A Caccia Di Fattezza Di Coghju Moderatu Aciugisce L'Autocuviuculugia in Young Rats (2013)

Dianne P. Figlewicz,^1,2 Jennifer L. Jay,² Molly A. Acheson, Irwin J. Magrisso,⁴ Custanza H. West,¹ Aryana Zavosh,² Stephen C. Benoit,³ e Jon F. Davis³

Avemu raportatu prima chì una dieta moderatamente alta in grassu aumenta a motivazione di saccarosu in topi adulti. In stu studiu, avemu pruvatu l'effetti motivaziunali, neurochemichi è metabolichi di a dieta alta in grassu in i rati masci transitori à a pubertà, durante settimane di 5-8. Avemu osservatu chì a dieta alta in grassu hà aumentatu motivatu per risponde per a saccarosa, chì era indipendente da i cambiamenti metabolichi o di i cambiamenti in i metaboliti di neurotransmisori in catecholamine in u nucleu accumbens. Tuttavia, i livelli di mRNA AGRP in l'ipotalamo sò stati elevati significativamente. Avemu dimustratu chì l'attivazione aumentata di e neurone AGRP hè assuciata cù un cumpurtamentu motivatu, è chì l'amministrazione AGRP esogena (terza cerebroventriculare) hà risultatu in una motivazione significativamente aumentata per a sacarosa. Queste osservazioni suggerenu chì una maggiore espressione è l'attività di AGRP in l'ipotalamo medianu ponu sustene u più rispunsevule per a saccarosie causata da l'intervenzione in alta dieta in grassu. Finalmente, avemu paragunatu a motivazione di sucrosi in rati pubertali vs adulti è avemu osservatu una motivazione aumentata per a saccarosa in i rati pubertali, chì hè cunforme à i rapporti precedenti chì l'animali ghjovani è l'omu anu una preferenza aumentata per u gustu dolce, paragunatu cù l'adulti. Inseme, i nostri studii suggerenu chì a dieta di fondu ghjucà un forte rolu modulativu in motivazione di u gustu dolce in animali adolescenti.

Subjects

I sughjetti eranu rami Albino maschili da Simonsen (Gilroy, CA). I rati sò stati manteni in chow (Laboratoriu di Rodenti di Dieta 5001, LabDiet) o moderatu cù altissima grassa (31.8%; Research Diets Inc) ad libitum. I dieti sono abbinati per u cuntenutu di carboidrati in generale (58% kcal vs 51% kcal per bassa grassu vs grassu altu, rispettivamente). U grassu bassa grassu hà 6.23 gm% zuccheri gratuiti è a dieta alta grassu hà 29 gm% sucrosi. Sò stati manteni annantu à un 12: 12 h ciclu di luce scuru cù luci luminose à 6 AM. A menu chì ùn sia micca indicatu altrimente, i rati sò stati purtati in 3 settimane di età, immediatamente dopu a svelta, è eranu allughjati per acclimazione finu à 5 settimane di età. À questa età, a dieta è / o furmazione è a prova di cumportamentu sò cuminciati. Prutocoli specifichi sò deskritti in dettagliu quì sottu, è riassuntu in Table 1. Perchè i rati maschili passanu per a pubertà à u 6^th-7^th settimana di età, u timing di studii hè statu pensatu per studià i rati mentre attraversanu sta tappa di u sviluppu. Tutte e prucedure realizati nantu à i surgi seguitanu e linee NIH per a cura di l'animali, è sò stati appruvati da u Subcomitatu per a Cura di l'animali è l'Użu di u Cumitatu di Ricerca è Sviluppu in u Sistema di Cura di Sana di Sanguardia Puget.

  

Table 1

Protocolli sperimentali

Sacchero autogestione

Prutocolu Generale. E prucedure eranu basati annantu à a nostra metodulugia publicata (Figlewicz et al., 2008; Figlewicz et al., 2006). Tutte e prucedure di furmazione è di prova sò stati realizati trà 0700 è 1200 hr. L'esperimentu includia fasi 2-3: furmazione di autoshaping è rata fissa (FR); chirurgia è ricuperazione in cohorte specificate (vede Table 1); è furmazione progressiva di i raporti (PR) utilizendu l'algoritmu di PR di Richardson è Roberts (Richardson & Roberts, 1996). L'algoritmu PR richiede 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, 251, 331, 437, 575, 759, 999 etc) a leva pressa per a riescita à furnisce i premii in una sessione, è hè un rigurosu test di motivazione è di ricumpensa (999). I razzi sò stati furmati per auto-amministrà 27% saccarosu (ricumpenza di 5 ml) spediti in un cuncipientu di goccia di liquidu. I quadri operanti, cuntrullati da un sistema Med Associates (Georgia, VT), avianu duie leviere, ma solu una leva (una leva attiva, retractable) hà attivatu a pompa per infusione. Presses nant'à l'altra palanca (una palestra inattiva, stazionaria) sò stati dinù arregistrati. A suluzione di zuccaru hè stata rimessa in un cuncipientu di goccia liquida per u cunsumu orale (Med Associates). A furmazione iniziale hè stata realizata durante sessioni di una h per i ghjorni 0.5 in un calendariu di rinfurzamentu continuu (FR10: ogni pressa di leva era rinfurzata), cun un massimu pussibule di recompensi di saccarosa 1 consegnati per sessione. Ogni sessione hà iniziatu cù l'inserimentu di a leva attiva è l'illuminazione di una mantellu bianca chì restava per tutta a sessione. Un tonu 50-s (5 Hz, 2900 dB sopra u fondu) + luce (20 W luce bianca sopra a leva attiva) discreta cue di compostu accumpagnatu ogni consegna di ricumpensa, seguita da un tempu 7.5-sec dopu ogni consegna di sucrosa. A furmazione PR hè stata realizata per un massimu pussibule 20 h / ghjornu per dece ghjorni. I sessioni di u ghjornu finiscinu dopu à 3 min di nessuna palestra attiva risponde à questu puntu, a luce di a casa hè stata spenta è a leva attiva si ritirava.

Effettu di AGRP nantu à auto-amministrazione di sucrosi

Cumu i nostri risultati anu mostratu un aumentu di l'espressione mRNA di AGRP in i rati pubertali alimentati a dieta alta in grassu, avemu vulsutu cunfermà chì AGRP puderia aumentà l'auto-amministrazione di saccarosio. I ratti alimentati da 5-wk antichi sò stati purtati attraversu a furmazione FR, dopu ricevanu canulule in u terzu ventriculu cerebrale (ICV). Dopu à una settimana di ricuperazione, cunferma di piazzamentu cun una prova di risposta à l'angiotensina II di u consumu (vede Figlewicz et al., [2006]), è una sessione di ri-furmazione FR, i rati sò stati cuminciati nantu à u paradigma di l'auto-amministrazione PR. Dopu PR Day 1, i rati sò stati assignati à unu di i dui gruppi cusì chì significheghjanu a prestazione PR Day 1 ùn era micca diffarenza trà i dui gruppi (veiculu CSF artificiale, aCSF; o AGRP, 2 μl di 0.01 nmol). Anu ricevutu iniezioni di aCSF (n = 8) o AGRP (n = 7) in i ghjorni PR 2, 5, è 8. L'ingesta totali d'alimentariu ogni ghjornu hè stata quantificata durante u tempu di furmazione PR.

Effettu di l'età nantu à a auto-amministrazione di sucosa

Avemu paragunatu u cumpurtamentu di l'auto-amministrazione trà i ratti pubertali è l'adulti ghjovani, chow alimentatu o a dieta grassa 31.8%. I surci anu duie settimane d'aclimatazione à u vivariu VAPSHCS (3 — 5wk o 8 — 10 wk). Dopu ricevanu a dieta durante tuttu u periodu di prova / furmazione (4 wk). Cusì, cum'è in l'esperimentu iniziale, i suri pubertali sò stati studiati à l'età di 5-8 wk. L'adulti ghjovani sò stati studiati à l'età di 10-13 wk di età.

Determinazione di cumpusizioni di corpu

A cumpusizioni di u corpu hè stata misurata usando spettroscopia di resonanza magnetica quantitativa (QMR [Nixon et al., 2010]) per determinà u cuntenutu di l'acqua di u corpu di i ratti individuali, da quale hè calculatu u grassu di u corpu relative. L'animali sò stati posti in supporti cilindrici senza anestesi, è dopu i titulari sò inseriti in a macchina QMR per una scan 2 minute, chì realizanu misure triplicate. I dati sò salvati in un urdinatore integratu (EchoMRI, Echo Medical Systems, Houston, TX) per u calculu immediatu di l'acqua di u corpu, di grassu è di massa magra.

Prova intravenosa di tolleranza à u glucosiu (IVGTT)

E IVGTT consciente sò stati realizati in rati cù cannule IV implantate cronicamente, chì sò stati riuniti per a notte prima di studià, utilizendu metodulugia basata annantu à Frangioudakis, Gyte, Loxham, & Poucher (2008). I cannuli intravenosi bilaterali sò stati implantati duie settimane prima di studiu, secondu a nostra metodulugia stabilita (Figlewicz et al., 2009). I campioni baseline sò stati disegnati à t-10 min (0.5 ml per a determinazione di l'insulina è a glucose, in tutti i tempi) è t0 min. I ratti anu ricevutu una infusione di glucosia 1 gm / 2ml / kg sopra 15-20 seconde seguita da 0.5 ml saldatura di salina. I campioni di sangue sò stati purtati à 5, 15, 30, 60, 90, è 120 min. A causa di un tappetu di un cateter durante a prucedura (dunque, l'incapacità di ottene campioni di sangue), i n finali per i dati baseline / IVGTT presentati sò 7-8 per rati alimentati chow e 8 per rati alimentati 31.8% dieta grassa (Table 3). L'insulina plasmatica hè stata determinata utilizendu l'insulina di Raf Linco kits RIA (# RI-13K è SRI-13K, Linco) è a glucosia di plasma era determinata in un Analizatore di Glucosa YSI). Area sottu a curva (AUC) per a risposta da baseline hè stata calculata à 5 min è 120 min. L'indice HOMA hè statu calculatu cum'è fasting (glucose [mM] × insulinm [U / L]) / 22.5 è hè statu calculatu utilizendu mostre di dingi terminali misurati per l'insulina è u glucose.

  

Table 3

Paràmetri Metabolichi¹

Paràmetri metabolichi di riunione

U razzi da l'Esperimentu 1 hè statu vutatu durante a notte prima di l'eutanasia, uni pochi ghjorni dopu à a fine di l'IVGTT. I ratti eranu profondamente anestesiuti da inalazione di isoflurane è exsanguinati. U cervellu hè stata eliminata rapidamente è congelatu in nitrogenu liquidu per a misurazione di l'ARNm ipotalamici di peptide ARNm è u nucleu accumbens catecolaminine. U plasma o u serum terminali sò stati utilizati per a misurazione di l'insulina fasting, u glucose, a leptina è i trigliceridi. Per i trigliceridi, Point Scientific Triglyceride GPO Kit # T7531-400 (Fisher # 23-666-418) è i standard KIT # 7531-STD (Fisher # 23-666-422) sò stati utilizati per duplicazione, è 3 μl di serum sò stati utilizati per duplicate. A leptina di Plasma hè stata misurata cù u Millipore Linco RIA Kit # RL 83K.

Metodi HPLC di Catecholamine [Davis et al., 2008]

I razzi sò stati eutanasia cù l'anestesia isoflurane, è u cervellu sò stati rapidamente ritirati, congelati, è guardatu à -80 ° C. I micro-punches bilaterali di u nucleu accumbens (NAcc) sò stati isolati da ogni animali. Benchì una cura sostanziale hè stata presa per minimizzà a contaminazione da e regioni vicine di u cervellu, per via di a natura è di a dimensione di ogni micro-punch, u nostru metudu ùn ci hà permessu di distingue subregioni (vale à dì core NAcc vs shell) in NAcc. Per l'analisi di cromatografia liquida (HPLC) ad alte prestazioni, una soluzione antiossidante (perchlorato 0.4 N, acido etilenediaminetetraacetic 1.343 mM (EDTA) è metabolisulfite di sodio 0.526 mM è stata aggiunta à i campioni seguita da omogeneizzazione usando un omogeneizzatore di tessuto ultrasonico (Biologics; Gainesville, VA ) Una piccola parte di l'omogenato di tessuto era dissoltu in 2% sulfate di dodecil sodiu (SDS) (p / v) per a determinazione di proteine ​​(Kit di reagenti di proteina Pierce BCA; Rockford, IL). La sospensione restante è stata filata in 14,000 g per 20 min in una centrifuga frigorifera U supernatante era riservatu à HPLC.

I campioni sò stati separati nantu à una colonna Microsorb MV C-18 (5 Am, 4.6_250 mm, Varian; Walnut Creek, CA) e esaminati simultaneamente per l'acidu DA, 3,4-dihydroxyphenylacetic (DOPAC) e l'acido homovanillic (HVA), entrambi marcatori di degradazione di dopamina, 5-HT è 5-HIAA. I composti sò stati rilevati usando un detettore coulometric di canale 12-channel (CoulArray 5200, ESA; Chelmsford, MA) attaccato à un Sistema di consegna di solvente Waters 2695 (Waters; Milford, MA) nelle seguenti condizioni: flussu di 1 ml / min; potenziali di rilevazione di 50, 175, 350, 400 è 525 mV, è; potenziale di scrubburazione di 650 mV. A fase mobile consistia di una soluzione 10% metanol in H distillata₂O chì cuntene 21 g / l (0.1 M) acido citrico, 10.65g / l (0.075 M) Na2HPO4, 176 mg / l (0.8 M) acido heptanesulfonico è 36 mg / l (0.097 mM) EDTA a un pH di 4.1. I campioni scunnisciuti sò stati quantificati contru à una curva standard di puntu 6 cun un minimu R² di 0.97. I campioni di cuntrollu di qualità sò stati intercalati cù ogni correzione per assicura a calibrazione HPLC.

Peptidi Orexigenici mRNA qPCR

Avemu misuratu l'espressione di peptidi ipotalamici chì stimulanu l'alimentazione è sò stati implicati in cumportamenti di motivazione è di ricumpensa (Figlewicz & Sipols, 2010): neuropeptide Y (NPY [ Hahn, Breininger, Baskin, & Schwartz, 1998; Jewett et al., 1995; Kelley, Nannini, Bratt, & Hodge, 2001]); peptide ligatu à agouti (AGRP [Aponte, Atasoy è Sternson, 2011; Barnes, Argyropoulos, & Bray, 2010; Broberger et al., 1998; Hagan et al., 2000; Hahn, Breininger, Baskin, & Schwartz, 1998; Kaushik et al., 2011; Krashes et al., 2011; Rossi et al., 1998; Tracy et al., 2008]); e orexin (Cason et al., 2010; Choi, Davis, Fitzgerald è Benoit, 2010). I topi sò stati eutanasiati cù anestesia isoflurane, è u cervellu hè statu rapidamente rimossu, congelatu è conservatu à -80 ° C finu à a trasfurmazione. L'ipotalamu mediale è laterale sò stati microdissettati cum'è un bloccu aduprendu un pianu di congelazione AHP-1200CPV (Thermoelectric Cooling America, Chicago, Il) chì hà mantenutu una temperatura costante di 12 ° C per tuttu u prucessu di dissezione. U RNA Totale da u tessutu microdissettu hè statu isolatu da u reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) è purificatu cù u Mini Kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) secondu e istruzioni di u fabbricante. U RNA tutale hè statu trattatu per rimuovere qualsiasi potenziale contaminazione di DNA genomicu aduprendu DNase senza RNase (Promega, Madison, WI), è hè statu quantificatu cù un spettrofotometru NanoVue (GE Healthcare, Cambridge, UK). A qualità RNA hè stata cunfirmata da l'elettroforesi standard in gel d'agarose. U DNA Complementariu (cDNA) hè statu poi retrotrascrittu (RT) da 1-2 μg di RNA totale da un mischju di esameri aleatorii è oligo DT priming aduprendu u Kit di Sintesi iScript cDNA (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). E reazioni non retrotrascritte (senza RT) sò state ancu preparate da ogni campione per cuntrullà a potenziale contaminazione di DNA genomicu. U cDNA è i cuntrolli senza RT sò stati diluiti, è 5-10 ng di mudellu cDNA da ogni campione hè stata aduprata per misurà l'espressione mRNA di geni selezziunati da PCR quantitativa in tempu reale aduprendu u Sistema di Rilevazione PCR in Tempo Reale MyIQ (Bio-Rad, Hercules , CA). E misurazioni duplicate per ogni campione sò state eseguite nantu à i piatti standard di 96 pozzi iCycler, inseme senza cuntrolli di mudellu (NTC) per rilevà a potenziale contaminazione croce, in volumi di reazione di 20 μl consistenti in 10 μl 2 × iQ Sybr Green Supermix (Bio- Rad, Hercules, CA), 2 μl di 0.2-0.5 μM ciascun primer, 3 μl di acqua DEPC e 5 μl di template. Tutte e reazioni qPCR includenu una analisi di curva di fusione per assicurà a specificità di u signale. L'espressione relativa per ogni genu d'interessu hè stata calculata per estrapolazione à una curva standard eseguita individualmente nantu à ogni piastra è derivata da diluzioni seriali di un campione cumunu di cDNA di riferimento, è normalizata à l'espressione relativa di geni di riferimento (fosfoproteina ribosomica acida 36B4 per l'espressione genica in tessutu ipotalamicu, è proteina ribosomale mitocondriale L32 per espressione in u nucleu accumbens). E prime sequenze seguenti (IDT, San Diego, CA) sò state aduprate per amplificà u prepro-orexin di rat, NPY è AGRP: Prepro-orexin, Forward: 5′-TTCCTTCTACAAAGGTTCCCT-3 ′, 5′-GCAACAGTTCGTAGAGACGGCAG-3 ′; NPY: Avanti, 5- TACTCCGCTCTGCGACACTACATC-3 '; Inversu: 5'-CACATGGAAGGGTCTTCAAGCC-3 '; AGRP, Attaccante: 5'-GCAGAAGGCAGAAGCTTTGGC-3 '; Inversu: 5'-CCCAAGCAGGACTCGTGCAG-3 '.

cFos Immunocitochimica (ICC) è Quantità

L'ICC di Fluorescenza hè stata aduprata per identificà i corpi di cellule neuronali Fos-pusitivi è AGRP-positivi in ​​l'ipotalamo mediale, secondu a nostra metodulugia stabilita (Figlewicz et al., 2011). L'ultimu ghjornu (PR Day 10), i topi sò stati piazzati in e so camere di autoamministrazione cum'è di solitu, per 90 min. Immediatamente dopu à l'ultima sessione di 90 minuti, i topi sò stati profondamente anestetizzati cù inalazione di isofluranu è perfusati cù 0.9% NaCl seguitu cù una soluzione fredda di 4% paraformaldeide. U timing per anesteticu è eutanasia hè statu basatu annantu à u cursu di tempu cunnisciutu di spressione massima di a proteina cFos à l'eventu 90-120 min-post. Cusì l'espressione cFos riflette l'attivazione di u CNS à l'iniziu di u compitu cumportamentale, piuttostu chè esse u risultatu di l'animali chì sperimentanu u compitu. I cerbelli sò stati rimossi è post-fissati in paraformaldeide parechji ghjorni, dopu messi in 20% saccarosiu-PBS, dopu 30% di saccarosiu-soluzione PBS. I cervelli sò stati sezionati nantu à un criostatu (Leica CM 3050S criostatu) per immunoistochimica. Avemu adupratu a nostra metodulugia stabilita per quantificà a proteina cFos immunoreattiva in sezioni cerebrali (Figlewicz et al., 2011). Sezioni coronali di pieno cerebro 12 μm muntate in Slide sò state lavate trè volte in saline tamponate di fosfat (PBS, OXOID, Hampshire, Inghilterra). E sezioni sò state lavate per 20 min cù 100% etanol / DI acqua (50%, v / v) seguite da un lavatu PBS, dopu bluccatu per 1 ora à a temperatura ambienti in PBS chì cuntene 5% capra normale o serum di burro. E sezzioni sò dopu lavate parechje volte in PBS è incubate durante a notte in 4 ° C in soluzioni d'anticorpi primariu custituite in PBS. Sezzioni eranu lavate trè volte in PBS è poi incubate in u bughjone à a temperatura ambienti in una suluzione d'anticorpi secundariu custituita in PBS per ora 1. E sezioni eranu dopu lavate di novu in PBS, è muntatu è coperto in u mediu di muntatura Vectashield duru (Vector; Burlingame, CA). L'imaghjini digitale di sezzioni sò stati acquistati utilizendu un microscopiu fluorescente Nikon Eclipse E-800 cunnessu à una camera di cattura digitale Qimaging Retiga utilizendu u software NIS Elements (Nikon).

Basatu nantu à studi PCR chì dimostranu un aumentu di i livelli di mRNA AGRP, ci avemu focu annantu à e regioni ipotalamiche mediali, in particulare u nucleu ventromediale è u nucleu arcuatu (ARC). I sezzioni 12 μm cumminati da Atlas sò stati valutati per l'espressione di cFos è quantitazioni in sezzioni è regioni accoppiati, secondu l'atlas di Paxinos è Watson [2005]. Per quantitazione (à a ingrandimentu 40 ×), e regioni atlasate sò state scelte. U software NIS Elements (Nikon) hè stata adupratu per catturà una maghjina di a zona desiderata. Un area hè stata delimitata per u numeru è u limitu per u numeru di cellule pusitivu hè statu stabilitu. L'area è u fondu identici (umbral) sò stati utilizati per e sezioni da i gruppi esperimentali rispettivi, è u numeru di u software di cellule pusitivi (quantitazione) hè stata realizata in a stessa sessione per tutti i gruppi sperimentali, per prevene i cambiamenti tra sessione in a definizione di fondo. Per l'analisi statìstiche, i cunti sò stati pigliati da una rata individuale solu s'ellu e sezzioni currispondenti o complete per ogni area eranu dispunibuli; i dati per una zona specifica ùn sò micca stati pigliati da un ratu se ci era una rappresentanza bilaterale incompleta per quella zona.

In più di a quantificazione cFos, hè stata cundotta immunoistochimica quantitativa doppia etichetta per cFos è AGRP. Perchè ùn vulemu micca disturbà e prestazioni comportamentali di l'animali, ùn sò micca stati pre-trattati cù colchicina per ottimizà a visualizazione di AGRP. Dunque a visualizazione di i neuroni pusitivi AGRP puderia esse sottovalutata. A prucedura di doppia tinta per AGRP era paragunabile à l'analisi di cFos-immunoreattività da solu, eccettu chì e sezzioni sò state bluccate per un'ora à temperatura ambiente in PBS-5% sieru d'asinu. Dopu, un mischju di anticorpi primari fos-Ab è AGRP hè statu adupratu per l'incubazione durante a notte à 4 ° C; listessa manera i dui anticorpi sicundarii eranu in a stessa suluzione è incubati per una ora in u bughju à a temperatura di l'ambienti. E analisi iniziali di ottimisazione sò state effettuate per determinà una diluzione adatta di l'anticorpi primari. Anticorpi primari aduprati eranu cunigli anti-cFos (1: 500) (sc-52) è capra anti-AGRP (1: 100) (18634) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). L'anticorpi sicundarii aduprati eranu Cy3-conjugated donkey anti-rabbit (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA), è Alexa fluor 488 donkey anti-capre IgG (Molecular Probes, Eugene, OR); tutti l'anticorpi secondarii sò stati diluiti à 1: 500.

Analisi statistici

I dati di u gruppu sò presentati cum'è media ± errore standard di a media (SEM) in u testu, Tabelle è Figure. A significazione hè definita cum'è p ≤ 0.05. E paragune statistiche sò fatte trà gruppi sperimentali, cum'è presentati in "Risultati" aduprendu u test di Studiente senza paru (per esempiu, dieta, età, o paragone di trattamentu). A "Normalizazione" di i dati hè definita cume hè aduprata.

Effettu di una dieta moderata alta in grassu nantu à a motivazione peri-pubertale per a saccarosa

I rati alimentavanu a dieta di grassu 31.8% durante i settimane 5-8, mentre chì in e sessioni di auto-amministrazione, anu avutu una motivazione significativamente elevata per a saccarosa, cumparatu cù i ratti alimentati da chow. Cumu mostra in Figura 1a, ùn ci era nisuna differenza di prestazione durante a furmazione iniziale di FR (media di pressi di leva attiva FRDays 1-10, 38 ± 5 vs 39 ± 2 per chow vs 31.8% dieta grassa, rispettivamente). Tuttavia, quandu i rati anu cambiatu à u compitu PR più rigurosu, ci hè statu un aumentu significativu di u numeru di palme attive, è u numeru di recompensi di saccarosa pigliati, ma micca in a lunghezza generale di a sessione (Figura 1b). Ùn ci era micca effettue di u trattamentu di a dieta crònica nantu à u numeru di presse inattivi in ​​leva. Quandu i rati eranu alimentati da a dieta alta in grassu durante i wks 5-8, ma dopu vultati à una dieta chow purtata da a furmazione FR è PR durante settimane 9-12, ci era una tendenza, ma ùn ci hè micca una differenza significativa in levette attive. Cusì, pare chì ùn ci hè alcun effettu di riportu comportamentale di una dieta moderatamente alta in grassu cunsumata durante u periodu peri-pubertale. I dati di u paràmetru PR per queste cohorte sò riassuntu in Table 2. Per cumincià à dilucidà un mecanismu (s) cuntribuisci à l'aumentu induvutu da a dieta in a motivazione di saccarosimu, avemu realizatu una quantità di misurazioni metaboliche è CNS.

  

figura 1

A risposta motivata da PR per ricompensa di sucrosi hè aumentata in i rati periferiali alimentati cù una dieta di grassu 31.8% (n = 8). 1a. Nantu à e sessioni di FR, ùn ci era micca effettue di a dieta, ma l'effettu di a dieta hè manifestu quandu i rati sò cambiati in u paradigma di PR. 1b. Dati sò ...

  

Table 2

Effettu di a Dieta Peri-Pubertale High Fat on Ratios Progressivi Rendimentu per Sucrosi

Effettu di una dieta moderata alta in grassu nantu à i parametri metabolichi

Immediatamente dopu a cunclusione di teste di cumpurtamentu, a cumpusizioni di grassu di u corpu era stata determinata nantu à i rati chì anu avutu l'intervenzione di dieta è u paradigma di cumportamentu durante i wks 5-8. I rati anu dunque ricevutu cannule intravenose croniche per teste di tolleranza di glucosiu (cunziente) di IV (IVGTTs). In seguitu, u plasma è u serum di fasting terminal sò stati ottenuti per misure metaboliche supplementari. Cumu mostra in Table 3, ùn ci era una diffarenza in a cumpusizioni di u corpu, u pesu di u corpu, l'insulina fasting o misure di glucosiu, a sensibilità à l'insulina (càlculu HOMA) o risposte à l'IVGTT, trà i rati alimentati da chow è i rati alimentati in dieta alta grassu. A misura di leptina à u fastidiu è a trigliceridi ùn sò micca diffirenzii trà i dui gruppi. Cusì, ancu chì u trattamentu dieteticu hà avutu un effettu significativu in a motivazione di a saccarosia, riflette una risposta cumportamentale in i rati alimentati cun grassu chì sò pre-obesi.

Effettu di una dieta moderata alta in grassu nantu à a neurostimulazione homeostatica è recompensa CNS

In più di e misure metaboliche terminali, i cervelli di la coorte chì avianu sia interventu dieteticu sia furmazione cumportamentale durante settimane 5-8 sò stati misurati per i profili d'amine di nucleus accumbens (n ​​= 4 per gruppo di dieta) o i livelli di ARNm di peptidi orexigenici ipotalamici. Cumu mostra in Table 4, ùn ci hè statu un effettu significativu di a dieta alta in grassu nantu à i metaboliti di dopamina, noradrenalina o serotonina in u nucleu accumbens, un situ centrale di ricumpensa è attività motivazionale (Ikemoto & Panksepp, 1996; Kelley & Berridge, 2002) in u quale ognunu di sti sistemi di neurotrasmettitori hà un rolu regolatoriu chjave. Dentru estratti ipotalamichi, sò stati misurati i livelli di mRNA di i peptidi orexigenici, NPY, AGRP è orexin. Una tendenza forte ma micca significativa per a crescita di AGRP in i ratti alimentati cù grassu hè stata osservata in questa coorte (n = 8 per una dieta); avemu dunque ripetutu u paradigma di dieta / addestramentu comportamentale in una coorte addizionale è misuratu NPY, AGRP, è orexin mRNA in l'ipotalamu. In e coorte combinate, avemu osservatu un aumentu significativu (p <0.05) in AGRP mRNA in ratti alimentati cù a dieta alta in grassu versus cuntrolli di chow (figura 2), ma nisun cambiamentu significativu in NPY o espressione orexina. Per evaluà possibili cunnessione trà l'espressione AGRP è u cumportamentu di l'auto-amministrazione, avemu misuratu cFos è neurone immunopositive AGRP in l'ipotalamo mediobasal. Gruppi di ratti eranu alimentati da a dieta chow o 31.8% grassu; alcuni sò stati purtati da u protokollu di auto-amministrazione (settimane 5-8) è altri sò stati tratti da cuntrolli cumportamentali. Figura 3a mostra un esempiu di co-localizazione di cFos è AGRP in un neurone di nucleu arcuatu. Cumu summatu in Table 5, l'attivazione di i neuroni AGRP (co-espressione di cFos-ICC è AGRP-ICC in e stesse cellule) hè stata assuciata cù l'attività di auto-amministrazione. Questu hè dimustratu in Figura 3b, induve u numeru di neurone attivate (cFos-pusitivi) hè mostratu cum'è u numeru di cellule neuronale, o cum'è percentuale di u totalu di neuroni AGRP-pusitivi: ci hè una attivazione significativa di neurone AGRP in i rati chì succedenu sucrosi, vs. , in i gruppi di dieta cumminata. Un paragone di trattamentu intra-dieteticu per u numeru di neuroni AGRP attivati ​​in u gruppu di auto-amministrazione vs i cuntrolli di manipulazione mostrava una tendenza chì ùn hà righjuntu significatività statistica (chow, p = .078; 31.8% dieta grassa, p = .073) . Hè impurtante, micca solu chì sti dati liganu l'attivazione neuronale AGRP cù u cumpurtamentu di l'auto-amministrazione, ma à causa di a cronometrazione per a misurazione di cFos (90 minuti dopu chì i rati sò stati posti in le camere di auto-amministrazione), l'espressione cFos riflette l'attività di neurone AGRP in anticipazione di, o à l'iniziu di l'attività di auto-amministrazione. Ci hè stata una tendenza non-significativa per l'aumentu di neuroni AGRP-pusitivi totali in u gruppu di l'auto-amministrazione (vs. cuntrolle di manipulazione, p = 0.16). In quelli ratti, induve a leva di pressione hè stata assuciata trà i gruppi di dieta, u numeru di neurone positivi AGRP hè ancu accumpagnatu. Ùn ci hè stata l'effettu di u trattamentu in a dieta solu nantu à un numeru di neuroni AGRP-pusitivi in ​​i rati di cuntrollu cumportamentu.

  

figura 2

Effettu di 31.8% di dieta grassa nantu à l'espressione mediale di peptide ipotalamicu mRNA. I dati sò nurmalizati per topi alimentati cù grassu (n = 17) vs quellu di i cuntrolli di chow (n = 16). AGRP mRNA hè significativamente elevatu (p <0.05).

  

figura 3

Attivazione di i neuroni AGRP à l'aparizione di succorsu auto-amministrazione. 3a. Co-localizazione di cFos è AGRP in neurone arcuate, ingrandimentu 60x. 3b. Numero di neuroni immunopositivi AGRP (cFos-immunopositive) attivati ​​in l'ipotalamo mediobasale ...

  

Table 4

Nucleus Accumbens Metaboliti Amine

  

Table 5

Attivazione Neuronica Agrp: Dieta è Trattamentu di Comportamentu

Effettu di l'amministrazione di AGRP nantu à a motivazione di saccarosiu

A nostra interpretazione di questa scuperta hè chì l'espressione AGRP in i rati pubertali hè un mecanismu chjave sott'à l'amministrazione di sucrosi rinfurzata di i rati alimentati à alta dieta in grassu. Per cunfirmà l'efficacità di AGRP per aumentà a motivazione per a saccarosia, AGRP hè stata amministrata via u terzu ventriculu à i rati peri-pubertali alimentati da chow durante a porzione PR del paradigma di cumpurtamentu. Questa schema di dosi di AGRP era sub-soglia per a stimulazione di l'assunzione di chow à traversu e duie settimane di paradigma di PR, ma hà risultatu significativamente in una auto-amministrazione di sucrosi, cum'è mostra in figura 4. (Nota chì ogni ricumpenza di zuccaru hà un cuntenutu caluricu di 0.1 kcal, dunque l'attività di self-amministrazione di u zuccaru cuntribuisce calori negligibili à l'ingestimentu totale quotidianu.) Table 6 mostra dati di paràmetri di auto-amministrazione in u paradigma PR di u ghjornu 9, cù AGVP o aCSF ICV injected in i ghjorni 2, 5, è 8. In i rati trattati da AGRP, u numeru di pressi per palanca attiva hè stata significativamente aumentata in PR Days 2-10 (p = 0.03), è in i ghjorni chì ùn sò micca iniezione (p = 0.048) cù una tendenza à un aumentu di u (media) ghjorni iniezione. Inoltre, Stop Time (chì riflette u tempu tutale impiegatu in u compitu di auto-amministrazione) hè stata aumentata significativamente in ghjorni senza iniezione (p = 0.02) cù tendenzi versu un aumento generale, è in i ghjorni di iniezione. U numeru di ricumpensa per a zuccaru hè stata aumentata in generale in PR Days 2-10 (p = 0.03). Ùn ci era micca effettu di u trattamentu AGRP nantu à una pressione di leva inattiva, cumparatu cù i cuntrolli trattati cù aCSF, o trà ghjorni iniezione è non-iniezione. I risultati sustenenu un'interpretazione di l'effettu sustinutu di l'AGRP per aumentà l'auto-amministrazione di saccarosio: i rati pressonu più nantu à a leva ricumpensa, ricevenu più ricumpensa di zuccaru, è passonu più tempu ingaghjatu cù u compitu.

  

figura 4

Terzu ventriculare (ICV) AGRP (0.01 nmol) stimula a auto-amministrazione di sacarosa in u paradigma di PR, ma ùn hà alcun effettu nantu à l'ingestimentu alimentariu ogni ghjornu in u periodu di studiu (PR Days 2 — 10, con iniezioni in Days 2, 5, è 8) . I dati AGRP (n = 9) sò spressi ...

  

Table 6

Effettu di l'ICV AGRP vs aCSF nantu à u Rendimentu Progressivu Rendimentu per Sucrosi

Effettu di a tappa di a vita nantu à a preferenza è a motivazione per a sucrosi

In l'esperimentu finali, avemu evaluatu se a motivazione per a saccarosa hè differente trà u topu pubertali è u pazzu adultu. In inizialu, i vechji ratti 5-è 10-wk sò stati datu una prova di preferenza di saccarosa cù scelte di soluzioni chì varianu da 0 à 20% sucrosi, prima di principià a prova d'autonumia è a furmazione. Cumu mostra in Figura 5a, è in cunforme cù i risultati riportati in a letteratura, i rati pre-pubertali parevanu preferiscenu una soluzione più dolce di i giovani rati adulti: a maiò parte di i rati pre-pubertali anu avutu un ingrossu di 20% suluzione di saccosa, mentre chì i rati adulti mostravanu un ingrossu di 15% sucrosu. In seguitu, i dui gruppi d'età eranu divisi trà a dieta di rata di rata è a dieta alta in grassu durante a furmazione è a prova di l'auto-amministrazione. Ci hè statu un aumentu chjucu ma statisticamente significativu in u numeru di pressi per levette attivi da i rati peri-pubertali vs. adulti (45 ± 3 vs 37 ± 2, p = 0.05) mediati in tutte e sessioni FR, senza alcuna differenza in u numeru di recompensi per a saccarosa o numme di pressi nantu à a leva inattiva. Cumu mostra in Figura 5b, Ci hè statu un effettu generale altamente significativu di l'età, in tutte e sessione di PR, cù a leva attiva aumentata significativamente per a pressione pubertale (n = 15) vs ratti adulti (n = 14) (ANNOVA 2-modu, PRDay × età; effettu di l'età, p = 0.017, nisun effettu indipendente di PRDay, nisuna interazzione significativa). Ci era una tendenza per un effettu più grande di l'età in a cundizione alimentaria alta in grassu, ma questu ùn hà micca ottenutu un significatu statisticu (p = .13). Table 7 elenca i parametri comportamentali di PR: in più di una pressione attiva aumentata, i rati peri-pubertali anu ricivutu significativamente più ricchezze di saccarosa, è mostranu una tendenza versu l'incrementu di Stop Time. Inoltre, i rati peri-pubertali anu un picculu ma significativu aumentu di u pressu nantu à a paleta inattiva (vale à dì, micca gratificante), anche se per i rati peri-pubertali è per i adulti, u numeru di presse inattivi in ​​leva era di circa 10% di u numeru. di leva di leva attiva Questi risultati suggerenu chì i rati peri-pubertali preferenu è cercanu più in modu apidu di cibi dolci, è l'effettu pò esse amplificatu cù un sfondate di dieta alta in grassu.

  

figura 5

I surci ghjovani anu aumentatu a motivazione per a ricumpenza di zuccaru cumparatu cù i rati adulti. 5a. Testi di preferenza per u zuccheru per i rati juvenili (peri-pubertali, n = 15) è ghjovani adulti (n = 14). I ratti anu avutu 30 min da beie da a gamma di concentrazioni (0-20% saccosa). ...

  

Table 7

Effettu di l'età nantu à u Razimentu Progressivu^a per a Sucosa

Questa ricerca hè stata sustinuta da NIH grant DK40963. Dianne Figlewicz Lattemann hè un Senior Scientist Career Research, Biomedical Laboratory Research Program, Dipartimentu di Veterani Affari Puget Sound System Care System, Seattle, Washington. Stephen Benoit hè statu sustinutu da NIH DK066223 è Ethicon Endosurgery Inc. L'autori ringrazianu u duttore Tami Wolden-Hanson per u sustegnu cù misurazioni di cumpusizioni di u corpu; Dr William Banks è Lucy Dillman per u sustegnu cù e misure di trigliceridi; è Amalie Alver, è Samantha Thomas-Nadler per assistenza per i studii di cumportamentu.

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