Circulating MicroRNA Expression Levels Associated With Disorder Internet Gaming (2018)

astrattu

fondo

L'usu addictivu di l'Internet è di i ghjoculi in linea hè un disordine psichiatricu potenziale chjamatu disordini di ghjoculi in Internet (IGD). I profili d'espressione di microRNA (miRNA) alterati sò stati rappurtati in u sangue è u tessulu cerebrale di i pazienti cun certi disordini psichiatrici è suggeriti cum'è biomarcatori. Tuttavia, ùn ci sò micca stati rapporti nantu à i profili di miRNA di sangue in IGD.

mètudi

Per scopre i miRNA associati à IGD, avemu analizatu i profili di espressione di miRNA di 51 campioni (25 IGD è 26 cuntrolli) utilizendu u TaqMan Low Density miRNA Array. Per a validazione, avemu realizatu PCR di trascrizione inversa quantitativa cù 36 campioni indipendenti (20 IGD è 16 cuntrolli).

Risposte alla lingua

Attraversu a scuperta è a validazione indipendente, avemu identificatu trè miRNA (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-652-3p) chì sò stati significativamente sottumessi in u gruppu IGD. L'individui cù tutti i trè alterazioni di miRNA avianu un risicu assai più altu di IGD cà quelli chì ùn anu micca alterazione [odds ratio (OR) 22, 95% CI 2.29-211.11], è l'OR aumentanu a dose dipendente cù u numeru di miRNA alterati. I geni di destinazione previsti di i trè miRNA sò stati assuciati cù e vie neurali. Avemu esploratu l'espressione di a proteina di i trè geni di destinazione downstream da western blot è cunfirmatu chì l'espressione di GABRB2 è DPYSL2 era significativamente più altu in u gruppu IGD.

cunchiusioni

Avemu osservatu chì l'espressioni di hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, è hsa-miR-652-3p sò stati regulati in i pazienti IGD. I nostri risultati seranu utili per capisce a fisiopatologia di IGD.

Segni: Disordine di ghjoculi in Internet, microRNA, biomarcatore, dipendenza, western blot

I MUVRINI

L'usu addictivu di l'Internet è di i ghjoculi basati in Internet ùn hè micca solu un fenomenu suciale in i paesi cù una vasta infrastruttura d'accessu à l'Internet, ma un putenziale disordine psichiatricu chjamatu disturbu di i ghjoculi in Internet (IGD).-). Sicondu i rapporti epidemiologichi, i tassi di prevalenza di IGD in l'adulescenti varianu trà i paesi, chì varieghja da 0.8 à 26.7% (). In particulare, i studii mostranu tassi di prevalenza sopra u 10% in l'adulescenti in parechji paesi asiatichi cum'è Corea di u Sud, Cina, Taiwan, Hong Kong è Singapore.). IGD hè assuciatu cù l'impairment in a cugnizione, relazioni psicosociali è a vita di ogni ghjornu; per esempiu, a diminuzione di u rendimentu accademicu o occupazionale (-). L'IGD hè avà inclusu in a Sezione III (Condizioni per Studii Ulteriori) di a quinta rivisione di u Manuale Diagnosticu è Statistiche di Disordini Mentali (DSM-V) (). In ogni casu, malgradu a so impurtanza clinico-sociale, pocu hè cunnisciutu di u mecanismu geneticu moleculare daretu à IGD.

Studi recenti di gemelli à grande scala anu suggeritu un background geneticu à IGD (, ). Vink et al. hà investigatu e differenze individuali in l'usu compulsivu di l'Internet cù 5,247 gemelli adulescenti monozigoti è dizigoti in u Registru di Twin Olandese è hà dettu chì u 48% di e differenze sò state spiegate da fatturi genetichi.). Li et al. hà osservatu 825 coppie di gemelli adulescenti cinesi è hà dettu chì i fatturi genetichi spiegavanu 58-66% di e differenze (). Per quessa, i polimorfismi di i geni implicati in a neurotrasmissione, a cognizione è l'attenzione, cum'è u genu D2 di u receptore di dopamina (DRD2), gene di catecolamina-O-metiltransferasi (COMT), gene di trasportu di serotonina (5HTTLPR), è u gene alfa nicotinicu di u receptore colinergicu (CHRNA4) sò stati signalati chì sò significativamente assuciati cù a dipendenza da Internet (-). Ricertamenti, Kim et al. varianti screened di più di 100 geni candidati ligati à a produzzione, l'azzione è u metabolismu di i neurotrasmettitori da l'analisi di sequenza di a prossima generazione è hà dettu chì rs2229910 di NTRK3 gene hè assuciatu cù IGD ().

In più di i fatturi genetichi, hè ancu cunnisciutu chì i fenotipi neurocomportamentali sò epigeneticu cuntrullati da RNA non codificanti cumpresi i microRNAs (miRNAs)., ). I miRNA sò picculi molecule di RNA monocatena senza codifica (circa 20-23 nucleotidi di lunghezza), chì regulanu negativamente l'espressione di geni codificanti di proteine ​​​​degradendu l'mRNA è ghjucanu un rolu criticu in u prucessu fisiopatologicu di diverse malatie.). Linee di evidenza anu dimustratu chì i miRNA sò abbundanti in u sistema nervu cintrali umanu (CNS) è agisce per sintonizà i livelli di espressione di i so geni di destinazione, chì sò implicati in u sviluppu è a maturazione di u sistema CNS.). Infatti, studii recenti anu revelatu chì i profili d'espressione di miRNA sò alterati in u tessulu cerebrale di i malati cù disordini psichiatrici, suggerenu chì i so profili d'espressione puderianu esse biomarcatori per i disordini psichiatrici., , ). Per esempiu, attraversu l'analisi post mortem, Lopez et al. hà infurmatu chì l'espressione di miR-1202, chì regula l'espressione di u genu metabotropicu di u receptore di glutamate-4 è predice a risposta à l'antidipressanti, hè stata regulata in i tessuti di a corteccia prefrontale di i malati di disordine di depressione maiò (). In quantu à u screening di biomarcatori, questu approcciu hà una limitazione chjara perchè eseguisce una biòpsia di u tissutu CNS per u screening hè impussibile. Siccomu i miRNA ponu esse rilevati in u sangue (plasma o serum), i miRNA circulanti anu un vantaghju definitu cum'è biomarcatori non invasivi in ​​i disordini neuropsichiatrici. In ogni casu, finu à a data, ùn ci sò micca studii nantu à i profili miRNA circulanti in IGD. Una migliore comprensione di i profili di espressione di miRNA circulanti puderia aiutà à chjarificà u mecanismu di u sviluppu IGD è facilità a traduzzione clinica.

In questu studiu, avemu u scopu di identificà i marcatori di miRNA assuciati à l'IGD, osservendu i miRNA di plasma espressi di manera differenziale trà l'IGD è i gruppi di cuntrollu è scopre e so implicazioni biologiche.

Materiale è Metodi

Sughjetti di studiu

Avemu sondatu 3,166 adulescenti (età 12-18 anni) utilizendu u puntuazione DSM-V IGD. Frà elli, 251 (168 masci è 83 femine) sò stati diagnosticati cum'è IGD secondu i criteri DSM-V (). Un totale di 91 individui (49 IGD è 42 cuntrolli) furnì u cunsensu infurmatu per stu studiu. Frà elli, quattru individui sò stati esclusi secondu i criterii d'esclusione. Infine, 87 individui (45 sughjetti IGD è 42 individui di cuntrollu sani) sò stati inscritti per stu studiu. Frà elli, i participanti 51 (25 pazienti IGD è cuntrolli 26) sò stati recrutati cum'è a scuperta stabilita da 2014 à 2016. L'altri participanti 36 (malati 20 IGD è cuntrolli 16) sò stati recrutati cum'è u settore di validazione indipendente da 2016. Tutti i participanti eranu coreani. individui, iscrittu da Seoul St. Mary's Hospital (Seoul, South Korea) è Seoul National University Boramae Hospital (Seoul, South Korea). Tutti i participanti anu sottumessu una entrevista strutturata da un psichiatru basatu annantu à u Schedule Kiddie Coreanu per Disordini Affettivi è Schizofrenia (K-SADS-PL) (). Tutti i participanti anu cumpletu i sottotesti di Disegnu di Blocchi è Vocabulariu di a Scala di Intelligenza Coreana-Wechsler per i zitelli, 4a edizione (K-WISC-IV) (). L'impulsività hè stata valutata da Barratt Impulsiveness Scale (BIS) (). Scale di u Sistema di Inhibizione di Cumportamentu (BInS) è di u Sistema di Attivazione di Cumportamentu (BAS) sò stati misurati per valutà a dimensione di a personalità (). I criteri di esclusione includenu disordini medichi maiò passati o attuali (per esempiu, diabete mellitus), disordine neurologicu (per esempiu, disordini convulsivi, ferite à a testa), disordini psichiatrici (per esempiu, disordine depressivu maiò, disordini d'ansietà), ritardo mentale, o qualsiasi abusu di sustanzia (p.e. , tabacco, cannabis, alcolu). E caratteristiche generale di i sughjetti di studiu sò riassunte in a Tabella Table1.1. Stu studiu hè statu appruvatu da u Cunsigliu di Revisione Istituzionale di l'Università Cattolica Medical College di Corea (MC16SISI0120). Tutti i participanti è i so genitori anu datu un accunsentu infurmatu scrittu.

Table 1

Caratteristiche generale di i sugetti di studiu.

 scupartaValidazioneCumbinatu
 
 cuntrolluIGDP-valuecuntrolluIGDP-valuecuntrolluIGDP-value
N2625 1620 4245 
Età (anni)
Mediana (min-max)13 (12 - 17)13 (12 - 15)0.75915 (13 - 18)14.5 (12 - 18)0.62814 (12 - 18)14 (12 - 18)0.509
Ore settimanale di ghjocu in Internet (h)
Mediana (min-max)5.25 (2 - 17)18 (6 - 46)1.27E−6a5.5 (2 - 23)8 (1 - 112)0.3745.5 (2 - 23)14 (1 - 112)1.63E−5a
Revenu mensile di a famiglia (milioni di KRW)
Mediana (min-max)5 (1 - 9)3 (1 - 9)0.5884 (4 - 4)2 (2 - 2)1.0005 (1 - 9)3 (1 - 9)0.460
Educazione (anni)
Mediana (min-max)8 (7 - 9)8 (7 - 9)0.58412 (12 - 12)6 (6 - 13)0.3058 (7 - 12)8 (6 - 13)0.269
K-WISC: cuncepimentu di blocchi
Mediana (min-max)10.5 (4 - 17)10 (4 - 16)0.54410 (3 - 16)12.5 (4 - 15)0.12510 (3 - 17)11 (4 - 16)0.598
K-WISC: vucabulariu
Mediana (min-max)9 (5 - 17)7 (5 - 13)0.1749.5 (8 - 15)11.5 (5 - 15)0.5959 (5 - 17)9 (5 - 15)0.527
KS
Mediana (min-max)24 (17 - 36)37 (22 - 51)3.81E−6a29 (17 - 34)59 (22 - 108)1.2E−5a25 (17 - 36)40 (22 - 108)2.05E−10a
Bis
Mediana (min-max)63 (35 - 75)67.5 (45 - 81)0.08061 (45 - 79)63 (32 - 82)0.83562 (35 - 79)65 (32 - 82)0.240
BAS
Mediana (min-max)31 (15 - 40)31 (13 - 51)0.55836.5 (22 - 48)34 (27 - 52)1.00032 (15 - 48)34 (13 - 52)0.637
BINS
Mediana (min-max)18 (10 - 26)17.5 (13 - 27)0.64218.5 (12 - 25)20 (13 - 21)0.13818 (10 - 26)19 (13 - 27)0.302
 

IGD, pazienti cù disordine di i ghjoculi in Internet; KS, Scala coreana di dipendenza da Internet; BIS, Scala d'impulsività di Barratt; BAS, Sistema di Attivazione di Cumportamentu; BInS, Sistema di Inhibizione di Cumportamentu; KRW, Won coreanu.

aP < 0.05 (test Mann-Whitney-Wilcoxon).

TaqMan Low Density miRNA Array (TLDA) Esperimenti

U sangue perifericu hè statu recullatu da ogni participante è trasferitu à u laboratoriu in 4 h per minimizzà a lisi di e cellule di sangue. U specimenu hè statu centrifugatu à 3,000 rpm per 10 min à a temperatura di l'ambienti. Allora, u supernatant (capa di plasma) hè stata cullata senza contaminazione di e cellule di sangue. I miRNA circulanti sò stati estratti cù TaqMan miRNA ABC Purification Kit (Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) secondu l'istruzzioni di u fabricatore. In breve, 50 µL di campione di plasma e 100 µL di tampone ABC sono stati mischiati. Dopu l'ibridazione cù perle magnetiche anti-miRNA specifiche per u target, i miRNA circulanti limitati sò stati eluiti da e perle cù 100 µL di buffer d'eluzione. In a fase di scuperta, 381 miRNA sò stati esaminati da 51 campioni di plasma (25 IGD è 26 cuntrolli) utilizendu u TaqMan miRNA ABC Purification Kit (Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) secondu l'istruzzioni di u fabricatore. Trascrizione inversa Megaplex è reazioni di pre-amplificazione sò state eseguite per aumentà a quantità di cDNA per l'analisi di l'espressione di miRNA utilizendu MegaplexPreAmp Primers Human Pool A è TaqManPreAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific). U pannellu TLDA A v2.0 (Thermo Fisher Scientific) hè stata eseguita nantu à u sistema PCR in tempu reale ViiA7 (Thermo Fisher Scientific) per valutà l'espressione di i miRNA. I dati crudi sò stati trattati cù ExpressionSuite Software v1.0.4 (Thermo Fisher Scientific) per determinà i valori Ct per ogni miRNA.

Analisi di dati per TLDA

Prima avemu misuratu i cicli di soglia (valore Ct) di ogni miRNA. I miRNA cù un valore Ct> 35 sò stati cunsiderati cum'è indetectable è esclusi da l'analisi sussegwenti. Tutti i valori Ct sò stati nurmalizzati à u valore Ct di miR-374b (valore ΔCt), unu di i miRNA più stabile chì circulanu in u plasma umanu.). Un rapportu di cambiamentu di log2 (valore ΔΔCt) di l'espressione hè statu calculatu utilizendu i valori medii di i campioni di cuntrollu cum'è calibratore in u pacchettu HTqPCR in Bioconductor (). A quantificazione relativa (RQ) di ogni mira di miRNA hè stata definita cum'è 2−ΔΔCt. Per a prova ipotetica di a diffarenza di l'espressione trà dui gruppi, avemu applicatu l'analisi variabile surrogata (SVA) per catturà eterogeneità cum'è l'effetti di batch in l'esperimenti chì utilizanu sva pacchettu in Bioconductor (). miRNA cù a P-valore <0.05 sò stati cunsiderati cum'è significativamente sfarente trà dui gruppi.

Analisi di arricchimentu di u gene

Per l'analisi di arricchimentu di geni, avemu usatu ToppFun in ToppGene Suite () per inferire Ontology Gene (GO) significativamente arricchita () termini, via è termini di malatia. Cum'è l'input per questu approcciu, avemu usatu 1,230 geni di destinazione previsti di i miRNA candidati. L'analisi di a via hè stata aduprata per truvà percorsi significativi di i geni di destinazione previsti secondu KEGG, BioCarta, Reactome, GeneMAPP è MSigDBin i percorsi ToppGene. U significatu di termini di arricchimentu funziunali hè statu determinatu basatu nantu à u Bonferroni-adjusted P- valore.

Validazione è Replicazione Quantitative Reverse Transcription PCR (qRT-PCR).

Per validà i 10 miRNAs chì sò stati spressi di manera differenziale in u stadiu di scuperta, qRT-PCR hè stata realizata cù u TaqMan MicroRNA Assay (miR-15b-5p, #000390; miR-26b-5p, #000407; miR-29b-3p, #). 000413; miR-125b-5p, #000449; miR-200c-3p, #002300; miR-337-5p, #002156; miR-411-5p, #001610; miR-423-5p, #002340; -483p, #5; è miR-002338-652p, #3) è u sistema ViiA002352 (Life Technologies) secondu u protocolu di u fabricatore. Dieci nanogrammi di RNA totale sò stati cunvertiti in cDNA di prima fila cù primers specifichi di miRNA utilizendu u TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (#7, Life Technologies), seguita da PCR in tempu reale cù TaqMan Probes. U RQ di ogni miRNA hè statu definitu cum'è 4366596−ΔCt, induve ΔCt hè a diffarenza di i ciculi di soglia per u sample in questione, normalizatu contru à u miRNA endogenu (miR-374b-5p, #001319). Tutte e reazzioni di PCR sò state realizate in triplicate, è i so valori Ct sò stati mediati. Avemu calculatu un log2 fold-change ratio (ΔΔCt) di ogni miRNA in u listessu modu cum'è in l'analisi basatu in array. Una prova non-parametrica di Mann-Whitney-Wilcoxon hè stata realizata per pruvà e differenze in i livelli di espressione di miRNA in dui gruppi cù un sogliu. P-valore di 0.05.

Analisi Western Blot

Ogni campione di siero hè stata prima sguassata di e prime 14 proteine ​​ad alta abbondanza (albumina, immunoglobulina G, immunoglobulina A, serotransferrina, aptoglobina, alfa-1 antitripsina, fibrinogeno, alfa-2 macroglobulina, alfa-1 glicoproteina acida, immunoglobulina M, AI. , apolipoprotein A-II, complement C3, è transtiretina) utilizendu a colonna MARS-14 (4.6 × 50 mm, Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA) prima di l'analisi western blot. A frazione libera ottenuta da a colonna MARS-14 hè stata cuncentrata cù un filtru centrifugu Amicon Ultracel-3 (cutoff 3 kDa), è dopu a cuncentrazione di a proteina hè stata determinata cù u metudu di l'acidu bicinchoninic. Les mêmes quantités (de 10 à 30 µg) de contrôle et de sérum IGD ont été séparées sur un gel préfabriqué Mini-PROTEAN TGX à 4-20 % (Bio-Rad, CA, USA) et transférées à une membrane de difluorure de polyvinylidene. Dopu, a membrana hè stata bluccata in TBS-T (190 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5 è 0.05% Tween 20) cù 5% di latte seccu senza grassu à a temperatura di l'ambienti per 30 min. I membrani sò stati incubati cù anticorpi primari contr'à DPYSL2 (1: 500, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), GABRB2 (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) è CNR1 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology). , Inc., Santa Cruz, CA, USA), DUSP4 (1:500, MybioSource, San Diego, CA, USA), è PI15 (1:500, MybioSource, San Diego, CA, USA) in TBS-T cù 5 % di latte seccu senza grassu à 4 ° C durante a notte, è dopu cù anticorpi secundari appropritati sia bovini anti-mouse (1: 1,000, Santa Cruz Biotechnology) sia caprenu anti-cunigliu (1: 1,000, Cell Signaling, Beverly, MA, USA). ) cunjugatu à perossidasi di rafanu à a temperatura di l'ambienti per 1 h. A rilevazione di u signale hè stata realizata cù a chimiluminescenza cù reagenti ECL (GE healthcare, Piscataway, NJ, USA). Avemu quantificatu i risultati western blot utilizendu u software di analisi TotalLab 1D (Dinamica Non-linear, Newcastle upon Tyne, UK). Dopu, u valore di u rapportu di densitometria hè statu calculatu dividendu u valore di densitometria di ogni mostra cum'è descrittu in altrò (). Cum'è un cuntrollu per a normalizazione, una mostra di serum cumminata da 46 IGD è campioni di cuntrollu hè stata utilizata per ogni esperimentu. A significazione statistica hè stata determinata utilizendu una prova non-parametrica di Mann-Whitney-Wilcoxon cù un sogliu. P-valore di 0.05.

Risposte alla lingua

Caratteristiche di i Sugetti di Studiu

E caratteristiche demografiche è cliniche di i sughjetti di studiu sò mostrati in a Tabella Table1.1. Quandu avemu paragunatu l'IGD è i gruppi di cuntrollu secondu a Scala Coreana di Pronezza di Addiction à Internet (K-Scale) cum'è descrittu in altrò (, ), u gruppu IGD hà dimustratu un valore K-Scale median significativamente più altu ch'è u gruppu di cuntrollu (37 vs 24, P = 3.81 × 10-6) (Tableau (Table1) .1). U tempu mediu settimanale passatu nantu à i ghjoculi in Internet in u gruppu IGD era significativamente più longu di quellu di i cuntrolli (18 vs. 5.25 h, P = 1.27 × 10-6). Mentre ùn ci era micca una differenza significativa trà dui gruppi in età, redditu mensuale di a famiglia, durata di l'educazione, cuncepimentu di blocchi è risultati di sottotesti di vocabulariu di u K-WISC, BIS, BInS è BAS.

MiRNAs espressi di manera differenziale trà IGD è cuntrolli

Per scopre i miRNA assuciati à IGD, avemu aduttatu un approcciu in dui passi (scuperta è validazione indipendente). U disignu di studiu è a strategia generale sò illustrati in Figura S1 in Material Supplementary. In u stadiu di scuperta, avemu analizatu i profili di espressione di miRNA di 51 campioni (25 IGD è 26 cuntrolli) utilizendu a matrice di miRNA chì cuntene 384 miRNA. I livelli d'espressione di 10 miRNA sò stati trovati significativamente sfarenti trà l'IGD è i gruppi di cuntrollu (Tabella (Table2) .2). I livelli di espressione relative di questi 10 miRNA sò mostrati in Figura Figure1.1. Frà elli, dui (hsa-miR-423-5p è hsa-miR-483-5p) sò stati upregulati è ottu (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-411-5p, è hsa-miR-652-3p) sò stati regulati in u gruppu IGD.

Table 2

MicroRNAs espressi di manera differenziale (miRNAs) è cambiamenti di fold.

miRNAscupartaValidazioneCumbinatu
 
 P-valuePiegate u cambiamentuP-valuePiegate u cambiamentuP-valuePiegate u cambiamentu
hsa-miR-15b-5p0.0330.8290.6941.1190.3810.947
hsa-miR-26b-5pa0.0080.8710.0490.8410.0130.857
hsa-miR-29b-3p0.0050.4000.5601.1870.0890.647
hsa-miR-125b-5p0.0210.5820.2900.9500.0690.723
hsa-miR-200c-3pa0.0110.3360.0030.5422.93 × 10-50.415
hsa-miR-337c-5p0.0090.3850.5820.8720.0200.553
hsa-miR-411-5p0.0040.3220.3361.2820.1580.595
hsa-miR-423-5p0.0261.3870.1890.9550.5181.175
hsa-miR-483-5p0.0181.8610.7651.4130.2111.647
hsa-miR-652-3pa0.0190.7150.0490.8770.0110.782
 

aI miRNAs anu alteratu significativamente in i gruppi di scuperta è di validazione in modu coerente.

 

Un file esterno chì tene una foto, un'illustrazione, ecc. Nome di l'oggetto hè fpsyt-09-00081-g001.jpg

Livelli di espressione relative di 10 miRNA espressi in modu differenziale. A quantificazione relativa (RQ) hè stata normalizzata à miR-374b-5p.

Validazione qRT-PCR di i miRNA candidati

Per cunvalidà i 10 miRNA candidati, avemu realizatu qRT-PCR cun un set di validazione indipendente (20 IGD è 16 cuntrolli) (Table S1 in Supplementary Material). Trè di sti miRNA (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, è hsa-miR-652-3p) sò stati significativamente regulati in u gruppu IGD di u settore di validazione (Tabella (Table2) .2). Trè altri miRNA (hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-125b è hsa-miR-423-5p) sò stati ancu regulati in u gruppu IGD ma micca significativamente. Quattru miRNA restanti (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-411-5p, è hsa-miR-423-5p) sò stati espressi in modu oppostu in u set di validazione. Quandu avemu cumminatu i setti di scuperta è validazione (un totale di 45 sughjetti IGD è 42 cuntrolli), i trè miRNA validati eranu sempre significativi (Tabella (Table2) .2). L'infurmazioni dettagliate, i lochi cromosomiali, e sequenze mature è i livelli di espressione in u CNS di questi trè miRNA sò dispunibili in a Tabella S2 in Materiale Supplementariu.

Effettu sinergicu di l'alterazione simultanea di i trè miRNA nantu à u risicu IGD

Per valutà l'effettu cumminatu di i trè miRNA, avemu osservatu i rapporti di probabilità (OR) di i quattru sottogruppi (cù 0, 1, 2, o 3 alterazioni di miRNA). L'alterazione di miRNA hè stata definita da u valore RQ cum'è descrittu in a Sezione "Materiale è Metodi." Perchè tutti i trè marcatori di miRNA sò stati regulati in u gruppu IGD, un miRNA chì u valore RQ era sottu à unu hè statu sfidatu cum'è alteratu. L'infurmazione dettagliata di u valore RQ di ogni sughjettu di studiu per i trè miRNA hè dispunibule in a Tabella S3 in Materiale Supplementariu. Per ogni sottugruppu, i probabili sò stati calculati cum'è u rapportu di u numeru di cuntrolli à quellu di IGD, dopu ogni OR hè statu calculatu dividendu e probabilità di ogni sottugruppu per probabilità di u sottogruppu senza alcuna alterazione di miRNA. L'individui cù trè alterazioni di miRNA mostranu un risicu 22 volte più altu di quelli senza alterazione di miRNA (OR 22, 95% CI 2.29-211.11). L'OR anu mostratu una tendenza crescente cù u numeru di miRNA alterati da 0 à 3 (r2 = 0.996) (Figura (Figure22).

Un file esterno chì tene una foto, un'illustrazione, ecc. Nome di l'oggetto hè fpsyt-09-00081-g002.jpg
Rapporti di probabilità (OR) per u numeru di marcatori di microRNA (miRNA) downregulated. I valori sopra l'estimi puntuali sò l'OR (intervallu di cunfidenza 95%).

Analisi GO è Pathway di i Genes Target di i miRNA candidati

Per acquistà una visione di e funzioni di i trè marcatori di miRNA rigulati significativamente in u gruppu IGD, i so geni di destinazione sò stati previsti utilizendu a basa di dati miRWalk 2.0 (). Un totale di 1,230 geni sò stati previsti in modu coerente cum'è target downstream da quattru algoritmi (miRWalk, miRanda, RNA22 è Targetscan) utilizendu a basa di dati miRWalk (-) (Table S4 in Material Supplementary). L'analisi di l'arricchimentu di l'inseme di geni utilizendu ToppFun in ToppGene Suite hà dimustratu chì i geni di destinazione di quelli miRNAs eranu significativamente assuciati à percorsi di sviluppu neurale cum'è "Guida Axon" è termini GO cum'è "neurogenesi" (Table S5 in Supplementary Material).

Espressione di i Genes Target Predicted

Trà i geni di destinazione downstream di i trè miRNA, 140 sò stati previsti simultaneamente per dui o più miRNA (Table S4 in Supplementary Material). Per scopre se i so livelli di espressioni di proteine ​​​​di i geni di destinazione downstream sò diffirenti trà l'IGD è i gruppi di cuntrollu, avemu sceltu 2 geni (DUSP4 e PI15), chì sò previsti cum'è target downstream di tutti i 3 miRNA è 3 geni addiziunali (GABRB2, DPYSL2, e CNR1) da quelli previsti per 2 miRNAs è realizatu l'analisi western blot cù i campioni di plasma da 28 IGD è 28 cuntrolli dispunibili per l'esperimentu. Avemu paragunatu l'espressioni di i cinque miri trà l'IGD è i gruppi di cuntrollu, misurà l'intensità di a banda è l'area cum'è descritta in altrò (). Frà elli, i livelli di espressione di DPYSL2 (28 IGD è 28 cuntrolli, P = 0.0037) è GABBR2 (27 IGD è 28 cuntrolli, P = 0.0052) eranu significativamente più altu in u gruppu IGD (Figura (Figure3) .3). Tuttavia, ùn pudemu micca osservà espressioni differenziali di CNR1 (P = 0.0853), DUSP4 (P = 0.5443), è PI15 (P = 0.6346).

 

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Imàgini Western blot è box-dot-plots chì mostranu l'espressione di (A) DPYSL2 è (B) GABRB2. E duie proteine ​​​​DPYSL2 è GABRB2 mostranu differenze significative in i so livelli d'espressione trà u disordine di u ghjocu in Internet (IGD) è i campioni di cuntrollu (P-valore <0.05). I dui proteini sò stati spressi à livelli più alti in i campioni IGD.

Articulu discussione

Hè statu infurmatu chì i miRNA sò implicati in u sviluppu neuronale (, ), è l'espressione differenziale di i miRNA cerebrali sò osservati in e malatie psichiatriche cum'è l'esquizofrenia (). Dunque, hè plausibile chì i profili di miRNA circulanti puderanu esse biomarcatori utili per l'IGD. I miRNA circulanti sò stati suggeriti cum'è biomarcatori per diversi disordini neuropsichiatrici (-); in ogni modu, i miccanismi molecolari daretu à u sviluppu IGD sò sempre largamente scunnisciuti malgradu a so impurtanza clinica è suciale. In particulare, ùn ci sò stati studii nantu à i miRNA assuciati à IGD. U scopu di stu studiu era duppiu. Prima, avemu pruvatu à scopre i miRNA di plasma assuciati cù IGD. Siconda, avemu evaluatu l'implicazione biologica di i candidati miRNA esplorendu l'espressione di proteine ​​​​è GO di i geni target downstream. Attraversu u screening di u genoma di i profili di espressione di miRNA è a validazione a valle di i candidati, avemu scupertu chì l'espressione di trè miRNA (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, è hsa-miR-652-3p) significativamente più bassu in i pazienti IGD cà i cuntrolli. Ancu se i mudelli di espressione di altri sette candidati di miRNA ùn sò micca stati replicati in a validazione, pò esse falsu negativu per via di una piccula dimensione di mostra in stu studiu. À a nostra cunniscenza, questu hè u primu rapportu nantu à a pussibilità chì i profili d'espressione di miRNA di sangue puderanu esse biomarcatori utili per IGD. A cumminazione di i trè marcatori di miRNA puderia serve cum'è un strumentu minimamente invasivo per l'identificazione precoce di e persone à risicu di IGD.

I miRNA identificati in stu studiu sò stati signalati per esse implicati in diversi disordini neuropsichiatrici. L'espressione di hsa-miR-200c in u sangue hè stata rapportata per esse regulata in parechji disordini psichiatrici cum'è a schizofrenia () è episodii depressivi maiò (). MiR-200c hè statu rapportatu per esse più altamente spressione in e frazioni sinaptiche cà in u cervellu tutale () è ancu esse assuciatu cù a morte di e cellule neuronali (). Basatu nantu à sti rapporti previ, miR-200c hè implicatu in u neurosviluppu è pò esse assuciatu cù disordini neuropsichiatrici se a so espressione hè perturbata. Diversi studii anu suggeritu l'associazione trà miR-652 è risicu di disordini neuropsichiatrici. Simile à u nostru approcciu, per identificà i biomarcatori di sangue per a schizofrenia, Lai et al. hà realizatu l'analisi TLDA cù i malati di schizofrenia è i cuntrolli normali, è truvò chì sette miRNA, cumpresu hsa-miR-652, sò stati espressi in modu sfarente in i malati di schizofrenia (). In u studiu sussegwente, anu designatu un mudellu di predizione utilizendu i dati di l'espressione di miRNA è hà distinguitu cù successu a schizofrenia da u cuntrollu normale (). L'espressione alterata di hsa-miR-652 hè stata osservata ancu in l'alcoolichi (). Hsa-miR-26b hè stata trovata per esse attivata durante a differenziazione di e cellule neuronali (). Perkins et al. hà dettu chì hsa-miR-26b hè statu rigulatu in a corteccia prefrontale di i malati di schizofrenia ().

Ancu s'ellu ùn ci hè nisuna evidenza diretta per sustene a relazione trà l'espressione perturbata di sti miRNA è a fisiopatologia di IGD, pudemu inferisce chì a disregulazione di questi miRNA pò esse assuciata cù a fisiopatologia di IGD basatu annantu à diversi rapporti precedenti nantu à i geni downstream chì avemu previstu. . Alcuni di i geni downstream di i trè miRNA cum'è GABRB2, CNR1, NRXN1, e DPYSL2 sò signalati chì sò assuciati cù disordini neuropsichiatrici. L'acidu gamma-aminobutiricu (GABA) hè un neurotrasmettitore inhibitore maiò in u SNC. A disregulazione di u receptore GABA, hè implicata in i disordini neuropsichiatrici cumprese l'addiction, l'ansietà è a depressione (), chì sò ancu e caratteristiche principali di IGD (). I polimorfismi genetichi in i geni di u receptore GABA sò riferiti chì sò assuciati cù l'addiction à l'alcohol è a schizofrenia (, ). Dihydropyrimidinase-like 2 (DPYSL2) hè un membru di a famiglia di a proteina mediatore di risposta di collapsina, chì ghjoca un rolu in l'assemblea di i microtubuli, a segnalazione sinaptica è a regulazione di a crescita assonale. In cunseguenza, sta molécula hè stata suggerita cum'è un biomarcatore per i disordini psichiatrici (, ). Polimorfismu in u DPYSL2 gene hè statu ancu infurmatu chì hè assuciatu cù u disordine di l'usu di l'alcohol (). I rapporti precedenti è i nostri dati suggerenu chì l'overespressione di GABRB2 è DPYSL2, obiettivi downstream di i miRNA regulati, hà implicazioni per a patogenesi di i disordini neuropsichiatrici cumpresi IGD. Cannabinoid receptor type 1 (CNR1) hè un heteroreceptor presinapticu chì modula a liberazione di neurotrasmettitori è i disturbi in a signalazione di cannabinoidi sò assuciati cù diversi disordini neuropsichiatrici (). Polimorfismu geneticu di CNR1 U genu hè cunnisciutu per esse assuciatu cù a dependenza di sustanzia in Caucasians (). In un mudellu di ratu, l'attivazione di l'ippocampu ventrale CNR1 disturba u cumpurtamentu suciale è a cognizione normale (). L'alterazione genetica in a famiglia NRXN hè cunnisciuta per esse implicata in diversi disordini neuropsichiatrici cumprese l'addiction ().

Per esaminà l'implicazione biologica di i trè candidati miRNA in una manera più diretta, avemu esploratu l'espressione di proteine ​​​​di i so geni di destinazione downstream. A causa di a dispunibilità limitata di campioni di plasma, di i 140 candidati cumuni (previsti cum'è downstream di 2 o più miRNAs), avemu esaminatu 5 miri (GABRB2, DPYSL2, CNR1, DUSP4 è PI15) per Western blot è cunfirmatu chì l'espressione di GABRB2. è DPYSL2 era significativamente più altu in u gruppu IGD. I rapporti precedenti è i nostri dati suggerenu chì l'overespressione di GABRB2 è DPYSL2, obiettivi downstream di i miRNA regulati, ponu avè implicazioni per a patogenesi di i disordini neuropsichiatrici cumpresi IGD. I risultati di GO è l'analisi di via di e camini di sviluppu neurale sustenenu ancu l'implicazione neurobiologica di i marcatori miRNA. Un altru scupertu interessante era l'effettu sinergicu di l'alterazione simultanea di i miRNAs. L'individui cun downregulation di tutti i 3 miRNA dimustranu un risicu 22 volte più altu ch'è quelli senza downregulation, è l'OR aumentanu in una manera dipendente da a dose. Ancu se l'IC per queste trè alterazioni era largu per via di una dimensione di mostra limitata, a correlazione positiva clara (r2 = 0.996) sustene l'effettu sinergicu di i trè miRNA.

Ancu s'è avemu scupertu i marcatori di miRNA assuciati à l'IGD è l'individui cù e trè alterazioni di miRNA avianu un risicu 22 volte più altu di quelli senza alterazioni di miRNA, ci sò parechje limitazioni in stu studiu. Prima, a piccula dimensione di mostra hà aumentatu a probabilità di mancassi altri marcatori miRNA significativi. Siconda, postu chì i nostri dati ùn eranu micca abbastanza per chjarificà se i profili di miRNA di plasma sò o causa o effettu, ùn pudemu micca cunfirmà i roli biologichi di questi marcatori non invasivi in ​​un ambiente clinicu. Ulteriori profilazioni di miRNA è a so analisi di geni downstream usendu u tissutu cerebrale umanu da u bancu di tissuti cerebrali ponu dà una risposta più diretta. L'analisi di u tissutu cerebrale cù un mudellu d'animali di disordine di u ghjocu seria ancu utile. Terzu, per via di a dispunibilità limitata di campioni di plasma, avemu esaminatu solu cinque molécule candidate downstream. L'esplorazione di più target downstream cù un set di campioni più grande serà utile per capiscenu più u mecanismu moleculare di IGD.

In riassuntu, attraversu u screening di u genoma di i profili di espressione di miRNA è a validazione indipendente, avemu scupertu trè miRNA associati à IGD (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p è hsa-miR-652-3p). Parechje di i so geni downstream sò stati implicati in diversi disordini neuropsichiatrici, è a validazione sperimentale di l'espressione alterata di sti geni downstream sustene l'implicazione di i miRNA identificati in stu studiu. Avemu trovu chì e persone cun downregulation di tutti i trè miRNA sò in altu risicu di IGD. Inseme cù i fatturi di risichi clinichi o ambientali cunnisciuti è i criteri diagnostichi, i nostri scuperti ponu facilità l'intervenzione precoce per aiutà e persone à risicu più altu di IGD.

Ethics Statement

Stu studiu hè statu appruvatu da u Cunsigliu di Revisione Istituzionale di l'Università Cattolica Medical College di Corea (MC16SISI0120). Tutti i participanti è i so genitori anu datu un accunsentu infurmatu scrittu.

Contributions Autor

ML è HC anu cuntribuitu ugualmente à stu documentu. ML, D-JK è Y-JC cuncepìu u studiu. SJ, S-MC, YP, DC è JL anu realizatu esperimenti è generazione di dati. J-WC, S-HP, J-SC è D-JK raccolte campioni di sangue è informazioni cliniche. ML, HC, S-HY, è Y-JC analizà i dati. ML, HC, S-HY, è Y-JC hà descrittu u manuscrittu. Y-JC hà supervisatu u prugettu.

Declarazione di Conflict of Interest

I autori dicianu chì a ricerca hè stata capunanzata in l'assenza di qualsiasi relazioni cummerciale o finanziarii chì puderia esse interpretatu com'è un cunflittu di interessu interessanti.

Footnotes

 

Finanziamento. Stu travagliu hè statu sustinutu da una cuncessione da u Prugramma di Ricerca di u Cervellu attraversu a Fundazione Naziunale di Ricerca di Corea (NRF), finanziata da u Ministeru di a Scienza è l'ICT è a Pianificazione Futura (NRF-2015M3C7A1064778).

 

 

Material Supplementary

U Materiale Supplementare per questu articulu pò esse trovatu online à http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpsyt.2018.00081/full#supplementary-material.

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