR di u striatum hà revelatu una espressione InsR distinta nantu à i corpi cellulari grandi chì sò stati identificati cum'è ChIs striatali da co-immunomarcatura per a colina acetiltransferasi (ChAT), l'enzima primaria necessaria per a sintesi di ACh. Utilizà criteri elettrofisiologichi²⁸ per identificà ChIs in studii preliminari di registrazione di cellule intere, parechji neuroni sò stati pieni di biocitina è poi processati per immunoistochimica; tutti questi (4/4) eranu immunopositivi sia per InsR sia per ChAT (Fig. 2a). A valutazione successiva di l'InsR è a co-localizzazione di ChAT in u NAc hà cunfirmatu chì quasi tutti i neuroni ChAT + espresu InsR (96%; n= 27/28 neuroni in quattru sezioni da dui rati).

  

  

(a) ChI piena di biocitina, poi immunomarcata per ChAT, e InsR (rappresentante di 4/4 ChIs pieni di biocitina); l'immagine fusionata mostra a co-localizazione; barre d'échelle, 10 μm. (b-e) Risposta di ChIs striatali à una seria di impulsi di corrente depolarizzanti (durata di 3 s; 200, 300 è 400 pA; intervalli di 120 s) prima è dopu l'insulina (30 nM). (b) L'adattazione di a freccia di Spike in un ChI (superior) hè vistu in a perdita di u putenziale di l'azzione (AP) scaricata durante l'injection currente, mentri spiking persiste in tuttu u pulse currente in l'insulina (bassu); set di dati cumpletu mostratu in d. (c) Cursu di u tempu rappresentativu di l'aumentu induvatu da l'insulina in u numeru AP cù ogni passu attuale per u ChI in b. (d) Riassuntu di u numeru AP durante l'impulsi currenti mandati prima è à l'effettu di punta di l'esposizione à l'insulina (n= 21 stimulazioni accoppiate, 7 neuroni, 5 ratti) (e) Risposte medite chì mostranu l'effettu di l'insulina (+ Ins) in cundizioni di cuntrollu (Con; n=21 paired stimulations, 7 neurons, ***P<0.001, accoppiate à duie code t-test), in presenza di HNMPA (5 μM) (n= 12 stimoli accoppiati, 4 neuroni, 4 ratti, P>0.05, accoppiate à dui coda t-test), è in presenza di PPP (1 μM) (n= 18 stimoli accoppiati, 6 neuroni, 6 ratti, **P<0.01, Wilcoxon hà accoppiatu coppia firmata prova di gradu). (f) Media evocata à impulsu unicu [DA]_o in core NAc prima è dopu l'insulina (30 nM) in mecamylamine (Mec; 5 μM) o DHβE (1 μM) normalizatu à u cuntrollu di piccu di 100% (n= 20-40 siti per subregione per cundizione da 3-4 rati, P> 0.05 versus cuntrollu, unpaired t-test). (g) Media evocata à impulsu unicu [DA]_o in slices forebrain da u cuntrollu heterozygote (Het) è Chat I topi KO prima è dopu l'insulina (30 nM), normalizzati à u cuntrollu di u piccu 100%. L'insulina aumentata evocata [DA]_o in topi eterozigoti da 190±23% in NAc shell, 140±8% in NAc core è 137±12% in CPU (n= 15-25 siti per subregione da 3-4 topi per genotipu, **P<0.01, ***P<0.001 versus control unpaired t-test), ma ùn avia micca effettu nant'à evucatu [DA]_o in ogni subregione striata di Chat KO i topi (P> 0.1).

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L'insulina aumenta l'eccitabilità di ChI

Per pruvà a funziunalità di InsRs nantu à ChIs striatali, avemu esaminatu l'effettu di l'insulina nantu à l'excitabilità di ChI utilizendu a registrazione di current-clamp di cellula sana. L'eccitabilità di ChI hè stata valutata utilizendu una serie di impulsi di corrente depolarizzanti di 3 s per suscitarà un trenu di potenziali d'azzione chì mostrava in modu affidabile l'adattazione di a freccia di spike.Fig. 2b), spessu cù perdita di spiking da a fine di u pulse currente. Sorprendentemente, l'insulina (30 nM) hà attenuatu l'adattazione di freccia di spike, risultatu in un aumentu progressiu di u numeru di potenziale d'azzione cù u tempu (Fig. 2c), cù un aumentu massimu (Fig. 2d, e) tipicamenti vistu trà 20 è 50 min di esposizione à l'insulina. In l'absenza di l'insulina, i ChIs di cuntrollu ùn anu micca cambiatu in u numeru di potenziali d'azzione evocati (P>0.05, paired two-tailed t- prova; dati micca mostrati); paragunatu cù i neuroni di cuntrollu monitorati annantu à u stessu intervalu di tempu, i neuroni esposti à l'insulina anu mostratu un cambiamentu significativamente più grande in u numeru di potenziali d'azzione evocati (cuntrollu). n= 12 coppie di stimuli da quattru neuroni, insulina n= 21 coppie di stimuli da sette neuroni, F_1,25= 5.63, P<0.05, ANOVA bidirezionale di misure miste; dati micca mostrati). L'effettu di l'insulina nantu à u numeru di potenziale d'azione crescente hè statu impeditu da HNMPA ma micca da l'inibitore selettivu IGF-1R PPP (Fig. 2e), dimustrendu chì l'excitabilità aumentata di ChI da l'insulina hè stata mediata da InsR.

Aumento di l'insuline di evocata [DA]_o richiede nAChR e ACh

Studi precedenti anu dimustratu chì ChIs è ACh regulanu potentemente a liberazione di DA striatale via nAChR nantu à assoni DA^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. L'espressione abbundante di InsR nantu à ChIs è l'aumentu di l'eccitabilità di ChI vistu cù l'esposizione aguda à l'insulina suggerenu chì questi neuroni puderanu esse target novi per l'insulina chì puderia purtà à una liberazione di DA aumentata. Per pruvà questu, avemu esaminatu l'effettu di l'insulina in presenza di mecamylamine, un antagonista nAChR non selettivu, o diidro-β-erythroidine (DHβE), un antagonista selettivu per i nAChR chì cuntenenu subunità β2 (β2*) chì sò arricchiti assoni DA³⁵. Evocatu [DA]_o was readily detected in the presence of these antagonists, even though both drugs decreased the amplitude of single-pulse-evoked [DA]_o (per esempiu, da 13-26% in core NAc), cum'è infurmatu prima^{29, 30, 31, 32}. À l'appui d'un rôle de l'ACh et des nAChR, l'effet de l'insuline sur [DA] évoqué._o hè stata prevenuta da mecamylamine o DHβE (Fig. 2f). Per cunfirmà l'implicazione di a signalazione di ACh striatale in a liberazione di DA amplificata da insuline, avemu esaminatu l'effettu di l'insulina in ex vivo fette striatali da topi in cui l'espressione di ChAT era geneticamente ablata in strutture di proencefalo (proencefalo Chat topi KO), cumpresi striatum³². Ancu i ChIs sò intatti in questi topi, a sintesi di ACh hè abulita, chì porta à [DA] diminuita, ma ancu facilmente rilevabile._o, cum'è descrittu prima³². In i cuntrolli eterozigoti di cuntrollu, l'insulina (30 nM) aumentava l'evocata [DA]_o in NAc shell and core è in CPU da 37-90% (Fig. 2g), superendu l'amplificazione vistu in striatum di rat (per esempiu, Fig. 1). However, the effect of insulin on evoked [DA]_o era assente in tuttu u cumplessu striatal in u proencefalo Chat KO mice, demonstrating that insulin-mediated enhancement of DA release requires striatal ACh, but not co-released transmitters from ChIs, such as glutamate³⁶.

L'influence de l'insuline sur l'évocation [DA]_o dipende da a dieta

Plasma and brain insulin concentrations are proportional to body adiposity^{6, 7, 8}, è puderia purtà à cambiamenti compensatori in a sensibilità cerebrale à l'insulina. Dunque, avemu pruvatu l'ipotesi chì a dieta influenza a capacità di l'insulina per prumove a liberazione di DA, utilizendu fette striatali da i rati mantinuti nantu à una dieta FR o OB cronica versus cuntrolli AL. Cum'è s'aspittava, i livelli di l'insulina plasmatica eranu correlati cù u pesu di u corpu, cù l'insulina più bassa in FR chì in AL o OB ratti (Fig. 3a e Table 2). Despite these differences in circulating insulin, peak-evoked [DA]_o in NAc shell and core, è CPU era significativamente più bassu in ex vivo fette striatali da i dui gruppi di dieta cumparatu cù AL (Fig. 3b e Supplementari Fig. 2 a, b), chì implica chì i fatturi in più di l'insulina guvernanu l'evocazione assoluta [DA]_o. U cuntenutu di DA striatale ùn hè micca diversu trà i gruppi di dieta, chì indicanu un cambiamentu in a regulazione di liberazione piuttostu cà in a sintesi di DA (Supplementari Fig. 2c). In cunfurmità cù un cambiamentu in a regulazione dinamica, a sensibilità di a liberazione di DA striata à l'insulina era marcatamente dipendente da a dieta. Nei ratti FR, concentrazioni di insuline ≤1 nM, che non avevano alcun effetto in AL (Fig. 1b), aumentatu evucatu [DA]_o (Fig. 3c), chì riflette una sensibilità aumentata à l'insulina, cù EC₅₀ des valeurs dans le striatum FR (0.4–0.6 nM) qui étaient approximativement un ordre de grandeur inférieures à celles de AL (comparer Figuri 1b e 3c). In cuntrastu chjappu, l'effettu di l'insulina hè stata persa in OB striatum; l'insuline même à 30 nM, qui avait un effet maximal dans le striatum AL (Fig. 1b), ùn avia micca effettu in OB (Fig. 3c).

  

  

(a) A concentrazione di l'insulina plasmatica hè correlata positivamente cù u pesu di u corpu in i gruppi di alimentazione (R= 0.76). (b) Media evocata à impulsu unicu [DA]_o in core NAc (vede Supplementari Fig. 2a, b per NAc shell è CPu) era più bassa in FR (38±4%) è OB (25±4%) versus AL (n= 50-60 siti da 5-6 ratti per gruppu di dieta, F_2,156= 23.337, ANOVA unidirezionale, Tukey HSD; ***P<0.001); OB versus FR (P<0.08). (c) Sensibilità di evocata [DA]_o à l'insuline a été augmentée en FR, mais perdue en OB (n= 21-49 siti per sottoregione per cuncentrazione da 2-4 ratti per gruppu di dieta, ANOVA unidirezionale, Tukey HSD), cù una sensibilità più grande in i ratti FR versus AL in tutte e sottoregioni (P<0.001 per ogni regione; ANOVA bidirezionale; CPU: F_{(conc × dieta; 3,286)}= 10.253; core: F_{(conc × dieta; 3,353)}= 6.166; cunchiglia: F_{(conc × dieta; 3,195)}= 10.735).

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Questi dati implicanu una relazione inversa trà a sensibilità InsR striatale è l'adipositu di u corpu. In alternativa, però, queste differenze dipendente da a dieta puderanu riflette una sensibilità alterata di nAChR. Dunque, avemu determinatu a risposta di cuncentrazione à a nicotina in u core NAc da ogni gruppu di dieta. A nicotina provoca a desensibilizazione nAChR, chì pò esse quantificata paragunendu a ratio di [DA]_o evocatu da un breve trenu di cinque impulsi à 100 Hz à un impulsu evocatu [DA]_o (5 p: 1 p ratio) cum'è un indice di attivazione / desensibilizazione nAChR^{30, 31}. Aduprendu stu approcciu, ùn avemu truvatu nisuna differenza trà i gruppi di dieta in a sensibilità nAChR in u core NAc (Supplementary Fig. 3a-c). Inoltre, u rapportu di cuntrollu 5 p: 1 p ùn hè micca diversu trà i gruppi di dieta in core NAc (Supplementari Fig. 3d) o CPu (micca illustratu), chì implica chì a dieta ùn altera micca a regulazione di liberazione DA dipendente da nAChR. Cusì, a sensibilità InsR striatale pare esse rinfurzata in i ratti FR versus AL, ma assente in i ratti OB, cù a perdita di regulazione di a liberazione di DA striata à concentrazioni fisiologiche di insulina.

L'insulina di shell NAc modula a preferenza di u gustu cundizionatu

I preferenze alimentari sò generate da i dui fattori pre- è post-ingestivi; i miccanismi per ognunu ùn sò micca cumpletamente risolti, ma l'evidenza attuale implica a signalazione NAc DA in i dui^{37, 38}. Siccomu i livelli di insuline in u plasma è u liquidu cerebrospinale (CSF) aumentanu rapidamente dopu l'elevazione di glucose perifèrica.⁶, è chì un aumentu di l'insulina in u striatum pò esse rilevatu in 5 minuti di elevazione di l'insulina plasmatica.⁷, hè logicu di ipotizà chì a liberazione periferica di insulina durante un pastu puderia rinfurzà a liberazione di NAc DA è cuntribuisce à i meccanismi di ricumpensa post-ingestiva. Avemu adattatu un protokollu di preferenza di gustu discritta prima³⁷ cù suluzioni di glucose zuccherate cù saccharin in i ratti per pruvà l'ipotesi chì u bloccu di l'effettu di l'insulina endogena per l'applicazione locale di un anticorpu di l'insuline (InsAb) in u NAc diminuiria a preferenza per u gustu accoppiatu. L'efficacità di l'InsAb in bluccà l'effetti di l'insulina hè stata pruvata in un in vitro analisi di l'assunzione di DA in sinaptosomi striatali. L'insulina (30 nM) hà causatu un aumentu significativu in V_aigle in sinaptosomi da NAc o CPu (A complementa Fig. 4), coherente cù i nostri V_aigle data from striatal slices (Table 1) è cù studii precedenti^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. In assenza di insulina, nè InsAb nè un anticorpu di cuntrollu immunoglobulina G (IgG) hà alteratu u V_aigle per l'assunzione di DA versus cuntrollu. In presenza di IgG, l'insulina hà ancu causatu un incrementu significativu V_aigle; in ogni modu, l'effettu di l'insuline nantu V_aigle hè stata persa in presenza di InsAb (A complementa Fig. 4).

Per minimizzà u dannu tissutu è priservà a sensibilità di u target tissue, sò stati testati dui gruppi di sughjetti in quale avemu alternatu a microinjection intra-NAc cù una prucedura di microinjection simulata, invece di utilizà un unicu gruppu di sughjetti è accoppià una soluzione aromatizzata cù InsAb è una altra cù veiculu. In cunseguenza, durante e sessioni di condizionamentu di una buttiglia, u gruppu sperimentale hà ricevutu microiniezioni InsAb accoppiate cù unu di dui sapori, è in sessioni alternate, microiniezioni simulate accoppiate cù l'altru sapore (Fig. 4a, manca). U gruppu di cuntrollu hà ricivutu microinjections simulate alternate cù microinjections di saline tamponate di fosfati (PBS) o IgG. E duie soluzioni aromatizzate cuntenenu glucose durante u cundizionamentu. Nisuna preferenza differenziale trà i sapori era prevista in u gruppu di microinjected di cuntrollu, mentre chì a preferenza era prevista per trasfurmà versu u gustu simulatu di microinjection-paired in u gruppu InsAb-microinjected.

  

  

(a) Diagramma chì illustra u cundizionamentu di una buttiglia (a manca) è a prova di dui buttigli (a diritta). (b) Volume cunsumatu (ml) durante e sessioni di condizionamentu di una buttiglia. Ci hè stata una interazzione significativa trà a sessione di infuzione-condizionamentu è u trattamentu di microinjection.n= 19-20 rati per gruppu, F_(3,111)= 3.088, P<0.05, 2 × 4 ANOVA mistu cù misure ripetute nantu à a sessione di infusione-condizionamentu). A microinjection InsAb hà diminuitu significativamente u cunsumu cumparatu cù u cuntrollu durante u terzu (t(40) = 3.026, **P<0.01) è quartu (t(40) = 3.052, **P<0.01, prutettu una coda t-test) infusioni. L'iniezioni simulate ùn anu micca effettu nant'à u cunsumu in ogni gruppu (F_3,111=1.110, 2 × 4 mixed ANOVA with repeated measures on mock conditioning session). (c) Volume consumed during two-bottle flavour-preference test. There was a significant interaction between flavour and microinjection treatment during conditioning (F_1,37= 5.36, P<0.05, ANOVA mixte à deux voies avec mesures répétées sur la saveur). U gruppu InsAb hà cunsumatu significativamente menu di u gustu di l'InsAb-paired cumparatu cù u gustu di simulazione (t(18) = 2.82, **P<0.01, prutettu una coda t-test); u gruppu di cuntrollu ùn hà micca mostratu preferenza di gustu (t(19) = 0.803, P> 0.05, prutettu t-test). Paragunendu gruppi, i ratti InsAb bevianu significativamente menu di u gustu di l'infuzione (t(40) = 1.96, *P<0.05) è significativamente più di u gustu simulatu (t(40) = 1.77, *P<0.05, prutettu una coda t-test) chè i cuntrolli.

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Durante e sessioni di condizionamentu in una buttiglia, a microinjection InsAb hà diminuitu significativamente u cunsumu cumparatu cù u veiculu durante a terza è a quarta infusione (Fig. 4b). À u cuntrastu, i dui gruppi anu cunsumatu u stessu voluminu di suluzione durante e quattru sessioni di iniezione simulata (F_3,111= 0.127, P>0.05, ANOVA mixte bidirezionale) (Fig. 4b). Dopu un totale di ottu sessioni di cundizzioni, a preferenza di sapori hè stata valutata in una prova di dui buttigli in quale i rati avianu accessu à e duie soluzioni aromatizzate simultaneamente (Fig. 4a). L'analisi statistiche hà revelatu una interazzione significativa trà u gustu è u trattamentu di microiniezione ricevutu durante u cundizionamentu (Fig. 4c). U gruppu InsAb hà cunsumatu significativamente menu di u gustu di l'InsAb-paired cumparatu cù u gustu di simulazione (Fig. 4c), mentri u gruppu di veiculi ùn hà micca mostratu preferenza di gustu (Fig. 4c), chì implica chì a signalazione di l'insulina intacta hà cuntribuitu à a selezzione di una suluzione calorica dolce. In cunfrontu cù u veiculu, i ratti microinjected InsAb bevianu significativamente menu di u gustu di l'infuzione è significativamente più di u gustu di simulazione di l'iniezione (Fig. 4c). Microiniezione di IgG (t(9) = 0.792. P>0.05, prutettu t-test) o PBS (t(9) = 0.442. P>0.05, prutettu t-tests) ùn anu micca effettu nantu à a preferenza di sapori (dati micca mostrati), argumentendu contru à a pussibilità chì un effettu micca specificu di a microinjection InsAb diminuite u cunsumu o a preferenza di sapori. Deve ancu esse nutatu chì a preferenza di u gruppu InsAb à a prova ùn hè micca una preferenza per u gustu menu novu, postu chì ùn ci era micca interazzione trà sessione è tipu di sessione (infuzione attuale versus infusione simulata) per u gruppu InsAb (F_3,54= 1.584, P> 0.05, ANOVA bidirezionale). Questu hè, u gruppu InsAb ùn hà micca cunsumatu più di u gustu di mock-infusion-paired relative à u gustu InsAb infusion-paired; piuttostu, e differenze trà i gruppi di trattamentu sò emerse solu durante e sessioni di infuzione-condizionamentu. In generale, sti dati indicanu chì l'insulina in u NAc ghjoca un rolu in u rinfurzamentu di a preferenza per un sapori chì signala una carica glicemica.

Riportemu quì chì l'insulina amplifica a liberazione di DA striata in una manera dipendente da nAChR modulendu l'eccitabilità ChI via InsRs. I nostri risultati implicanu chì l'insulina pò serve cum'è un signalu di ricumpensa, in più di u so rolu stabilitu in a signalazione di sazietà. In particulare, l'effettu di l'insulina nantu à a liberazione di DA hè modulatu da a dieta, cù una sensibilità marcatamente aumentata à l'insuline dopu FR, ma una perdita cumpleta di a regulazione rinforzata di l'insuline nantu à una dieta OB. Questi cambiamenti parenu riflette cambiamenti in a sensibilità InsR chì sò inversamente ligati à i livelli di insulina circulante, postu chì i livelli di insulina plasmatica sò stati trovati per esse dipendente da a dieta, ma a sensibilità nAChR ùn era micca. Infine, i nostri studii di preferenza di sapori in animali cumportanu implicanu chì a signalazione di l'insulina in a cunchiglia NAc influenza a preferenza di l'alimentariu, chì implica micca solu l'insulina in l'apprendimentu di l'alimentariu, ma ancu cunferma u so rolu di signale di ricumpensa.

Net [DA]_o riflette l'equilibriu trà a liberazione di DA è l'assunzione di DA via u DAT. Previous evidenza chì mostra chì l'insulina pò regulà l'attività DAT^{18, 19, 20, 21, 22, 23} hà purtatu à a prediczione chì un aumentu di l'insulina duverà causà una diminuzione netta di [DA] evocata._o via increased DA uptake. However, we found that in the striatum, the effect of insulin is more complex than this. Although insulin exposure did increase V_aigle per u DAT, l'effettu primariu di l'insulina era nantu à a liberazione di DA, micca in l'assunzione di DA, cun un aumentu consistente di [DA] evocatu._o in una gamma fisiologica di concentrazioni di insulina in NAc shell è core è in CPu. Ancu l'aumentu di evocati [DA]_o hà tornatu à i livelli di cuntrollu à una cuncentrazione suprafisiologica di 100 nM, V_aigle hè statu ancu micca cambiatu da u cuntrollu, eliminendu un effettu predominante nantu à u DAT cum'è una spiegazione. Invece, a perdita di l'effettu nantu à l'assunzione è a liberazione implica a desensibilizazione di l'InsR o a downregulation of the downstream signaling pathways at high concentrations d'insulina. En effet, les InsR subissent une endocitose rapide et une dégradation après la liaison à l'insuline dans les tissus periferiques.¹, with emerging evidence for loss of neuronal InsR sensitivity after short-term exposure to high levels of insulin or high-calorie diets^{10, 11, 39}.

L'effettu dominante di l'insulina per rinfurzà a liberazione di DA striatale riportatu quì cuntrasta cù i risultati di dui altri recenti ex vivo studii fette. In u primu, l'insulina hà causatu una diminuzione di u overflow evocatu elettricamente di [³H]DA da fette striate, anche se aumentata [³H] DA overflow hè statu rilevatu quandu u DAT hè statu inhibitu²². Datu chì liberatu [³H]DA deve scappà l'uptake mediata da DAT in tuttu u tissutu per esse rilevatu in a suluzione superfusing, stu protokollu hè soprattuttu sensible à a regulazione DAT. I nostri risultati chì mostranu chì l'insulina aumenta a liberazione di DA via l'attivazione di ChIs è nAChR, in più di rinfurzà l'assunzione mediata da DAT, spiegherebbenu l'aumentu apparentemente paradossale di l'insuline-enhanced.³H] DA overflow vistu quandu cumpetizione effetti nant'à u DAT statu bluccatu²². U secondu studiu hà utilizatu FCV per a rilevazione diretta di liberazione di DA somatodendriticu in u VTA, ma hà ancu truvatu un effettu predominante di l'insulina nantu à l'assunzione di DA, riflessa in una diminuzione evocata [DA]_o (rif. 23). Differenze in una quantità di fattori, da i microcircuiti lucali à i meccanismi di liberazione di DA somatodendritici versus assonali⁴⁰, puderia cuntribuisce à sta diferenza regiunale. Comu discutitu più in seguitu, però, i roli di l'insuline dipendenu da a regione sò prubabilmente cumplementarii, invece di cuntradittori.

In precedenza, ogni rolu di regulazione dipendente da l'insulina di a signalazione DA era stata assunta per esse mediata da l'attivazione diretta di InsRs nantu à i neuroni DA. Mostremu quì chì InsRs sò ancu spressi nantu à ChIs striatali, è chì l'insulina modula l'excitabilità ChI per amplificà a liberazione di DA striata, chì pò ghjucà un rolu pivotale in l'influenza di l'insulina nantu à a dieta. I ChIs striatali ricevenu proiezioni da i neuroni di i nuclei intralaminari di u thalamus, chì mostranu un focu di scoppiu in risposta à stimuli sensoriali salienti è aiutanu à guidà i mudelli di spiking in pausa di burst in ChIs chì sò impurtanti per dirige l'attenzione, u rinfurzamentu è l'apprendimentu assuciativu.⁴¹. Dunque, l'azzione di l'insulina à l'InsRs nantu à i ChIs striatali puderia rinfurzà l'effettu di i segnali alimentari sensoriali nantu à a risposta striata à u focu talamicu, cuntribuendu à una percezione aumentata di u valore di ricumpensa di un pastu ingeritu. A prumuzione diretta di a liberazione di DA striata da l'attivazione di ChI hà purtatu à u suggerimentu chì i fatturi chì stimulanu ChIs anu un rolu privilegiatu cum'è attivatori di liberazione di DA.³³. I nostri dati furniscenu a prima evidenza di sustegnu per questu, cù l'eccitabilità ChI rinfurzata da l'insulina è a signalazione ACh chì guidanu aumenti dinamichi in a liberazione di DA.

L'elevata liberazione di DA in presenza di insuline sustene ancu contru à un rinfurzà in a signalazione ACh in una misura chì provoca a desensibilizazione nAChR o l'attivazione di u receptore muscarinic ACh (mAChR), l'una di l'altra pò supprime l'evocazione di un impulsu unicu [DA]_o (rif 29, 30, 31, 42). Thus, the mechanisms reported here are distinct from ACh activation of mAChRs, which has been associated with aversion and satiety⁴³.

Un impulsu evocatu [DA]_o era più bassu in i ratti FR è OB cà in i ratti AL; anche se questi risultati sò in cunsonanza cù i rapporti precedenti^{44, 45, 46}, i nostri studii furnisce u primu paraguni sistematicu di trè subregioni striatali in i dui gruppi di dieta nantu à un tempu constantemente. I miccanismi sottumessi à i cambiamenti dipendente da a dieta in a liberazione di DA ùn sò micca stati elucidati, è sò fora di u scopu di i studii prisenti. Toutefois, étant donné que les niveaux d'insuline plasmatique sont modifiés à l'opposé par les régimes FR et OB, il est peu probable qu'une diminution de [DA] évoquée._o in i dui gruppi hè una cunsequenza di i livelli di insuline dipendente da a dieta.

Per d 'altra banda, i cambiamenti in a sensibilità InsR cù a dieta è i cunsequenti livelli di insuline plasmatica dipendente da a dieta furnisce l'esplicazione più probabile per a sensibilità aumentata à l'insulina in FR è a perdita di risposta à l'insulina in OB. Ùn ci era micca evidenza per a spiegazione alternativa di a sensibilità alterata di nAChR in i ratti FR o OB versus AL. Ancu se i nostri scuperti sò trà i primi à indicà una sensibilità aumentata di l'InsR striatale cù FR¹⁸, a perdita di pisu pò esse accumpagnata da i livelli di insuline diminuite in CSF⁷, ce qui contribuerait à une sensibilité accrue de la libération de DA à l'insuline en FR. À u cuntrariu, a perdita di a risposta di l'insulina in i ratti OB hè coherente cù l'evidenza precedente per a diminuzione di a sensibilità InsR di u cervellu indotta da l'aumentu di pisu o di diete OB.^{3, 10, 11}.

U nostru ex vivo slice data support the hypothesis that insulin may signal reward as well as satiety. We tested this hypothesis by blocking the effect of endogenous insulin with bilateral InsAb microinjection in the NAc shell during flavour-preference conditioning. Consistent with a role in reward, blocking the effect of insulin decreased preference for the flavour of a paired glucose-containing solution versus the flavour associated with intact insulin signalling. Blocking insulin in the NAc shell also decreased consumption of a paired solution during one-bottle conditioning, whereas mock or control microinjections had no effect on consumption. These data suggest that insulin in the NAc shell plays a role in food preference. Previous studies have shown that intact DA signalling in the NAc is necessary for acquisition of flavour conditioning^{37, 38}, confirming a role for NAc DA in mediating the reinforcing effects of nutritive solutions. In this light, preference for the glucose solution paired with intact insulin availability argues against a primary effect of insulin on DAT-mediated DA uptake in the NAc shell, as this would be expected to decrease [DA]_o è dunque diminuite u cunsumu di u gustu di cuntrolli. I nostri risultati sò ancu cunsistenti cù quelli di un studiu precedente in quale a microiniezione di insulina in a cunchiglia di NAc hà aumentatu u tempu chì l'animali sò stati impegnati in l'auto-amministrazione orale di saccarosi, cun un aumentu di cunfini di u cunsumu di saccarosi.²⁶, chì era oppostu à a cunsequenza prevista di l'aumentu di l'assunzione di DA. In generale, sti dati di cumportamentu sò cunsistenti cù l'influenza prevista di l'insulina nantu à ChIs striatali è a liberazione DA rinfurzata. Tuttavia, sti risultati ùn escludenu micca l'implicazione di altri elementi di u microcircuito striatale in i cumpurtamenti monitorati, datu l'espressione InsR diffusa in tuttu u striatum.^{1, 14}.

I studii riportati quì furniscenu a prima evidenza chì l'insulina ghjoca un rolu in a cumunicazione di u valore caloricu, è dunque l'effetti gratificante di un pastu, chì hà implicazioni impurtanti per l'influenza di l'insulina in i sughjetti sottupesi è obesi. Diversi studii indicanu chì l'effetti post-ingestivi di l'alimentu, indipendentemente da chì i camini di trasduzione di u gustu sò intactu.⁴⁷, Aumentà a liberazione NAc DA è u rinfurzamentu pusitivu di u cumpurtamentu^{37, 47}. Cusì, a risposta di l'insulina post-absortiva pò codificà u rendiment glucemicu di un pastu è cuntribuisce à u rinfurzamentu di e preferenze alimentarii è i cumpurtamenti chì permettenu u cunsumu. Tuttavia, cambiamenti estremi in i livelli di insulina circulante è a sensibilità cintrali di l'InsR puderia avè un rolu in un comportamentu anormale è adattativu. Par exemple, l'hypoinsulinémie et la surrégulation compensatoire de la sensibilité à l'InsR chez les sujets FR pourraient être un facteur de leur disposition à l'excès.⁴⁸. À u cuntrariu, l'insensibilità centrale à l'insulina in a diabetes mellitus II o l'obesità, riflessa quì in i ratti OB, puderia cuntribuisce à un sensu diminuitu di ricumpensa dopu l'ingestione, guidà l'assunzione di alimenti cun un altu indice glicemicu cum'è compensazione.^{49, 50}. Per quessa, un aumentu o una diminuzione di a sensibilità di l'insulina striatale puderia cuntribuisce à l'alimentazione patologica, risultatu in binge eating è / o obesità.

In generale, i nostri scuperti revelanu un novu rolu per l'insulina cum'è un signalu di ricumpensa. Un tali rolu cuntrasta cù a so funzione cunnisciuta cum'è un signalu di sazietà, cumprese i risultati recenti chì l'insulina microinjected in u VTA pò diminuisce l'alimentazione hedonica è a preferenza per i segnali assuciati à a ricumpensa alimentaria.^{23, 24}. Questu suscita a quistione di cumu si pò cuncilià i roli apparentemente opposti per l'insulina in queste funzioni dipendente da DA. A risposta pò esse chì questi effetti sò cumplementarii, piuttostu cà contradictori. I risultati attuali indicanu chì l'insulina in u striatum comunica u valore di ricumpensa di un pastu ingeritu. Un rolu doppiu in a signalazione di a sazietà pò solu permette à l'insulina di serve l'impurtante scopu di finisce un pastu, mentre chì simultaneamente stabilisce una memoria di e so qualità nutrizionale è cusì gratificante, rinfurzendu cusì a ripetizione di u cumpurtamentu ingesttivu.

Manipulazione di l'animali

I prucedure di l'animali sò stati in cunfurmità cù e linee di NIH è appruvati da u Cumitatu di Cura è Uso d'Animali di a Scola di Medicina di NYU. Tutti l'animali eranu nantu à 12 ore di luce: ciculu scuru, cù luci da 06:00 à 18:00; ex vivo e fette sò state preparate trà 08:00 è 12:00. Studi meccanicistici in ratti AL è topi sò stati realizati in ex vivo fette d'animali allughjati in coppie, mentri i rati sò stati allughjati singolamenti per tutti i paraguni di gruppi di dieta è per studii di cumportamentu.

Regimi di dieta di ratti

I ratti maschi adulti Sprague-Dawley (Taconic) avianu 8-10 settimane d'età à l'iniziu di regimi di dieta chì duravanu 21-30 ghjorni. I ratti sò stati semi-aleatoriu assignati à i gruppi di dieta: i sughjetti sò stati classificati per u pesu iniziale, dopu ogni trio successivu di ratti hè statu distribuitu aleatoriamente trà i gruppi di dieta. I ratti AL anu avutu accessu liberu à i ratti per u listessu periodu cum'è i ratti accoppiati in dieti FR o OB. Tutti i rati avianu accessu liberu à l'acqua. A restrizione alimentaria hè stata implementata cum'è prima⁵¹; brevemente, i rati anu ricivutu 40-50% di l'assunzione di AL di ratto standard ogni ghjornu finu à chì u pesu di u corpu hè stata ridutta di 20%, dopu chì l'alimentu hè statu titolatu per mantene stu pesu. I ratti OB avianu accessu liberu à u chow è u cioccolatu Ensure, un liquidu assai piacevule cù grassu è zuccheru moderatu.⁵².

Forebrain Chat topi knockout

Topi cù un allele floxed conditional of Chat (Chat^flox) sò stati incruciati cù a Nkx2.1^Cre linea transgénica per pruduce topi in i quali l'ablazione di a sintesi di ACh hè limitata à u cervellu anteriore³². Littermates transgenic non mutanti eranu cuntrolli; i so genotipi Cre⁺;Chat^flox/+ è Cre^-;Chat^flox/flox sò chjamati "eterozigoti". I topi maschi adulti usati per i studii di fette avianu ad libitum accessu à chow è acqua.

Ex vivo preparazione di fette è suluzione fisiologica

Rats or mice were deeply anaesthetized with 50 mg kg^-1 pentobarbital (intraperitoneale (ip)) è decapitati. Per a voltammetria, fette coronali di u cervellu anteriore (spessore 300-400-μm) sò state tagliate nantu à un microtomo di lama vibrante Leica VT1200S (Leica Microsystems; Bannockburn, IL) in CSF artificiale tamponatu HEPES (aCSF) cuntentu (in mM): NaCl. (120); NaHCO₃ (20); glucose (10); acidu HEPES (6.7); KCl (5); sali di sodiu HEPES (3.3); CaCl₂ (2); è MgSO₄ (2), equilibratu cù 95% O₂/ 5% CO₂. I fette sò stati mantinuti in questa suluzione à a temperatura di l'ambienti per 1 h prima di l'esperimentu^{30, 32, 53}. Per l'elettrofisiologia, dopu à l'anestesia, i rati sò stati perfusi transcardiali cù una suluzione di ghiaccio chì cuntene (in mM): saccarosi (225); KCl (2.5); CaCl₂ (0.5); MgCl₂ (7); NaHCO₃ (28); NaH₂PO₄ (1.25); glucose (7); ascorbate (1); è pyruvate (3), è equilibratu cù 95% O₂/ 5% CO₂. Slices sò stati tagliati in questa suluzione, dopu trasferitu à una camera di ricuperazione in aCSF mudificatu chì cuntene (in mM): NaCl (125); KCl (2.5); NaH₂PO₄ (1.25); NaHCO₃ (25); MgCl₂(1); CaCl₂ (2); glucose (25); ascorbate (1); piruvatu (3); è myo-inositol (4), équilibré à 95% d'O₂/ 5% CO₂; sta suluzione hè stata inizialmente à 34 ° C, poi lasciata à rinfriscà gradualmente à a temperatura di l'ambienti⁵⁴. Tutti l'esperimenti di voltammetria è fisiologia sò stati realizati in una camera di registrazione di immersione à 32 ° C chì hè stata superfusa à 1.5 ml min.^-1 cù aCSF chì cuntene (in mM): NaCl (124); KCl (3.7); NaHCO₃ (26); CaCl₂ (2.4); MgSO₄ (1.3); KH₂PO₄ (1.3); è glucose (10), è albumina di serum bovina (BSA, 0.05–0.1 mg ml)^-1) équilibré à 95 % d'O₂/ 5% CO₂; i fette sò stati permessi di equilibrà in questu ambiente per 30 min prima di l'esperimentazione.

Voltammetria ciclica à scansione rapida

Studi di liberazione di DA evocati sò stati realizati utilizendu FCV in fette di u cervellu^{32, 53} preparatu da ratti maschili o Chat Topi knockout di u cervellu è cuntrolli eterozigoti (5-8 settimane). Studi in Chat I topi knockout sò stati cecati, ma i gruppi di dieta di ratti avianu fenotipi evidenti chì impediscenu l'accecazione. E misurazioni voltammetriche sò state fatte cù un Millar Voltammeter (dispunibule per dumanda speciale à u Dr Julian Miller à St Bartholomew è a Royal London School of Medicine and Dentistry, Università di Londra). Una forma d'onda triangulu convenzionale hè stata aduprata per FCV, cù una gamma di scansione da -0.7 à +1.3 V (versus Ag/AgCl), scan rate di 800 V s.^-1, and sampling interval of 100 ms^{30, 32, 53}. I dati sò stati acquistati utilizendu una scheda DigiData 1200B A/D cuntrullata da u software Clampex 7.0 (Dispositivi Moleculari). A liberazione DA hè stata evocata cù un elettrodu stimulanti cuncentricu; l'amplitude de l'impulsion du stimulus était de 0.4 à 0.6 mA et la durée de 100 μs^{30, 32, 53}. L'estimulazione di un impulsu lucale hè stata utilizata in core NAc è CPu; in ogni modu, un brevi trenu di impulsi à alta frequenza (cinque impulsi à 100 Hz) hè statu usatu per amplificà [DA] evocati._o in shell NAc. I dui paradigmi di stimulu evocanu a liberazione di DA chì hè potenziale d'azzione è Ca²⁺ dipendente, micca affettatu da glutamate liberatu simultaneamente è GABA^{42, 55}, è facilitatu da ACh liberatu simultaneamente^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. To quantify evoked [DA]_o, l'elettrodi sò stati calibrati cù cuncentrazione cunnisciuta di DA à 32 ° C dopu ogni esperimentu in aCSF è in a presenza di ogni droga utilizata durante un esperimentu datu.⁵³.

Esperimenti di voltammetria per valutà l'effettu di l'insulina nantu à [DA] evocata_o sò stati ottenuti utilizendu unu di dui protokolli. Esperimenti iniziali per determinà u cursu di u tempu per l'effettu di l'insulina (Sigma, I5523) sò stati realizati da u monitoraghju evucatu [DA]_o ogni 5 min in un unicu situ. L'insulina hè stata applicata dopu l'evocazione consistente [DA]_o hè stata ottenuta (tipicamenti 4-5 misure); l'effettu di l'insulina era massimu dopu à 50-60 min, è dopu evucatu [DA]_o restò à questu livellu per a durata di l'esperimentu (tipicamenti 90 min esposizione totale à l'insulina; Fig. 1c). In seguitu, l'effettu di l'insulina hè statu evaluatu da a registrazione evocata [DA]_o in 4-5 siti discreti in fette (+ 1.5 mm da bregma) in ognuna di e trè subregioni striatali in cundizioni di cuntrollu (aCSF o aCSF plus droga) è di novu à u mumentu di l'effettu massimu di l'insulina (sampling over 60-80 min), dopu sti campioni sò stati mediati per ogni subregione. L'effettu di l'insulina diminuite cù u tempu dopu a preparazione di fette; per minimizzà u tempu ex vivo è per ottimisà l'usu di l'animali, tipicamente, duie fette da un animali datu sò stati pruvati in a camera di registrazione à u stessu tempu. I droghe utilizati per sfidà l'effettu di l'insulina sò stati applicati 15 minuti prima di l'insulina via aCSF superfusing, cumpresu HNMPA trisacetoxymethyl ester (HNMPA-AM)._3; Enzo Life Sciences), S961 (Novo Nordisk), LY294002 (Sigma), picropodophyllotoxin (PPP; Tocris), mecamylamine (Tocris) è DHβE (Tocris). Cum'è descrittu in Risultati, a sensibilità alterata pussibule di i receptori ACh nicotinici trà i gruppi di dieta hè stata pruvata paragunendu u rapportu di piccu [DA]_o evoked by 5 p (100 Hz) with that evoked by 1 p evoked (5 p:1 p ratio)^{30, 31} in NAc core in presenza di 0-500 nM di nicotina (Sigma).

Determinazione di V _aigle da evocatu [DA]_o transitori in fette striatali

Per evaluà i cambiamenti indotti da l'insulina in l'assunzione di DA mediata da DAT, a parte iniziale di a fase di caduta di [DA] evocata._o curve hè stata adattata à l'equazioni di Michaelis-Menten per estrattà V_aigle (costante massima di assorbimentu)⁵⁶. K_m (chì hè inversamente correlata à l'affinità di u DAT per DA) hè stata fissata à 0.2 μM è hè cunnisciutu per esse simile in tutte e sottoregioni striate.⁵⁷ è micca affettatu da l'insulina (vede A complementa Fig. 4 didascalia).

Whole-cell recording

Slices Brain sò stati preparati da 29- à 35-ghjornu-vecchia ratu masculi; e cundizioni di registrazione eranu identiche à quelli usati in i studii di liberazione DA. L'arregistramentu di a pinza di corrente di cellula intera anu utilizatu metudi cunvinziunali⁵⁴. Striatal ChIs sò stati visualizati utilizendu un microscopiu Olympus BX51WI (Olympus America, Center Valley, PA) cù ottiche di cuntrastu d'interferenza differenziale infrarossa è un scopu di immersione in acqua × 40. A suluzione di pipette cuntene (in mM): K-gluconate (129); KCl (11); HEPES (10); MgCl₂ (2); EGTA (1); Na₂-ATP (2); Na₃-GTP (0.3); è aghjustatu à pH 7.2-7.3 cù KOH. Per i neuroni registrati per esse valutati per l'immunoreattività ChAT, 0.3% di biocitina hè stata inclusa in a suluzione di pipette è i neuroni registrati brevemente (~ 5 min) per minimizzà a diluzione di u cuntenutu intracellulare. A resistenza di pipette era ~ 3-5 MΩ. I registrazioni sò stati ottenuti utilizendu un amplificatore Axopatch 200B (Dispositivi Moleculari, Sunnyvale CA) è filtrati passaghju à 2 kHz. ChIs sò stati identificati da criteri elettrofisiologichi stabiliti²⁸; a maiò parte eranu tonicamente attivi inizialmente, ma l'attività diminuì variamente dopu à patching. Tuttavia, a risposta à l'iniezione attuale era generalmente robusta è coherente cù u tempu, è hè stata dunque aduprata per investigà l'effettu di l'insulina nantu à l'excitabilità ChI (vede Risultati). In esperimenti per esaminà u rolu di InsRs è IGF-1Rs in questa risposta, sia HNMPA o PPP hè stata applicata per almenu 20 min prima chì un ChI hè stata patched. L'effetti massimi di l'insulina sola sò stati tipicamenti osservati dopu ~ 16 min d'esposizione, anche se in alcune cellule, l'aumentu ùn era massimu finu à 50 min o più. Inoltre, in quattru di sei neuroni registrati in PPP, l'insulina hà causatu una diminuzione iniziale di u numeru di spike prima di ricuperà è superà u numeru di spike iniziale. In cunseguenza, in tutti l'esperimenti, l'effettu di l'insulina hè statu quantificatu paragunendu l'effettu massimu nantu à u numeru di spike cù u numeru di spikes evocati immediatamente prima di l'applicazione di l'insulina. A diffarenza apparente in u tempu per ghjunghje l'effettu piccu puderia riflette una quantità di fatturi, cumprese a prufundità di a cellula arregistrata in a fetta. I putenziali d'azzione evocati sò stati ancu registrati in ChIs in assenza di insulina in punti di tempu paragunabili.

Cromatografia liquida di altu rendiment

U cuntenutu DA di fette striatali di ratto (spessore 400-μm) hè statu determinatu utilizendu cromatografia liquida d'alta prestazione cù rilevazione elettrochimica.⁵⁸. I coppie di fette sò state equilibrate per 30 min à 32 ° C in aCSF, è dopu una fetta per coppia hè stata incubata per 60 minuti supplementari à 32 ° C in aCSF mentre l'altra hè stata incubata in aCSF cù insulina 10 o 30 nM. Per i paraguni di gruppi di dieta, u tissutu striatal hè statu cullatu trà 30-60 min post-ricuperazione. Dopu à l'incubazione, l'eccessu di aCSF hè statu eliminatu cù cura da e fette, un campione di tissutu striatale (7-10 mg) hè statu pesatu, congelatu nantu à ghiaccio seccu è poi almacenatu à -80 ° C. U ghjornu di l'analisi, i campioni sò stati sonicati in ghiaccio, eluenti, deoxygenated cù argon.⁵⁸, filatu in una microcentrifuga per 2 min, è u supernatant injected direttamente nantu à a colonna HPLC (BAS, West Lafayette, IN); u detector era un elettrode di carbone vitreu stabilitu à 0.7 V versus Ag/AgCl.

Immunohistochemistry

Per l'etichettatura immunoistochimica, i topi sò stati anestetizzati cù pentobarbital di sodiu (50 mg kg).^-1, ip), poi perfused transcardially with PBS (154 mM NaCl in 10 mM phosphate buffer, pH 7.2) seguita da 4% paraformaldehyde in questa PBS; i cervelli sò stati eliminati è e sezioni coronali (20 μm) sò stati tagliati è processati cunvinziunali^{27, 59}. Immunofluorescence images were obtained with a Nikon PM 800 confocal microscope equipped with a digital camera controlled by Spot software (Diagnostic Instruments Inc.) and using a × 100 objective (numerical aperture=1.4) or with a Zeiss LSM 510 confocal microscope using a × 63 objective (numerical aperture=1.2). The lasers were Argon (488 nm), He/Ne (543 nm) and He/Ne (633 nm). Appropriate filters for each laser were selected by the confocal microscope software. Pinhole size varied with the objective used and section thickness selected in z-generazione di stack; avemu sceltu u valore di pinhole ottimali indicatu da u software (tipicamenti 30 μm). I fugliali digitali sò stati analizati cù u software di deconvolution (AutoQuant Imaging), cù l'imaghjini finali trattati cù Adobe Photoshop 7.0. Tutte l'imaghjini sò stati aghjustati per a luminosità è u cuntrastu; tali aghjustamenti sò stati fatti uniformi à tutte e parte di l'imaghjini. Gli assoni DA striati sono stati identificati usando due anticorpi TH: policlonale AB152 coniglio anti-TH (1: 800) e monoclonale MAB318 mouse anti-TH (1: 500) (entrambi da Chemicon). Trè anticorpi InsR sò stati utilizati: sc-57342 è sc-09 (1: 100; Santa Cruz), è PP5 (un rigalu da Pfizer). A specificità di ognunu hè statu dimustratu prima^{60, 61}, and was confirmed in the present studies by the absence of immunolabelling with antibodies sc-57342 or PP5 in the presence of the corresponding blocking peptide. ChAT antibody was AB144 (1:200; Millipore), and biotin was from Vector (1:200). Secondary antibodies used were donkey anti-rabbit Alexa 488 (Invitrogen), or donkey anti-rabbit Cy2 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), donkey anti-goat Cy3 (Jackson) and donkey anti-mouse Cy5 (Jackson).

Per valutà a co-localizzazione di InsR in assoni TH +, avemu utilizatu metudi descritti in precedenza per identificà a presenza di Kir6.2, a subunità di formazione di pori di K ATP-sensibile.⁺ canali negli assoni DA²⁷. I punti chì rapprisentanu InsRs sò stati distribuiti in l'imaghjini aghjustate, chì indicanu chì a superposizione cù l'immunoreattività di TH pò accade in una certa misura per casu. Per pruvà sta ipotesi, avemu cuntatu i superposizioni InsR / TH in 42 campi indipendenti in trè sezioni immunomarcate NAc da dui ratti. I fugliali digitali InsR sò stati poi rotati 90 ° in u sensu orariu è i cunti ripetuti; a rotazione hà diminuitu u numeru di InsR puncta chì co-localized cù TH in a maiò parte di i campi (vede Risultati). A diminuzione di u nùmeru di superposizioni cù rotazione²⁷ indicava la proporzione di InsR puncta in ogni campo striatale associato agli assoni DA.

ELISA di glucose di sangue è insuline

U sangue di u troncu hè statu cullatu à u mumentu di a decapitazione per studii di fette. A glucose di sangue hè stata determinata immediatamente cù un monitor standard di glucose di sangue. Per l'insulina, sangue supplementu hè statu cullatu in tubi chì cuntenenu EDTA è centrifugatu à 1,500.g per 15 minuti; U surnatant (plasma) hè statu cullatu è almacenatu à -80 ° C finu à u processu cù un kit ELISA di insulina di rat ALPCO.

Posizionamentu di cannula è verificazione istologica

Quarantuno ratti maschi adulti Sprague-Dawley (Taconic è Charles River) chì pesavanu inizialmente 350-425 g sò stati anestetizzati cù ketamina (100 mg kg).^-1, ip) è xilazina (10 mg kg^-1, ip) è stereotaxically implanted with two chronicly indwelling guide cannulae (26 gauge) placed bilaterally 2.0 mm dorsal to infusion sites in the NAc medial shell.⁶² (1.6 mm davanti à bregma; 2.1 mm laterale à a sutura sagittale, punte angulate 8 ° versu a linea mediana, 5.8 mm ventrale à a superficia di u cranu). I ratti sò stati dati banana (2.0 mg kg^-1, subcutaneous) cum'è un analgésicu post-chirurgicu dopu a ricuperazione da l'anesthesia è a matina dopu. Una settimana dopu a cirurgia, i rati sò stati posti nantu à FR (discrittu sopra) è manteni à 80% di u so pesu di ricuperazione post-chirurgia per u restu di u studiu. A piazzamentu di a cannula hè stata determinata histologicamente dopu a fine di a prova di cumportamentu. Ogni ratu hè statu uccisu cù CO₂, decapitata è u cervu sguassatu è fissatu in 10% formalin tamponatu per> 48 h. Sezioni coronali congelate (spessore 40 μm) sò state tagliate nantu à un Criostat Reichert-Jung, scongelu muntatu nantu à vetri di vetru rivestiti di gelatina, è macchiati cù cresyl violet. I dati da un ratu datu sò stati utilizati solu se e duie cannule eranu in a cunchiglia mediale NAc⁶² (cumprese a cunchiglia / core o cunchiglia / cunfini di tuberculu olfattivu) (A complementa Fig. 5); based on these criteria, two rats were excluded from the final analysis.

Pre-esposizione di condizionamentu di preferenza di gustu

I ratti anu ricivutu una notte (in a cage di casa) è sei sessioni di 30 minuti per ghjornu di pre-esposizione (in camere di prova) à 0.2% di saccarina di sodiu (Sigma) in acqua cù un intervallu di 48 h trà e sessioni. I ratti anu ricivutu duie sessioni di 5 minuti per ghjornu di esposizione à 0.2% di saccarina di sodiu in 0.05% di uva senza zucchero o ciliegia Kool-Aid (Kraft Foods) in acqua. Per a prima sessione di pre-esposizione di Kool-Aid, a mità di i rati anu ricivutu una soluzione à aroma di ciliegia, è l'altra mità hà ricevutu una suluzione à uva. I sapori sò stati invertiti nantu à a seconda sessione di pre-esposizione Kool-Aid per assicurà chì tutti i rati anu campionatu ogni gustu. L'assunzione hè stata misurata per tutte e sessioni di pre-esposizione. E camere di prova eranu gabbie di plastica chjaru cù letti freschi. Per tutte e sessioni di pre-esposizione, i rati avianu accessu à a stessa suluzione da i dui lati di a camera. Eccettu per a sessione di pre-esposizione di notte, tutte e sessioni sò state realizate in una sala di prucedura cumportamentale, cù un periodu di abituazione di 30 minuti prima di qualsiasi furmazione o prova.

Condizionamentu in una buttiglia

Studi precedenti anu dimustratu chì a microiniezione di InsAb in l'ipotalamo ventromediale pò bluccà l'effettu di l'insulina nantu à u cumpurtamentu di l'alimentazione è a secrezione di glucagon.^{63, 64}. Quì avemu usatu stu approcciu per valutà un rolu pussibule di l'insulina in u rinfurzamentu di a scelta di l'alimentariu. I ratti sò stati assignati semi-aleatoriu basatu annantu à u voluminu mediu di pre-esposizione in dui gruppi, cuntrollu o sperimentale (InsAb). In u gruppu di cuntrollu, i ratti anu ricevutu veiculu (microiniezione PBS; 137 mM NaCl è 2.7 mM KCl in 10 mM tampone fosfatatu) o IgG (Abcam ab81032; 0.5 μg μl).^-1 in PBS, cum'è ricevutu) microinjection in NAc shell prima di cunsumà una di e duie soluzioni aromatizzate, è una microinjection simulata prima di cunsumà l'altra suluzione aromatizzata. In u gruppu sperimentale, i ratti anu ricevutu microiniezione di shell NAc di InsAb (Abcam ab46707; 0.5 μl di 1 μg μl).^-1 in PBS, cum'è ricevutu) prima di l'esposizione à una soluzione aromatizzata, è simulate microinjection prima di l'esposizione à l'altru. Sò stati utilizati dui gruppi di sughjetti cù l'alternanza trà a microinjection fluida è a microinjection simulata, cusì chì u numeru tutale di microinjections era limitatu à quattru, minimizendu cusì u dannu tissutu pussibule è a perdita di sensibilità in u situ di microinjection.⁶⁵. Per a microiniezione di fluidi, a suluzione di cuntrollu o InsAb hè stata caricata in dui tubi PE-30 di 50 cm attaccati à una estremità à siringhe Hamilton da 5 μl piene d'acqua distillata è à l'altra estremità à cannule d'iniettore di calibre 31, chì si estendevanu 2.0 mm. oltre le guide implantate. I volumi di infusione di 0.5 μl sò stati consegnati in 90 s à una velocità di 0.005 μl s^-1; l'injector hè stata lasciata in u locu per ~ 60 s per permette u tempu di diffusione, dopu l'injector hè statu rimpiazzatu cù u stylet.

I rati sò stati trasferiti direttamente à e camere di cumportamentu in 2 minuti da a fine di a microinjection o di microinjection simulata. I suluzione di cundizzioni cuntenenu 0.2% di saccarina di sodiu, 0.05% uva o ciliegia Kool-Aid senza zuccheru, è 0.8% glucose. L'accessu à a suluzione hè stata limitata à 30 min per sessione. U gustu accoppiatu è u latu di a camera cù l'accessu per beie sò stati assignati semi-aleatoriu è compensati in ogni gruppu. L'intervallu trà e microinjections era almenu 72 h, alternendu trà infuzione è sessioni di simulazione per un totale di ottu sessioni di cundizzioni.

Test di preferenza di dui buttigli

Quaranta ottu ore dopu à l'ultima sessione di cundizzioni, i rati sò stati posti in camere di prova cù accessu simultanea à i dui sapori di cundizzioni; suluzione eranu 0.2% saccarina di sodiu in 0.05% uva o ciliegia Kool-Aid, senza glucose. A prova hè accaduta in 2 ghjorni (60 min per ghjornu). A pusizioni di u tubu di beie chì cuntene una soluzione mock-paired o infusion-paired hè stata alternata per assicurà chì ogni ratu hè pruvatu per u cunsumu di ogni suluzione in i dui lati di a gabbia. L'assunzione di ogni suluzione aromatizzata hè stata mediata per i dui ghjorni di teste per determinà a preferenza.

[³L'assunzione di H]DA in i sinaptosomi striatali per valutà l'efficacità di InsAb

Sinaptosomi striatali^{21, 66} sò stati preparati da ratti AL (masculi, 350-400 g), cù NAc (shell and core) è CPu disseccati è preparati separatamente. U tissutu da ogni regione hè stata homogenizata in 15 volumi di una suluzione di saccarosa 0.32 M di ghiaccio in un homogenizatore di vetru cù pestle di Teflon motorizatu; dopu à risciacquare è centrifugazione, a pellet finale hè stata risuspendita in saccarosi 0.32 M di ghiaccio.^{21, 66}. Prima di inizià u [³Test di assorbimento di H]DA⁶⁶, aliquote sinaptosomiali in un volume totale di 180 μl di tampone di assorbimento sono state incubate in un agitatore per 15 minuti a 30 ° C in presenza o assenza di insulina 30 nM, in veicolo (PBS) o in InsAb (diluizione finale 1:500) , in IgG (diluzione finale 1:500) o in veiculu. Tampone d'uptake cuntenutu (in mM): NaCl (122); Na₂HPO₄ (3); NaH₂PO₄ (15); KCl (5); MgSO₄ (1.2); glucose (10), CaCl₂ (1); nialamide (0.01); tropolone (0.1); è l'acidu ascorbic (0.001), pH 7.4. l'assunzione di [³L'H]DA hè stata iniziata da a dispensazione rapida di 20 μl di ogni sospensione sinaptosomica in i piatti di 96 pozzetti cù concentrazioni variate di DA (0.003-1.0 μM) è [³H]DA (5 nM); dopu à 5 minuti in un agitatore di piastra à 25 ° C, l'absorzione hè stata terminata da una filtrazione à u vacuu rapidu è friddu.⁶⁶. Counts per well were converted to pmoles, then corrected to mg of total protein per minute. All assays were performed in triplicate and repeated at least four times; V_aigle e K_m sò stati calculati cù u software Biosoft Kell Radlig (Cambridge, UK).

Analisi statistica

Dati sò datu cum'è mezi±sem; L'impurtanza hè stata valutata utilizendu Student's paired or unpaired t-tests ou ANOVA, sauf indication contraire. Per i dati di voltammetria, n hè u numeru di siti di registrazione, datu chì a variabilità di situ à situ in una subregione striata hè più grande di a variabilità inter-animali o inter-slice^{30, 32, 55, 56}; U numeru di l'animali hè nutatu per ogni settore di dati. L'EC₅₀ per l'effettu di l'insulina è a nicotina nantu à i picculi evocati [DA]_o hè statu calculatu cù Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Per i dati elettrofisiologichi, a significazione statistica hè stata valutata cù paired t-tests o una prova di Wilcoxon in Prism 6.0, o una ANOVA mixta bidirezionale in SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Per a valutazione di l'implicazione di l'insulina in u condizionamentu di a preferenza di u gustu, dui studii cumpleti sò stati cumpleti cù protokolli chì eranu identici cù l'eccezzioni di u trattamentu di u veiculu utilizatu. In u primu studiu, 10 rati anu ricivutu infusioni di veiculi di PBS è 9 anu ricivutu infusioni di InsAB. In u sicondu studiu, 10 rati anu ricivutu infusioni di veiculi di IgG è 10 anu ricivutu infusioni di InsAb. Ùn ci era nisuna differenza significativa trà i dui gruppi di veiculi (PBS o IgG) durante e sessioni di infuzione-condizionamentu (F₁₉= 0.619, mixte ANOVA bidirezionale) cù misure ripetute nantu à a sessione di infusione-condizionamentu) o à a prova (F₁₉=0.012, two-way mixed ANOVA with repeated measures on flavour). Consequently, the two experiments were combined for analysis. For this analysis, a 2 × 4 mixed ANOVA (with repeated measures on infusion-conditioning day) was used to determine the effects of microinjection treatment during conditioning, followed by protected t-teste (una coda per determinà in quali sessioni di cundizzioni di trattamentu di microiniezione diminuite u voluminu di ingesta). A stessa analisi hè stata cumpletata per e sessioni di condizionamentu simulatu. Per determinà l'effettu di u trattamentu di condizionamentu durante una prova di preferenza di gustu à dui buttigli, i dati sò stati analizati utilizendu un ANOVA mistu bidirezionale (cù misure ripetute nantu à u gustu), seguitu da prutetta. t-tests (una coda per pruvà l'ipotesi chì InsAb diminuiria preferenza).

Cumu per citaru stu articulu: Stouffer, MA Et al. L'insulina aumenta a liberazione di dopamina striata attivando l'interneuroni colinergici è cusì signala a recompensa. Nat. Cumunu. 6:8543 doi: 10.1038/ncomms9543 (2015).

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Ritratti in isula

These studies were supported by NIH grants DA033811 (M.E.R., K.D.C. and M.E.A.R.), NS036362 (M.E.R.), DA03956 (K.D.C.) and a NARSAD Independent Investigator Award (K.D.C.). S961 was a generous gift from Dr Lauge Schaffer, Novo Nordisk. PP5 antibody was a generous gift from Pfizer. We thank Dr Charles Nicholson, NYU School of Medicine for software to extract V_aigle valori di dati FCV.