ફોસ્ફોરીલેશન દ્વારા ડેલ્ટાફોસબી સ્થિરતાનું નિયમન (2006)

જે ન્યૂરોસી 2006 May 10;26(19):5131-42.

સોર્સ

મનોચિકિત્સા વિભાગ, મૂળભૂત ન્યુરોસાયન્સ માટે સેન્ટર, યુનિવર્સિટી ઓફ ટેક્સાસ સાઉથવેસ્ટર્ન મેડિકલ સેન્ટર, ડલ્લાસ, ટેક્સાસ 75390-9070, યુએસએ.

અમૂર્ત

ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પરિબળ ડેલ્ટાફોસબી (જેને ફોસબીએક્સ્યુએનએક્સ અથવા ફોસબી [ટૂંકા સ્વરૂપ તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે]) મગજમાં લાંબી-અવધિની પ્લાસ્ટિસિટીનો એક મહત્વપૂર્ણ મધ્યસ્થી છે જે વિવિધ પ્રકારનાં મનોવૈજ્ઞાનિક ઉત્તેજનાના લાંબા સમયથી સંપર્કમાં આવે છે, જેમાં દુરુપયોગ, તાણ અને ઇલેક્ટ્રોકોનવુલ્સિવ હુમલાઓના ડ્રગ્સનો સમાવેશ થાય છે. . ડેલ્ટાફોસબીની એક વિશિષ્ટ સુવિધા એ છે કે, એકવાર પ્રેરિત થઈ જાય તે પછી, વધુ ઉત્તેજનાની ગેરહાજરીમાં તે પ્રમાણમાં લાંબા સમયગાળા માટે મગજમાં ચાલુ રહે છે. જો કે, આ દેખીતી સ્થાયીતાના અંતર્ગતની પદ્ધતિઓ અજાણ્યા રહી છે. અહીં, અમે દર્શાવીએ છીએ કે ડેલ્ટાફોસબી સેલ સંસ્કરણમાં આશરે 10 એચના અડધા જીવન સાથે પ્રમાણમાં સ્થિર ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળ છે. વધુમાં, અમે દર્શાવે છે કે ડેલ્ટાફોસબી મગજમાં ફોસ્ફોપ્રોટીન છે અને ડેલ્ટાફોસબીમાં અત્યંત સંરક્ષિત સીરિન અવશેષ (સેરએક્સએનએક્સએક્સ) નું ફોસ્ફોરિલેશન પ્રોટોસોમલ ડિગ્રેડેશનથી રક્ષણ આપે છે. અમે કેટલાક સૂચનો પૂરા પાડે છે જે સૂચવે છે કે આ ફોસ્ફોરિલેશન કેસીન કાઇનેઝ 27 દ્વારા મધ્યસ્થી થાય છે. આ તારણો એ પ્રથમ પુરાવા છે કે ડેલ્ટાફોસબી ફોસ્ફોરીલેટેડ છે અને દર્શાવે છે કે ફોસ્ફોરીલેશન તેની સ્થિરતામાં ફાળો આપે છે, જે મગજમાં લાંબા સમયથી ચાલતા અનુકૂલનને મધ્યસ્થી કરવાની મધ્યસ્થતાના મુખ્ય ભાગમાં છે.

પરિચય

ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પરિબળ ΔFOSB, FOSB2 અથવા FOSB [ટૂંકા સ્વરૂપ] ને પણ નિયુક્ત કરે છે, તે તાત્કાલિક પ્રારંભિક જનીનનું સી ટર્મિનસ-ટ્રંકેટેડ સ્પ્લિસ વેરિઅન્ટ છે. FOSB (ડોબ્રાઝાન્સ્કી એટ અલ., 1991; નાકાબેપુ અને નાથન્સ, 1991; યેન એટ અલ., 1991). પૂર્ણ-લંબાઈ FOSB ની જેમ, ΔFOSB એ ડીએનએ-બાઇન્ડિંગ મૂળભૂત ડોમેન અને લ્યૂકાઇન ઝિપર ધરાવે છે જેના દ્વારા તે પ્રોટિન્સ પ્રોટીન-એક્સ્યુએનએક્સ (એપી-એક્સ્યુએનએક્સએક્સ) ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન ફેક્ટર કૉમ્પ્લેક્સ બનાવવા માટે જુન પ્રોટીન સાથે ઘટાડે છે, જે ઘણા જનીનોની અભિવ્યક્તિને નિયંત્રિત કરે છે (મોર્ગન અને કુરાન, 1995; રિલસ્કી અને કાઝમમેર્ક, 2004). એફઓએસબીના સી ટર્મિનસમાં મળી આવેલા ટ્રાન્સએક્ટિવિવેશન ડોમેનના ભાગનો અભાવ હોવા છતાં, ΔFOSB સંસ્કારી કોષો અને મગજમાં એક બળવાન ટ્રાન્સ્ક્રિપ્શનલ એક્ટિવેટર અને દમનકર્તા તરીકે કાર્ય કરે છે.ડોબ્રાઝાન્સ્કી એટ અલ., 1991; નાકાબેપુ અને નાથન્સ, 1991; ચેન એટ અલ., 1997; મેકક્લુંગ અને નેસ્લેર, 2003; કુમાર એટ અલ., 2005).

ΔFOSB એ ક્રોનિક, પરંતુ તીવ્ર, મનોવૈજ્ઞાનિક ઉત્તેજનાની વિવિધતા, તાણ, ચોક્કસ જીવાણુઓ, એન્ટીસાઇકોટિક અને એન્ટીડિપ્રેસન્ટ દવાઓ, દુરૂપયોગની દવાઓ અને કુદરતી પુરસ્કારો સહિત તીવ્ર ન હોય તેવા મગજમાં એક ક્ષેત્ર-વિશિષ્ટ રીતે ઉચ્ચ સ્તર તરફ દોરી જાય છે. (આશા અને અલ., 1994b; હિરોઇ અને ગ્રેબેઇલ, 1996; મોરાતાલા એટ અલ., 1996; બિંગ એટ અલ., 1997; મંડેલ્ઝીસ એટ અલ., 1997; કેલ્ઝ એટ અલ., 1999; વર્મી એટ અલ., 2002; એન્ડરસન એટ અલ., 2003; કોલબી એટ અલ., 2003; પીકમેન એટ અલ., 2003; પેરોટ્ટી એટ અલ., 2004; ઝાચારીઉ એટ અલ., 2006). ΔFosB ની રજૂઆત મગજના આમાંના કેટલાક ઉત્તેજનાની કાર્યાત્મક અસરો સાથે સીધી રીતે સંબંધિત છે. વધારાની ઉત્તેજનાની ગેરહાજરીમાં પણ ΔFOSB ની સતતતા તેને અન્ય બધા ફૉસ પારિવારીક ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળોથી અલગ પાડે છે, જે તીવ્ર ઉત્તેજનાના પ્રતિભાવમાં ઝડપથી પ્રેરિત થાય છે, થોડા કલાકોમાં બેઝલ સ્તરોમાં ક્ષીણ થઈ જાય છે અને સામાન્ય રીતે ક્રોનિક સ્ટીમ્યુલેશન પછી ડિસેન્સિટાઇઝેશન દર્શાવે છે (આશા અને અલ., 1992; દુઉનીસ એટ અલ., 1993; પર્સિકો એટ અલ., 1993; હિરોઇ અને ગ્રેબેઇલ, 1996; પેરોટ્ટી એટ અલ., 2004). આનાથી Δ FosB એ એક આકર્ષક ઉમેદવાર બનાવે છે જે જીન અભિવ્યક્તિમાં લાંબા સમયથી ચાલતા ફેરફારોમાં મધ્યસ્થી કરે છે જે ચોક્કસ ક્રોનિક ઉત્તેજના દ્વારા સ્થિર સ્થિર ન્યુરોનલ અનુકૂલનને આધારે બનાવે છે.

કારણ કે mFOSB ની લાંબી હાજરી તેના એમઆરએનએ (MRNA) ની વધુ રજૂઆતની ગેરહાજરીમાં થાય છે (ચેન એટ અલ., 1995), અમે અનુમાન કર્યો હતો કે, સંપૂર્ણ લંબાઈ FOSB અને અન્ય તમામ ફૉસ કુટુંબ પ્રોટીનથી વિપરીત, જે આંતરિક રૂપે અસ્થિર હોય છે, ΔFOSB અસામાન્ય સ્થિર ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પરિબળ હોઈ શકે છે (આશા અને અલ., 1994b; ચેન એટ અલ., 1997; નેસ્લેર એટ અલ., 2001; મેકક્લુંગ એટ અલ., 2004). તદુપરાંત, તીવ્ર-વિરુદ્ધ ક્રોનિક-ઉત્તેજિત મગજ પેશીઓના ઇમ્યુનોબ્લોટિંગ વિશ્લેષણ સૂચવે છે કે ΔFOSB દેખીતી રીતે બદલાય છે M_r (આણ્વિક સમૂહ) ~ તીવ્ર સ્થિતિમાં ~ xNUMX કેડીઆથી તીવ્ર સ્થિતિમાં ~ xNUMX-33 કેડીએ સુધી ક્રોનિક સારવાર દરમિયાન (આશા અને અલ., 1994a; ચેન એટ અલ., 1995). કારણ કે વધારાના એમઆરએનએના અસ્તિત્વ માટે કોઈ પુરાવા નથી કારણ કે આ વિવિધ આઇસોફોર્મ્સ માટે એન્કોડ કરી શકે છે, અમે વધુ અનુમાન લગાવ્યા કે ΔFOSB પોસ્ટટ્રાન્સલૅશનલમાં ફેરફાર કરાયો છે અને તે કદાચ તેના અસામાન્ય સ્થિરતામાં ફાળો આપે છે. જોકે, તારીખ સુધી, Δફોસબીના ટર્નઓવર અથવા પોસ્ટટ્રાન્સલેશનલ ફેરફારોના કોઈ બાયોકેમિકલ વિશ્લેષણની જાણ કરવામાં આવી નથી. વર્તમાન અભ્યાસનો ધ્યેય એ નક્કી કરવાનો હતો કે ΔFOSB એક ફોસ્ફોપ્રોટીન છે અને ફોસ્ફોરિલેશન તેની સ્થિરતામાં ભૂમિકા ભજવે છે કે કેમ.

અગાઉના વિભાગ આગામી વિભાગ

સામગ્રી અને પદ્ધતિઓ

સસ્તન કોશિકાઓ અને ડીએનએ રચનાઓ.

પીસીએક્સએનએક્સએક્સ સેલ્સ (ક્લોન્ટેચ, માઉન્ટેનવ્યૂ, સીએ) ઉચ્ચ-ગ્લુકોઝ ડીએમઇએમમાં એલ-ગ્લુટામાઇન (એલ-ગ્લિન) ધરાવતી અને 12% ગર્ભ બોવાઇન સીરમ (એફબીએસ), 5% ઘોડો સીરમ (ઇન્વિટ્રોજન, કાર્લ્સબેડ, સીએ બંને) સાથે પૂરક સાથે સંસ્કારી હતી. , 10 યુ / એમએલ પેનિસિલિન, અને 100 μg / એમએલ streptomycin (સિગ્મા-એલ્ડરિક, સેન્ટ લૂઇસ, એમઓ બંને). હીલા સેલ્સ (અમેરિકન ટાઇપ કલ્ચર કલેક્શન, મનાસાસ, વી.એ.) ઉચ્ચ ગ્લુકોઝ ડીએમઇએમમાં એલ-ગ્લિન ધરાવતી અને 100% એફબીએસ, પેનિસિલિન અને સ્ટ્રેપ્ટોમાસીન સાથે પૂરક છે. બંને કોષ લાઇન્સ 10 ° C પર ભેજવાળી 37% CO માં રાખવામાં આવી હતી₂ વાતાવરણ

ડીએનએ સાથેના ક્ષણિક સંક્રમણ માટે, પીસીએક્સ્યુએનએક્સ અથવા હેલા કોષોને છ-કૂવા પ્લેટ (પીસીએક્સ્યુએનએક્સએક્સ કોષો માટે કોલાજેન 1 સાથે કોટેડ) પર ઉગાડવામાં આવ્યાં હતાં જેથી બીજા દિવસે 12-12% સંગઠન સુધી પહોંચી શકાય અને પછી લિપોફેક્ટેમાઇન 90 (Invitrogen) નો ઉપયોગ કરીને ચેપ લાગ્યો. કેટલાક પ્રયોગોમાં (જુઓ ફીગ્સ 1 ⇓⇓⇓⇓⇓-7), Δફોસબીને પીસીએક્સએનએક્સએક્સ કોશિકાઓમાં પુનઃસંગ્રહ દ્વારા હ્રીપ્સ સિમ્પ્લેક્સ વાયરસ (એચએસવી) સાથે ચેપ દ્વારા વ્યક્ત કરવામાં આવી હતી.

Δ ફોસબી અને ફોસબી સીડીએનએ અમારા પોતાના પીટીપોપ-કંસ્ટ્રક્ટ્સમાંથી મેળવ્યા હતા (ચેન એટ અલ., 1997), અને એક પીસીડીએનએક્સએનએક્સએક્સ વેક્ટર (ઇન્વિટ્રોજન) માં વિભાજિત. આ PCDNA3.1-ΔFOSB / FOSB રચનાનો ઉપયોગ સસ્તન કોશિકાઓમાં અભિવ્યક્તિ માટે અને સાઇટ-નિર્દેશિત મ્યુટેજેનેસિસ માટે નમૂના તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો. અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ રેકોમ્બિનન્ટ એચએસવી-Δ FOSB તૈયાર કરવામાં આવ્યો હતો (નેવ એટ અલ., 1997), અને તૈયારી ~ 1 × 10 ની ટાયટર હતી⁸ પીફુ / એમએલ.

પલ્સ-પીછો પ્રયોગો.

ચેપ / સંક્રમણ પછી આશરે 24 એચ, છ સારી પ્લેટોમાં કોશિકાઓ (પીસીએક્સએનએક્સએક્સ અથવા હેલા) પીબીએસના 12 એમએલ સાથે બેથી ત્રણ વખત ધોવાઇ હતી અને સીઆઇએસ / મેટ-ફ્રી ડીએમઇએમના 2 એમએલમાં ~ 37 એચ માટે 1 ° સે પર વીજળીયુક્ત હતી. (Invitrogen) મેટ અને સીસના ઇન્ટ્રાસેસ્યુલર પૂલ્સને ઘટાડવા માટે 2% ડાયલઝ્ડ એફબીએસ (હાઇક્લોન, લોગાન, યુટી) સાથે પૂરક છે. આ "ભૂખમરો" સમયગાળાના અંતે, દવાઓ (જો કોશિકાઓને સારવાર આપવામાં આવે છે) ઉમેરવામાં આવી હતી, અને કોષોને 5-12 μCi સાથે લેબલ (પલ્સ) કરવામાં આવ્યા હતા ³⁵એસ પ્રોટીન લેબલિંગ મિકસ (પર્કિનઅલ્મર, વેલેસ્લી, એમએ), બધા નવા સંશ્લેષિત પ્રોટીનને લેબલ કરવા માટે 1 ° C પર ~ 37 એચ માટે. પછી રેડિઓએબલને પીબીએસના 2 એમએલ સાથે, અને ત્રણથી ત્રણ વખત કોશિકાઓ ધોવાથી દૂર કરવામાં આવ્યું ³⁵એસ-લેબલવાળા પ્રોટીન (પીછો) ને "ઠંડા" (નોનરાઇડિઓએક્ટિવ) માધ્યમથી 5% FBS સાથે સપ્લિમેંટ કરીને અને વિવિધ સમય બિંદુઓ પર કોષો ઉગાડવાથી માધ્યમને બદલતા (પીછો) કરવામાં આવ્યા હતા. સમગ્ર પીછેહઠ દરમિયાન સેલ સારવાર જાળવવામાં આવી હતી. આ પ્રયોગોના બધા આંકડા તેમના ટર્નઓવર દરોની સરખામણીને શ્રેષ્ઠ બનાવવા માટે વિવિધ પ્રોટીનની પ્રારંભિક માત્રા દર્શાવે છે.

પ્રાણીઓ અને ક્રોનિક ઇલેક્ટ્રોકોનવુલ્સિવ જપ્તી સારવાર.

પુખ્ત સ્પ્રેગ ડૉવલી પુરુષ ઉંદરો (200-300 જી; ચાર્લ્સ રીવર લેબોરેટરીઝ, કિંગ્સ્ટન, આરઆઇ) એકવાર દૈનિક એકવાર XNTX-7 ડી માટે ઇલેક્ટ્રોકોવલ્સિવ સીઝર્સ (ઇસીએસ) સાથે સારવાર કરવામાં આવતી હતી. ઇસીએસ અગાઉ વર્ણવ્યા પ્રમાણે કરવામાં આવ્યું હતું (આશા અને અલ., 1994a) નો ઉપયોગ કરીને ઉગો બાસાઇલ (કોમેરિઓ વી, ઇટાલી) નીચેની સેટિંગ્સ સાથે ઇસીએસ એકમ: આવર્તન, 100 કઠોળ / ઓ; પલ્સ, 0.5 એમએસ; આંચકો અવધિ, 1.0 એસ; અને વર્તમાન, 75 એમએ. શામ નિયંત્રણ પ્રાણીઓને ઇલેક્ટ્રિકલ પ્રવાહ વિના કાન-ક્લિપ ઇલેક્ટ્રોડ્સ લાગુ કરીને સમાંતર રીતે ગણવામાં આવે છે.

³² પી મેટાબોલિક લેબલિંગ.

બ્રેઇન સ્લાઇસેસના લેબલિંગ માટે, ઉંદરોને ડિસીપિટેટેડ કરવામાં આવ્યા હતા, મગજ ઝડપથી વિખરાયેલા હતા, અને 300 μm ફ્રન્ટલ કોર્ટિકલ સ્લાઇસેસ ડીએસકે માઇક્રોસિલિઅર (ટેડ પેલા, રેડ્ડીંગ, સીએ) સાથે તૈયાર કરવામાં આવ્યા હતા. ફોસ્ફેટ-અપૂરતી કૃત્રિમ સીએસએફ (એસીએસએફ) ના 2 એમએલમાં પ્લાસ્ટિક ટ્યુબની અંદરના ભાગમાં કાપી નાંખ્યું હતું અને એક O સાથે સતત ખાનદાન પરપોટા હેઠળ 30 ° C પર જાળવવામાં આવ્યું હતું.₂/ સી.ઓ.₂ મિશ્રણ (હેમિંગ્સ એટ અલ., 1989). સ્લાઇસેસ (ટ્યુબ દીઠ બે સ્લાઇસેસ) 1.3-8 એચ માટે 10 એમસીઆઈ સાથે લેબલ કરવામાં આવી હતી જે ઑકેડાઈડ એસિડ (100 એનજી / એમએલ) ની હાજરી અથવા ગેરહાજરીમાં હતી. આ ઇન્ક્યુબેશનના અંતમાં, ઠંડા એસીએસએફ સાથે ઓછામાં ઓછા ત્રણ વખત કાપી નાંખ્યું અને ત્યારબાદ ઠંડા રેડિયોમ્યુન્યુપોપ્રિએયસ એસે (આરઆઇપીએ) બફર [પીબીએસ, પીએચ 250, 7.4 એમએમ NaCl, 150% (વી / વી) ની 1 μl માં sonication દ્વારા સમર્પિત. ) Igepal, 0.5% (ડબલ્યુ / વી) સોડિયમ ડિઓક્સિકોલેટ, 0.1% (ડબલ્યુ / વી) એસડીએસ, 1 એમએમટીએ] 0.6% સુધી એસડીએસ સાથે ઉપયોગ કરતાં પૂરક, સસ્તન કોષો માટે પ્રોટીઝ ઇનહિબિટર કૉકટેલ (5 μl / ml પર વપરાય છે; સિગ્મા-એલ્ડરિચ), ફોસ્ફેટઝ ઇનહિબિટર કોકટેલ્સ I અને II (1: 100; સિગ્મા-એલ્ડરિચમાં વપરાય છે), 1 એમએમ પીએમએસએફ, અને 2% ગ્લિસરોલ. હોમોજેનેટસને પછી 15 મિનિટ માટે ઉકાળીને 15,000 × પર સેન્ટ્રિફ્યુગેશન દ્વારા સાફ કરવામાં આવ્યું g 15 મિનિટ માટે. પરિણામી સુપરરેટન્ટ્સમાં પ્રોટીન એકાગ્રતા બીસીએ પ્રોટીન પરોક્ષ (પીઅર્સ, હોલમડેલ, એનજે) નો ઉપયોગ કરીને આકારણી કરાઈ હતી.

માટે ³²સંસ્કારી કોશિકાઓની P લેબલિંગ, ચેપ / સંક્રમણ પછી ~ 24 એચ, ફોસ્ફેટ-મુક્ત માધ્યમથી કોશિકાઓ બેથી ત્રણ વખત ધોવાઇ હતી અને આ માધ્યમમાં ~ xNUMX એચ માટે ઉકાળી હતી. આ ભૂખમરા અવધિ પછી, 1-0.2 એમસીઆઇ ³²પીએચ₃PO₄ (પર્કિનઅલ્મર) દરેક કૂવામાં ઉમેરવામાં આવ્યા હતા, અને કોષોને 4-12 એચ માટે લેબલ કરવામાં આવ્યા હતા જે પ્રયોગના પ્રકારને આધારે (ફિગ્સ. 1-7 સ્પષ્ટીકરણો માટે જુઓ). ત્યારબાદ કોષો પીબીએસ સાથે ત્રણ વખત ધોયા અને એક્સએમએક્સએક્સ મિનિટ માટે બરફ પર લુઈડ કરવામાં આવ્યા, જે પૂરક આરઆઇપીએ બફરના 15 μl સાથે હતા. લાસેટ્સને સ્ક્રેપીંગ દ્વારા એકત્ર કરવામાં આવ્યા હતા અને 50 GA સોયથી શરણ ડીએનએ દ્વારા 10 મિનિટ સુધી બાફેલી, અને 25-10 મિનિટ XNTX-15,000 મિનિટ માટે કેન્દ્રિત કરીને 15 ° C પર કેન્દ્રિત કરવામાં આવ્યા હતા. સાફ થયેલ એલિસેટ્સ (સુપરરેટન્ટ્સ) ને નવી ટ્યુબમાં તબદીલ કરવામાં આવી હતી અને બીસીએ પ્રોટીન એસે (પીઅર્સ) કરવામાં આવી હતી. આ પ્રયોગોના તમામ આંકડાઓ તેમના સંબંધિત ફોસ્ફોરિલેશન સ્તરોની તુલનાને ઑપ્ટિમાઇઝ કરવા માટે કુલ જંગલી-પ્રકાર (ડબલ્યુટી) અને S30A ΔFOSB પ્રોટીનની સમાન માત્રા દર્શાવે છે.

કેમિકલ્સ અને સેલ સંસ્કૃતિ સારવાર.

ઓકાડેલિક એસિડ (ઓએ; સિગ્મા-એલ્ડરિચ) ઇથેનોલમાં ઓગળેલા હતા અને 100 એનજી / એમએલની અંતિમ સાંદ્રતા પર ઉપયોગમાં લેવાય છે. 5,6-Dichloro-1-β-D-ribofuranosyl-benzimidazole (ડીઆરબી; બાયોમોલ, પ્લાયમાઉથ મીટિંગ, પીએ) ડિમીથિલ સલ્ફોક્સાઈડ (ડીએમએસઓ; સિગ્મા-એલ્ડરિચ) માં ઓગળેલા હતા અને 50 μm ની અંતિમ સાંદ્રતા પર સેલ સંસ્કૃતિમાં ઉપયોગમાં લેવાય છે. સ્પર્મિન (સિગ્મા-એલ્ડરિચ) પાણીમાં ઓગળેલા હતા અને 200 μm ની અંતિમ સાંદ્રતા પર ઉપયોગમાં લેવાય છે. કેલ્ફોસ્ટિન-સી (બાયોમોલ) ડીએમએસઓમાં ઓગળવામાં આવ્યું હતું અને 0.2 μm પર ઉપયોગમાં લેવાયું હતું, જ્યારે ફોર્બોલ 12- મેરિસ્ટેટ 13-acetate (PMA; પ્રોમેગા, મેડિસન, ડબ્લ્યુઆઇ) ડીએમએસઓમાં વિસર્જન થયું હતું અને 0.1 μm પર વપરાય છે. મેરિસ્ટાઇલેટેડ-ઑટોકામ્ટેઇડ-એક્સ્યુએનએક્સ-સંબંધિત ઇન્હિબીરેટરી પેપ્ટાઇડ (એમ-એઆઇપી; બાયોમોલ) પાણીમાં ઓગળેલા હતા અને 2 અને 1 μm ની અંતિમ સાંદ્રતા પર ઉપયોગમાં લેવાય છે. બ્રોડ-સ્પેક્ટ્રમ પ્રોટીન કેનાઝ ઇનહિબિટર એચ-એક્સ્યુએનએક્સ અને એચ-એક્સએનટીએક્સ (બાયોમોલ) પાણીમાં ઓગળેલા હતા અને અનુક્રમે 10 અને 7 μm ની અંતિમ સાંદ્રતા પર ઉપયોગમાં લેવાય છે. એમજીએક્સયુએનએક્સ (કેલ્બીકેમ, સાન ડિએગો, સીએ) અને એપૉક્સોમિસિન (પેપ્ટાઇડ્સ ઇન્ટરનેશનલ, લુઇસવિલે, કેવાય) બંને ડીએમએસઓમાં ઓગળેલા હતા અને અનુક્રમે 8 અને 150 μm ની અંતિમ સાંદ્રતા પર ઉપયોગમાં લેવાય છે. તમામ પ્રયોગોમાં, ડીએમએસઓ (વાહન) એ સમગ્ર ઉપચારમાં સતત ડીએમએસઓ જાળવવા માટે જરૂરી કોશિકાઓમાં ઉમેરવામાં આવ્યું હતું. માટે ³²પી લેબલિંગ પ્રયોગો, દવાઓ લેબલ સમક્ષ તરત જ ઉમેરવામાં આવી હતી અને બાકીની લેબલિંગ અવધિ માટે રાખવામાં આવી હતી. પલ્સ-ચેઝ પ્રયોગો માટે, સીઝ / મેટ "ભૂખમરો" ના સમયે દવાઓ ઉમેરવામાં આવી હતી, જે લેબલિંગ સમયગાળા દરમિયાન રાખવામાં આવી હતી અને પછી ચેઝ માધ્યમમાં પાછા ઉમેરવામાં આવી હતી. આ પેપ્ટાઇડ્સના ઝડપી ટર્નઓવરને વળતર આપવા માટે ચેઝ દરમિયાન પ્રત્યેક 3-4 એચ પ્રોટીઝોમ ઇનહિબિટરને સ્પીક કરવામાં આવ્યાં હતાં.

Δએફએસબી ઇમ્યુનોપ્ર્રેઇર, ઇમ્યુનોબ્લોટિંગ, અને ઑટોરાડિયોગ્રાફી.

રોગપ્રતિકારક શક્તિ માટે, લ્યુએટ્સને ઇમ્યુનોપ્રેઇરી (આઈપી) સાથે આગળ વધતા પહેલા સીએડીએસ એકાગ્રતાને 1% સુધી ઘટાડવા માટે સાદા આરઆઇપીએ સાથે 5: 0.1 ઘટાડવામાં આવ્યા હતા. બિનસત્તાવાર બંધનને મર્યાદિત કરવા માટે, લૈસેટ્સને ઓછામાં ઓછું 4 એચ માટે નોમિમ્યુન આઇજીજી અને પ્રોટીન જી-સેફરોઝ (સિગ્મા-ઍલ્ડરિચ) સાથે ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટિંગ દ્વારા પ્રથમ સાફ કરવામાં આવ્યું હતું. ΔFOSB ત્યારબાદ બકરી પોલીક્લોનાલ એન્ટિબોડીનો ઉપયોગ કરીને સાફ કરેલ લૅસેટ્સમાંથી ઇમ્યુનોપ્રિપ્રિટેટ કરાયો હતો જે લ્યુસેટ પ્રોટીનના 48-0.5 μg આઇજીજી XGXX-1 μg આઇજીજી પર એફઓએસબી અને Δફોસબી (એસસી-એક્સNUMએક્સજી; સાન્ટા ક્રૂઝ બાયોટેકનોલોજી, સાન્ટા ક્રૂઝ, સીએ) બંનેમાં હાજર આંતરિક ઉપસ્થિતિને માન્ય કરે છે. (કુલ પ્રોટીનની 10-50 μg) 300 મીલીની કુલ માત્રામાં. ઓછામાં ઓછા 0.5 એચ માટે રોટર પર 4 ° સે પર આઇપીને ધીમેથી મિશ્ર કરવામાં આવ્યા હતા અને પછી જી-સેફરોઝના પ્રોટીન 8 μl ઉમેરવામાં આવ્યા હતા અને આઇપીને ઓછામાં ઓછા 15 એચ માટે મિશ્ર કરવામાં આવ્યા હતા. આઇપીને 4 × પર સ્પિનિંગ દ્વારા પેલલેટ કરવામાં આવ્યા હતા g 3-5 મિનિટ 4 ° C પર, ઠંડા સાદા આરઆઇપીએના 0.5 એમએલ સાથે ત્રણ વખત અને ઠંડા પીબીએસ સાથે 0.1% ટ્વિન 20 ધરાવતી બે વખત ધોવાઇ. ત્યારબાદ આઇપીને કોલ્ડ પીબીએસના 0.5 મી.એલ. માં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવ્યું, ટ્રાન્સફર, નવી ટ્યુબમાં પેલેટેડ, અને ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેડ પ્રોટીન પછી 15 ની 25-2 μl ઉમેરીને લેમ્મિલી પ્રોટીન નમૂના બફર ઘટાડવામાં આવ્યું. આ આઇપી પ્રોટોકોલને લીસેટમાં લગભગ તમામ ΔFOSB ની વિશિષ્ટ અને અસરકારક વરસાદમાં પરિણમ્યું. રોગપ્રતિકારક પ્રોટીનને એસ.ડી.એસ.-PAGE ની આજુબાજુ એક 12.5% ટ્રાઇ-એચ.સી.સી. માપદંડ જેલ (બાયો-રેડ, હર્ક્યુલીસ, સીએ) પર સંપૂર્ણ આઇપી લોડ કરીને, અને ત્યારબાદ પીવીડીએફ અથવા નાઇટ્રોસેલ્યુલોસ પર સ્થાનાંતરિત કરીને એસડીએસ-PAGE હેઠળ મૂકવામાં આવ્યાં. સ્થાનાંતરણ પછી, કલા શુષ્ક અને સુકાઈ ગઈ હતી ³²પી- અને ³⁵કોડાક (રોચેસ્ટર, એનવાય) ઑટોરૅડિઓગ્રાફિક ફિલ્મનો ઉપયોગ કરીને ઑટોરાડિઓગ્રાફી દ્વારા એસ-રેડિઓલેબલ્ડ પ્રોટીન બેન્ડ્સ તેમજ સ્ટોર્મ (ઍમર્સહામ બાયિઓસન્સીસ, પિસ્કાટાવે, એનજે) ફોસ્ફોર આઇમેજરનો ઉપયોગ કરીને ફોસ્ફોરિમિંગ દ્વારા અવલોકન કરવામાં આવ્યું હતું. કુલ (અનફોસ્ફોરીલેટેડ અને ફોસ્ફોરીલેટેડ) Δ ફોસબી સેલ લાઇસેટ્સ અથવા મગજ હોમોજેનેટસમાં ઇમ્યુનોપ્રિસીકેટિટેડ પ્રોટીનની ઇમ્યુનોબ્લોટિંગ દ્વારા શોધી કાઢવામાં આવ્યું હતું (તે જ કલાનો ઉપયોગ કરીને શોધી કાઢવા માટે ³²પી લેબલવાળા પ્રોટીન), અથવા સમાન પ્રમાણમાં લોસેટ / હોમોજેનેટ પ્રોટીન એસડીએસ-PAGE ને આધિન છે અને પીવીડીએફ અથવા નાઇટ્રોસેલ્યુલોઝ પર સ્થાનાંતરિત થાય છે. પીએનબીમાં 1% (ડબલ્યુ / વી) નોનફેટ ડ્રાય મિલ્ક (બાયો-રેડ) સાથે XENX% (વી / વી) 0.1% (v / v) ટ્વિન 20 (સિગ્મા) સાથે 1 ° C માટે 25% માટે સપ્લિમેંટ કરીને તેને પ્રથમ વખત અવરોધિત કરવામાં આવ્યું હતું. પછી ઝેનબી / ΔFOSB (4: 1 પર વપરાયેલ) ની એમિનો એસિડ્સ 16-1 સામે ઉત્પન્ન થયેલ અમારી પોતાની સસલી એન્ટિ-ફોસબી પોલીક્લોનાલ એન્ટિબોડી સાથે ઝેન એક્સએક્સએક્સ ° સે ખાતે રાતોરાત રાતોરાત ઇમ્યુનોબ્લોટ કરાઈ હતી. પ્રાથમિક ઉકાળો પછી, બફર બ્લોક સાથે 10,000 મિની માટે કલાકો ચાર વખત ધોયા હતા, અને પછી XXX ° સે માટે ~ 5 ° સે માટે ઇંક્યુબેટ કરવામાં આવ્યું હતું, બકરી વિરોધી સસલું આઇજીજી હર્જરડિશ પેરોક્સિડેઝ સાથે સંકળાયેલું હતું (25 પર વપરાય છે: બફરને અવરોધિત કરવામાં 1, વેક્ટરમાંથી લેબોરેટરીઝ, બર્લિંગમૅમ, સીએ). મેમ્બ્રેનને પછી બફર બ્લોક સાથે 1 મિનિટ માટે ત્રણ વખત અને પીબીએસ સાથે 5000 મિનિટ માટે એક વખત ધોવાઇ હતી. કુલ ΔFOSB પ્રોટીન બેન્ડ્સ કોડાક એમઆર ફિલ્મમાં વિસ્તૃત કેમેલ્યુમાઇન્સન્સ (પીઅર્સ) દ્વારા અને / અથવા ઇસીએલ-પ્લસ રેજેન્ટ્સ (એમેર્સહમ બાયિઓસન્સીસ) અને સ્ટોર્મ ફોસ્ફર આઇમેજરનો ઉપયોગ કરીને ફ્લોરોસેન્સની શોધ દ્વારા કલ્પના કરવામાં આવી હતી.

ઓવરેક્સપ્રેસ અને જંતુનાશક કોષોમાંથી com FOSB ના શુદ્ધિકરણ.

ΔFOSB એ એસએક્સએક્સએનએક્સએક્સ કીટ કોષોમાં એન ટર્મિનસ હેક્સા-તેમનો ટૅગ કરેલા પ્રોટીન (એન-હીસ (9) ΔFOSB) તરીકે ઓકેક્સેપ્સ્ડ કરવામાં આવ્યો હતો, જે બેક-ટૂ-બેક બેકુલોવાયરસ અભિવ્યક્તિ પ્રણાલી (ઇન્વિટ્રોજન) નો ઉપયોગ કરીને અને ઉત્પાદકની સૂચનાઓને અનુસરે છે. સંક્ષિપ્તમાં, Δફોસબી સીડીએનએ (અવશેષો 6-2) એફેનિટી એન-ટર્મિનલ ટેગ દ્વારા આગળ વધેલું MGHHHHHAG એ PFASTBACTM237 વેક્ટરમાં અવલોકિત હતું, જેનો ઉપયોગ ફરીથી કંબોડન્ટ બેકુલોવારસ પેદા કરવા માટે થયો હતો. Sf1 કોશિકાઓ ફરીથી કોમ્બિનેંટ વાયરસથી સંક્રમિત થઈ હતી, અને એન-હિસ (9) ΔFosB એ સેલો લૈસેટ્સમાંથી ઘણા ક્રોમેટોગ્રાફિક પગલાઓ દ્વારા શુદ્ધ કરવામાં આવી હતી જેમાં મોનો-ક્યૂ કૉલમ (અમરસહમ) નો ઉપયોગ કરીને નિકલ કૉલમ (ક્વિઆજેન, વેલેન્સિયા, સીએ), આયન વિનિમયનો ઉપયોગ કરીને એફેનિટી ક્રોમેટ્રોગ્રાફીનો સમાવેશ થાય છે. બાયિઓસન્સીસ), અને જેલ-ગાળણક્રિયા કૉલમ (અમર્સમ બાયિઓસન્સીસ) નો ઉપયોગ કરીને માપ બાકાત.

ઈન વિટ્રોમાં ફોસ્ફોરીલેશન અભ્યાસ.

ઈન વિટ્રોમાં ટાઇમ કોર્સ અને સ્ટોચીકોમેટ્રી વિશ્લેષણ માટે ફોસ્ફોરીલેશન પ્રતિક્રિયાઓ 30 μl ની વોલ્યુમમાં કરવામાં આવી હતી જેમાં 10 μm સબસ્ટ્રેટ (એન-હીસ (6) ΔFOSB અથવા પોઝિટિવ કંટ્રોલ સબસ્ટ્રેટ), 250 μm એટીપી, અને 1 μCi / μl [γ-³²પી] એટીપી, કેનાઝ નિર્માતા દ્વારા પૂરી પાડવામાં આવેલ બફર, અને નીચેનામાંના એકમાં: CK2 (20 એનજી / μl; અપસ્ટેટ, ચાર્લોટસવિલે, વી.એ.), કેમકી (10 એનજી / μl; અપસ્ટેટ), પીકેસી (1.6 એનજી / μl; કેલ્બીકેમ) અથવા પીએક્સયુએનએક્સએક્સએનએક્સએક્સકે (70 એમયુ / μl; અપસ્ટેટ). નિયત સમય બિંદુઓ પર પ્રતિક્રિયા સોલ્યુશનમાંથી 6 μl aliquots દૂર કરીને સમયક્રમની પ્રતિક્રિયાઓ કરવામાં આવી હતી અને લેમેલ્મી પ્રોટીન નમૂના બફર ઘટાડવા 2.5 × ની સમાન વોલ્યુમ ઉમેરી હતી. CK5 પ્રતિક્રિયા માટે માઇકલિસ-મેન્ટેન ગતિિક પરિમાણો પ્રયોગાત્મક વ્યાખ્યાયિત રેખીય સ્થિર-સ્થિતિ પરિસ્થિતિઓ હેઠળ નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા. આ પ્રતિક્રિયાઓ 4 μl ની 2 μl ની 15 એનજી / μl એન્ઝાઇમ, 10 μm એટીપી, 2 μCi / μl [γ-³²પી] એટીપી, અને એન-તેમનું (6) Δ FOSB સાંદ્રતા 2.5-30 μm થી લઇને. તમામ પ્રતિક્રિયાઓ પાણીના સ્નાનમાં 30 ° C પર કરવામાં આવી હતી. એસ.ડી.એસ.-PAGE અને બાયો-સેફ ક્યુમાસી (બાયો-રેડ) સાથે જેલના સ્ટેનિંગ પછી, જેલ સૂકાઈ ગઈ હતી, અને ³²પી-ફોસ્ફેટ નિવેશનું મૂલ્યાંકન ફોસ્ફોરિમિંગ વિશ્લેષણ દ્વારા કરવામાં આવ્યું હતું (નીચે જુઓ, ડેટા ક્વોન્ટિફિકેશન, ગણતરીઓ અને આંકડાઓ).

દ્વિ-પરિમાણીય ફોસ્ફોપ્પ્ડાઇડ નકશો અને ફોસ્ફોમેનો એસિડ વિશ્લેષણ.

આ બંને વિશ્લેષણ દ્વારા વર્ણવ્યા અનુસાર કરવામાં આવ્યા હતા પ્લેઇગ અને ડન (2000). સંક્ષિપ્તમાં, સૂકી જેલ ટુકડાઓ સમાવી રહ્યા છે ³²પી લેબલ થયેલ ΔFOSB (ક્યાંથી ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ પ્રતિક્રિયાઓ અથવા ચયાપચયની લેબલવાળા કોશિકાઓના રોગપ્રતિકારક તંત્રથી), એક્સાઇઝ્ડ, રીહાઇડ્રેટેડ, ધોવાઇ, અને ટ્રિપ્ટિક પાચનને આધિન હતા. ટ્રિપ્ટિક પાચન ઉત્પાદનો ધરાવતું સુપરરેટન્ટ લાઇયોફિલાઇઝ્ડ હતું અને લાઇફફિલેટ ઘણીવાર ધોવાઇ ગયું હતું અને ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ બફરના 10 μl માં ફરીથી મુકાયું હતું, પીએચ 1.9. નમૂના (3 μl) સેલ્યુલોઝ પાતળા સ્તરની ક્રોમેટોગ્રાફી (ટીએલસી) પ્લેટ (ઍનલટેક, નેવાર્ક, ડીઇ) પર જોવાયું હતું અને ટીએલસી ઉપર ચઢીને ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ અને અન્ય પરિમાણ દ્વારા એક પરિમાણમાં વિભાજિત કરવામાં આવ્યું હતું. પરિણામસ્વરૂપ ફોસ્ફોપ્પ્ડાઇડ નકશાઓ ઑટોરાડિયોગ્રાફી અને ફોસ્ફોરાઇમિંગ દ્વારા વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવામાં આવી હતી. ફોસ્ફોમેનો એસિડ વિશ્લેષણ માટે, ટ્રિપ્ટિક ડાયજેસ્ટ્સના 2 μl જે ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ બફરમાં ફરીથી મુકાયા હતા તેને એક્સએલએક્સ એમસીએલમાં 105 મી એચસીએલમાં 25 મીટર માટે 3 ° C પર એચસીએલ હાઇડ્રોલિસિસ દ્વારા વધુ સાફ કરવામાં આવ્યું હતું.₂ વાતાવરણ પ્રતિક્રિયા પાણીમાં છઠ્ઠા ઘાટ દ્વારા બંધ કરી દેવામાં આવી હતી, અને મિશ્રણ lyophilized હતી. ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ બફરના 5 μl માં પાયોફિલેટનું પુનર્ગઠન કરવામાં આવ્યું હતું, પીએચ 1.9, અને ફોસ્ફો-સર્, ટીએચ, અને-ટાયર ધોરણો સાથે સેલ્યુલોઝ ટીએલસી પ્લેટ પર જોયું હતું. ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસને ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ બફર, પીએચ 1.9 નો ઉપયોગ કરીને ટીએલસી પ્લેટની લંબાઈના અડધા ભાગ પર કરવામાં આવી હતી, અને પછી પ્લેટને પીએચ 3.5 બફરમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવી હતી, અને ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ પૂર્ણ થવા માટે કરવામાં આવી હતી. એસીટોનમાં 1% (v / v) ninhydrin સોલ્યુશન સાથે ટી.એલ.સી. પ્લેટને સ્પ્રે કરીને ફોસ્ફોમેનો એસિડ સ્ટાન્ડર્ડ્સની કલ્પના કરવામાં આવી હતી, અને ³²પી-લેબલવાળા એમિનો એસિડ નમૂનાઓ સ્વયંસંચાલિત અને ફોસ્ફોરિમિંગ એમ બંને દ્વારા કલ્પનામાં લેવાયા હતા.

સીઆરઆરએનએ-પ્રેરિત CK2α નોક-ડાઉન.

અમે CK2 ના સ્તરોને પસંદ કરીને ડાઉન-ડાઉન કરવા માટે આરએનએ હસ્તક્ષેપ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કર્યો છે (ડિ મૈરા એટ અલ., 2005). બીજા દિવસે ~12-70% સંગઠન સુધી પહોંચવા માટે પીસીએક્સએનએક્સએક્સ સેલ્સને કોલેજેન આઇ-કોટેડ છ-કૂવા પ્લેટ પર સીડ કરવામાં આવ્યા હતા, જ્યારે તેઓ સંક્રમણથી સીટીઆરએનએ અથવા સીઆરઆરએનએ ન્યૂટક્લાઈટીંગના એમઆરએન તરફ નિર્દેશિત ન હોય તેવા 80 એનએમ (અંતિમ સાંદ્રતા) સાથે સંક્રમિત થયા હતા. ઋષિ CK20 ના α સબ્યુનિટ, ટ્રાન્ફેક્શન એજન્ટ સાયલેન્ટફેક્ટિન (બાયો-રેડ) ના 2 μl નો ઉપયોગ કરીને અને ઉત્પાદકની સૂચનાઓને અનુસરે છે. લગભગ 5 એચ પછી, ઉપર જણાવેલ પ્રમાણે કોશિકાઓને ΔFOSB પ્લાઝમિડ સાથે સંક્રમિત કરવામાં આવી હતી. આશરે 24 એચ પછીથી (~ સીઆરઆરએનએ ટ્રાન્સએક્શન પછી ~ 24 એચ), કોશિકાઓને ક્યાંય આધિન કરવામાં આવી હતી ³²ઉપર વર્ણવ્યા મુજબ પી મેટાબોલિક લેબલિંગ અથવા પલ્સ-ચેઝ વિશ્લેષણ. નીચેના ચાર CK2α siRNAs સમાન પરિણામો સાથે ઉપયોગમાં લેવાયા હતા: 5'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ', 5'P-UCAAUCAU-GACAUUUUGUGUU3', 5'P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3 ', 5'P-AAAUCCCUG ACAUCUUAUUUU3' (ધર્મકોન, લેફાયેટ, CO). નકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે, અમે ઉપયોગ કર્યો હતો સિલેન્સર નકારાત્મક નિયંત્રણ # એએમબીએનએક્સ સીઆરએનએ એ એમ્બિયન (ઑસ્ટિન, ટેક્સાસ). સીએક્સએક્સ્યુએનએક્સ નાક-ડાઉનની મર્યાદા એક 3: 2 મંદીમાં રાતોરાત વિરોધી CK2 પોલીક્લોનલ એન્ટિબોડી (અપસ્ટેટમાંથી કેટલોગ # 06-873 સૂચિ) નો ઉપયોગ કરીને ઇમ્યુનોબ્લોટિંગ દ્વારા નિરીક્ષણ કરવામાં આવી હતી. β-Tubulin નો લોડિંગ કંટ્રોલ તરીકે ઉપયોગ થયો હતો અને એક 1: 1000 મંદીમાં રાતોરાત એક મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડી (અપસ્ટેટમાંથી કેટલોગ # 05-661 સૂચિ) સાથે શોધી કાઢ્યું હતું.

સાઇટ નિર્દેશિત મ્યુટેજેનેસિસ.

એલા અથવા એએસપીમાં સેરક્સમૅક્સનું પરિવર્તન, ક્વિક ચેન્જ સાઇટ-ડાયરેક્ટેડ મ્યુટાજેનેસિસ કીટ (સ્ટ્રેટાજેન, લા જોલા, સીએ) નો ઉપયોગ કરીને અને ઉત્પાદકની સૂચનાઓનું પાલન કરીને પૂર્ણ થયું હતું. માઉસ ΔFOSB પ્રોટીન માં Ser27 પરિવર્તનો રજૂ કરવા માટે, નીચેના મ્યુટેજેનેસિસ પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરવામાં આવતો હતો. સેરએક્સએનએક્સએક્સ એલા: (રિવર્સ પ્રિમર) 27'GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 '. સેરએક્સએનએક્સએક્સ થી એએસપી (આગળ પ્રિમર) 27'CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATટીસીજીજીટીજીગાસીટીસીટીટીસીજીસીએક્સએક્સએક્સએક્સ '. પરિવર્તિત પાયા ઘાટામાં છે, અને સેરએક્સએનએક્સએક્સ કોડન ઇટાલીકાઇઝ્ડ છે.

બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ.

સંભવિત ફોસ્ફોરિલેશન સાઇટ્સ અને ΔFosB માટેના કેનાસ પ્રોસેસ સહિતના વિશિષ્ટ ડેટાબેસેસ પર માઉસ પ્રોટીન અનુક્રમ સબમિટ કરીને શોધવામાં આવ્યા હતા (http://www.expasy.org/prosite/), આગાહીપ્રોટીન (રોસ્ટ એટ અલ., 2004), અને નેટફોસ્કે (બ્લોમ એટ અલ., 2004).

ડેટા ક્વોન્ટિફિકેશન, ગણતરીઓ અને આંકડા.

પીવીડીએફ અથવા નાઇટ્રોસેલ્યુલોઝ મેમ્બરમાં હાજર પ્રોટીનની માત્રા સ્ટ્રોમ ફોસ્ફર આઇમેજર અને સાથે સાથે ઇમેજક્વોન્ટ સૉફ્ટવેર (અમર્સમ બાયિઓસન્સીસ / મોલેક્યુલર ડાયનેમિક્સ) નો ઉપયોગ કરીને પરિણમે છે. સેલ સંસ્કૃતિ અને મગજની સ્લાઇસમાં ફોસ્ફોરીલેશન અધ્યયન, મૂલ્યો માટે મેળવેલા છે ³²પી-લેબલવાળા પ્રોટીન પછી ΔFosB માટે મેળવેલા મૂલ્યો દ્વારા વિભાજિત કરવામાં આવ્યા હતા, અને ગુણોત્તર તરીકે વ્યક્ત કરવામાં આવ્યા હતા. માં ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ ફોસ્ફોરીલેશન અભ્યાસ, જથ્થો ³²ΔFOSB (stoichiometry) ની પે-લેબલ ΔFOSB પ્રતિ છિદ્રની ગણતરી અગાઉની જેમ કરવામાં આવી હતી (સહિન એટ અલ., 2004). વપરાયેલી સાધનની રેખીયતા શ્રેણીમાં તમામ માપ લેવામાં આવ્યા હતા. કાઇનેટિક પરિમાણોની ગણતરી માઇકલિસ-મેન્ટેન મોડેલ દ્વારા કરવામાં આવી હતી V = V_{મેક્સ}[S] / ([S]+K_M) અને V_{મેક્સ} = k₂[E_કુલ]. અર્ધ જીવન (t_1/2) ΔFOSB અને FOSB ના પલ્સ-ચેઝ પ્લોટ્સ (નોનલાઇન રીગ્રેશનનો ઉપયોગ કરીને ડેટા પોઇન્ટ્સને શ્રેષ્ઠ ફીટ કરવામાં આવે છે) થી અંદાજવામાં આવ્યો હતો અને બાકીના પ્રોટીનની રકમ મૂળ રૂપે 50% છે તે સમયને અનુરૂપ છે. બધા આંકડાઓમાં, બતાવેલા પરિણામો ઓછામાં ઓછા બે થી ત્રણ સ્વતંત્ર પ્રયોગોના પ્રતિનિધિ છે. બધા ગ્રાફમાં, બતાવેલો ડેટા સરેરાશ ± SEM (3 ≤ n ≤16). ભેદભાવના આંકડાકીય મહત્વનું મૂલ્યાંકન unpaired નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું t પરીક્ષણ, બહુવિધ તુલના માટે સુધારેલ છે, અને તારામંડળ સૂચવે છે p ≤ 0.05.

અગાઉના વિભાગ આગામી વિભાગ

પરિણામો

ΔFOSB અસામાન્ય રીતે સ્થિર ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળ છે

તેમ છતાં આપણે અગાઉ અનુમાન લગાવ્યું છે કે ΔFOSB પ્રમાણમાં સ્થિર ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પરિબળ છે (નેસ્લેર એટ અલ., 2001), પ્રોટીનની ટર્નઓવર પ્રોફાઇલનો સીધો વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યો નથી. આ પ્રશ્નનો ઉકેલ લાવવા માટે, અમે પીસીએક્સએનએક્સએક્સ કોષોનો ઉપયોગ કરીને પલ્સ-ચેઝ પ્રયોગો હાથ ધર્યા છે, જે ન્યુરોન-જેવી કોષ રેખા તરીકે મોટા પ્રમાણમાં ઉપયોગમાં લેવાય છે, જેમાં ΔFOSB ને એક રેકોમ્બિનેટન્ટ હર્પીસ સિમ્પલેક્સ વાયરસ (એચએસવી-ΔFOSB) સાથે સંક્રમણ દ્વારા સંક્રાંતિથી વ્યક્ત કરવામાં આવી હતી. નવા સંશ્લેષિત પ્રોટીન ચયાપચયથી લેબલવાળા હતા ³⁵એસ-મેટ / સીઝ અને ડિગ્રેડેશન પેટર્ન ³⁵એસ-લેબલ થયેલ ΔFOSB (³⁵એસ-Δફોસબી) રેડિઓલેબલવાળા એમિનો એસિડ્સને દૂર કર્યા પછી વિવિધ સમય બિંદુઓએ મેળવેલા સેલ લાયસેટ્સમાંથી તેને immunoprecipitating દ્વારા મોનીટર કરવામાં આવી હતી. એસડીએસ-PAGE અને ઑટોરાડિયોગ્રાફી દ્વારા ઇમ્યુનોપ્રિસિપેટીટ્સનું વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે PC12 કોશિકાઓમાં ΔFOSB નો અડધો જીવન ~ xNUMX એચ છે (ફિગ 1). આ તારણો દર્શાવે છે કે ફૉસબીનો અડધો જીવન સૌથી વધુ અવ્યવસ્થિત ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પરિબળો (ચર્ચા જુઓ) કરતા વધારે છે, જેમાં પૂર્ણ-લંબાઈ FOSB શામેલ છે, જેની સેલ સંસ્કૃતિમાં અર્ધ-જીવન ~ xNUMX મિનિટ હોવાનું નોંધાયું છે (ડોબ્રાઝાન્સ્કી એટ અલ., 1991; કાર્લે એટ અલ. 2004). વધુમાં, એ નોંધવું યોગ્ય છે કે ΔFOSB ના ધોવાણ પ્રથમ-ડિગ્રી ઘાતાંકીય કચરાના વળાંકમાં બંધબેસતું નથી, પરંતુ ધીમું ડિગ્રેડેશન દર સાથે શરૂ થવાને બદલે તે બિફાસિક છે. આ એક કરતાં વધુ ΔFOSB જાતિઓ અને / અથવા એક કરતાં વધુ અધોગતિ પાથવેની અસ્તિત્વ સૂચવે છે.

મોટું સંસ્કરણ જુઓ:

પાવરપોઈન્ટ સ્લાઇડ તરીકે ડાઉનલોડ કરો

આકૃતિ 1.

ΔFOSB અસામાન્ય રીતે સ્થિર ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળ છે. CultureFOSB નો અડધો જીવન સેલ સંસ્કૃતિમાં ~ xNUMX એચ છે. ΔFOSB એ પીસીએક્સએનએક્સએક્સ સેલ્સમાં એચએસવી-Δફોસબી અથવા ચેપયુક્ત ચેપ દ્વારા ΔFOSB ધરાવતી પ્લાઝમીડ સાથે ચેપ દ્વારા વ્યક્ત કરવામાં આવી હતી, અને કોષો સામગ્રી અને પદ્ધતિઓમાં વર્ણવ્યા પ્રમાણે પલ્સ-ચેઝ પ્રયોગોને આધિન હતા. ΔFOSB overexpress માટે ઉપયોગમાં લેવાતી પદ્ધતિને ધ્યાનમાં લીધા વિના સમાન પરિણામો મેળવવામાં આવ્યા હતા. આ આંકડો ΔFOSB ની અધોગતિનો સમય અભ્યાસક્રમ (અને પ્રતિનિધિ ઑટોરાડિયોગ્રામ) બતાવે છે. ઓછામાં ઓછા પાંચ સ્વતંત્ર પ્રયોગોથી મેળવેલ ઓછામાં ઓછા 10 વ્યક્તિગત ડેટા પોઇન્ટ્સની સરેરાશ ± SEM ની આલેખિત માહિતી છે. સરખામણી માટે, પૂર્ણ-લંબાઈ FOSB નો અહેવાલ અર્ધ-જીવન સૂચવવામાં આવે છે.

ΔFOSB એ મગજમાં ફોસ્ફોપ્રોટીન છે

અમે પૂર્વધારણા કરી છે કે ΔFOSB નું પોસ્ટ ટ્રાન્સાન્સલેશનલ સંશોધન તેની દેખીતી સ્થિરતામાં ફાળો આપી શકે છે. કારણ કે ફોસ્ફૉરેલેશનને ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પરિબળોની પ્રવૃત્તિને ઘણી રીતોમાં મોડ્યુલેટ કરવા માટે બતાવવામાં આવ્યું છે, જેમાં તેમની સ્થિરતા (સમીક્ષા માટે, જુઓ ડેસ્ટર એટ અલ., 2000; વ્હાઇટમૅશ અને ડેવિસ, 2000), અમે તપાસ કરી છે કે ΔFOSB એ ફોસ્ફોપ્રોટીન છે. આ અંતમાં, Δ FosB અભિવ્યક્તિ ક્રોનિક મગજનો ઉપયોગ કરીને ઉંદર મગજમાં પ્રેરિત કરવામાં આવી હતી, ΔFosB ના ઉચ્ચ સ્તરને પ્રેરિત કરવા માટે જાણીતી સારવાર, ખાસ કરીને આગળના ભાગમાં (આશા અને અલ., 1994a). છેલ્લા ઇસીએસ સારવાર પછી એક દિવસ, જ્યારે osએફએસબીનું સ્તર ઊંચું રહે છે, પાતળા આગળના કોર્ટિકલ કાપીને તૈયાર કરવામાં આવ્યા છે અને ચયાપચયની રીતે લેબલ થયેલ છે ³²પી-ઓર્થોફોસ્ફેટ. સ્લાઇસેસનું સમાંતર સમૂહ રેડિઓએબલ લેબલ નથી, અને આનો ઉપયોગ ΔFOSB સ્તરના કુલ શોધવા માટે કરવામાં આવતો હતો. એસડીએસ-PAGE દ્વારા ચોક્કસ એન્ટી-ફોસબી / Δફોસબી એન્ટિબોડી અને રોગપ્રતિકારક પ્રોટીનને છૂટા કર્યા પછી ઇમ્યુનોપ્રાયઇર પછી, ફોસ્ફોરિલેટેડ ³²પી લેબલવાળી ΔFOSB એટોરાડિયોગ્રાફી દ્વારા શોધી કાઢવામાં આવી હતી, જ્યારે ઇમ્યુનોબ્લોટિંગ દ્વારા કુલ ΔFOSB શોધી કાઢવામાં આવ્યું હતું. આ વિશ્લેષણથી જાણવા મળ્યું છે કે ΔFOSB એ મગજમાં ફોસ્ફોરિલેટેડ છે, જે ચોક્કસ દ્વારા પુરાવા આપે છે ³²~ 35 કેડીઆનો પી લેબલ થયેલ બેન્ડ ક્રોનિકલી સારવારમાં મગજના નમૂનાઓમાં હાજર છે, પરંતુ શેમ-કંટ્રોલ કંટ્રોલ્સમાં વર્ચ્યુઅલ રીતે નિદાન નહી થયેલા (ફિગ 2A). આ હકીકત સાથે સુસંગત છે કે, ક્રોનિક ઉત્તેજનાની ગેરહાજરીમાં, ΔFOSB ના મૂળભૂત સ્તરો ખૂબ ઓછા છે. રોગપ્રતિકારક પ્રતિક્રિયાની વિશિષ્ટતા નોમિમ્યુન આઇજીજી ઉપસંહારમાં સિગ્નલની અભાવ દ્વારા સમજાવી શકાય છે.

મોટું સંસ્કરણ જુઓ:

પાવરપોઈન્ટ સ્લાઇડ તરીકે ડાઉનલોડ કરો

આકૃતિ 2.

ΔFOSB એ મગજમાં ફોસ્ફોપ્રોટીન છે. A, ΔFOSB એ મગજમાં ફોસ્ફોરિલેટેડ છે. સમાવિષ્ટ Δફોસબી સામગ્રી અને પદ્ધતિઓમાં વર્ણવ્યા પ્રમાણે ક્રોનિક મગજની ઇસીએસ સારવાર દ્વારા ઉંદર મગજમાં પ્રેરિત કરવામાં આવ્યું હતું. આગળની કોર્ટિકલ સ્લાઇસેસ ચયાપચયથી લેબલવાળી હતી ³²પીએચ₃PO₄ ઘણા કલાકો માટે. સ્લાઇસેસના હોમજેનાઇઝેશન પછી, Δએફએસબી ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેડ હતું, અને ફોસ્ફોરીલેટેડ ΔFOSB (³²પી-Δફોસબી) ઓટોરાડિયોગ્રાફી (ટોચની પેનલ) દ્વારા શોધી કાઢવામાં આવ્યું હતું. ઇમ્યુનોબ્લોટિંગ (તળિયે પેનલ) દ્વારા નોનરેડિઓએક્ટિવ ઇમ્યુનોપ્રિસીસેટ્સમાં કુલ ΔFOSB શોધી કાઢવામાં આવ્યું. નકારાત્મક નિયંત્રણો રૂપે, શેમ્પૂ-સારવારવાળા પ્રાણી અને બિન-મેગ્નેટ આઇજીજીની રોગપ્રતિકારકતા બતાવવામાં આવે છે. B, ઉમેદવાર ફોસ્ફોરિલેશન સાઇટ્સ અને માઇન્સ માટે અનુરૂપ પૂર્વાનુમાન સ્કોર્સ સાથેના કેનાસ ΔFOSB પ્રોટીન અનુક્રમ બાયોઇનફોર્મેટિક વિશ્લેષણ દ્વારા મેળવવામાં આવ્યા હતા. ઉચ્ચ આગાહી સ્કોર્સ સાથેના ઉમેદવાર પ્રોટીન અનુક્રમમાં પ્રકાશિત થાય છે અને કોષ્ટકમાં સૂચિબદ્ધ થાય છે. ડી.એન.એ.-બાઇન્ડિંગ (મૂળભૂત) ડોમેન અને લ્યૂકાઇન ઝીપર પ્રોટીન અનુક્રમમાં બોલ્ડમાં છે. C, D, ΔFOSB ફોસ્ફોરિલેશન સેર / થ્રાસ ફોસ્ફેટઝ ઇન્હિબિટર ઓએ દ્વારા વધારી છે. C, ³²ગેરહાજરી (સી.ટી.આર.) માં લેબલની ફ્રન્ટલ કોર્ટિકલ સ્લાઇસેસથી અથવા ઇયુએનએક્સ એનજી / એમએલ ઓએ (ગ્રાફ અને ટોપ પેનલ) ની હાજરી ઑટોરાડિયોગ્રાફી દ્વારા ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટ્સમાં પી-Δફોસબી સ્તરો શોધી કાઢવામાં આવ્યા હતા. નીચેનું પેનલ બતાવે છે ΔFOSB એ ઇમ્યુનબ્લોટિંગ દ્વારા અનલેબલ્ડ સ્લાઇસેસમાંથી ઇમ્યુનોપ્રિસિપેટીટ્સમાં શોધી કાઢે છે. D, પીસીએક્સએમએક્સએક્સ સેલ્સ એચએસવી-Δફોસબી અથવા એચએસવી-લેકઝ (વેક્ટર) અને ચયાપચયથી લેબલવાળા ચેપગ્રસ્ત હતા. ³²પીએચ₃PO₄ ગેરહાજરીમાં (સીટીઆર) અથવા 100 એનજી / એમએલ ઓએની હાજરી. ³²ઇમ્યુનોપ્રિસીસેટ્સમાં પી-Δફોસબી સ્તરો ઑટોરાડિયોગ્રાફી (ગ્રાફ, ટોચની પેનલ) દ્વારા શોધી કાઢવામાં આવ્યા હતા. નીચેનું પેનલ બતાવે છે કે lFosB એ સેલ લિઝિટ્સમાં ઇમ્યુનોબ્લોટિંગ દ્વારા શોધી કાઢે છે.

ΔFOSB ફોસ્ફોરિલેશનમાં કયા કાઇનેઝ અને સાઇટ (ણો) શામેલ છે તે સ્પષ્ટ કરવા તરફના પ્રથમ પગલા તરીકે, અમે તેના બાયોઇન્ફોર્મેટિક વિશ્લેષણોમાં એમિનો એસિડ અનુક્રમિત કર્યું. આ પરથી જાણવા મળ્યું છે કે, ΔFOSB માં કોઈ ટાયર ફોસ્ફોરિલેશન ઉમેદવાર સાઇટ્સ શામેલ હોવા છતાં, તેમાં કેટલીક સીએમ / થ્રી કિનાઝ સર્વસંમતિ સાઇટ્સ શામેલ છે, જેમાં ત્રણ કેએમકેઆઇઆઈ સાઇટ્સ, ત્રણ CK2 સાઇટ્સ અને બે PKC સાઇટ્સ શામેલ છે જેમાં ખૂબ જ ફોસ્ફોરિલેશન પૂર્વાનુમાન સ્કોર્સ છે (ફિગ 2B). જો બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ દ્વારા આગાહી કરાઈ હોય તો, ΔFOSB એ સીર અથવા થ્રાસ અવશેષો પર માત્ર ફોસ્ફૉરિલેટેડ છે, પછી તેનું ફોસ્ફોરિલેશન સીર / થ્ર ફોસ્ફેટેસની પ્રવૃત્તિ દ્વારા નોંધપાત્ર રીતે મોડ્યુલેટ થવું જોઈએ. આ પૂર્વધારણાને ચકાસવા માટે, અમે આગળના કોર્ટિકલ સ્લાઇસેસને લેબલ કર્યું હતું ³²O-O. ની હાજરી અથવા ગેરહાજરીમાં પી-ઓર્થોફોસ્ફેટ, એક સેર / થ્ર પ્રોટીન ફોસ્ફેટઝ ઇન્હિબિટર. બતાવ્યા મુજબ આકૃતિ 2C, OA એ મોટો (~ xNUMX-fold) વધારો થયો છે ³²પી-Δફોસબી. તે ΔFOSB સ્તરોમાં એક નાનો વધારો પણ કરે છે, જે અગાઉની અહેવાલો સાથે સુસંગત છે, જે OA ના કાર્સિનોજેનિક અસરોને જોડે છે, જે ફોસ પ્રોટિન્સ સહિતના ઘણા તાત્કાલિક પ્રારંભિક જનીનોને પ્રેરિત કરવાની ક્ષમતા ધરાવે છે.મિલર એટ અલ., 1998; ચોઈ એટ અલ., 2004). ફોસ્ફોરીલેટેડ ΔFOSB સ્તરોમાં ચોખ્ખું પરિણામ નોંધપાત્ર એકંદર વધારો (~ xNUMX%) છે.

અમે પછી તપાસ કરી કે, પીસીએક્સએનએક્સએક્સ સેલ્સમાં, જે પ્રાયોગિક મેનીપ્યુલેશન માટે વધુ સક્ષમ છે, ΔFOSB એ મગજમાં જોવા મળતા સમાન ફોસ્ફોરીલેશન પેટર્ન બતાવ્યું. અમે એચએસવી-Δફોસબી સાથે સંક્રમણ દ્વારા પીસીએક્સએનએક્સએક્સ સેલ્સમાં ΔFOSB વ્યક્ત કર્યો અને ચયાપચયથી કોશિકાઓનું લેબલ કર્યું ³²ઓ-ઓ હાજરી અથવા ગેરહાજરીમાં પી-ઓર્થોફોસ્ફેટ. એચએસવી-Δફોસ-ચેપગ્રસ્ત કોશિકાઓમાંથી પ્રોટીનની સફળ અભિવ્યક્તિ અને રોગપ્રતિકારક શક્તિ ઇમ્યુનોબ્લોટ (બંને) માં હાજરી દ્વારા બતાવવામાં આવે છે.ફિગ 2D, તળિયે પેનલ) અને ~ 35 કેડીએ બેન્ડનું ઑટોરોડિઓગ્રાફ (ટોચનું પેનલ), વેક્ટર-ચેપવાળા કોશિકાઓમાં ગેરહાજર છે. જેમ મગજમાં જોવા મળ્યું તેમ, ઓએ કુલ ΔFOSB સ્તરોમાં નાનો વધારો થયો પરંતુ ખૂબ વધારે (લગભગ બેવડો) વધારો થયો ³²પી-Δફોસબી, પરિણામે ΔFOSB ફોસ્ફોરિલેશનમાં નોંધપાત્ર વધારો (~ xNUMX%) થયો. વધુમાં, બાયોઇન્ફોર્મેટિક આગાહી સાથે સુસંગત, ટાયર ફોસ્ફેટાસ ઇન્હિબિટર સાથે પીસીએક્સએનએક્સએક્સ કોશિકાઓની સારવારમાં નોંધપાત્ર ફેરફારો થયા નથી. ³²પી-Δફોસબી સ્તરો (ડેટા બતાવ્યો નથી). એકસાથે, આ તારણો જણાવે છે કે ΔFOSB એ મગજમાં અને પીસીએક્સએનએક્સએક્સ સેલ્સમાં સેર અને / અથવા થ્રાસ અવશેષો પર ફોસ્ફ્રોરિલેટેડ છે અને બાદમાં પુષ્ટિ કરે છે કે તે એક સારા સેલ કલ્ચર સિસ્ટમ છે, જેમાં ફોસ્ફોરીલેશન અને ΔFOSB ની ડિગ્રેડેશન પ્રોફાઇલ્સનો વધુ અભ્યાસ કરવો.

CK2 પરંતુ PKC અથવા કેમેકીઆઇ ફોસ્ફોરીલેટ્સ Δ FOSB નથી ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ

ઉપર વર્ણવ્યા પ્રમાણે, ΔFOSB એમિનો એસિડ અનુક્રમણિકાના વિશ્લેષણથી સીકેક્સ્યુએનએક્સ, પીકેસી અને કેએમકેઆઇઆઈ ફોસ્ફોરિલેશન સાઇટ્સ માટે ઉચ્ચ આગાહી સ્કોર્સ જાહેર થયા. Which ફોસબીબી ફોસ્ફોરીલેટ કરી શકે છે તે નિર્ધારિત કરવા માટે, આમાંના કયા કિનારીઓ નિર્ધારિત કરી શકે છે, અમે શ્રેણીબદ્ધ આયોજિત કર્યું ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ શુદ્ધ કિનારીઓ અને શુધ્ધ રિકોમ્બિનન્ટ ΔFOSB નો ઉપયોગ કરીને ફોસ્ફોરિલેશન પ્રતિક્રિયાઓ. બતાવ્યા મુજબ આકૃતિ 3A, ત્રણ ઉમેદવાર નામાંકિત, માત્ર CK2 ફોસ્ફોરીલેટેડ ΔFOSB નોંધપાત્ર રીતે. આ ઉપરાંત, અન્ય કેટલાક કેનાઇઝનો પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યો હતો (દા.ત., જીએસકેક્સયુએનએક્સ અને પીક્સ્યુએક્સએસએક્સએનએક્સએક્સકે) પરંતુ ફોસફોરીલેટને ΔFosB નોંધપાત્ર રીતે નિષ્ફળ કરવામાં નિષ્ફળ (ડેટા બતાવવામાં આવ્યો નથી). સમય કોર્સ વિશ્લેષણ દ્વારા સીકેક્સએનએક્સએક્સ પ્રતિક્રિયાના વધારાના પાત્રકરણથી જાણવા મળ્યું છે કે આ કિનાઝ ΔFOSB (ફોસ્ફેટ) ની પ્રત્યેક ફોસ્ફેટ દીઠ ~ 3 mol ની રચનાને ઉત્પન્ન કરી શકે છે.ફિગ 3B). હકીકત એ છે કે CK2 ΔFOSB ફોસ્ફૉરિલેટ કરી શકે છે ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ નોંધપાત્ર સ્ટેચિઓમીટ્રી (~ xNUMX%) ને શારીરિક રીતે સંબંધિત પ્રતિક્રિયા સૂચક છે. અમે પછી શુદ્ધ ΔFOSB ની વધતી માત્રામાં સીએક્સએક્સ્યુએનએક્સ ઇનક્યુબેટ કરીને આ પ્રતિક્રિયાના ગતિવિજ્ઞાનનો અભ્યાસ કર્યો, અને અમે નિર્ધારિત કર્યું કે CK50 ફોસ્ફોરીલેટ્સ withFOSB એ V_{મહત્તમ} 5.8 PMOL · મિનિટ^-1 Μg^-1 એન્ઝાઇમ, એ K_M 18.4 μm, અને એ k_{બિલાડી} 0.2 / s (ફિગ 3C). આ ગતિશીલ પરિમાણો માટે મેળવેલ મૂલ્યો આ પ્રતિક્રિયાના શારીરિક સુસંગતતાને વધુ સમર્થન આપે છે. ઉદાહરણ તરીકે, આ K_M DARPP2 માટે CK32, તેના શ્રેષ્ઠ જાણીતા સબસ્ટ્રેટ્સમાંનું એક, 3.4 μm છે, અને k_{બિલાડી} ~ xNUMX / સે છેગિરોલ્ટ એટ અલ., 1989); એ K_M એટીપી રેન્જ માટે ~ xNUMX-10 μm (કોચેટ એટ અલ., 1983; સિલ્વા-નેટો એટ અલ., 2002), અને કેસીન રેંજ માટે ~ xNUMX-10 μm (મેગીયો એટ અલ., 1977; પેરિન એટ અલ., 1987). એકસાથે, આ ડેટા સૂચવે છે કે osFOSB એ CK2 માટે સચોટ સબસ્ટ્રેટ છે ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ.

મોટું સંસ્કરણ જુઓ:

પાવરપોઈન્ટ સ્લાઇડ તરીકે ડાઉનલોડ કરો

આકૃતિ 3.

CK2 પરંતુ PKC અથવા કેમેકીઆઇ ફોસ્ફોરીલેટ્સ Δ FOSB નથી ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ. ઑટોરાડિયોગ્રાફ (ટોચની પેનલ) ફોસ્ફોરીલેટેડ ઉત્પાદન બતાવે છે, અને કુમાસી-સ્ટેઇન્ડ જેલ (તળિયે પેનલ) એ પ્રતિક્રિયામાં કુલ ΔFOSB રજૂ કરે છે. A, શુદ્ધ પુનઃસંયોજક ΔFOSB ને આધીન કરવામાં આવ્યું ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ વિવિધ ઉમેદવાર કેનાસેસ દ્વારા ફોસ્ફોરિલેશન (જેમાંથી ત્રણ બતાવવામાં આવે છે). B, ટાઇમ કોર્સ અને સ્ટિઓઇકોમેટ્રિક વિશ્લેષણો સૂચવે છે કે CK2 ફોસ્ફોરીલેટ કરી શકે છે ΔFOSB ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ ~ xNUMX% ની સ્ટોચીકોમેટ્રી સાથે. C, સીકેક્સએક્સએક્સએક્સ પ્રતિક્રિયાના કાઇનેટિક વિશ્લેષણથી જાણવા મળ્યું છે કે ΔFOSB એ એકદમ યોગ્ય છે ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ સબસ્ટ્રેટ. પ્રતિક્રિયાના રેખાકરણને ડબલ-પારસ્પરિક પ્લોટ (તળિયે) માં બતાવવામાં આવે છે, પરંતુ ગતિવિષયક પરિમાણો માઇકલિસ-મેન્ટેન કર્વ (ટોચ) માંથી મેળવવામાં આવ્યા હતા.

CK2 એ અચોક્કસ કોશિકાઓમાં ΔFosB ના ફોસ્ફોરિલેશન અને સ્થિરતાને સુધારે છે

ΔFOSB ના CK2-mediated ફોસ્ફોરિલેશનની શારીરિક સુસંગતતાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે, અમે તુલનાત્મક ફોસ્ફોપ્પ્ડાઇડ મેપિંગનો ઉપયોગ કરીને ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ ફોસ્ફોરીલેટેડ અને પીસીએક્સ્યુએનએક્સ-સેલ-ફોસ્ફોરીલેટેડ ΔFOSB. એસડીએસ-PAGE અને જેલની જાહેરાત પછી ³²પી-Δફોસબી (માંથી ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ પ્રતિક્રિયાઓ અથવા immunoprecipitate ના ³²પી-લેબલવાળા કોશિકાઓ), પ્રોટીનને ટ્રાયપસિનથી પાચન કરવામાં આવ્યું હતું, અને પરિણામે ફોસ્ફોપ્પ્ડાઇડ્સ બે-પરિમાણીય વિભાજનને આધિન હતા. આ વિશ્લેષણથી જાણવા મળ્યું છે કે સીકેક્સ્યુએનએક્સએક્સ પ્રતિક્રિયામાંથી મુખ્ય ફોસ્ફોપ્પેટાઇડ પીસીએક્સએનએક્સએક્સ કોષોમાં ΔFOSB ફોસ્ફોરિલેટેડમાંથી બે મુખ્ય ફોસ્ફોપ્પ્ટીડ્સમાંથી એક સાથે જોડાયો છે (ફિગ 4A), જ્યારે પી.કે.સી. અથવા કેએમકેઆઇઆઇ (ડેટા બતાવવામાં આવ્યો નથી) ના પરિણામે થતા ફોસ્ફોપ્પાઇડ્સની પ્રતિક્રિયા ન હતી. પીસીએક્સએનએક્સએક્સ સેલ્સમાંથી નકશામાં બીજો Δ ફોસબી ફોસ્ફોપ્પ્ટાઇડ હાજર હતો, પરંતુ કોઇ પણ કેનાસની અક્ષમતાને કારણે અમે એક સમાન ફોસ્ફોપ્પાઇડ પેદા કરવા માટે પરીક્ષણ કર્યું છે. ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ, અમે હાલમાં જાણતા નથી કે આ બીજા ફોસ્ફોપ્પ્ડાઇડમાં ફોસ્ફોરેપ્ટેશન સાઇટ અન્ય ફોસ્ફોપ્પ્ડાઇડથી અલગ છે કે કેમ કે તે એક અલગ ટ્રિપ્ટિક પેપ્ટાઇડનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે કે જે સમાન ફોસ્ફોરિલેશન સાઇટ ધરાવે છે.

મોટું સંસ્કરણ જુઓ:

પાવરપોઈન્ટ સ્લાઇડ તરીકે ડાઉનલોડ કરો

આકૃતિ 4.

CK2 એ અચોક્કસ કોશિકાઓમાં ΔFosB ના ફોસ્ફોરિલેશન અને સ્થિરતાને સુધારે છે. A, સીકેક્સ્યુએક્સએક્સ પરંતુ પીકેસી કોશિકાઓમાં osFosB ફોસ્ફૉરિલેટને લાગે છે. KFOSB ફોસ્ફોરિઅલેટેડ દ્વિ-પરિમાણીય ફોસ્ફોપ્પ્ડાઇડ નકશા સીકેક્સ્યુએક્સએક્સ અથવા પીકેસી દ્વારા ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ અથવા અખંડ PC12 કોષો દ્વારા. તીર સીકેક્સ્યુએક્સએક્સ-ફોસ્ફોરીલેટેડ પેપ્ટાઇડનું સ્થળાંતર દર્શાવે છે પરંતુ પી.સી.એક્સ.એમ.એક્સએક્સ કોષોમાંથી પ્રાપ્ત ΔFOSB ફોસ્ફોપ્પ્ટીડ્સમાંની એક સાથે પીકેસી-ફોસ્ફોરીલેટેડ એક નહીં. B, પીસીએક્સએનએક્સએક્સ સેલ્સમાં ફોસબી ફોસ્ફોરેલેશન એ શક્તિશાળી CK12 એક્ટિવેટર શુક્રાણુ (એસપી) સાથે કોશિકાઓના ઉપચાર દ્વારા વધારો થયો છે અને CK2 ઇન્હિબીટર ડીઆરબી સાથે સારવાર દ્વારા ઘટાડો થયો છે. તેનાથી વિપરીત, પીસીએક્સએનએક્સએક્સ સેલ્સમાં ફોસફોર્નેશન પી.કે.સી. એક્ટિવેટર (પીએમએ) અથવા પીકેસી-વિશિષ્ટ અવરોધક કેલ્ફોસ્ટિન-સી (કેલ્ફ) સાથે સારવારથી અસર કરતું નથી. પ્રતિનિધિ ઑટોરાડિયોગ્રામ (ટોચની પેનલ) અને ઇમ્યુનોબ્લોટ (તળિયે પેનલ) બતાવવામાં આવે છે. સી-એફ, ΔFOSB સ્થિરતા પર CK2 પ્રવૃત્તિનો પ્રભાવ. આ આંકડાઓ ΔFOSB ની અધોગતિના સમયક્રમ (અને પ્રતિનિધિ ઑટોરાડિયોગ્રામ) દર્શાવે છે. પીસીએક્સએનએક્સએક્સ કોષો સંક્રમિત રીતે ΔFOSB ને વ્યક્ત કરે છે તે અભાવે અથવા CK12 અવરોધક ડીઆરબીની હાજરીમાં પલ્સ-ચેઝ પ્રયોગો કરવામાં આવતી હતી.C), સીકેક્સ્યુએનએક્સ એક્ટિવેટર શુક્રાણુ (D), અથવા બ્રોડ-સ્પેક્ટ્રમ કિનેઝ ઇન્હિબિટર એચ-એક્સએનટીએક્સ (E), જેનો ઉપયોગ DRB ના અસ્પષ્ટ પ્રભાવો માટે નિયંત્રિત કરવા માટે થયો હતો. F, ΔFOSB સ્થિરતા પર CK2 ના ઉત્પ્રેરક સબ્યુનિટને નકારી કાઢવાનો પ્રભાવ. પીસીએક્સએનએક્સએક્સ (CX12) કોષો ક્યાં તો નોન-લક્ષ્યાંકિત સીઆરઆરએનએ (સીટીઆર) અથવા સીઆરઆરએનએ લક્ષ્યાંકિત ઉંદર CK2α અને 24 એચ સાથે સંક્રમિત થયા હતા પછીથી ΔFosB પ્લાઝ્મિડ સાથે સંક્રમિત થયા. ટોચની પેનલ સંપૂર્ણ-કોષીય લૈસેટ્સના ઇમ્યુનોબ્લોટ્સ દર્શાવે છે જે CK2 અને RFB પ્રોટીન સ્તરો પર CK2 siRNA ની અસર દર્શાવે છે. Β-tubulin માટે સંબંધિત ઇમ્યુનોબ્લોટ લોડિંગ કંટ્રોલ તરીકે બતાવવામાં આવે છે.

K ફોસ્બ કેનાઝ તરીકે સીકેક્સ્યુએક્સ (CK2) ના શારીરિક સુસંગતતાને આગળ વધારવા માટે, અમે drugsફોસબી-એક્સપ્રેસિંગ પીસીએક્સ્યુએનએક્સ સેલ્સને બે દવાઓ સાથે વ્યક્ત કરતા હતા જે CK12 પ્રવૃત્તિને મોડ્યુલેટ કરે છે. બતાવ્યા મુજબ આકૃતિ 4B,-ફોસબી ફોસ્ફોરિલેશન એ પીસીએક્સએનએક્સએક્સ સેલ્સની સારવાર દ્વારા સેલ-પેર્મેબલ CK12 ઇન્હિબીટર ડીઆરબી (DB)મેગીયો એટ અલ., 1990; ઝેઝિસ્કા એટ અલ., 1995), અને પોલિમાઈન શુક્રાણુ સાથે સારવાર દ્વારા વધારો થયો છે, જે એક શક્તિશાળી CK2 સક્રિયકર્તા તરીકે ઓળખાય છે (કોચેટ અને ચેમ્બઝ, 1983; મેગીયો એટ અલ., 1983). તેનાથી વિપરીત, પીકેસીએનએક્સએક્સ સેલ્સની સારવાર પીકેસી ઇનહિબિટર કેલ્ફોસ્ટિન-સી (કોબાયશી એટ અલ., 1989; તામાકી એટ અલ., 1990) અથવા પીકેસી એક્ટિવરેટર પીએમએ (શ્મિટ અને હેકર, 1975; બેહ એટ અલ., 1989) ΔFOSB ફોસ્ફોરિલેશનમાં નોંધપાત્ર ફેરફારો ન થયા. પીએમએના કિસ્સામાં, સહેજ (અને નોંધપાત્ર નહીં) વધારો ³²પી-Δફોસબી આ ડ્રગને કારણે કુલ ΔFOSB સ્તરોમાં વધારો કરીને જવાબદાર હોઈ શકે છે; હકીકતમાં, એવું નોંધાયું છે કે ફોર્બોલ એસ્ટર ઘણા ફોસ કુટુંબ પ્રોટીનની અભિવ્યક્ત કરે છે, જેમાં ફોસબી (યોઝા એટ અલ., 1992; સુહ એટ અલ., 2004). વધુમાં, ચોક્કસ કોષ-પ્રસારપાત્ર કેએમકેઆઇઆઇ ઇન્હિબિટર એમ-એઆઈપી (C-A)ઇશિડા અને ફુજીસાવા, 1995; સ્ટીવન્સ એટ અલ., 1999) પણ Δફોસબી ફોસ્ફોરિલેશન (ડેટા બતાવવામાં આવ્યો નથી) માં ઘટાડો થયો નથી. સાથે મળીને, આ પરિણામો અમારી સાથે સુસંગત છે ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ તારણો અને સંકેત આપે છે કે અખંડ કોશિકાઓમાં ΔFOSB સંભવિત રૂપે CK2 દ્વારા ફોસ્ફોરિલેટેડ છે પરંતુ PKC અથવા CaMKII નથી. હકીકત એ છે કે CK2 અવરોધ સંપૂર્ણપણે prevent FosB ફોસ્ફોરિલેશનને અટકાવતું નથી પ્રોટીનની વધારાની ફોસ્ફોરિલેશન સાઇટ્સના અસ્તિત્વને સૂચવે છે.

અમે પછીથી તપાસ કરી હતી કે CK2 ΔFOSB ના ટર્નઓવરમાં ભૂમિકા ભજવે છે અને તેની સ્થાયીતામાં. આ અંતમાં, અમે pul ફોસ્બ-એક્સેસિંગ પીસીએક્સએનએક્સક્સ કોષોનો ઉપયોગ કરીને પલ્સ-ચેઝ પ્રયોગો હાથ ધર્યા હતા જેમાં CK12 ઇન્હિબિટર અથવા ફોસ્ફોરીલેશન અભ્યાસમાં ઉપયોગમાં લેવાતા CK2 એક્ટિવેટર સાથે સારવાર કરવામાં આવ્યાં હતાં. બતાવ્યા મુજબ આકૃતિ 4C, સીકેબીએનટીએક્સએક્સ ઇન્હિબિટર ડીઆરબી સાથેના કોશિકાઓની સારવાર, ΔFosB ના ટર્નઓવર રેટ પર નોંધપાત્ર અસર પડી હતી, તેના ડિગ્રેડેશન વળાંકના આકારમાં ફેરફાર દ્વારા પુરાવા છે, બિફાસિકથી એક વળાંક છે જે ઘાતાંકીય ક્ષતિની નજીક છે. તેનાથી વિપરીત, સીકેક્સ્યુએનએક્સ એક્ટિવેટર શુક્રાણુઓની હાજરીએ ΔFOSB ના અધોગતિ દરમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો કર્યો હતો, જે પીછોના પહેલા કલાકો દરમિયાન પ્રોટીનનું સંચય થયો હતો (ફિગ 4D).

ઘણા કેનાઝ એક્ટિવેટર્સ અને ઇન્હિબિટર સાથે કેસ છે તેમ, શુક્રાણુ અને ડીઆરબી સીકેક્સ્યુએક્સએક્સ પ્રવૃત્તિના મોડ્યુલેશનની બહાર મેટાબોલિક અસરો કરી શકે છે. હકીકતમાં, ડીઆરબી ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પરિબળ IIH (TFIIH) - સંયુક્ત કાઇનેઝને અટકાવવા માટે બતાવવામાં આવ્યું છે (યાન્ંકુલવ એટ અલ., 1995), જે આરએનએ પોલીમિરેઝ II-mediated ટ્રાન્સક્રિપ્શનને અવરોધમાં પરિણમે છે. કારણ કે આ અસર સંભવતઃ ΔFOSB ની સ્થિરતાને પ્રભાવિત કરી શકે છે, અમે બ્રોડ સ્પેક્ટ્રમ કિનેઝ ઇન્હિબિટર એચ-એક્સએનટીએક્સ (X-8) ના પ્રભાવનું વિશ્લેષણ કર્યું છે.હિદકા અને કોબાયશી, 1992) Tફોસબી ટર્નઓવર પર એકાગ્રતા (200 μm) પર TFIIH- સંકળાયેલ કિનેઝને રોકવા માટે જાણીતું છે પરંતુ CK2 (યાન્ંકુલવ એટ અલ., 1995). બતાવ્યા મુજબ આકૃતિ 4Eએચ-એક્સ્યુએનએક્સએક્સ સાથેની સારવાર ΔFOSB ના ટર્નઓવર રેટને અસર કરતી નથી. સમાન પરિણામો એચ-એક્સ્યુએનએક્સએક્સ (X-8), અન્ય બ્રોડ સ્પેક્ટ્રમ કાઇનેઝ ઇન્હિબિટર સાથે મેળવવામાં આવ્યા હતા, જે TFCIH- સંકળાયેલ કિનાઝને અટકાવે છે પરંતુ CK7 (ડેટા બતાવવામાં આવ્યો નથી) ને અવરોધિત કરે છે. આ ડેટા વધુ અર્થઘટનને સમર્થન આપે છે કે ડીઆરબી દ્વારા થતી ΔFOSB સ્થિરતામાં ઘટાડો એ CK2 ના અવરોધને આભારી છે.

ΔFOSB ટર્નઓવરમાં CK2 ની ભૂમિકાને વધુ પ્રસ્થાપિત કરવા માટે, અમે સીઆરઆરએનએ દ્વારા સીકેક્સએનએક્સએક્સને નકારી કાઢવાના પરિણામોની તપાસ કરી. અમે પીસીએક્સએનએક્સએક્સ કોષોનો ઉપયોગ કરીને આ પ્રયોગો કર્યા હતા, જે પ્રથમ નિયંત્રણ (નોનટેક્લિંગ) સીઆરઆરએનએ અથવા સીઆરઆરએનએ સાથે સંક્રમિત હતા જે ઉંદર CK2 (CK12α) અને 2 h ના ઉત્પ્રેરક સબ્યુનિટના એમઆરએનએ લક્ષ્યાંકિત કરે છે અને બાદમાં ΔFosB સાથે સંક્રમિત થાય છે. બતાવ્યા મુજબ આકૃતિ 4F, CK2α siRNA સાથે સંક્રમણક્ષમતા lyFOSB સ્તર (ટોચની પેનલ) ને અસર કર્યા વિના અસરકારક રીતે અને ખાસ કરીને CK2α પ્રોટીન સ્તરોને નીચે ફેંકી દે છે. પલ્સ-ચેઝ વિશ્લેષણથી જાણવા મળ્યું છે કે સીકેએક્સ્યુએનએક્સએક્સને નકારીને પરિણામે ΔFOSB ટર્નઓવર રેટમાં નોંધપાત્ર વધારો થયો છે જે પ્રોટીનના ઝડપી ઘટાડાથી પુરાવા આપે છે. CK2 પ્રવૃત્તિને અવરોધિત કરતી હકીકત (ડીઆરબી સારવાર અથવા સીઆરએનએ દ્વારા) ΔFOSB ના ટર્નઓવરને વધારે છે અને બાઇફાસિક વળાંકના ધીમી-દર ઘટકને ગુમ કરવામાં પરિણમે છે, જ્યારે CK2 સક્રિયકરણ વક્રના ધીમા તબક્કામાં વધારો કરે છે, તે માટે મજબૂત સમર્થન પૂરું પાડે છે ΔFOSB સ્થિરતા નિયમનમાં CK2 ભૂમિકા ભજવે છે તેવો વિચાર.

CX2 ફોસ્ફોરીલેટ્સ ΔFOSB ને Ser27 પર

CK2 દ્વારા ΔFOSB ફોસ્ફોરિલેટેડ સાઇટ પરની સાઇટ્સ (ઓળખાણ) ઓળખવાની શરૂઆત કરવા માટે, અમે ફોસ્ફો-એમિનો એસિડ વિશ્લેષણ હાથ ધરીને comFOSB ફોસ્ફોરિલેટેડ દ્વારા સીકેક્સ્યુએક્સએક્સ ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ અને પીસીએક્સએનએક્સએક્સ સેલ્સમાં ફોસફોરીલેટેડ ફોસબી. આ પ્રયોગો પરથી જાણવા મળ્યું છે કે, બંને કિસ્સાઓમાં, એકમાત્ર ફોસ્ફો-એમિનો એસિડ મળી આવ્યો હતો જે ફોસ્ફો-સેર હતો (ફિગ 5A). CK2 માટે પ્રાપ્ત થતી સ્ટિઓઇકોમેટ્રી સાથે મળીને આ શોધ ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ ફોસ્ફોરિલેશન પ્રતિક્રિયા (~ એક્સયુએનએક્સ%) (ફિગ 3B) અને સીકેક્સ્યુએનએક્સ ફોસ્ફોપ્પ્ડાઇડ નકશા પર માત્ર એક નોંધપાત્ર સ્થળની હાજરી (ફિગ 4A), સૂચવે છે કે ΔFOSB ના CK2 ફોસ્ફોરિલેશન સંભવતઃ એક સીરિન અવશેષ સુધી મર્યાદિત છે. આ નિષ્કર્ષ ફોસ્ફોરેલેશન સર્વસંમતિ સાઇટ વિશ્લેષણ (એક વિશ્લેષણ) સાથે સુસંગત છે.ફિગ 2B), કે જે સીકેક્સ્યુએક્સએક્સ માટે માત્ર એક ઉમેદવાર સેરેન, એટલે કે, સેરેક્સ્યુએક્સ, આગાહી કરી. ટેક્સનોમિક એનાલિસિસ દ્વારા જાહેર કરવામાં આવ્યું છે કે ફૉસ પરિવારના સભ્યો વચ્ચે ઉત્ક્રાંતિ દ્વારા Ser27 ખૂબ સંરક્ષિત છે (ફિગ 5B) સૂચવે છે કે તે એક મહત્વપૂર્ણ શારીરિક કાર્ય લાવી શકે છે.

મોટું સંસ્કરણ જુઓ:

પાવરપોઈન્ટ સ્લાઇડ તરીકે ડાઉનલોડ કરો

આકૃતિ 5.

CX2 ફોસ્ફોરીલેટ્સ ΔFOSB Ser27 પર. A, સીએક્સએક્સ્યુએનએક્સ-ફોસ્ફોરીલેટેડ (ફોસ્ફોમેલીનો એસિડ વિશ્લેષણ)ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ) અને પીસીએક્સ્યુએનએક્સ સેલ-ફોસ્ફોરીલેટેડ Δફોસબી દર્શાવે છે કે, બંને કિસ્સાઓમાં, મુખ્ય અવશેષો ફોસ્ફોરિલેટેડ એ સેરેન છે. B, ફોસબી / Δફોસબી એમિનો એસિડ અનુક્રમણિકાના ક્રોસ-પ્રજાતિના પૃથ્થકરણથી ફોસના પરિવારના સભ્યોમાં ઝેબ્રાફિશ (ડાર્ક હાઇલાઇટ) માંથી સેરેક્સ્યુએક્સનું ઉચ્ચ સંરક્ષણ જાહેર થયું. જો કે, પોઝિશન + + 27 પર એસિડિક અવશેષ, કે જે CK3 સર્વસંમતિ સાઇટ માટે જરૂરી છે, તે સંરક્ષિત (પ્રકાશ હાઇલાઇટ) નથી. C, હીલા કોષો સ્થાયી રૂપે જંગલી-પ્રકાર ΔFOSB (WT) અથવા ΔFOSB સાથે સંક્રમિત થયા હતા જેમાં એલા (S27A) સાથે સેરેક્સ્યુએક્સને સ્થાનાંતરિત કરવા માટે બિંદુ પરિવર્તન શામેલ છે. કોષો ચયાપચયથી લેબલ થયેલ છે ³²પીએચ₃PO₄ અને CK2 ને સક્રિય કરવા વાહન અથવા સ્પર્મિન (એસપી) સાથે સારવાર કરી. પ્રાપ્ત ΔFOSB ઇમ્યુનોપ્રિસીસેટ્સના પ્રતિનિધિ ઑટોરાડિયોગ્રામ (ટોચની પેનલ) અને ઇમ્યુનોબ્લોટ (તળિયે પેનલ) બતાવવામાં આવે છે. મૉક-ટ્રાન્સફેક્ટેડ કોષો (વેક્ટર) ની રોગપ્રતિકારકતા બતાવવામાં આવે છે.

ΔFOSB માં Ser27 ફોસ્ફોરિલેટેડ છે કે નહીં તે નિર્ધારિત કરવા માટે, અમે આ અવશેષને એલામાં પરિવર્તિત કર્યો છે, અને પ્રોટીનની ફોસ્ફોરિલેશન સ્થિતિ પરના પરિણામોનું વિશ્લેષણ કર્યું છે. આ અંતમાં, અમે ડબલ્યુટી અથવા એસએક્સ્યુએનએક્સએક્સ મ્યુટન્ટ ΔFOSB વ્યક્ત કરવા માટે હેલા સેલ્સ (જે ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતા સાથે સંક્રમિત થઈ શકે છે) નો ઉપયોગ કરવા માટે કર્યો હતો. સંક્રમણ પછી આશરે 27 એચ, કોશિકાઓ ચયાપચયની સાથે લેબલ કરવામાં આવી હતી ³²પી-ઓર્થોફોસ્ફેટ, અને સંપૂર્ણ-કોષના લોસેટ તૈયાર કરવામાં આવ્યા હતા. ઇમ્યુનોપેરેઇઅર અને એસડીએસ-પૃષ્ઠ પછી, ³²પી-Δફોસબી ઓટોરોડિયાગ્રાફી અને ઇમ્યુનોબ્લોટિંગ દ્વારા કુલ ΔFOSB દ્વારા શોધી કાઢવામાં આવ્યું હતું. બતાવ્યા મુજબ આકૃતિ 5C (તળિયે પેનલ), Δ FosB વેક્ટર-ટ્રાંસફેક્ટેડ કોશિકાઓમાં શોધી કાઢવામાં આવ્યું ન હતું, જ્યારે ડબલ્યુટી અથવા એસએક્સ્યુએનએક્સએ મ્યુટન્ટ સાથે સંક્રમિત કોષો ΔFosB સફળતાપૂર્વક પ્રોટીન વ્યક્ત કરે છે. અમે જોયું કે S27A પરિવર્તનમાં નોંધપાત્ર (~ xNUMX%) ઘટાડો થયો છે ³²પી-Δફોસબી સ્તરો (ફિગ 5C, ટોચની પેનલ અને ગ્રાફ), સૂચવે છે કે જીવંત કોશિકાઓમાં, ΔFOSB એ સેરએક્સએનએક્સએક્સ પર ફોસ્ફોરિલેટેડ છે. CK27 દ્વારા કોષો SerxNUMX ખરેખર ફોસ્ફોરિલેટેડ છે કે નહીં તે સ્થાપિત કરવાના પ્રયાસમાં, અમે સીટીએક્સટીએક્સએક્સ એક્ટિવેટર શુક્રાણુઓની WT અને S27A ΔFOSB ના ફોસ્ફોરેલેશનને મોડ્યુલેટ કરવા માટે ક્ષમતાની તુલના કરી હતી. જેમ આપણે અગાઉ પીસીએક્સએનએક્સએક્સ સેલ્સમાં જોયું હતું (ફિગ 4B), શુક્રાણુઓ સાથે હીલા કોશિકાઓની સારવારમાં ડબલ્યુટી પ્રોટીનની ફોસ્ફોરેલેશનમાં નોંધપાત્ર વધારો થયો છે. આ અસર S27A પરિવર્તન દ્વારા નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડો થયો હતો તે હકીકત (ફિગ 5C) અર્થઘટનને સપોર્ટ કરે છે કે ΔFOSB માં Ser27 એ CK2 માટે શારીરિક સબસ્ટ્રેટ છે.

Ser27 ના ફોસ્ફોરેલેશન ΔFOSB ની સ્થિરતાને નિયંત્રિત કરે છે

CK2 સક્રિય થાય ત્યારે અને CK2 સક્રિય થાય ત્યારે KFOSB ની સ્થિરતા ઘટતી જાય છે તેની ખાતરી કર્યા પછી (ફિગ 4), અને તે સીકેક્સ્યુએનએક્સ ફોસ્ફોરીલેટ્સ ΔFOSB પર Ser2 (ફિગ 5), અમે આગાહી કરી હતી કે આ સાઇટના ફોસ્ફોરેલેશનને અટકાવવાથી પ્રોટીનને અસ્થિર બનાવવું જોઈએ. હેલ્લા કોશિકાઓ સાથે સંકળાયેલી પલ્સ-ચેઝ પ્રયોગો ડબલ્યુટી અથવા એસએક્સ્યુએનએક્સએક્સ મ્યુટન્ટ expressફોસબીને વ્યક્ત કરતી વખતે સંકળાયેલો હોવાનું જાહેર કરવામાં આવ્યું છે, આગાહી મુજબ, એસએક્સ્યુએનએક્સએક્સએ પરિવર્તન એ ΔFosB ની અધોગતિના દરમાં નોંધપાત્ર વધારો થયો છે, અને પ્રોટીનના અર્ધ જીવનમાં સહજ ઘટાડો (ફિગ 6A). અમે પછી તપાસ કરી હતી કે આ નિયમનકારી મિકેનિઝમ વધુ ન્યુરોન-જેવી પીસીએક્સએનએક્સએક્સ સેલ લાઇનમાં થાય છે. આ પ્રયોગો જણાવે છે કે, જેમ કે આપણે હીલા કોશિકાઓમાં અવલોકન કર્યું હતું, S12A બિંદુ પરિવર્તન એ PC27 કોશિકાઓમાં ΔFOSB ના અડધા જીવનમાં નાટકીય ઘટાડાનું કારણ બને છે (~ xNUMX થી ~12 h સુધી) (ફિગ 6B). હકીકત એ છે કે આ અસ્થિરતા સમાન છે જે CK2 ઇન્હિબિશન અથવા નોક-ડાઉન (ફિગ 4) આ વિચાર માટે વધુ સમર્થન પૂરું પાડે છે કે CX2-mediated SeroxNUMX નું ફોસ્ફોરિલેશન ΔFOSB ની સ્થિરતાને નિયંત્રિત કરે છે. ΔFOSB પ્રોટીન ટર્નઓવર પર સેરેક્સ્યુએક્સ ફોસ્ફોરિલેશનની નિયમનકારી ભૂમિકા માટે વધારાના પુરાવા એએસપી મ્યુટેશન (એસએક્સ્યુએનએક્સડીડી) માં ફોસ્ફોમિમેટિક સેરએક્સએનએક્સક્સનો ઉપયોગ કરીને મેળવવામાં આવ્યા હતા. S27D પરિવર્તન ફોસ્ફોમિમેટિક માનવામાં આવે છે, કારણ કે તે એમિનો એસિડ 27 પર મોટા નકારાત્મક ચાર્જ (કાર્બોક્સાઇલ) જૂથને મૂકે છે અને તેથી આંશિક રીતે સેરેક્સ્યુએક્સના ફોસ્ફોરિલેશનની નકલ કરે છે. બતાવ્યા મુજબ આકૃતિ 6C, એસએક્સઇએનએક્સએક્સડી પરિવર્તનએ S27A પરિવર્તનની વિપરીત અસરને પરિણમી હતી અને પરિણામે પ્રોટીનમાં ડબલ્યુટી પ્રોટીન કરતાં વધુ સ્થિર હતું. એ જ રીતે સીકેક્સએક્સએક્સએક્સ સક્રિયકરણ પછી પ્રાપ્ત અસર (ફિગ 4D), એસએક્સઇએનએક્સએક્સડી પરિવર્તનનું પરિણામ સંચયમાં પરિણમ્યું અને આમ ચેઝના પહેલા કલાકો દરમિયાન ΔFOSB સ્તરમાં વધારો થયો.

મોટું સંસ્કરણ જુઓ:

પાવરપોઈન્ટ સ્લાઇડ તરીકે ડાઉનલોડ કરો

આકૃતિ 6.

Ser27 ના ફોસ્ફોરેલેશન ΔFOSB ની સ્થિરતાને નિયંત્રિત કરે છે. A, C, પલ્સ-ચેઝ વિશ્લેષણ ΔFOSB ના ટર્નઓવર રેટ પર સેરેક્સ્યુએક્સ ફોસ્ફોરિલેશનની અસર દર્શાવે છે. ડિગ્રેડેશન પ્રોફાઇલ અને જંગલી-પ્રકાર ΔFOSB (ડબલ્યુટી) ના અંદાજિત અડધા જીવન, સેરેક્સ્યુએક્સએક્સ એલા મ્યુટન્ટ (એસએક્સ્યુએનએક્સએક્સએ), અને ફોસ્ફોમિમેટેટિક સેરએક્સએનએક્સએક્સ એએસપી મ્યુટન્ટ (એસએક્સ્યુએનએક્સડીડી) બતાવવામાં આવે છે. હીલા કોશિકાઓમાં સમાન તારણો મેળવવામાં આવ્યા હતા (A) અને પીસીએક્સયુએનએક્સ સેલ્સ (B, C).

સેરએક્સ્યુએનએક્સ ફોસ્ફોરિલેશન એ પ્રોટોસોમલ ડિગ્રેડેશનને અટકાવીને ΔFosB સ્થિર કરે છે.

સીક્સએક્સએનએક્સના ફોસ્ફોરિલેશન ΔFOSB ને સ્થિર કરે છે તે મિકેનિઝમની સ્પષ્ટતા શરૂ કરવા માટે, અમે પ્રોટિસોમ ઇન્હિબિટર MG27 ની ક્ષમતાની તપાસ કરી હતી (પાલેમ્બેલા એટ અલ., 1994; ત્સુબકી એટ અલ., 1996) અને ઇપોક્સોમિસિન (હનાદા એટ અલ., 1992; કિમ એટ અલ., 1999) ડબલ્યુટી અને એસએક્સ્યુએનએક્સએ મ્યુટન્ટ ΔFOSB ની ડિગ્રેડેશન દરને સુધારવા માટે. પલ્સ-ચેઝ પ્રયોગો પીસીએક્સટીએક્સએક્સ કોશિકાઓનો ઉપયોગ કરીને એક ડબલ્યુટી અથવા એસએક્સ્યુએનએક્સએક્સએ ΔFOSB વ્યક્ત કરતા ફરીથી સંયોજક એચએસવીથી ચેપગ્રસ્ત અને ડી.એમ.એસ.ઓ. અથવા બે પ્રોટીઝોમ ઇન્હિબિટર પૈકીના એક સાથે ચેપ લાગ્યો હતો. આ પ્રયોગો પરથી જાણવા મળ્યું છે કે ડબલ્યુટી પ્રોટીનનું ડિગ્રેડેશન રેટ બે પ્રોટીઝોમ ઇન્હિબિટર્સમાંની હાજરી માટે પ્રમાણમાં અસ્વસ્થ છે.ફિગ 7A), એસએક્સ્યુએનએક્સએક્સએ મ્યુટન્ટની આ દવાઓ પ્રત્યે સંવેદનશીલ છે (ફિગ 7B). આ સૂચવે છે કે, ડબલ્યુટી પ્રોટીનથી વિપરીત, એસએક્સએનટીએક્સએક્સ મ્યુટન્ટ પ્રોટોસોમલ ડિગ્રેડેશનનો લક્ષ્યાંક છે. ખરેખર, એમજીએક્સયુએનએક્સ અથવા ઇપોક્સમિસિન સાથેની કોશિકાઓની સારવાર એ ΔFosB ના ઘટાડા દર પર S27A પરિવર્તનની અસરને સંપૂર્ણપણે રદ કરે છે, એમએક્સએક્સટીએક્સ માટે ~ એક્સએનટીએક્સએક્સથી ~ એક્સયુએનએક્સએક્સ સુધીના સીએક્સએનએક્સએક્સએ મ્યુટન્ટના અર્ધ જીવનમાં વધારો અને ~ ઇપોક્સોમિસિન માટે 132 એચફિગ 7B). એકસાથે, આ તારણો સૂચવે છે કે સેરોક્સ્યુએક્સ પર ΔFOSB નું ફોસ્ફોરેલેશન પ્રોટીસોમલ ડિગ્રેડેશનથી પ્રોટીનનું રક્ષણ કરે છે અને તેથી તેની અસામાન્ય સ્થિરતા માટે આવશ્યક છે.

મોટું સંસ્કરણ જુઓ:

પાવરપોઈન્ટ સ્લાઇડ તરીકે ડાઉનલોડ કરો

આકૃતિ 7.

સેરોક્સ્યુએક્સનું ફોસ્ફોરેલેશન તેના પ્રોટોસોમલ ડિગ્રેડેશનને અટકાવીને ΔFOSB સ્થાયી કરે છે. A, B, એચએસવી ચેપવાળા પીસીએક્સએનએક્સએક્સ સેલ્સ સાથે પલ્સ-ચેઝ એનાલિસિસ ડિગ્રેડેશન પ્રોફાઇલ અને જંગલી-પ્રકારનાં અંદાજિત અર્ધ-જીવન દર્શાવે છે ΔFOSB (A) અથવા S27A ΔFOSB (B) ગેરહાજરી અથવા બે પ્રોટીઝોમ ઇનહિબિટરની હાજરી [એમજીએક્સ્યુએનએક્સ અને એપૉક્સોમિસિન (એપૉક્સો)]. હકીકત એ છે કે જંગલી-પ્રકાર ΔFOSB ના ટર્નઓવર પર ડ્રગની કોઈ અસરકારક અસર નથી, જ્યારે પ્રોટીસૉમ ઇનહિબિટરવાળા કોશિકાઓની સારવારથી S132A ΔFosB ની સ્થિરતા પરિણમી. C, લાંબા ગાળાની મગજ પ્લાસ્ટિકિટી મધ્યસ્થી કરવા માટે ΔFosB ની ક્ષમતામાં સેરેક્સ્યુએક્સ ફોસ્ફોરિલેશનની ભૂમિકા માટે એક મોડેલ. એકવાર પ્રેરિત થઈ ગયા પછી, SFNUMX ના CK27-mediated ફોસ્ફોરિલેશન દ્વારા મગજમાં ΔFOSB એક ભાગ સ્થાયી કરવામાં આવે છે. આના પરિણામે તેના સંગ્રહમાં પરિણમે છે, જે પરિણામે જીન અભિવ્યક્તિમાં લાંબા સમય સુધી ચાલતા ફેરફારોમાં પરિણમે છે. જનીન અભિવ્યક્તિમાં આ સ્થિર ફેરફારો સ્થિર વર્તણૂકલક્ષી અનુકૂલનમાં ફાળો આપે છે. તેનાથી વિપરીત, સેર / થ્ર ફોસ્ફેટેસ દ્વારા એસએક્સ્યુએનએક્સએક્સનું ડિફોસ્ફોરેલેશન PP2 અને / અથવા PP27A પ્રોટીનને અસંતુલિત કરવામાં અને પ્રોટિસોમલ મશીનરી દ્વારા તેની પ્રક્રિયામાં પરિણમે છે.

અગાઉના વિભાગ આગામી વિભાગ

ચર્ચા

હાલના અભ્યાસમાં, અમે બતાવ્યું છે કે osFOSB પાસે સેલ સંસ્કૃતિમાં ~ 10 એચ નું અર્ધ જીવન છે, જે સંપૂર્ણ લંબાઈવાળા FOSB અને મોટાભાગના અન્ય અવ્યવસ્થિત ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પરિબળોની તુલનામાં તેને સ્થિર બનાવે છે, જેની સેલ સંસ્કૃતિમાં અર્ધ-જીવન ટૂંકા હોઈ શકે છે થોડી મિનિટો અને ભાગ્યે જ 3 એચ કરતા વધી જાય છે (હેન અને ઇજેનમેન, 1984; ડોબ્રાઝાન્સ્કી એટ અલ., 1991; રોબર્ટ્સ અને વ્હાઇટલો, 1999; ફેરરા એટ અલ., 2003; હીરાટા એટ અલ., 2004). આ ઉપરાંત, આપણે શોધી કાઢીએ છીએ કે ΔFOSB મગજમાં ફોસ્ફોરિલેટેડ છે અને તેના ફોસ્ફોરિલેશન એ PP1 / PP2A ઇન્હિબિટર ઑકેડાઇક એસિડ પ્રત્યે સંવેદનશીલ છે. અમારા સેલ કલ્ચર સ્ટડીઝ દર્શાવે છે કે ΔFOSB ની સ્થિરતા સીકેક્સ્યુએક્સએક્સ દ્વારા મોડ્યુલેટ કરવામાં આવી છે, પ્રોટીનને સ્થિર કરવા માટે ઉચ્ચ CK2 પ્રવૃત્તિ સાથે. છેવટે, અમારા તારણો સૂચવે છે કે CK2 એ ખૂબ સંરક્ષિત એન ટર્મિનસ સેરીન (એસએક્સએનટીએક્સએક્સ) પર ΔFOSB ફૉસ્ફરસિલેટ્સ કરે છે અને દર્શાવે છે કે S2 નું ફોસ્ફોરેલેશન ΔFosB ને પ્રોટોસોમલ ડિગ્રેડેશનથી સુરક્ષિત કરે છે. તેથી અમે એક મોડેલ રજૂ કરીએ છીએ જેમાં સીએક્સએક્સએનએક્સ દ્વારા એસએક્સ્યુએનએક્સએક્સ પર ΔFOSB નું ફોસ્ફોરેલેશન ΔFOSB ના ટર્નઓવરનું નિર્ણાયક નિયમનકારી મિકેનિઝમ છે (ફિગ 7C). ΔFOSB ના આવા ફોસ્ફોરિલેશન-મધ્યસ્થી સ્થિરીકરણ કાર્યશીલ રૂપે મહત્વપૂર્ણ છે, કારણ કે વિશેષ મગજના પ્રદેશોમાં ΔFOSB ના વધેલા સ્તરને સીધી સંખ્યાબંધ ન્યુરોનલ જનીનોને નિયંત્રિત કરવામાં દર્શાવવામાં આવ્યું છે. વિવો માં અને કેટલાક ન્યુરોસાયકિયાટ્રિક ડિસઓર્ડર (પરિચય જુઓ) ની પશુ મોડેલ્સમાં અસરકારક વર્તણૂકીય અસરો લાગુ પાડવા.

જો કે ફોસ્ફોરેલેશન એ કેટલાક ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળોની ટ્રાંસ્ક્રીપ્શન પ્રવૃત્તિને નિયમન કરવાની ઝડપી અને ઉલટાવી શકાય તેવી રીત છે, જેમ કે ક્રેબ (સીએએમપી રિસ્પોન્સ એલિમેન્ટ બાઇન્ડિંગ પ્રોટીન) (બોહમેન, 1990), ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પરિબળોના અધોગતિને મોડ્યુલેટ કરવું નિયમનનું વધુ શક્તિશાળી (ઓછું સરળતાથી ફેરવી શકાય તેવા) સ્વરૂપ પ્રદાન કરે છે (ડેસ્ટર એટ અલ., 2000). ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પરિબળો જેની કાર્યકારી પ્રવૃત્તિ તેમના ડિગ્રેડેશનના સ્તરે નિયમન થાય છે તેમાં એનએફટીબી (ડેસ્ટર એટ અલ., 2000), સી-માયક (સીઅર્સ એટ અલ., 1999), અને સી-ફોસ (ફેરરા એટ અલ., 2003), બીજાઓ વચ્ચે. ઘણા કિસ્સાઓમાં, ફોસ્ફોરિલેશન એ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પરિબળની સ્થિરતાનું મુખ્ય નિયમનકાર છે, કેમ કે સી-ફોસ માટે બતાવવામાં આવ્યું છે (ઑકાઝાકી અને સગાતા, 1995; સુસુમી એટ અલ., 1995), ફોસ-સંબંધિત એન્ટિજેન-એક્સ્યુએનએક્સ (ફ્રે -1-1) (વૉઅલ અને માર્શલ, 2003), ફ્રે-એક્સ્યુએનએક્સ (મેનબે એટ અલ., 2001), સી-જુન (ફુચસ એટ અલ., 1996), જુનબ (ફુચસ એટ અલ., 1997), એટીએફએક્સટીએક્સ (ફુચસ એટ અલ., 2000), અને P53 (બૂચમેન એટ અલ., 2001). આમ, અમારા અભ્યાસો transFosB ને ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળોની આ સૂચિમાં ઉમેરે છે જેમની કાર્યકારી પ્રવૃત્તિ તેના ફોસ્ફોરીલેટેડ-આધારિત સ્થિરતા દ્વારા નિયંત્રિત થાય છે.

સીકે 2 એ સર્વવ્યાપક અને રચનાત્મક રીતે સક્રિય સેર / થ્રી કિનાઝ છે જેણે far૦૦ જેટલા કલ્પિત સબસ્ટ્રેટ્સને અત્યાર સુધી ઓળખી કા and્યા છે અને સેલ મૃત્યુ અને અસ્તિત્વ સહિતના બહુવિધ જૈવિક પ્રક્રિયાઓમાં ફસાયેલા છે (લિચફીલ્ડ, 2003; ઉન્ગર એટ અલ., 2004), સેલ્યુલર તણાવ પ્રતિભાવો (યાનગવા એટ અલ., 1997; કાટો એટ અલ., 2003), અને ડીએનએ રિપેર અને ક્રોમેટીન રિમોડેલિંગ (બારઝ એટ અલ., 2003; ક્રોહન એટ અલ., 2003). સીકેક્સ્યુએનએક્સ (PK2) ના પેટેટીવ સબસ્ટ્રેટ્સમાંથી એક તૃતિયાંશ ભાગ જનીન અભિવ્યક્તિના નિયમનમાં પ્રોટીન શામેલ છે (મેગીયો અને પિન્ના, 2003). હકીકતમાં, સીકેક્સ્યુએનએક્સ એ એક અણુ પરમાણુ કિનનેઝ બતાવવામાં આવ્યું છે (ક્રેક એટ અલ., 1992) (સમીક્ષા માટે, જુઓ યુ એટ અલ., 2001) અને ઘણા ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળોના BZIP ડોમેન્સ સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરવા માટે (યામાગુચી એટ અલ., 1998). CK2-mediated ફોસ્ફોરિલેશનને ઘણા પ્રોટીનના ઘટાડાને ઘટાડવા (Iશ્વાર્ઝ એટ અલ., 1996), પીટીએન (ટોરેર્સ અને પુલિડો, 2001), લેન્સ કનેક્શન (યિન એટ અલ., 2000), ક્રોમેટીન-સંબંધિત પ્રોટીન HMG1 (વિસ્નિવીસ્કી એટ અલ., 1999), અને એચએમબીબી (HMGB) જેવા ઘણા ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળોસ્ટેમર એટ અલ., 2002), માયફ-એક્સ્યુએનએક્સ (વિન્ટર એટ અલ., 1997), અને સી-માયક (ચેન્નાવજલા અને સેલ્ડેન, 2002). CK2 એ મગજમાં સૌથી વિપુલ પ્રમાણમાં છે (અલકાઝર એટ અલ., 1988; ગિરોલ્ટ એટ અલ., 1990), અને તેની પ્રવૃત્તિ મગજ કાર્યના ઘણા પાસાઓમાં ફેલાયેલી છે, જેમાં ન્યુરોનલ અસ્તિત્વનો સમાવેશ થાય છે (બોહનીંગ એટ અલ., 2003), ભિન્નતા (નથુલ એટ અલ., 2004), આયન ચેનલ ફંક્શન (જોન્સ અને યાકેલ, 2003; બીલ્ડલ એટ અલ., 2004), અને લાંબા ગાળાની શક્તિ અને ન્યુરોનલ પ્લાસ્ટિસિટી (ડાયઝ-નિડો એટ અલ., 1992; લીબરમેન અને મોડી, 1999; રેખર્ડ એટ એટ., 2003).

ન્યુરોનલ કાર્યના નિયમનમાં CK2 ની ભૂમિકા માટે આ વધતા પુરાવા હોવા છતાં, તેના પ્રવૃત્તિને નિયંત્રિત કરવા વિશે થોડું જાણીતું છે. સીકેક્સ્યુએક્સએક્સ રચનાત્મક રીતે સક્રિય હોવાનું માનવામાં આવે છે, ચોક્કસ સબસ્ટ્રેટ્સમાં ફોસ્ફોરિલેટને તેની ક્ષમતાને નિયમન સાથે તેના ઇન્ટ્રાસેસ્યુલર સ્થાનિકીકરણમાં ફેરફારો પર આધાર રાખે છે (દા.ત. સાયટોસોલ વિ ન્યુક્લિયસ) (અહમદ અને તાવીક, 1994; યુ એટ અલ., 1999). ક્રોનિક ઉત્તેજના પછી મગજમાં ΔFosB સંચયને પ્રેરિત કરવા માટે કયા સંકેતો આવશ્યક છે તેના સંબંધમાં આ માહિતી એક મહત્વપૂર્ણ પ્રશ્ન ઉભી કરે છે.ફિગ 7C). એક જરૂરિયાત એ સક્રિયકરણ પુનરાવર્તન છે FOSB જનીન અને Δફોસ એમઆરએનએ (INR)ચેન એટ અલ., 1995). અમારું ડેટા સૂચવે છે કે ΔFosB ના CK2 ફોસ્ફોરિલેશન તેની સ્થિરતા માટે નિર્ણાયક છે, સૂચવે છે કે eneFOSB ની જીન અભિવ્યક્તિ પર લાંબા ગાળાની અસરો માટે બીજું સંકેત જરૂરી હોઈ શકે છે, એટલે કે સિગ્નલ કે જે સીકેક્સ્યુએક્સએક્સ દ્વારા પ્રોટીનના ફોસ્ફોરિલેશનને ઉત્તેજિત કરે છે. આમાં કેટલાક અજ્ઞાત મિકેનિઝમ અથવા ન્યુક્લિયસના તેના સ્થાનાંતરણ દ્વારા CK2 ની સક્રિયકરણ શામેલ હોઈ શકે છે. વૈકલ્પિક રીતે, ΔFOSB ના CK2 ફોસ્ફોરિલેશન રચનાત્મક હોઈ શકે છે, જેમ કે stimFosB પ્રોટીન દરેક ઉત્તેજનાના જવાબમાં અનુવાદિત થાય છે, તેના ભાગનો એક ભાગ ફોસ્ફોરિલેટેડ થાય છે અને સ્થાયી થાય છે, જેથી વારંવાર ઉત્તેજના સાથે તે અસરગ્રસ્ત ચેતાકોષમાં ઉચ્ચ સ્તરોમાં સંચયિત થાય છે.

અમારા તારણો દર્શાવે છે કે CK2 અને S27 સંભવતઃ એકમાત્ર કાઇનેઝ અને સાઇટ નથી, જે ΔFOSB ફોસ્ફોરિલેશન માટે જવાબદાર છે, કારણ કે સીકેક્સ્યુએક્સએક્સ અથવા એસએક્સ્યુએનએક્સએક્સએ પરિવર્તનનો કોઈ અવરોધ ΔFOSB ફોસ્ફોરિલેશનને સંપૂર્ણપણે રોકી શક્યો નથી. સમાન ટૉકન દ્વારા, હકીકત એ છે કે S2A પરિવર્તન ફોસ્ફો-ΔFosB માં 27% ઘટાડામાં પરિણમે છે તે દલીલ કરે છે કે S27 એ પ્રોટીન પર એક મોટી ફોસ્ફોરિલેશન સાઇટ છે. અમે, તેમ છતાં, putFOSB પર અન્ય મૂત્રપિંડના કેનાસો અને ફોસ્ફોરિલેશન સાઇટ્સની તપાસ કરી રહ્યા છીએ. આખરે, તે મગજમાં ΔFOSB માં S30 અને કોઈપણ અન્ય ફોસ્ફોરિલેશન સાઇટ્સના ફોસ્ફોરિલેશનનું વિશ્લેષણ કરવા માટે પણ મહત્વપૂર્ણ રહેશે. વિવો માં વિવિધ પ્રકારનાં ક્રોનિક ઉત્તેજના પછી, ઉદાહરણ તરીકે, સામૂહિક સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી અથવા ફોસ્ફોસ્પેસિફિક એન્ટિબોડીઝના ઉપયોગ દ્વારા.

ઉપર જણાવ્યા મુજબ, ΔFosB માં S27 એ સમગ્ર વિકાસ અને અન્ય ફોસ કુટુંબ પ્રોટીન વચ્ચે ખૂબ સંરક્ષિત છે. જો કે, સીકેક્સ્યુએક્સએક્સ માટેની સર્વસંમતિ સાઇટ તે નથી: જેમ દર્શાવ્યું છે આકૃતિ 5B, ફક્ત FOSB / ΔFOSB (અને ઝેબ્રાફિશ ઝેનોલોગ), પરંતુ સી-ફોસ અથવા ફ્રે-એક્સ્યુએક્સએક્સ નથી, તે XXX પર એસિડિક અવશેષ ધરાવે છે, જે સીકેક્સ્યુએક્સએક્સ ફોસ્ફોરિલેશનનું મુખ્ય નિર્ધારક છે (મારિન એટ અલ., 1986; મેગીયો એટ અલ., 1994). આમ, S2 પર CK27 ફોસ્ફોરિલેશનની અભાવ એ સમજાવી શકે છે કે શા માટે અન્ય ફોસ કુટુંબ પ્રોટીન ΔFOSB જેટલા સ્થિર નથી. જો કે, આ શા માટે પૂર્ણ-લંબાઈ FOSB શામેલ નથી, કે જે સમાન CK2 સર્વસંમતિ સાઇટ ΔFOSB તરીકે છે, તે સમાન સ્થાયી નથી. અમને ખબર નથી કે આ સંરક્ષિત અવશેષ પર CK2 દ્વારા પૂર્ણ-લંબાઈ FOSB ફોસ્ફ્રોરિલેટેડ છે કે નહીં. FOSB ની એકમાત્ર અહેવાલો (સ્કીનર એટ અલ., 1997) અને સી-ફોસ (ઑકાઝાકી અને સગાતા, 1995; ચેન એટ અલ., 1996) ફોસ્ફોરીલેશન એ પ્રોટીનના સી-ટર્મિનલ ક્ષેત્રમાં સાઇટ્સનું વર્ણન કરે છે, જે ΔFOSB માં ગેરહાજર છે. CK2 દ્વારા પૂર્ણ-લંબાઈ FOSB અને અન્ય ફોસ કૌટુંબિક પ્રોટીનનું સંભવિત ફોસ્ફોરિલેશન સીધો તપાસ કરવાની જરૂર છે. તેમ છતાં, જો તેઓ ફોસ્ફોરીલેટેડ હોય તો પણ, અન્ય ફોસ કૌટુંબિક પ્રોટીન તેમની સી ટર્મિનિમાં રૂપરેખા સમાવવા માટે જાણીતા છે જે ઝડપી ડિગ્રેડેશન માટે પ્રોટીનને લક્ષ્યાંક બનાવે છે (પાપવાસિલીઓ એટ અલ., 1992; જરિલ-એન્કોન્ટ્રે એટ અલ., 1997; એક્વાવિવા એટ અલ., 2002). ઉદાહરણ તરીકે, એવું દર્શાવવામાં આવ્યું છે કે તમામ ફોસ કૌટુંબિક પ્રોટીનની સી ટર્મિનસમાં હાજર ~ 21 અવશેષોનો એક ભાગ, પરંતુ ΔFOSB માં ગેરહાજર, સી-ફોસ માટે અસ્થિરતા ડોમેન તરીકે કાર્ય કરે છે (એક્વાવિવા એટ અલ., 2001). અમે શોધી કાઢ્યું છે કે જો કે આ અનુક્રમણિકા સમાન રીતે પૂર્ણ-લંબાઈ FOSB (કાર્લે એટ અલ., 2004), domainFOSB માં આ ડોમેનની ગેરહાજરી તેના સ્થિરીકરણ માટે સંપૂર્ણપણે જવાબદાર નથી. તેના બદલે, આ સી ટર્મિનસ ડોમેન અને સેરએક્સ્યુએનએક્સ ફોસ્ફોરિલેશનની ગેરહાજરીનું મિશ્રણ ΔFOSB અને FOSB વચ્ચે સ્થિરતામાં આશરે પાંચ ગણા તફાવત માટે સંપૂર્ણપણે જવાબદાર હોવાનું લાગે છે.

જો કે ફૉસ કુટુંબ પ્રોટીનનું ધોવાણ જટીલ છે અને સંપૂર્ણપણે સમજી શકાયું નથી, પ્રોટીસોમલ ડિગ્રેડેશન એ મુખ્ય માર્ગ છે જે શામેલ છે (સાલ્વાત એટ અલ., 1999; એક્વાવિવા એટ અલ., 2002; ફેરરા એટ અલ., 2003). અહીં પ્રસ્તુત કરાયેલ ડેટા, જેમાં પ્રોટોસૉમલ ઇન્હિબિટર્સ નોંધપાત્ર રીતે ΔFOSB ડિગ્રેડેશનના દરને નોંધપાત્ર રીતે બદલતા નથી, એવી દલીલ કરે છે કે, અન્ય ફોસ કુટુંબ પ્રોટીનથી વિપરીત, ΔFOSB એ 26S પ્રોટીસોમને અવગણે છે, અને તેના સ્થિરીકરણમાં તે મુખ્ય ભૂમિકા ભજવે છે. તેથી અમે એવી યોજનાનું પ્રસ્તાવ આપીએ છીએ જેમાં ΔFOSB ની વિસ્તૃત સ્થિરતા બે મુખ્ય પરિબળોના સંયોજનને આભારી છે: (1) સી-ટર્મિનલ અસંતુલિત ડોમેનની ગેરહાજરી અને (2) CK27 દ્વારા S2 નું ફોસ્ફોરિલેશન.

સારાંશમાં, વર્તમાન અભ્યાસ, earlyFOSB, તાત્કાલિક પ્રારંભિક જનીનનું ઉત્પાદન શા માટે છે તે મુજબ મિકેનિકલ અંતઃદૃષ્ટિ પ્રદાન કરે છે FOSB, અન્ય તમામ ફોસ પારિવારિક સભ્યોથી વિપરીત છે, પ્રમાણમાં લાંબા સમયથી રહેલી પ્રોટીન. તેમ છતાં અન્ય ફોસ કુટુંબ પ્રોટીન ઝડપી પરંતુ ક્ષણિક ઉત્તેજના-ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન કપ્લીંગ (મધ્યસ્થી)મોર્ગન અને કુરાન, 1995), ΔFOSB ની સંબંધિત સ્થાયીતા તેને ક્રોનિક ઉત્તેજના દ્વારા પ્રેરિત લાંબા સમયથી ચાલતા ટ્રાન્સક્રિપ્શન ફેરફારોમાં મધ્યસ્થી કરવાની ક્ષમતા પ્રદાન કરે છે. આ દૃષ્ટિકોણને સમર્થન આપે છે કે ΔFOSB મગજમાં સતત મોલેક્યુલર સ્વીચ તરીકે કાર્ય કરે છે, ધીમે ધીમે તીવ્ર પ્રતિસાદોને ક્રોનિક અનુકૂલનમાં રૂપાંતરિત કરે છે. ΔFOSB ની સ્થિરતા માટે સેરેક્સ્યુએક્સ ફોસ્ફોરિલેશનની ઓળખાણ કેન્દ્રીય મિકેનિઝમની ઓળખ ΔFosB ના કાર્યને નિયંત્રિત કરવા માટેના માર્ગોના વિકાસ માટે નવા રસ્તાઓ ખોલે છે અને તેનાથી ન્યુરલ અને વર્તણૂકીય પ્લાસ્ટિસિટી પર તેની લાંબા ગાળાની અસરોને સુધારે છે.

અગાઉના વિભાગ આગામી વિભાગ

ફૂટનોટ્સ

નવેમ્બર 21, 2005 પ્રાપ્ત થયું.
પુનરાવર્તન ફેબ્રુઆરી 21, 2006 પ્રાપ્ત થયું.
સ્વીકૃત એપ્રિલ 2, 2006.

આ કાર્યને નેશનલ એલાયન્સ ફોર રિસર્ચ ઓન સ્કિઝોફ્રેનિઆ અને ડીપ્રેશન યંગ ઇન્વેસ્ટિગેટર એવોર્ડ દ્વારા પી.જી.યુ., નેશનલ ડ્રગ એબ્યુઝ પર નેશનલ ઇન્સ્ટિટ્યુટ (એનઆઈડીએ), પી.જી.જી. નેશનલ રિસર્ચ સર્વિસ એવોર્ડ અને નેશનલ ઇન્સ્ટિટ્યુટ ઑફ મૅન્ટલ હેલ્થ અને એનઆઇડીએથી ઇજેએન માટે ગ્રાન્ટ દ્વારા સમર્થન આપવામાં આવ્યું હતું. તેની મદદ માટે ડો. જેમ્સ બીબને આભાર ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ ફોસ્ફોરીલેશન assays, મગજ-હુ હાન મેટાબોલિક લેબલિંગ માટે ઉપયોગમાં લેવાતી મગજ સ્લાઇસેસની તૈયારી માટે અને રેકૉમ્બિનન્ટ એચએસવીઝના પેકેજિંગ સાથેની મદદ માટે ડૉ. રાચેલ નેવની મદદ માટે.
જી. રુડેન્કોનું હાલનું સરનામું: લાઇફ સાયન્સિસ ઇન્સ્ટિટ્યૂટ અને ફાર્માકોલોજી ડિપાર્ટમેન્ટ, યુનિવર્સિટી ઓફ મિશિગન, 210 વtenશન્ટો એવન્યુ # 3163 એ, એન આર્બર, એમઆઈ 48109-2216.
પત્રવ્યવહાર એરિક જે. નેસ્લેર, 5323 હેરી હેઇન્સ બૌલેવાર્ડ, ડલ્લાસ, TX 75390-9070 ને સંબોધવા જોઈએ. ઇમેઇલ: [ઇમેઇલ સુરક્ષિત]

અગાઉના વિભાગ

સંદર્ભ

એક્વાવિવા સી, બ્રૉકલી એફ, ફેરારા પી, બોસિસ જી, સાલ્વાત સી, જરિલ-એન્કોન્ટ્રે હું, પાઇચાસીક એમ (2001) જી (0) થી ટીએસ તબક્કા સંક્રમણ દરમિયાન સી-ફોસ પ્રોટો-ઓન્કોપ્રોટીનની ઝડપી પ્રોટોસોમલ ડિગ્રેડેશનના નિયંત્રણમાં સી-ટર્મિનલ ટ્રાઇપેપ્ટાઇડ મોડિફની ઓળખ સામેલ છે. ઓન્કોજેન 20:7563-7572.

અમૂર્ત

પરિચય

સામગ્રી અને પદ્ધતિઓ

સસ્તન કોશિકાઓ અને ડીએનએ રચનાઓ.

પલ્સ-પીછો પ્રયોગો.

પ્રાણીઓ અને ક્રોનિક ઇલેક્ટ્રોકોનવુલ્સિવ જપ્તી સારવાર.

32 પી મેટાબોલિક લેબલિંગ.

કેમિકલ્સ અને સેલ સંસ્કૃતિ સારવાર.

Δએફએસબી ઇમ્યુનોપ્ર્રેઇર, ઇમ્યુનોબ્લોટિંગ, અને ઑટોરાડિયોગ્રાફી.

ઓવરેક્સપ્રેસ અને જંતુનાશક કોષોમાંથી com FOSB ના શુદ્ધિકરણ.

ઈન વિટ્રોમાં ફોસ્ફોરીલેશન અભ્યાસ.

દ્વિ-પરિમાણીય ફોસ્ફોપ્પ્ડાઇડ નકશો અને ફોસ્ફોમેનો એસિડ વિશ્લેષણ.

સીઆરઆરએનએ-પ્રેરિત CK2α નોક-ડાઉન.

સાઇટ નિર્દેશિત મ્યુટેજેનેસિસ.

બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ.

ડેટા ક્વોન્ટિફિકેશન, ગણતરીઓ અને આંકડા.

પરિણામો

ΔFOSB અસામાન્ય રીતે સ્થિર ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળ છે

ΔFOSB એ મગજમાં ફોસ્ફોપ્રોટીન છે

CK2 પરંતુ PKC અથવા કેમેકીઆઇ ફોસ્ફોરીલેટ્સ Δ FOSB નથી ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ

CK2 એ અચોક્કસ કોશિકાઓમાં ΔFosB ના ફોસ્ફોરિલેશન અને સ્થિરતાને સુધારે છે

CX2 ફોસ્ફોરીલેટ્સ ΔFOSB ને Ser27 પર

Ser27 ના ફોસ્ફોરેલેશન ΔFOSB ની સ્થિરતાને નિયંત્રિત કરે છે

સેરએક્સ્યુએનએક્સ ફોસ્ફોરિલેશન એ પ્રોટોસોમલ ડિગ્રેડેશનને અટકાવીને ΔFosB સ્થિર કરે છે.

ચર્ચા

ફૂટનોટ્સ

સંદર્ભ

લેખ આ લેખનો અવતરણ

ઝડપી કડીઓ

³² પી મેટાબોલિક લેબલિંગ.