Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2011 Apr; 300 (4): R876 – R884.
Publicatu in ligna 2011 Feb 9. doi: 10.1152 / ajpregu.00655.2010
PMCID: PMC3075076
1,2 astrattu
Avemu già dichjaratu chì l'amministrazione di l'insulina in u nucleu arcuatu di l'ipotalamo diminuite a motivazione per a saccarosa, valutata da un compitu di auto-amministrazione, in i rati. Perchè u mudellu di l'attivazione di u sistema nervoso centrale (CNS) in associazione cù l'auto-amministrazione di saccarosu ùn hè micca stata valutata, in u presente studiu, avemu misuratu l'espressione di c-Fos cum'è un indice di attivazione neuronale. Avemu furmatu rats à bar-press per a saccarosa, secondu un calendariu fissi (FR) o di rapportu prugressivu (PR) è l'espressione mappata di l'immunoreattività c-Fos in u CNS, paragunatu cù l'espressione c-Fos in i cuntrolli manipulati. Avemu osservatu una espressione unica di c-Fos in l'ipotalamo mediale (i nuclei arcuati, paraventriculari, retrochiasmati, dorsomediali, ventromediali) in associazione cù l'iniziu di PR performance, è l'espressione di c-Fos in l'ipotalamo laterale è in u nucleu di stria terminalis in associu cù l'iniziu di u rendiment FR. L'espressione c-Fos hè stata aumentata in u nucleu accumbens di u topu FR è PR. U nostru studiu mette in risaltu l'impurtanza di i circuiti d'omeostasi à l'ipotalamic d'energia è di i circuiti limbichi in a realizazione di un compitu di ricumpensa alimentaria. Datu u rolu di l'ipotalamo mediale in a regulazione di l'equilibriu energeticu, u nostru studiu suggerisce chì questu circuitu pò cuntribuisce à a regulazione di u premiu in u cuntestu più grande di l'omeostasi energetica.
i circuiti dopaminergici mesolimbici (DA), cumprese l'area tegmentale ventrale (VTA) è e proiezioni in i siti di striatu è corticale, hè statu identificatu cum'è ghjucatu un rolu criticu in l'aspetti motivatori o gratificanti di numerose classi di droghe di abusu (13, 22-24, 26, 48). Ricerche recenti da u nostru laboratoriu è d'altri suggerenu chì questu circuitu ghjucà dinù un rolu maiò in l'aspetti motivatori o recompensa di l'alimentariu. L'interazione funzionale è anatomica cù i circuiti chì regulanu l'omeostasi energetica hè suggerita da i raporti di a modulazione di a recompensa alimentaria per u statutu nutritivu di l'animali (10, 14, 16, 43). A modulazione di a recompensa, cumprese a ricumpenza alimentaria, per u statutu nutrizionale o metabolicu, hè fortemente influenzata da i segni neuronali è endocrini, cumprese l'insulina (15), leptina (11, 18, 21, 30, 32), ghrelin (35), hormone concentrante di melanina (MCH) (45), è orexin (5, 7): a presenza di receptori, l'efficacità biochimica è celulare, è l'efficacità in vivo o cumportamentale di questi signali in u sistema nervoso centrale (CNS) sò stati dimustrati in bundanza in l'ultimi anni.
I circuiti limbichi estensi sò dimustrati dinò per ghjucà un rolu in alimentazione è a ricumpensa per l'alimentu (2, 19, 28). Eppuru, ci sò siti CNS cuntributivi supplementari. In particulare, l'ipotalamo laterale (LH) hè statu longu cunnisciutu per esse un situ chì media in comportamentu d'alimentazione è di autostimulazione (4, 31). Neurone orexinergiche è signalazione di leptina in u LH sò stati identificati cum'è impurtanti per l'alimentazione è a ricumpensa alimentaria (5, 29, 30). Recentemente avemu osservatu chì l'insulina amministrata sia in u terzu ventriculu cerebrale sia in u nucleu arcuatu di l'ipotalamo (ARC) puderia diminuisce l'auto-amministrazione di saccarosu, ma l'amministrazione di l'insulina in u VTA o nucleus accumbens ùn hà avutu alcun effettu nant'à stu paradigma di ricumpensa specifica (15). Cusì, pare chì parechji siti ipotalamici puderanu ghjucà un rolu significativu in a ricerca è l'acquisizione di un alimentu motivatu, è coerenti cun questu, si puderia ipotesi chì e regioni hipotalamiche sò attivamente sostanzialmente assuciati in associazione cù l'auto-amministrazione alimentaria. Per cumincià à pruvà sta ipotesi, avemu mappatu l'espressione c-Fos in u CNS di rati furmati in un paradigma di auto-amministrazione di sucrosi, dopu una furmazione à rati fissi (FR), o dopu una furmazione di raporti progressivi (PR), un compitu più strettu. per a valutazione di a motivazione (20).
MATERIELI E METODI
Subjects.
I sughjetti eranu topi maschili Albino (325-425 g) di Simonsen (Gilroy, CA). I topi sò stati mantenuti in chow ad libitum. Sò stati mantenuti in un ciclu 12: 12-h luce-scuru cù luci accese à 6 AM è sò stati addestrati è testati trà 7 AM è meziornu, in a situazione postprandiale è postabsorptiva. Tutte e procedure effettuate nantu à i topi seguitanu e linee guida di l'Instituti Naziunali di Salute per a cura di l'animali è sò state appruvate da u Sottocumitatu di Cura è Utilizazione di l'Animali di u Cumitatu di Ricerca è Sviluppu in u Sistema di Salute VA Puget Sound.
Sucucosa auto-amministrazione.
E prucedure eranu basati annantu à a nostra metodulugia publicata (15) è eranu purtati nantu à e razze alimentate. L'esperimentu includia trè fasi: autoshaping per inizià a furmazione, furmazione FR, è furmazione progressiva di raporti (PR) utilizendu l'algoritmu PR di Richardson è Roberts (38). L'algoritmu PR richiede 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, 251, 331, 437, 575, 759, 999 etc) a leva pressa per a riescita à furnisce i premii in una sessione (38). I razzi sò stati furmati per auto-amministrà 5% saccarosu (ricumpenza di 0.5 ml) spediti in un cuncipientu di goccia di liquidu. I quadri operanti, cuntrullati da un sistema Med Associates (Georgia, VT), avianu duie leviere, ma solu una leva (una palanca attiva è retractabile) hà attivatu a pompa per infusione. Presses nant'à l'altra palanca (una palestra inattiva, stazionaria) sò stati dinù arregistrati. Cumu avemu osservatu prima, u numaru di pressi nantu à a leva inattiva era assai ridutta (menu di 10 presses / sessione). A suluzione di zuccaru hè stata rimessa in un cuncipientu di goccia di liquidu per u cunsumu orale (Med Associates, St. Albans, VT). A furmazione iniziale hè stata realizata durante e sessioni di 1-h in un schema di rinforzamentu cuntinuu (FR1: ogni pressa di leva era rinforzata). Ogni sessione hà iniziatu cù l'inserimentu di a leva attiva è l'illuminazione di una luce di casa bianca chì hè stata per tutta a sessione. Un tonu 5-s (2900 Hz, 20 dB sopra u fondu) è luce (7.5 W luce bianca sopra a leva attiva) discreta cue di compostu accumpagnatu ogni consegna di ricumpensa, cun un 20-s inizio chì principia cù a consegna di sucrosa. A furmazione FR hè stata realizata per i ghjorni 10; a risulazione stabile hè ottenuta da a quinta sessione. A furmazione PR hè stata realizata per un massimu pussibule 3 h / ghjornu per i ghjorni 10. I sessioni di PR si finìanu dopu 30 min di nessuna riserva di leva attiva, à questu puntu a luce di a casa hè spenta automaticamente è a leva attiva hè stata ritirata; i suriti sò stati purtati fora di e camere è vultatu in e casce di casa. "Ora di piantà" riportatu in Table 2 riprisenta u mumentu chì u sistema hè statu disattivatu; per quessa, l'ultima pressa di palanca attiva si seria accaduta 30 min prima di l'ora di stop. Dati cumportamentali (Table 2) rapprisentanu medie di sessioni 6-10 per a furmazione FR, è sessioni 1-9 per a furmazione PR. I rati manighjati sò stati purtati da a stanza di l'alloghju è pusati in una camera operante pulita cù luce luminosa di a casa per 60 min, in a stanza di prucedura, per simule l'esperienza di manipulazione è di a stanza di i rati chì succeghjanu. Ùn sò stati datu nunda per manghjà nè beie mentre eranu in i quadri operanti è ùn anu avutu accessu à a panca.
L'ultimu ghjornu, i topi sò stati piazzati in e camere secondu i ghjorni di furmazione è sò stati tenuti in e camere per 90 min, dopu chì sò stati rimossi, per anestesia, perfusione, è successiva immunoistochimica. I topi di cuntrollu sò stati ancu purtati in a sala di prucedura è tenuti in una camera operante pulita, secondu i ghjorni di furmazione, per 90 min, dopu à quali sò stati anestetizzati è perfusi. Immediatamente dopu à l'ultima sessione di 90 min, i topi sò stati profondamente anestetizzati cù inalazione di isofluranu è perfusati cù 0.9% NaCl seguitu cù una soluzione fredda di 4% paraformaldeide. U tempu per l'anesteticu è l'eutanasia hè statu basatu annantu à u cursu di u tempu cunnisciutu di spressione massima di a proteina c-Fos à 90-120 min dopu l'avvenimentu. Cusì, l'espressione c-Fos riflette l'attivazione di u CNS à l'iniziu di u compitu cumportamentale, piuttostu chè esse u risultatu di l'animali chì sperimentanu u compitu è ingeriscenu u saccarosu. I cervelli sò stati rimossi è postfissati in paraformaldeide per parechji ghjorni; dopu, sò stati successivamente piazzati in 20% saccarosu-PBS, dopu à quelli sò stati piazzati in 30% di saccarosu-soluzione PBS. I cervelli sò stati sezionati nantu à un criostatu (criostatu Leica CM 3050S) per immunoistochimica.
c-Fos immunohistochimica è quantitazione.
Avemu aduprà a nostra metodulugia stabilita per quantificà a proteina immunoreattiva c-Fos in sezzioni cerebrale (12). A schermu qualitivu iniziale di u pienu cervellu hè statu purtatu per l'espressione c-Fos. E sezioni coronali di pieno cervellu di 12-μm muntate in Slide sò state lavate 3 volte in PBS (Oxoid, Hampshire, UK). E sezioni sò stati poi bluccati per 1 h à temperatura di l'ambienti in PBS chì cuntene 5% serum di capra normale o di sceccu. E sezzioni sò dopu lavate parechje volte in PBS è incubate durante a notte in 4 ° C in soluzioni d'anticorpi primariu custituite in PBS. Sezzioni eranu lavate trè volte in PBS è poi incubate in u bughjone à a temperatura ambienti in una suluzione d'anticorpi secundariu cumpostu in PBS per 1 h. E sezzioni eranu dopu lavate di novu in PBS è muntatu è coperto sbulicatu in u mediu di muntatura di Vectashield à hard set (Vector Laboratories, Burlingame, CA). L'imaghjini digitale di sezzioni sò stati acquistati utilizendu un microscopiu fluorescente Nikon Eclipse E-800 cunnessu à una camera Optiphot è utilizendu u software Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).
In seguitu, avemu focu annantu à un numeru limitatu di zoni chì mostranu una apparente differenza trà e cundizioni, per a quantificazione, è per u fenotipatu neuronale. Specificamente, avemu focu annantu à u nucleu accumbens core è shell (NAc); anteriore è posteriore nucleu di stria terminalis (aBNST, pBNST); regioni ipotalamiche mediali [nucleo ventromediale (VMH), ipotalamo dorsomediale (DMH), nucleo paraventriculare (PVN), area retrochiasmatica (RCh), è ARC]; hypothalamus laterale (LH), cumprese e regioni dorsali è ventrali è l'area periferica (peF); VTA; cervellu troncu [nucleu d'oliva inferiore, hipoglossale (nXII) di u trattu solitario, nucleu reticular laterale, è nuclei adrenalina / noradrenalina C1 / A1]. Sezioni 12-μm cumpresi per Atlas sò state valutate per espressione c-Fos è quantitazione in sezioni e regioni accoppiati, basatu annantu à l'atlas di Paxinos è Watson (34). Vede per contu Table 1 per coordenate stereotossiche specifiche. L'accentu primariu di l'analisi era di paragunà ogni compitu di cumpurtamentu cù u so cuntrollu rispettivu (PR vs. PRC; FR vs FRC). Per ottimisimu e differenzi pussibuli basati nantu à e cundizioni vs u cuntrollu, i picculi performanti di i gruppi PR è FR sò stati scelti per l'analisi. Cusì, i rati 4 / 12 PR è 3 / 12 FR sò stati analizati: Questi ratti avianu un numeru di pressa di leva attivu (u puntu di cumportamentu primariu) chì era più grande di una deviazione standard sopra a media per u so rispettivu gruppu di cumpurtamentu. Hè statu ancu analizatu un sottocupolu di i rati di cuntrollu (rati 5 PRC è 3 FRC, presenti in a stanza di prucedura, à tempu cù i rati FR o PR). Un gruppu supplementu di trè rati hè stata purtata per via di a procedura FR ("FRext") per imità a durazione addiziunata di a prucedura PR (vale à dì, per un totale di ghjorni 20, postu chì i rati PR sò attraversati FR è poi PR) per valutà se e differenzi trà FR è PR sò dovuti à u compitu cumpurtamentu o à a durata di a prucedura. U cervellu di FRext ùn hè statu analizatu è prisentatu in modu sistematicu, ma regioni specifiche d'interessu sò stati evaluati cù l'altri quattru gruppi, per permette una quantificazione comparativa, cumu indicatu specificamente in risultati.
Per quantitazione (à a ingrandimentu 40 ×), e regioni atlasate sò state scelte. U software ImagePro Plus (Media Cybernetics) hè stata adupratu per catturà una maghjina di l'area desiderata. Un spaziu hè stata delimitata per cuntà, è hè statu stabilitu un sogliu per conti cellulari pusitivi. L'area è u fondu identici (umbral) sò stati utilizati per e sezioni da i gruppi esperimentali rispettivi, è u numeru di u software di cellule pusitivi (quantitazione) hè stata realizata in a stessa sessione per tutti i gruppi sperimentali, per prevene i cambiamenti tra sessione in a definizione di fondo. Per l'analisi statìstiche, i cunti sò stati pigliati da una rata individuale solu s'ellu e sezzioni currispondenti o cumplete attraversu ogni zona (cum'è definitu in Table 1) sò stati dispunibuli; i dati per una zona specifica ùn sò micca stati presa da un ratu se ci era una rappresentanza bilaterale incompleta per quella zona.
Analisi qualitativa di doppia marcata d'immunofluorescenza.
E sezzioni di u cervellu sò state prelevate da i topi in cui c-Fos hè statu quantificatu, per immunoistochimica doppia etichetta. Perchè ùn vuliamu micca disturbà e prestazioni comportamentali di l'animali, ùn sò micca stati pretrattati cù colchicina per uttimizà a visualizazione di i neurotrasmettitori peptidici. Dunque, a visualizazione di i fenotipi neuronali attivati in associazione cù u compitu di auto-amministrazione era limitata. Tuttavia, per cumincià a valutazione di i fenotipi di neuroni attivati in una serie di lochi CNS, e immagini digitali (acquistate cum'è descritte in a sezione sopra) sò state prese à 20 ×, 40 ×, o 60 × (cum'è indicatu in figure leggende) ingrandimentu . A procedura di doppia macchia per glutammato decarboxilasi (GAD), tirosina idrossilasi (TH), CRF, neuropeptide Y (NPY), Agouti-related peptide (AgRP), e tryptophan hydroxylase era paragunabile à l'analisi di c-Fos-immunoreattività propiu, eccettu chì una mischia di c-Fos-Ab è unu di l'altri anticorpi primari hè stata aduprata per l'incubazione durante a notte à 4 ° C; listessa manera, i dui anticorpi sicundarii eranu in a listessa suluzione è incubati per 1 ora in u bughju à a temperatura di l'ambienti. Un lavu di 20-min à 50% di etanolu prima di u passu di bloccu hè statu adupratu per u test di orexin. E analisi iniziali di ottimisazione sò state effettuate per determinà una diluzione adatta di l'anticorpi primari. Anticorpi primari aduprati eranu cunigli anti-c-Fos (1: 500) (sc-52) è mouse anti-c-Fos (1: 800) (tramindui da Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); anti-GAD di u topu (1: 1,000), anti-tirosina idrossilasi di u topu (1: 500), è pecore anti-triptofanu idrossilasi (tutti da Chemicon, Temecula, CA); anti-CRF di cunigliulu (1: 500) (rigalu da u duttore Wylie Vale, Salk Institute, CA); anti-NPY di cunigliulu (1: 1,000), anti-AGRP di cunigliulu (1: 1,000), è capra anti-orexina A (1: 5,000) tutti da Phoenix Pharmaceutical (St. Joseph, MO). L'anticorpi sicundarii aduprati eranu Cy3-capra cunghjugata anti-cunigliulu o anti-topu (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA), Alexa Fluor 488 capra anti-topu o anti-cunigliulu o sumere anti-pecuri IgG (Molecular Probes, Eugene, OR) ; tutti l'anticorpi secondarii sò stati diluiti à 1: 500. c-Fos / MCH doppia immunostaintazione hè stata analizzata in serie; prima, per MCH (1: 2,500 anticorpu primariu, Millipore) cun Alexa-488-capra anti-cunigliulu (1: 500) anticorpu secundariu. E diapositive sò state sbloccate cù 5% di serum di capra nurmale è macchiate per anti-c-Fos (1: 500) è cy3-capra anti-cunigliulu cum'è anticorpu secondariu. Un lavu di 20-min à 50% di etanolu prima di u passu di bloccu hè statu adupratu per u test MCH.
Analisi statistica.
I dati di u gruppu sò prisentati cume mezi ± SE in u testu, tavule è figuri. L'impurtanza hè definita cum'è P ≤ 0.05. E paragune statistiche sò fatte trà gruppi sperimentali (FR vs. PR) o trà gruppi sperimentali è cuntrolli currispundenti (PR vs. PRC; FR vs. FRC) aduprendu Studenti unpaired t-test. I coefficienti di correlazione Pearson trà presse di leva attive è espressione c-Fos in diverse regioni cerebrali, è dinò a correlazione di l'espressione c-Fos trà varie regioni cerebrali in condizioni identiche sperimentali, sò state calcolate cù u StatPlus: mac LE prugramma di analisi statistica per a versione Mac OS 2009 da AnalystSoft. Avemu pruvatu per correlazioni lineari (Pearson's R statìstica) trà espressione c-Fos in diverse regioni CNS. Avemu dinò interrugatu correlazioni trà l'espressione c-Fos in diverse regioni CNS è cumportamentu attivatu. I dati FR è PR di i rati, per i quali a quantificazione c-Fos hè stata realizata, eranu usati per questi correlazioni.
RESULTU
c-Fos quantitazione.
Cumu avemu osservatu prima, u numaru di pressioni per a leva attiva era significativamente più grande per a prestazione PR vs. FR (Table 2), è u numaru di recompensi di zuccaru era più grande durante a performance FR. A durata di a sessione per i rati PR era di circa 90 min (tempu di stop - 30). Table 3 elencu i cunti di cellule immunoreattivi c-Fos in tutte e regioni CNS induve a quantificazione hè stata realizata. U mudellu di l'espressione c-Fos per i rati FR è PR hè riassuntu in Fig. 1. Ci hè statu un attivazione significativa di l'ipotalamo mediale (MH)gine, un cumpostu di ARC, PVN, RCh, DMH, è VMH) di rati impegnati in palanca PR pressionando per a saccarosa, ma nisuna attivazione generale in i ratti impegnati in palestra FR chì preme per a saccarosa, cumparatu cù i rispettivi cuntrolli. Dentru l'ipotalamo mediale di i rati PR, sta attivazione hè accaduta in PVN, ARC, è VMH (Fig. 2). Pressione di leva FR, ma micca pressione di palanca PR, era assuciata cù l'attivazione significativa in LH (basata principalmente nantu à l'attivazione in l'area periferica). I dui pressi di leva attivi è l'espressione hipotalamica c-Fos eranu paragunabili trà i gruppi FRext è FR (MHgine, 946 ± 26 è 911 ± 118; ARC, 176 ± 18 è 186 ± 10; LHgine, 468 ± 79 è 378 ± 34; LHpeF, 200 ± 31 è 173 ± 15, rispettivamente), chì suggerenu chì a diffarenza di u modellu di espressione trà i gruppi FR è PR hè in relazione micca cù a durata di a furmazione / sperienza, ma cù a natura di a funzione strumentale. Per u gruppu FR, ci hè statu un significativu aumentu di l'espressione c-Fos in u BNST, osservatu sia in aBNST sia in pBNST. Eppuru FR è PR lever pressing sò stati assuciati cun un aumento di c-Fos-neurunopositivi neurone in a cunchiglia NAc; I conti di c-Fos eranu aumentati significativamente in u core NAc da i rati impegnati in pressione di palanca FR, cù una tendenza insinificante versu una crescita spressione di c-Fos in rati impegnati in pressione di palanca PR. c-Fos ùn hè statu aumentatu in a VTA cù a missione PR, ancu se una tendenza non significativa versu un incrementu hè stata osservata cù a tarea FR. Finalmente, c-Fos era aumentatu significativamente in u nucleu di l'ipoglossal (nervi craniali XII) in u cervellu di i ratti furmati per a PR, ma micca per FR.
L'espressione di c-Fos hè stata osservata in altre regione CNS, cume a cortezza amigdala è cerebrale (Fig. 3). Tuttavia, l'espressione hè stata osservata sia in cundizioni di cuntrollu, sia in associu cù e funzioni PR è FR, chì suggerenu chì l'aspetti non specifici di a prucedura (manipulazione, muvimentu in a stanza di prucedura) puderia avè risultatu in questa attivazione. A quantificazione in queste rigioni ùn hè stata realizata. Inoltre, l'attivazione in e regioni staminali di u cervellu à l'usu nXII hè stata osservata, ma hè stata fatta in associazione cù u cuntrolu è e cundizioni legate à l'attività, suggerendu ancu un rolu in a suscità inesperta o in attivazione di comportamentu.
Avemu pruvatu per correlazioni trà l'espressione c-Fos in diverse regioni CNS. Combinendu dati da gruppi di pressu à leva, truvamu una correlazione negativa trà l'espressione c-Fos in u LH è in u VMH; cusì, l'attivazione di u VMH hè stata associata à una diminuzione di l'attivazione generale di u LH (Pearson's R, −0.7986; t = −3.7534; P = 0.0056). Inoltre, avemu osservatu una significativa correlazione positiva trà l'espressione c-Fos in a regione perifornica di u LH è u VTA (Pearson's R, 0.7772; t = 3.493; P = 0.0082), in cunfurmità cù a connettività monosinaptica cunnisciuta trà queste duie regioni (vede a discussione in Ref. 2 e 13). Avemu trovu una significativa correlazione negativa trà l'espressione c-Fos in u VTA vs. a NAc-shell, sia testata separatamente per e prestazioni FR (Pearson's R, −0.9262; t = −4.9125; P = 0.008) o per prestazioni PR (Pearson's R, −0.9897; t = −9.7624; P = 0.0103), in cuerenza cù inputs reciproci cunnisciuti trà e regioni striatali à a substantia nigra è a VTA (2, 13). Avemu ancu pruvatu per e correlazioni trà l'espressione c-Fos in diverse regioni CNS, è u comportamentu. Combinendu i dati da i gruppi di pressione di leva, avemu osservatu una significativa correlazione positiva trà c-Fos in l'ARC, è presse di leva attive (Pearson's R, 0.8208; t = 3.8017; P = 0.0067).
Identificazione di e neurone attivate cun u ingrossu di zuccaru è a motivazione per a sucrosi.
In u troncu cerebrale, i neuroni c-Fos-pusitivi ùn anu mostratu immunostaining pusitivu per TH, l'enzima limitante di rata per l'epinefrina è a noradrenalina (è dopamina); per quessa, sti neuroni catecolaminergici ùn pare micca esse attivati da e tarei FR o PR. Tuttavia, certi neuroni c-Fos-pusitivi mostranu immunostaining pusitivu per triptofanu idrossilase, chì indicanu chì una populazione di neurone serotonin hè stata attivata. Cumu mostra in Fig. 4, in l'ARC, i corpi cellulari c-Fos-pusitivi eranu circundati da fibri macchiati di AGRP, è hè stata osservata un mudellu simili per l'immunostinazione di fibre NPY / c-Fos (micca mostratu). In u PVN, i neuroni c-Fos-pusitivi apparsu à circundà e neurone CRF-pusitivi, ma ùn hè stata osservata alcuna colocalizzazione (datu micca mostrati). Fig. 5 mostra immunostaining sia per l'orexine sia per l'MCH in u LH. Neurone di Orexin sò stati trovati in i dLH è in peLH. Eppuru chì avemu osservatu i neuroni MCH positivi in a peLH, ùn ci era esencialmente micca colocalizazione cù c-Fos in quella regione di u LH. Tuttavia, avemu osservatu colocalizazione c-Fos in neurone pusitive in oreine in u peLH (Fig. 6, cima), è assai limitata c-Fos colocalization cù MCH in u vLH (Fig. 6, fondu). Ci vole à rimpiazzà chì a localizazione, è a colocalizazione cù c-Fos, ponu esse sottovalutati per i neurotransmissori peptidi cum'è CRH, perchè i rati ùn eranu micca trattati cun colchicina. Infine, dentru u nucleu accumbens core è shell (Fig. 7), c-Fos coimmunostaining cù GAD, l'enzima sintetica per u neurotransmissore GABA, hè stata osservata, per i topi FR è PR. Ci hè stata una tintura robusta per TH in u VTA; in ogni modu, i neuroni c-Fos-pusitivi eranu raramenti osservati è ùn pare micca colocalizà solu cù TH.
DISCUSSION
In u studiu attuale, avemu usatu l'espressione di u generu immediata immediata, c-Fos, per valutà u mudellu di l'attivazione di CNS acuta associata à l'iniziu di l'attività di pressione di leva di auto-amministrazione di saccarosa, sia cum'è una funzione relativamente impegnativa (FR) sia in un progressivamente, un compitu più impegnativu pensatu à riflette una ricerca motivata di una ricumpensa, cume a sacrosi, è di participà fermamente i circuiti limbichi (22, 24, 49) (PR). I patroni d'attivazione ipotalamici differianu trà e duie funzioni, cù l'attivazione LH / limbica predominante in u compitu FR è l'attivazione medica ipotalamica / limbica predominante in a PR opera (vede Fig. 1). Ci hè parechji mutivi pussibuli per questu. Prima, sti paradigmi puderanu "cartografìanu" cumu una sperienza qualitativa diversa in u CNS. I rati furmati in u rendimentu FR aspittàvanu una attività faciule, ricumpensa. A anticipazione di un alimentu gratificante duverà influenzallu forti u mudellu c-Fos osservatu in i rati FR. A diffarenza qualitativa apparente in u mudellu di attivazione suggerisce chì una seconda pussibilità - chì l'animali PR semplicemente anu più sperienza cù u compitu - hè menu probabile, è questu era sustinutu da a nostra misurazione di c-Fos in l'ipotalamo di rati chì anu ricevutu sessioni 20 FR , chì hà mostratu attività simili à u gruppu FR, micca u gruppu PR. Tutti dui sti pussibulità puderanu esse pruvati aumentendu sistematicamente a difficultà di a furmazione FR è valutendu i cambiamenti in l'attivazione CNS, in quale casu, unu puderia predisce un cambiamentu qualitativu in u mudellu di attivazione. Tuttavia, mentre chì u numeru di sperienze di furmazione ùn pò micca cuntà per u mudellu di attivazione di u CNS, u numeru mediu di a recompensa di sucrosi in una sessione puderia: a missione PR puderà esse simplice amparatu cum'è una sperienza "menu gratificante", è questu puderà esse cunnessu funzionale cù mancanza di attivazione di LH. Cusì, u mudellu di attivazione di u CNS à u principiu di a sessione puderia riflette un statu interoceptivu, cum'è quellu di u paradigma di u locu cundizionatu: a forza d'attivazione in u circuitu limicu hè assuciatu à l'apprendimentu è à a motivazione. Avemu osservatu a variabilità di l'espressione c-Fos in l'ipotalamo mediale di l'animali FRC. In particulare in PVN, questa variabilità puderia esse maschendu l'attivazione in i rati FR, per quessa una tendenza à l'aumentu di i ratti c-Fos vs FRC hè stata osservata (Table 3). Tuttavia, l'attivazione hipotalamica mediale in generale ùn era micca diffirenti trà l'animali FR è FRC.
Ci hè da nutà, chì ancu se u nostru scopu era di identificà i siti CNS chì cuntribuiscenu à l'iniziu di u cumpurtamentu, a risoluzione tempurale hè un pocu di cunsiderazione. Cumu discututu in seguitu, hè ora apprezzatu chì diverse subcomponenti di cumpurtamentu strumentali o operanti sò mediati da l'attivazione di sferenti populazioni di neuroni (13, 23, 33, 49). Ùn pudemu micca escludisce micca cumplettamente chì l'attivazione dovuta à una pressione di bar assai immediata o a leccazione di recompense puderia cuntribuisce un pocu à i modelli d'attivazione chì avemu osservatu. I nostri risultati furniscenu a basa per un'investigazione ulteriore nantu à i roli di siti specifici di u CNS in aspetti diffirenti o cumpunenti di a carica di auto-amministrazione, è per questi studii, misurazione di altri geni immediati immediati cù timecorni "on" è "off" (36) sarà assai utile
I correlazioni chì avemu truvatu in l'espressione c-Fos trà e diverse regioni cerebrali sustenenu a connettività funziunale cunnisciuta di e rigioni limbicali ipotalamici è primari per questa particulare missa di ricumpensa, cume trà LH è VMH, è trà a regione perifornica di u LH è a VTA (vede discussione in Ref. 2 e 13). Avemu dinò interrugatu correlazioni trà l'espressione c-Fos in diverse regioni attivate, è u cumportamentu. A correlazione trà c-Fos in l'ARC è palanca attiva si adatta à u rolu ben definitu di l'attività di l'ARC in l'apportu alimentariu (1); cù a nostra osservazione previa chì l'iniezione di l'insulina specificamente in l'ARC hà diminuitu l'auto-amministrazione di saccarosu (15); cù raporti previ di u rolu criticu di l'ARC, è i so neuroni endorfininergici, in l'acquisizione è in u rendimentu di l'auto-amministrazione di cocaine (40-42); è cun e proiezioni identificate da l'ARC à u NAc (17). Cusì, l'ARC ghjucassi probabilmente un rolu chjave in u cumpurtamentu motivatu à circà è ottene parechji tipi di stimuli gratificanti, cumpresu, ma senza limitazione, l'alimentariu. Finalmente, avemu osservatu l'attivazione significativa di u PVN è VMH cù l'iniziu di a ricerca di sucrosi PR. Questu hè cuncordante à i roli ben caratterizzati di questi nuclei ipotalamici mediali in a regulazione di l'ingestimentu alimentariu, a cunnessione diretta sinaptica cù l'ARC, è cunnessi identificati cù u circuitu limbicu (1, 27, 37).
Avemu truvatu una correlazione negativa significativa trà l'espressione c-Fos in a VTA vs. a NAc-shell, sia pruvata per a performance FR o PR. Hè stata una certa surprisa chì l'attivazione più forte di VTA ùn hè stata osservata in associazione cù PR-FR o autocamministrazione di sucrosi (rispettu à i cuntrolli rispettivi). Forsi sta ricerca riflette u tempu di a nostra misura, focu annantu à i siti putenziali CNS attivi à l'iniziu di a tarea, per questu animali sò stati ben furmati. Questu seria coherente cù l'osservazioni è a tesi di Schultz (44), chì l'attivazione neuronale dopamina serve cum'è marcatore di stimuli inesperu o ricompense, è questa attivazione diminuisce in associu cù a furmazione. Tuttavia, a liberazione di dopamina striatale durante a presa di sucrosi in animali addestrati hè stata dimustrata cume un avvenimentu assai precisu è puntualmente discreto (39). Cusì, hè pussibule chì e tendenzi chì avemu osservatu seranu fortemente significativi cun un gruppu di studiu più grande (vale à dì, più putenza statìstica). Avemu osservatu l'attivazione di NAc in associazione cù u principiu di piglià FR è PR di sucrosi. Sia l'attivazione è l'inibizione di i neuroni NAc sò stati riportati in associazione cù u rendimentu strumentale di ricumpensa, è u mudellu di attivazione / attività hè dipendente à a furmazione è l'ambiente, è hè assuciatu cù diversi cumpunenti di u cumpurtamentu (p.e., orientazione, approcciu, ingesta) (6, 33, 50). Cumu l'avemu discututu, a misurazione di c-Fos ùn cappiaria micca una tale attività specifica. Carlezon hà prupostu chì "recompensa" hè assuciata principalmente cù una diminuzione di l'attività di i neuroni NAc, vale à dì, neuroni spiny media (3). Questa ùn hè micca cuncordante à e nostre osservazioni - sostanzialmente rinfriscata a NA-c-Fos in paragone cù i cuntrolli di manipulazione è i neuroni c-Fos-positivi colocalizzati cù GAD, coerenti cù l'attivazione di neurone spine medie (GABAergic) - ma ùn avemu specificamente valutatu "inhibizione neuronale NAc ”. L'attivazione è l'inibizione di i NAc si ponu accade durante i travaglii strumentali, cun specificità anatomiche è tempurale. Da a perspettiva di stu studiu, si pò cuncludi chì a NAc hè intarvena in l'iniziu di a presa di sucrosi strumentale, cù u core NAc chì cuntribuisce à l'attivazione motorica è a cunchiglia di NAc cuntribuiscenu à l'aspettu motoru è motivaziunali di u compitu.
Avemu osservatu ancu l'attivazione di e duie regioni principali di BNST (anteriore è posteriore) in rati FR. U BNST hè una parte di circuiti limbichi chì modulanu e risposte neuroendocrine à esperienze di stimulu ripetutu (8, 9), è in un sensu più grande, hè assuciatu cù l'apprendenza di stimuli recurrenti. Eppuru chì u so rolu hè stata elucidata più cumprensamente in relazione à esperienze di stressor ripetute, a nostra ricerca suggerisce un rolu più ampiu per u BNST: U BNST pò modulare e risposte di CNS à stimuli pusitivi, cum'è stimuli negativi o stressanti. Siccomu avemu osservatu sta attivazione à l'iniziu di a FR, ma micca a PR, u rendiment, a recrutazione BNST pò esse ligata à a crescente ricumessa di saccarosu di furmazione FR. A nostra osservazione di nessuna attivazione diretta di i neuroni CRF suggerisce chì e risposte strumentali per a saccrosa ùn sò micca un stressor maiò; in ogni modu, l'espressione c-Fos in altre neurone PVN hè coherente cù a modulazione di u circuitu di stress (46). Infatti, Ulrich-Lai è i so culleghi anu dichjaratu chì, utilizendu un paradigma di dieta / alimentazione sfarente, l'assunzione di saccaru modulate a funzione PVN (47). Finalmente, avemu osservatu l'attivazione di u nucleu di u nervu ipoglossale in associu cù u rendimentu PR ma micca a FR. U significatu di questu solu ci pò esse speculatu; una pussibilità hè chì a rilevanza di u gustu di a saccrosa pò esse elevata in i ratti chì ingeriscenu menu ricumpensa di a sucrosi.
A ricerca di zuccaru è a piglia di saccarosu deve esse cunsiderata cum'è una sperienza di multimodalità, dinamica in u tempu, postu chì l'ingestione resultassi in segnali periferichi ligati à u cuntenutu caloric di a saccarosa, in quantu à l'abitudine è allestesia in sessione (25). Mentre a nostra ricerca hè stata focu annantu à l'influenza di i segnali endocrini periferici, vale à dì, l'insulina è a leptina, per modulare a ricompensa alimentaria, i so effetti ponu, a turnu, esse mediati direttamente di manera centrale da trasmettitori è neuropeptidi chì ghjucanu un rolu in un cortu o longu termine. ricumpensa per l'alimentazione o per l'alimentariu (vede discussione in Ref. 14). U studiu attuale furnisce qualchì scopu di questu; avemu osservatu qualche attivazione di neuroni chì sprimenu sia MCH sia orexina, duie neuropettide chì sò orexigeniche. Questi risultati ponu, in fatti, sottovalutà u rolu di MCH o orexin in a ricumpenza alimentaria, postu chì l'immunocitochimica in i rati non trattati cù colchicina ùn hà micca dubbitu limitata a visualizazione di e duie neuropeptidi. L'identificazione di neurone orechine attivate in u LH hè coherente in generale cù i numerosi studii chì implicanu e neurone orexin in l'alimentazione, a ricumpensa alimentaria, è a ricumpenza di stimulu più generalizzata (per esempiu, 5, 7, 29). Avemu osservatu l'attivazione di neurone orexin peFLH. Aston-Jones è i culleghi (5) anu dissettatu u rolu di sfarente pupulazioni di neurone LH orexin in u cumpurtamentu di ricumpensa è anu implicatu neurone peFLH orexin in excitazione, in cuntrastu di a recompensa per se. A nostra ricerca, dunque, suggerisce un rolu per l'orexina LH in u excitazione, è forse l'orientazione versu a paleta attiva o unghie per a presa di sucrosi.
Vale a pena di a cunsiderazione futura hè a unicità o generalizabilità di a sucrosi cum'è un stimulu gratificante. Sia a definizione u mudellu di attivazione precoce di u CNS chì avemu prisentatu quì hè l'alimentariu cum'è stimulu, o generalizeghja à altri stimuli gratificanti. Cumu si spiega sopra, in particulare in l'attività di FR, l'ingestione di una quantità di ricarche di zuccaru puderia avè cunsequenze metaboliche, cù modulazione di liberazione di l'hormone (per esempiu, colecistokinina, ghrelina, insulina) è cambiamenti in l'attivazione neurale periferica è CNS. Questi cambiamenti ùn sarebbero aspittàvuli di ghjucà un rolu direttu in i mudeli iniziali di attivazione di u CNS chì avemu misuratu, ma pò ghjucà un rolu in l'apprendre di a ricumpenza di zuccaru durante a furmazione. In novu, i neuropeptidi cume l'orexina ponu esse implicati criticamente.
U nostru studiu rapprisenta, à a nostra cunniscenza, a prima dimostrazione di l'attivazione di nuclei ipotalamici mediali specifici à l'iniziu di l'auto-amministrazione di sucrosi, cumpresu i PVN, implicati in l'omeostasi è a responsabilità à l'estressi, è a ARC, chì hè critica per l'omeostasi energetica, sintimentu nutritivu, è regulazione di u ingestimentu alimentariu. Impurtante, avemu osservatu l'attivazione di l'ipotalamo mediale è a NAc, in associazione cù l'inizialità PR, sughjendu chì sia l'omeostaticu sia alcuni siti limbici ghjucanu un rolu in l'iniziazione di auto-amministrazione di saccarosio. I siti di circuiti limicichi supplementari ponu esse ricrutati in un puntu di seguitu in u compitu.
Perspettive è Significanza
Mentre chì, storicamente, i studii di cumpurtamenti motivaziunali è di ricumpensa implicarianu più forte i circuiti limichi CNS, un grande numaru di prove hà accadutu chì enfatizeghja l'interazione critica di u funziunamentu trà i circuiti homeostasi limbici è energetichi. U studiu attuale suggerisce avà l'impurtanza prubabile di nuclei ipotalamici mediali specifici in u travagliu motivatu per a sucrosi. Extrapolando da stu studiu, studi futuri ponu valutà se u rolu di l'ipotalamo mediale hè necessariu è se a so attivazione hè implicata in una ricerca motivata di altre ricumpensa cum'è droghe di abusu. Inoltre, i risultati di stu studiu furnenu a motivazione per studià alterazioni di cumpurtamenti motivati in circustanzi cuncomitanti cù fisiologia medica ipotalamica alterata, cum'è in obesità.
BENESSE
Questa ricerca hè stata sustinuta da Istituti Naziunali di Cunvenzione di Salute DK40963. Dianne Figlewicz Lattemann hè un Científico di Ricerca in Studi Senior, Programma di Ricerca in Laboratoriu Biomedicu, Dipartimentu di Affari Veterani Puget Sound System Care System, Seattle, Washington. U Dr. Sipols hè sustinutu da u Cunsigliu Letone di Scienze Grant 04.1116.
ACKNOWLEDGMENTS
Ringraziemu Drs. Yavin Shaham, Stephen Benoit, Christine Turenius, è JE Blevins per cunsiglii è discussioni utili.
Vede ancu
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