Reglugerð um DeltaFosB stöðugleika með fosfórun (2006)

J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.

Heimild

Sálfræðideild, Center for Basic Neuroscience, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas 75390-9070, USA.

Abstract

Uppskriftarstuðullinn DeltaFosB (einnig nefndur FosB2 eða FosB [stutt form]) er mikilvægur sáttari við langvarandi mýkt sem er framkölluð í heila vegna langvarandi útsetningar fyrir nokkrum tegundum af geðrofsáreiti, þar á meðal misnotkun lyfja, streitu og rafsnúningsfloga. . Sérstakur eiginleiki DeltaFosB er að þegar hann hefur verið örvaður heldur hann áfram í heila í tiltölulega langan tíma án frekari örvunar. Aðferðirnar sem liggja að baki þessum augljósum stöðugleika hafa hins vegar haldist óþekktar. Hér sýnum við fram á að DeltaFosB er tiltölulega stöðugur uppskriftarstuðull, með helmingunartíma um það bil 10 klst. Í frumurækt. Ennfremur sýnum við að DeltaFosB er fosfóprótein í heila og að fosfórun á mjög varðveitt serín leifum (Ser27) í DeltaFosB verndar það gegn niðurbroti proteasomal. Við veitum nokkrar línur af vísbendingum sem benda til þess að þessi fosfórýlering sé miðluð af kaseinkínasa 2. Þessar niðurstöður eru fyrstu vísbendingar um að DeltaFosB er fosfórýlerað og sýna fram á að fosfórýlering stuðlar að stöðugleika þess, sem er kjarninn í getu hans til að miðla langvarandi aðlögun í heila.

Hvernig gengur lífið dag frá degi? Er það í jafnvægi og allt eins og það á að vera? Er jafnvægi hvort sem litið er á veraldlega stöðu eða andlega? Lífið er eins og það er. Það er ekki alltaf sólskyn. Það koma reglulega lægðir með rok og rigningu. Við vitum að í heildar samhenginu er lægð hluti af vistkerfi að leita að jafnvægi. Stundum erum við stödd í miðju lægðarinnar. Þar er logn og gott veður, sama hvað gengur á þar sem stormurinn er mestur. Sama lögmál gildir varðandi þitt eigið líf. Ef þú ert í þinn miðju, þínum sannleik þá heldur þú alltaf jafnvægi átakalaust. Sama hvað gustar mikið frá þér þegar þú lætur til þín taka. Huldufólk hefur gefið okkur hugleiðslu sem hjálpar okkur að finna þessa miðju, finna kjarna okkar og sannleikann sem í honum býr. Þegar þú veist hver þú ert og hvers vegna þú ert hér, mun líf þitt vera í flæðandi jafnvægi. Hugleiðslan virkjar þekkinguna sem er í vitund jarðar og færir hana með lífsorkunni inn í líkama okkar. Þar skoðar hún hugsana og hegðunar munstrið og athugar hvort það myndar átakalausu flæðandi jafnvægi. Hinn möguleikinn er falskt jafnvægi sem hafa þarf fyrir að viðhalda með tilheyrandi striti, áhyggjum og ótta. Síðan leiðbeinir þessi þekking okkur að því jafnvægi sem er okkur eðlilegt. Við blómstrum átakalaust, líkt og planta sem vex átakalaut frá fræi í fullþroska plöntu sem ber ávöxt.

Uppskriftarstuðull ΔFosB, einnig tilnefndur FosB2 eða FosB [stutt form], er C enda-stytt sundurafbrigði af strax snemma geninu fosb (Dobrazanski o.fl., 1991; Nakabeppu og Nathans, 1991; Yen o.fl., 1991). Eins og FosB í fullri lengd, hefur osFB DNA-bindandi grunnlén og rauðrænu rennilás þar sem það dimmar með Jun próteinum til að mynda virkjunarprótein-1 (AP-1) umritunarstuðulfléttur, sem stjórna tjáningu margra gena (Morgan og Curran, 1995; Rylski og Kaczmarek, 2004). Þrátt fyrir að það skorti hluta af aðgerðarsviði sem er að finna í C endanum á FosB, þá virkar ΔFosB bæði öflugur transcriptional virkjari og repressor í ræktuðum frumum og í heila (Dobrazanski o.fl., 1991; Nakabeppu og Nathans, 1991; Chen et al., 1997; McClung og Nestler, 2003; Kumar et al., 2005).

ΔFosB er framkallað mikið magn á svæðisbundinn hátt í heila eftir langvarandi, en ekki bráða útsetningu fyrir margvíslegu geðvirku áreiti, þar með talið streitu, ákveðnum meinsemdum, geðrofslyfjum og þunglyndislyfjum, misnotkun lyfja og náttúrulegum umbunum. (Hope o.fl., 1994b; Hiroi og Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Bing o.fl., 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz et al., 1999; Werme o.fl., 2002; Andersson o.fl., 2003; Colby et al., 2003; Peakman et al., 2003; Perrotti o.fl., 2004; Zachariou et al., 2006). Örvun ΔFosB hefur verið í beinum tengslum við virkniáhrif nokkurra þessara áreita á heilann. Þrávirkni ΔFosB, jafnvel án frekari örvunar, aðgreinir það frá öllum öðrum umritunarþáttum Fos-fjölskyldunnar, sem örvast hratt til að bregðast við bráðu áreiti, rotnar aftur í grunnstyrk innan nokkurra klukkustunda og sýnir almennt ónæmingu eftir langvarandi örvun (Hope et al., 1992; Daunais o.fl., 1993; Persico o.fl., 1993; Hiroi og Graybiel, 1996; Perrotti o.fl., 2004). Þetta gerir ΔFosB að aðlaðandi frambjóðanda til að miðla nokkrum af þeim langvarandi breytingum á tjáningu gena sem liggja til grundvallar stöðugum taugaaðlögunum af völdum ákveðinna langvinnra áreita.

Vegna þess að langvarandi viðvera ΔFosB á sér stað í fjarveru frekari örvunar á mRNA þess (Chen et al., 1995), veltum við fyrir okkur að ólíkt FosB í fullri lengd og öllum öðrum Fos fjölskyldupróteinum, sem eru í eðli sínu óstöðug, getur osFosB verið óvenju stöðugur umritunarstuðull (Hope o.fl., 1994b; Chen et al., 1997; Nestler o.fl., 2001; McClung et al., 2004). Ennfremur benti ónæmisblóðugreining á bráða- og langvarandi örvandi heilavef til þess að ΔFosB breytist í ljós M_r (mólmassi) frá ∼33 kDa í bráða ástandi til ∼35 – 37 kDa við langvarandi meðferð (Hope o.fl., 1994a; Chen et al., 1995). Vegna þess að engar vísbendingar eru um tilvist viðbótar mRNA sem gætu umritað fyrir þessa ýmsu ísóform, veltum við enn frekar fyrir því að osFosB sé breytt eftir þýðingu og að þetta stuðli kannski að óvenjulegum stöðugleika þess. Hingað til hefur hins vegar ekki verið greint frá neinum lífefnafræðilegum greiningum á veltu eða breytingum eftir fjárhagsáætlun ΔFosB. Markmið þessarar rannsóknar var að ákvarða hvort osFosB er fosfóprótein og hvort fosfórýleringu gegnir hlutverki í stöðugleika þess.

Fyrri hluti Næsta kafli

Efni og aðferðir

Frumur spendýra og DNA smíði.

PC12 frumur (Clontech, Mountainview, CA) voru ræktaðar í DMC með háum glúkósa sem innihélt l-glútamín (L-Gln) og bætt við 5% fósturvínsfermi (FBS), 10% hestasermi (báðir frá Invitrogen, Carlsbad, CA) , 100 U / ml penicillín og 100 μg / ml streptomycin (báðir frá Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). HeLa frumur (American Type Culture Collection, Manassas, VA) voru ræktaðar í DME með háum glúkósa sem innihélt L-Gln og bætt við 10% FBS, penicillíni og streptómýsíni. Báðum frumulínunum var haldið við 37 ° C í rakt 5% CO₂ andrúmsloft.

Fyrir tímabundna transfection með DNA voru PC12 eða HeLa frumur settar á sex holu plötur (húðaðar með kollageni fyrir PC12 frumur) til að ná 90 – 100% ármóti daginn eftir og var síðan transfected með Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Í sumum tilraunum (sjá Figs. 1 ⇓⇓⇓⇓⇓-7, FosB var tjáð tímabundið í PC12 frumum með sýkingu með raðbrigða herpes simplex vírus (HSV).

ΔFosB og FosB cDNA voru fengin úr eigin pTetop smíðum (Chen et al., 1997), og undirklóna í pcDNA3.1 vektor (Invitrogen). Þessar pcDNA3.1-osFosB / FosB smíði voru notaðar til tjáningar í frumum spendýra og sem sniðmát fyrir stökkbreytta stökkbreytingu. Raðbrigða HSV-osFosB var framleitt eins og áður hefur verið lýst (Neve o.fl., 1997), og efnablandan hafði títer af ∼1 × 10⁸ pfu / ml.

Púls-elta tilraunir.

Um það bil 24 klst. Eftir sýkingu / transfection voru frumur (PC12 eða HeLa) í sex holu plötum þvegnar tvisvar til þrisvar sinnum með 2 ml af PBS og ræktaðar við 37 ° C í ∼1 klst. Í 2 ml af Cys / Met-frjáls DMEM (Invitrogen) bætt við 5% dialyszed FBS (Hyclone, Logan, UT) til að tæma innanfrumu laugar af Met og Cys. Í lok þessa „hungurs“ tímabils var lyfjum (ef meðhöndla frumur) bætt við og frumur voru merktar (púls) með 12 – 25 μCi af ³⁵S próteinmerkingarblanda (PerkinElmer, Wellesley, MA) fyrir ∼1 h við 37 ° C til að merkja öll nýbúin prótein. Geislamerkið var síðan fjarlægt með því að þvo frumurnar tvisvar til þrisvar með 2 ml af PBS, og ³⁵S-merktum próteinum var fylgt eftir (elta) með því að skipta um miðilinn með „köldum“ (ógeislavirkum) miðli bætt við 5% FBS og uppskera frumurnar á ýmsum tímapunktum. Frumumeðferð var haldið úti í eltingum. Allar tölur þessara tilrauna sýna svipað upphafsmagn af hinum ýmsu próteinum til að hámarka samanburð á veltuhlutfalli þeirra.

Dýr og langvarandi rafflæðismeðferð.

Fullorðnir Sprague Dawley karlrottur (200 – 300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) voru meðhöndlaðar einu sinni á sólarhring með krampaköstum (ECS) fyrir 7 – 9 d. ECS var framkvæmt eins og áður hefur verið lýst (Hope o.fl., 1994a) nota an Ugo Basile (Comerio VA, Ítalía) ECS eining með eftirfarandi stillingum: tíðni, 100 púls / s; púls með, 0.5 ms; lengd áfalls, 1.0 s; og núverandi, 75 mA. Meðhöndlun dýranna með svindli voru samhliða meðhöndluð með því að beita eyraklemmuvökva án rafstraums.

³² P efnaskiptamerkingar.

Til merkingar á heilasneiðum voru rottur teknar af höfði, gáfur voru fljótt sundraðar og 300 μm framangreindir barkalögsneiðar voru búnir til með DSK smásjá (Ted Pella, Redding, CA). Sneiðarnar voru ræktaðar inni í plaströrum í 2 ml af fosfatskortu gervi CSF (ACSF) og haldið við 30 ° C við stöðuga bláa freyðingu með O₂/ CO₂ blanda (Hemmings o.fl., 1989). Sneiðarnar (tvær sneiðar í hverri túpu) voru merktar með 1.3 mCi fyrir 8 – 10 klst. Í viðurvist eða fjarveru okadaic sýru (100 ng / ml). Í lok þess ræktunar voru sneiðarnar skolaðar að minnsta kosti þrisvar sinnum með köldu ACSF og síðan einsleitt með hljóðvistun í 250 μl af köldu geislaónæmisprófun (RIPA) stuðpúði [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v / v ) Igepal, 0.5% (w / v) natríum deoxycholate, 0.1% (w / v) SDS, 1 mm EDTA] bætt við fyrir notkun með SDS allt að 0.6%, próteasahemjandi kokteil fyrir spendýrafrumur (notaður við 5 μl / ml; Sigma-Aldrich), fosfatasahemlar kokteila I og II (notaðir við 1: 100; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF og 2% glýseról. Einsleitnir voru síðan soðnir í 15 mín og hreinsaðir með skilvindu við 15,000 × g í 15 mín. Próteinstyrkur í supernatants sem myndaðist var metinn með því að nota BCA próteingreiningu (Pierce, Holmdel, NJ).

Til að ³²P merkingar á ræktuðum frumum, ∼24 klst. Eftir sýkingu / blóðgjöf, frumur voru þvegnar tvisvar til þrisvar með fosfatfríum miðli og ræktaðar í þessum miðli í ∼1 klst. Eftir þetta sult tímabil, 0.2 – 0.3 mCi af ³²PH₃PO₄ (PerkinElmer) var bætt við hverja holu, og frumur voru merktar fyrir 4 – 12 h eftir tegund tilraunar (sjá mynd. 1 – 7 til að fá upplýsingar). Frumur voru síðan þvegnar þrisvar með PBS og ljósar á ís í 15 mín. Með 50 μl af viðbótar RIPA biðminni. Lýsötum var safnað með því að skafa og var látið fara 10 sinnum í gegnum 25 ga nál til að klippa DNA, soðið í 10 mín. Og skilvindt við 15,000 snúninga á mínútu í 15 – 30 mín. Við 4 ° C. Hreinsuðu lýsin (flotvatnin) voru flutt í nýtt rör og BCA próteingreining (Pierce) var framkvæmd. Allar tölur þessarra tilrauna sýna svipað magn af heildar villtum tegundum (WT) og S27A ΔFosB próteinum til að hámarka samanburð á hlutfallslegu fosfórunargildum þeirra.

Efna- og frumuræktarmeðferðir.

Okadaic sýra (OA; Sigma-Aldrich) var leyst upp í etanóli og notað í lokastyrk 100 ng / ml. 5,6-Dichloro-1-ß-d-ribofuranosyl-benzimidazol (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) var leyst upp í dímetýlsúlfoxíði (DMSO; Sigma-Aldrich) og notað í frumuræktun í lokastyrk 50 μm. Spermin (Sigma-Aldrich) var leyst upp í vatni og notuð við lokastyrk 200 μm. Calphostin-C (Biomol) var leyst upp í DMSO og notað við 0.2 um, en phorbol 12-myristat 13-asetat (PMA; Promega, Madison, WI) var leyst upp í DMSO og notað við 0.1 um. myristoylated-autocamtide-2-tengt hindrandi peptíð (m-AIP; Biomol) var leyst upp í vatni og notað við lokastyrk 1 og 10 μm. Breiðvirkt prótein kínasahemlar H-7 og H-8 (Biomol) voru leystir upp í vatni og notaðir við lokastyrk 150 og 200 μm, í sömu röð. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) og epoxomicin (Peptides International, Louisville, KY) voru bæði leyst upp í DMSO og notuð í lokastyrk 12.5 og 7.5 μm, í sömu röð. Í öllum tilraunum var DMSO (burðarefni) bætt við frumur eftir þörfum til að viðhalda stöðugu magni af DMSO yfir meðferðir. Fyrir ³²P merkingartilraunir, lyfjunum var bætt við rétt fyrir merkimiðann og þeim haldið áfram það sem eftir var af merkingartímabilinu. Fyrir tilraunir við púls elta var lyfjum bætt við þegar Cys / Met „hungri“ var haldið í gegnum merkingartímabilið og síðan bætt aftur í eltingarmiðilinn. Próteasóm hemlarnir voru spikaðir á 3 – 4 klst. Í gegnum eltuna til að bæta upp fyrir skjóta veltu þessara peptíða.

Δ FosB ónæmisfrestun, ónæmisblöðrun og sjálfdreifingargreining.

Fyrir ónæmisframsog voru þynnulýsat þynnt 1: 5 með venjulegu RIPA til að ná styrk SDS niður í 0.1% áður en haldið var áfram með ónæmisframsog (IP). Til að takmarka ósértæka bindingu voru lysötin fyrst hreinsuð með ónæmisframsogi með ónæmisglímu IgG og próteini G-Sepharose (Sigma-Aldrich) í að minnsta kosti 4 klst. ΔFosB var síðan ónæmisframsogað úr hreinsuðu lysötunum með því að nota polyclonal geitamótefni sem þekkir innri eftirlíkingu sem er til staðar í bæði FosB og ΔFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) við 0.5 – 1 μg IgG á 10 μg lýs (50 – 300 μg af heildarpróteini) í heildarrúmmáli 0.5 ml. IPs var blandað varlega við 4 ° C á snúningi í að minnsta kosti 8 klst. Og þá var 15 μl af próteini G-Sepharose bætt við og IPs var blandað saman í að minnsta kosti 4 klst. IP-tölur voru pelleteraðar með snúningi á 3000 × g í 3 – 5 mín. við 4 ° C, þvegin þrisvar með 0.5 ml af köldu sléttu RIPA og tvisvar með köldu PBS sem innihélt 0.1% Tween 20. IP-lyfjum var síðan blandað aftur í 0.5 ml af köldu PBS, flutt, pelleterað í nýju túpu og ónæmisframsoguðu próteinum var síðan skolað út með því að bæta við 15 – 25 μl af 2 × draga úr Laemmli prótein sýni stuðpúði. Þessi IP samskiptaregla leiddi til sérstakrar og árangursríkrar úrkomu nánast alls FosB í lýsatinu. Ónæmisupptaka próteinin voru sett á SDS-PAGE með því að hlaða allan IP-ið á 12.5% Tris-HCl viðmiðunar hlaup (Bio-Rad, Hercules, CA) og síðan flutt yfir á PVDF eða nitrocellulose. Eftir flutning var himnan loftþurrkuð og ³²P- og ³⁵S-geislamerkt próteinbönd sáust með sjálfvirkri myndgreiningu með því að nota Kodak (Rochester, NY) myndrannsóknarljósmynd, svo og með fosfórmyndun með Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager. Heildar (ófosfórýrat og fosfórýlerað) ΔFosB í frumulýsötum eða samsöfnun heila greindist með ónæmisblöðru af annað hvort ónæmisfrumuðu próteini (með sömu himnu og notuð var til að greina ³²P-merkt prótein), eða af jafn miklu magni af lysati / einsleitt próteini sem var sett á SDS-PAGE og flutt yfir á PVDF eða nitrocellulose. Himnan var fyrst læst með því að rækta hana með 1% (w / v) ófitu þurrmjólk (Bio-Rad) í PBS bætt við 0.1% (v / v) Tween 20 (Sigma) fyrir 1 h við 25 ° C. Himnan var síðan ónæmisblöðruð yfir nótt við 4 ° C með okkar eigin kanína gegn FosB margliða mótefni myndað gegn amínósýrum 1 – 16 af FosB / ΔFosB (notuð við 1: 10,000). Eftir aðal ræktun voru himnur þvegnar fjórum sinnum í 5 mín. Með hindrandi stuðpúði, og síðan ræktaðar við 25 ° C í ∼1 klst með geit gegn kanínu IgG samtengd við piparrót peroxidasa (notað við 1: 5000 í hindrandi stuðpúði, úr Vector Rannsóknarstofur, Burlingame, CA). Himnur voru síðan þvegnar þrisvar í 10 mín. Með hindrandi biðminni og einu sinni í 5 mín. Með PBS. Alls ΔFosB próteinbönd voru sýnd á Kodak MR filmu með aukinni efnafræðilegum hreyfingu (Pierce) og / eða með því að greina flúrljómun með því að nota ECL-Plus hvarfefni (Amersham Biosciences) og Storm PhosphorImager.

Ofþrýstingur og hreinsun raðbrigða ΔFosB frá skordýrafrumum.

Δ FosB var ofprentað í Sf9 skordýrafrumum sem N endahexa-His-merkt prótein (N-His (6) ΔFosB) með því að nota Bac-til-Bac baculovirus tjáningarkerfið (Invitrogen) og fylgja leiðbeiningum framleiðandans. Stuttlega, ΔFosB cDNA (leifar 2 – 237) á undan með skyldleika N-endamerkisins MGHHHHHHAG var undirklónað í pFASTBacTM1 vektor, sem var notað til að búa til raðbrigða baculovirus. Sf9 frumur voru sýktar með raðbrigða veiru, og N-His (6) ΔFosB var hreinsað úr frumulýsötum með nokkrum litskiljunarþrepum þar með talið sækni litskiljun með því að nota nikkelsúlu (Qiagen, Valencia, CA), anjónaskipti með mono-Q súlu (Amersham Líffræði) og útilokun stærðar með gelsíunarsúlu (Amersham Biosciences).

In vitro rannsóknir á fosfórun.

In vitro fosfórunarviðbrögð vegna tímabils og greining á stoðtækni voru framkvæmd í rúmmáli 30 μl sem innihélt 10 μm hvarfefni (N-His (6) ΔFosB eða jákvætt stjórnunarhvarfi), 250 μm ATP og 1 μCi / μl [γ-³²P] ATP, stuðpúði frá framleiðanda kínasa, og einn af eftirfarandi kínasa: CK2 (20 ng / μl; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / μl; Upstate), PKC (1.6 ng / μl; Calbiochem) eða p70S6K (2.5 mU / μl; Upstate). Tímabreytingarviðbrögð voru framkvæmd með því að fjarlægja 5 μl skammta úr hvarflausninni á tilteknum tímapunktum og bæta við jafnmiklu magni af 4 × draga úr Laemmli próteinsýni stuðpúði. Michaelis-Menten hreyfiorka fyrir CK2 viðbrögð voru ákvörðuð við empirískt skilgreind, línuleg stöðug skilyrði. Þessi viðbrögð voru framkvæmd í 15 mín í rúmmáli 10 μl sem innihélt 2 ng / μl ensím, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [γ-³²P] ATP og N-His (6) ΔFosB styrkur allt frá 2.5 – 30 μm. Öll viðbrögð voru framkvæmd við 30 ° C í vatnsbaði. Eftir SDS-PAGE og litun á hlaupinu með Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad) var hlaupið þurrkað og ³²P-fosfat innlimun var metin með greining á fosfórmyndun (sjá hér að neðan, magngreining gagna, útreikninga og tölfræði).

Tvívídd fosfóepteptíð kort og fosfóamínósýru greining.

Báðar þessar greiningar voru gerðar eins og lýst er Ploegh og Dunn (2000). Í stuttu máli, þurr hlaup brot sem innihalda ³²P-merkt ΔFosB (annað hvort frá vitro viðbrögð eða frá ónæmisfrumum efnaskipta merktra frumna), voru skorin út, þurrkuð, þvegin og sett í meltingarfærasjúkdóm. Flotvatnið sem innihélt tryptic meltingarafurðirnar var frostþurrkað og frostþurrkað þvegið nokkrum sinnum og blandað aftur í 10 μl af rafskautabuffi, pH 1.9. Sýninu (3 μl) var sást á sellulósa þunnlags litskiljun (TLC) plötu (Analtech, Newark, DE) og aðskilin í einni vídd með rafgreiningu og hinni víddinni með hækkandi TLC. Sýnt var fram á fosfóepteptíð kort með sjálfvirkri myndgreiningu og fosfórmyndun. Fyrir greiningu á fosfóamínósýru var 2 μl af meltingartruflunum sem var búið að blanda saman í rafskautabuffi frekar með HCI vatnsrofi við 105 ° C í 25 mín. Í 3 m HCl undir N₂ andrúmsloft. Viðbrögðin voru stöðvuð með sexföldun þynningu í vatni, og blandan var frostþurrkuð. Frostþurrkað var resuspended í 5 μl af rafskautabuffi, pH 1.9, og sást á sellulósa TLC plötu ásamt fosfó-Ser, -Thr og -Tyr stöðlum. Rafskaut var framkvæmt yfir helmingi af lengd TLC plötunnar með því að nota rafskautabuff, pH 1.9, og síðan var platan flutt í pH 3.5 stuðpúðann og rafgreining var framkvæmd til fulls. Fosfóamínósýru staðlarnir voru sýndir með því að úða TLC plötunni með 1% (v / v) ninhydrin lausn í asetoni, og ³²P-merkt amínósýru sýni voru bæði sýnd með sjálfvirkri myndgreiningu og fosfórmyndun.

siRNA af völdum CK2α slegið niður.

Við notuðum RNA truflunaraðferð til að fella niður stig CK2 (Di Maira o.fl., 2005). PC12 frumur voru settar á kollagen I-húðaða sex holu plötum til að ná ∼70 – 80% ármót daginn eftir, þegar þær voru tímabundnar transfected með 20 nm (lokastyrkur) annaðhvort ekki miðandi siRNA eða siRNA beint í átt að mRNA hvata α undireining rotta CK2, með 5 μl af umbrotsefninu SilentFectin (Bio-Rad) og fylgja leiðbeiningum framleiðanda. Um það bil 24 klst. Seinna voru frumur skammvinnir transfekteraðir með ΔFosB plasmíði, eins og fram kemur hér að ofan. Um það bil 24 klst. Seinna (∼48 klst. Eftir siRNA transfection) voru frumur látnar undir annað hvort ³²P efnaskiptamerkingar eða púls eltingargreining eins og lýst er hér að ofan. Eftirfarandi fjögur CK2α siRNAs voru notuð með svipuðum niðurstöðum: 5'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ', 5'P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3', 5'P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3 ', 5'P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU3' (Dharmacon, Lafayette, CO). Sem neikvæð stjórn notuðum við Hljóðdeyfir neikvæð stjórn #3 siRNA frá Ambion (Austin, TX). Fylgst var með umfangi CK2-niðurbrots með ónæmisblöðru með því að nota and-CK2 fjölklóna mótefni (verslun # 06-873 frá Upstate) yfir nótt við 1: 1000 þynningu. ß-Tubulin var notað sem hleðslustýring og greind með einstofna mótefni (verslun # 05-661 frá Upstate) yfir nótt við 1: 20,000 þynningu.

Stökkbreyting á vefsvæðum.

Stökkbreytingu Ser27 til Ala eða Asp var framkvæmd með því að nota Quick Change Site-beint Mutagenesis sett (Stratagene, La Jolla, CA) og fylgja leiðbeiningum framleiðanda. Til að koma Ser27 stökkbreytingunum í mouseFosB prótein í músinni voru eftirfarandi stökkbreytingar á stökkbreytingum notaðir. Ser27 til Ala: (öfuggrunnur) 5′GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 ′. Ser27 til Asp (áfram grunnur) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 ′. Stökkbreyttu undirstöðurnar eru feitletraðar og Ser27 merkjamálið er skáletrað.

Lífupplýsingafræði.

Leitað var að mögulegum fosfórýlunarstöðum og kínasa fyrir osFB með því að senda próteinröð músarinnar í sérhæfða gagnagrunna þar á meðal ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost o.fl., 2004) og NetPhosK (Blom o.fl., 2004).

Magngreining gagna, útreikninga og tölfræði.

Magn próteina sem er til staðar í PVDF eða nitrocellulose himnu var magngreint með Storm PhosphorImager og meðfylgjandi ImageQuant hugbúnaði (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). Í frumuræktinni og heila sneið fosfórýleringarannsóknum voru gildin fengin fyrir ³²P-merktu próteini var síðan deilt með gildunum sem fengust fyrir heildarfosB, og gefin upp sem hlutfall. Í vitro rannsóknir á fosfórun, magn af ³²P-merkt ΔFosB á hverja mól af ΔFosB (stoichiometry) var reiknað eins og lýst var áður (Sahin o.fl., 2004). Allar mælingar voru gerðar innan línusviðs tækisins sem notað var. Hreyfiorki voru reiknuð út með því að nota Michaelis-Menten líkanið V = V_max[S] / ([S]+K_M) Og V_max = k₂[E_Samtals]. Helmingunartíminn (t_1/2) af ΔFosB og FosB voru metin út frá púls-elta lóðunum (með því að nota þá ólínulegu aðhvarf sem best passaði gagnapunkta) og samsvara þeim tíma þegar magn próteins sem er eftir er 50% af upprunalegu. Í öllum tölum eru niðurstöðurnar sem sýndar eru dæmigerðar fyrir að minnsta kosti tvær til þrjár óháðar tilraunir. Í öllum myndritum eru gögnin sem eru sýnd meðaltöl ± SEM (3 ≤ n ≤16). Tölfræðileg þýðing mismunanna var metin með því að nota óparað t próf, leiðrétt fyrir marga samanburð og stjörnum gefur til kynna p ≤ 0.05.

Fyrri hluti Næsta kafli

Niðurstöður

ΔFosB er óvenju stöðugur umritunarstuðull

Þó að við höfum áður velt því fyrir okkur að osFosB sé tiltölulega stöðugur umritunarstuðull (Nestler o.fl., 2001), ekki hefur verið framkvæmt bein greining á veltupróteini próteinsins til þessa. Til að takast á við þessa spurningu gerðum við tilraunir til að elta pulsu með PC12 frumum, sem hafa verið mikið notaðar sem taugalíkar frumur, þar sem osFosB var tímabundið tjáð með sýkingu með raðbrigða herpes simplex vírus (HSV-ΔFosB). Nýjuð prótein voru merkt með efnaskiptum ³⁵S-Met / Cys, og niðurbrotsmynstrið ³⁵S-merkt ΔFosB (³⁵Fylgst var með S-osFosB með ónæmisútfellingu frá frumulýsötum sem fengust á ýmsum tímapunktum eftir að geislamerktu amínósýrurnar voru fjarlægðar. Greining á ónæmisfrumunum með SDS-PAGE og sjálfvirkri myndgreiningu leiddi í ljós að helmingunartími ΔFosB í PC12 frumum er ∼10 klst. (Fig. 1). Þessar niðurstöður sýna að helmingunartími ΔFosB er hærri en hjá flestum hvata uppskriftarþátta (sjá umfjöllun), þar með talið FosB í fullri lengd, en greint hefur verið frá helmingunartíma í frumuræktun ∼90 mín. (Dobrazanski o.fl., 1991; Carle o.fl. 2004). Að auki er rétt að taka fram að niðurbrot ΔFosB passar ekki fyrsta stigs veldisfallsferli, heldur er það tvífasískt, byrjar með hægari niðurbrotshraða. Þetta bendir til tilvist fleiri en einnar FosB tegunda og / eða fleiri en einnar niðurbrotsferðar.

Skoða stærri útgáfu:

Hlaða niður sem PowerPoint Slide

Mynd 1.

ΔFosB er óvenju stöðugur umritunarstuðull. Helmingunartími ΔFosB er ∼10 klst. Í frumurækt. ΔFosB var tjáð í PC12 frumum með annað hvort sýkingu með HSV-ΔFosB eða skammvinnri transfection með ΔFosB sem innihalda plasmíð, og frumur voru látnar gangast undir tilraunir með púls eins og lýst er í Efnum og aðferðum. Jafngildar niðurstöður fengust óháð aðferðinni sem notuð var til að ofþjappa ΔFosB. Myndin sýnir tímaferli (og dæmigerðra sjálfvirkrar aðgreiningar) ΔFosB niðurbrots. Gögnin sem teiknuð eru eru meðaltal ± SEM af að minnsta kosti 15 einstökum gagnapunkta fengnum úr að minnsta kosti fimm óháðum tilraunum. Til samanburðar er greint frá helmingunartíma FosB í fullri lengd.

ΔFosB er fosfóprótein í heila

Við höfum haft þá tilgátu að breyting ΔFosB eftir umskiptingu geti stuðlað að greinilegum stöðugleika þess. Vegna þess að sýnt hefur verið fram á að fosfórmyndun mótar virkni umritunarþátta á margan hátt, þar með talið stöðugleika þeirra (sjá til skoðunar Desterro o.fl., 2000; Whitmarsh og Davis, 2000), við könnuðum hvort ΔFosB er fosfóprótein. Í þessu skyni var framkallað ΔFosB tjáning í heila rottu með langvarandi ECS, meðferð sem vitað er að örvar mikið magn af osFosB, einkum í framan heilaberki (Hope o.fl., 1994a). Einn dag eftir síðustu ECS meðferð, þegar osFosB gildi eru áfram há, voru þunnar framan barkalögsneiðar gerðar og merktar með efnaskiptum með ³²P-ortófosfat. Samsíða sneiðar voru ekki geislamerkaðar og þær voru notaðar til að greina heildarfosb stig. Eftir ónæmisfrumnafslátt með sérstöku and-FosB / osFosB mótefni og aðskilnaði ónæmisframsoguðu próteina með SDS-PAGE, fosfórýlerað ³²P-merkt ΔFosB greindist með sjálfvirkri myndgreiningu en alls ΔFosB fannst við ónæmisblokka. Þessi greining leiddi í ljós að osFosB er fosfórýlerað í heila eins og sést af sérstöku ³²P-merkt band af N35 kDa sem er til staðar í langvarandi meðferðarheilasýni, en er nánast ógreinanlegt í samanburðarmeðferðinni sem meðhöndluð var (Fig. 2A). Þetta er í samræmi við þá staðreynd að ef ekki er um langvarandi örvun að ræða, eru grunnþéttni ΔFosB mjög lág. Sérhæfni ónæmisfrumnafarviðbragðsins er sýnd með skorti á merki í ónæmu IgG botnfallinu.

Skoða stærri útgáfu:

Hlaða niður sem PowerPoint Slide

Mynd 2.

ΔFosB er fosfóprótein í heila. A, ΔFosB er fosfórýlerað í heila. Innrænt Δ FosB var framkallað í heila rottu með langvarandi ECS meðferð eins og lýst er í Efni og aðferðum. Skerfisliðar í framan voru merktar með efnaskiptum ³²PH₃PO₄ í nokkrar klukkustundir. Eftir samsöfnun á sneiðunum var osFosB ónæmisútfellt og fosfórýrað ΔFosB (³²P-osFosB) fannst með sjálfvirkri myndgreiningu (efsta spjaldið). Heildar ΔFosB í ógeislavirkum ónæmisfrumum greindist með ónæmisblöðru (botnborð). Sem neikvæður samanburður er sýnt ónæmisfellingu dýrs sem meðhöndlað var með skömmtum og ónæmis IgG. B, Fosfórýleringarsetur frambjóðenda og kínasa með samsvarandi forspárstig fyrir mouseFosB próteinröð músarinnar voru fengin með lífupplýsingagreiningu. Frambjóðendasíðurnar með hærri forspárgildi eru auðkenndar í próteinsröðinni og eru taldar upp í töflunni. DNA-bindandi (grundvallaratriði) lénið og rennilás rauðkorna eru feitletruð í próteinröðinni. C, D, ΔFosB fosfórun er aukin með Ser / Thr fosfatasa hemlinum OA. C, ³²P-Δ FosB gildi í ónæmisfrumum úr framanverðum barkalögsneiðum merkt í fjarveru (Ctr) eða nærveru 100 ng / ml OA (línurit og toppborð) voru greind með sjálfvirkri myndgreiningu. Neðsta spjaldið sýnir samtals ΔFosB sem greinist í ónæmisfrumum úr ómerktum sneiðum með ónæmisblokka. D, PC12 frumur voru smitaðar með HSV-osFosB eða HSV-LacZ (vektor) og umbrotnar með efnaskiptum með ³²PH₃PO₄ í fjarveru (Ctr) eða nærveru 100 ng / ml OA. ³²P-ΔFosB gildi í ónæmisfrumubörnum greindust með myndrannsóknargreiningu (myndrit, toppborð). Neðsta spjaldið sýnir heildarFosB sem greinist í frumulýsötum með ónæmisblokka.

Sem fyrsta skref í átt að því að koma í ljós hvaða kínasa (s) og staður / staðir taka þátt í ΔFosB fosfórýleringu, settum við amínósýruröð sína fyrir nokkrar lífupplýsingagreiningar. Þetta leiddi í ljós að þrátt fyrir að ΔFosB innihaldi enga Tyr-fosfórýlunargildissíður, þá inniheldur það nokkra Ser / Thr kínasasáttmála-staði, þar á meðal þrjá CaMKII-staði, þrjá CK2-síður og tvo PKC-staði með mjög háa forspárgildi fyrir fosfórýleringu (Fig. 2B). Ef osFosB er aðeins fosfórýrað á Ser eða Thr leifum, eins og spáð er með lífupplýsingafræði, ætti að breyta verulega fosfórun þess með virkni Ser / Thr fosfatasa. Til að prófa þessa tilgátu merktum við framan barksteris sneiðar með ³²P-ortófosfat í viðurvist eða fjarveru OA, Ser / Thr próteinfosfatasa hemils. Eins og sést á Mynd 2C, OA olli mikilli (∼2.5-falt) aukningu árið ³²P-osFosB. Það olli einnig litlum aukningu á heildar stigum FosB, sem er í samræmi við fyrri skýrslur sem tengdu krabbameinsvaldandi áhrif OA við getu þess til að örva nokkur strax snemma gen, þar á meðal Fos prótein (Miller o.fl., 1998; Choe o.fl., 2004). Nettó niðurstaðan er veruleg aukning (∼60%) í fosfórýleruðu atedFosB stigum.

Við könnuðum þá hvort PCFosB sýndi fosfórýleringamynstur svipað því sem sést í heila í PC12 frumum, sem eru færari fyrir tilraunameðferð. Við tjáðum ΔFosB í PC12 frumum með sýkingu með HSV-ΔFosB og merktum efnafræðilega frumurnar með ³²P-ortófosfat í nærveru eða fjarveru OA. Árangursrík tjáning og ónæmisfrestur próteinsins frá HSV-osFosB-sýktum frumum er sýnd með nærveru bæði í ónæmisblöðru (Fig. 2D, neðri spjaldið) og sjálfvirka myndgreininguna (efsta spjaldið) á ∼35 kDa band, fjarverandi í vektor-smituðu frumunum. Eins og kom fram í heila olli OA lítil aukning á heildar stigum FosB en mun meiri (um það bil tvíþætt) aukning í ³²P-osFosB, sem leiddi til verulegrar (∼50%) nettóaukningar osFosB fosfórun. Ennfremur, í samræmi við lífupplýsingaspárnar, leiddi meðferð PC12 frumna með Tyr fosfatasa hemli ekki marktækum breytingum á ³²P-ΔFosB stig (gögn eru ekki sýnd). Saman leiddu þessar niðurstöður í ljós að ΔFosB er fosfórýlerað á Ser og / eða Thr leifum í heila og í PC12 frumum og staðfestu að hið síðarnefnda væri gott frumuræktarkerfi til að kanna frekari fosfórýleringu og niðurbrotssnið ΔFosB.

CK2 en ekki PKC eða CaMKII fosfórýlat ΔFosB vitro

Eins og lýst er hér að ofan sýndi greining á osFosB amínósýruröð háum spágildum fyrir CK2, PKC, og CaMKII fosfórýleringarstaði. Til að ákvarða hvaða af þessum kínasa getur fosfórýlat FosB, gerðum við röð af vitro fosfórunarviðbrögð með hreinsuðum kínasa og hreinsuðum raðbrigða ΔFosB. Eins og sést á Mynd 3A, af þremur frambjóðandi kínasa, aðeins CK2 fosfórýlerað ΔFosB á verulegan hátt. Að auki voru nokkrir aðrir kínasa prófaðir (td GSK3 og p70S6K) en tókst ekki að fosfórlera verulega ΔFosB (gögn ekki sýnd). Viðbótarlýsing á CK2 viðbrögðum með greiningum á tímabrautum leiddi í ljós að þessi kínasa getur hvatað aðlögun ∼0.5 mól af fosfati á hverja mól af osFosB (Fig. 3B). Sú staðreynd að CK2 getur fosfórýlerað ΔFosB vitro að umtalsverðri stoichiometry (∼50%) er vísbending um lífeðlisfræðilega viðeigandi viðbrögð. Við könnuðum þá hreyfiorka þessarar viðbragðs með því að rækta CK2 í nærveru vaxandi magns af hreinsuðu ΔFosB og við komumst að því að CK2 fosfórýlat atesFosB með a V_max af 5.8 pmól · mín^-1 · Μg^-1 af ensími, a K_M af 18.4 μm, og a k_köttur af 0.2 / s (Fig. 3C). Gildin, sem fengin eru fyrir þessar hreyfiorka, styðja enn frekar á lífeðlisfræðilega mikilvægi þessarar viðbragða. Til dæmis, K_M af CK2 fyrir DARPP32, eitt þekktasta undirlag þess, er 3.4 μm, og k_köttur er ∼0.3 / s (Girault o.fl., 1989); the K_M fyrir ATP er á bilinu ∼10 – 40 μm (Cochet o.fl., 1983; Silva-Neto o.fl., 2002), og það fyrir kasein er á bilinu ∼10 – 50 μm (Meggio o.fl., 1977; Pyerin o.fl., 1987). Saman benda þessar upplýsingar til þess að ΔFosB sé jákvætt undirlag fyrir CK2 vitro.

Skoða stærri útgáfu:

Hlaða niður sem PowerPoint Slide

Mynd 3.

CK2 en ekki PKC eða CaMKII fosfórýlat ΔFosB vitro. Rafeindatækni (efsta spjaldið) sýnir fosfórýleraða vöruna og Coomassie-lituð hlaup (botnspjaldið) sýnir heildarFosB sem er til staðar í hvarfinu. A, Hreinsað raðbrigði ΔFosB var tekið undir vitro fosfórun með ýmsum kínasa kandídatum (þar af þrír sýndir). B, Tímabraut og holrannsóknargreiningar benda til þess að CK2 geti fosfórýlerað ΔFosB vitro með stoichiometry af ∼50%. C, Hreyfiorka á CK2 viðbrögðum leiddi í ljós að osFosB er jákvæðni vitro undirlag. Línubreyting hvarfsins er sýnd á tvöföldu gagnkvæmu samsæri (neðst), en hreyfiorka var fengin úr Michaelis-Menten ferlinum (efst).

CK2 mótar fosfórýleringu og stöðugleika ΔFosB í ósnortnum frumum

Til að meta lífeðlisfræðilega mikilvægi CK2-miðluðs fosfórýleringar á osFosB, gerðum við samanburðarfosfóeptept kortlagningu með því að nota vitro fosfórýrað og PC12 klefi-fosfórýlerað ΔFosB. Eftir SDS-PAGE og hlaup skolun ³²P-ΔFosB (frá vitro viðbrögð eða frá ónæmisfrumun ³²P-merktar frumur), próteinið var melt með trypsíni, og fosfópeptíðunum sem fengust voru sett í tvívítt aðskilnað. Þessi greining leiddi í ljós að aðal fosfópeptíðið frá CK2 viðbrögðum komst út með einu af tveimur helstu fosfóepteptíðum frá ΔFosB fosfórýleruðu í PC12 frumum (Fig. 4A), en fosfópeptíðin, sem voru afleiðing af PKC eða CaMKII (gögnum ekki sýnd), gerðu það ekki. Það var annað ΔFosB fosfóepteptíð til staðar á kortinu frá PC12 frumum, en vegna vanhæfni einhvers kínasa sem við höfum prófað til að mynda svipað fosfepteptíð vitro, við vitum ekki eins og er hvort þetta annað fosfóepteptíð inniheldur fosfórýleringarstað sem er frábrugðinn hinu fosfóepteptíðinu eða hvort það táknar sérstakt tryptískt peptíð sem inniheldur sama fosfórleringarstað.

Skoða stærri útgáfu:

Hlaða niður sem PowerPoint Slide

Mynd 4.

CK2 mótar fosfórýleringu og stöðugleika ΔFosB í ósnortnum frumum. A, CK2 en ekki PKC virðist fosfórýlat ΔFosB í frumum. Tvívídd fosfóepteptíð kort af ΔFosB fosfórýlerað með CK2 eða PKC vitro eða með ósnortnum PC12 frumum. Örvarnar sýna upptöku CK2-fosfórýleruðu peptíðsins en ekki PKC-fosfórýleruðu með einu af ΔFosB fosfóepteptíðunum sem fengnar voru úr PC12 frumum. B, ΔFosB fosfórun í PC12 frumum er aukin með því að meðhöndla frumur með öflugri CK2 virkjunar sæði (SP) og minnka með því að meðhöndla CK2 hemilinn DRB. Aftur á móti hafði phosphFosB fosfórýlering í PC12 frumum ekki áhrif á meðferð með hvorki PKC virkju (PMA) né PKC-sértækum hemli calphostin-C (Calph). Sýnt er fulltrúa sjálfstætt aðgerð (toppborð) og ónæmisblokkur (neðri spjaldið). C-F, Áhrif CK2 virkni á ΔFosB stöðugleika. Tölurnar sýna tímaferli (og dæmigerðra sjálfvirkrar aðgreiningar) ΔFosB niðurbrots. PC12 frumur sem tjá tímabundið ΔFosB voru látnar fara í tilraunir með púls elta í fjarveru eða í viðurvist CK2 hemilsins DRB (C), CK2 virkjunar sæði (D), eða breiðvirka kínasa hemillinn H-8 (E), sem var notað til að stjórna ósértækum áhrifum DRB. F, Áhrif þess að slá niður hvata undireiningar CK2 á ΔFosB stöðugleika. PC12 frumur voru transfected með annaðhvort siRNA (Ctr) sem ekki voru markvissir eða siRNA sem miðuðu rottum CK2a og 24 h síðar transfected með ΔFosB plasmíði. Efsta spjaldið sýnir ónæmisblöðrur af heilfrumulýsötum sem sýna áhrif CK2 siRNA á CK2 og ΔFosB próteinmagn. Samsvarandi ónæmisblöðru fyrir ß-túbúlín er sýnd sem hleðslustýring.

Til að fjalla frekar um lífeðlisfræðilega mikilvægi CK2 sem ΔFosB kínasa, meðhöndluðum við ΔFosB-tjáandi PC12 frumur með tveimur lyfjum sem breyta CK2 virkni. Eins og sést á Mynd 4B, ΔFosB fosfórun var minnkuð með meðhöndlun PC12 frumna með frumu gegndræpi CK2 hemlin DRB (Meggio o.fl., 1990; Szyszka o.fl., 1995), og jókst með meðferð með pólýamínsæðinu, sem vitað er að er öflugur CK2 virkjari (Cochet og Chambaz, 1983; Meggio o.fl., 1983). Aftur á móti er meðhöndlun PC12 frumna með PKC hemlinum calphostin-C (Kobayashi o.fl., 1989; Tamaoki o.fl., 1990) eða PKC virkjarinn PMA (Schmidt og Hecker, 1975; Beh o.fl., 1989) leiddi ekki til verulegra breytinga á osFosB fosfórun. Þegar um er að ræða PMA jókst lítilsháttar (og ekki marktæk) hækkun á ³²P-ΔFosB mætti rekja til hækkunar á heildar ΔFosB stigum af völdum þessa lyfs; raunar hefur verið greint frá því að phorbol esterar örvi tjáningu nokkurra Fos fjölskyldupróteina, þar á meðal FosB (Yoza o.fl., 1992; Suh o.fl., 2004). Ennfremur er meðhöndlun frumna með sértæka frumu gegndræpi CaMKII hemill m-AIP (Ishida og Fujisawa, 1995; Stevens o.fl., 1999) olli heldur ekki minni ΔFosB fosfórun (gögn ekki sýnd). Saman eru þessar niðurstöður í samræmi við okkar vitro niðurstöður og benda til þess að ósnortinn frumur ΔFB sé líklega fosfórýleraður með CK2 en ekki PKC eða CaMKII. Sú staðreynd að CK2 hömlun kemur ekki alveg í veg fyrir ΔFosB fosfórýleringu bendir til þess að viðbótar fosfórýlunarstaðir séu í próteini.

Við skoðuðum næst hvort CK2 gegnir hlutverki í veltu ΔFosB og þar með í stöðugleika þess. Í þessu skyni gerðum við púls-elta tilraunir með því að nota osFosB-tjáandi PC12 frumur sem voru meðhöndlaðar með annað hvort CK2 hemlinum eða CK2 virkjaranum sem notaður var í fosfórýlunarrannsókninni. Eins og sést á Mynd 4C, meðhöndlun frumna með CK2 hemlinum DRB hafði veruleg áhrif á veltuhlutfall ΔFosB, sem sést af breytingu á lögun niðurbrotsferils hans, frá tvífasa til ferils sem er nær því sem veldisfall. Hins vegar olli nærveru CK2 virkjunar sæðisins verulegri lækkun á niðurbrotshraða ofFosB, sem leiddi til uppsöfnunar próteins á fyrstu klukkustundum eltingarinnar (Fig. 4D).

Eins og á við um marga kínasa virkjara og hemla, getur sæði og DRB haft efnaskiptaáhrif utan mótunar á virkni CK2. Reyndar hefur verið sýnt fram á að DRB hamlar umritunarstuðul IIH (TFIIH) tengdum kínasa (Yankulov o.fl., 1995), sem hefur í för með sér hömlun á RNA fjölliðu II-miðluðu umritun. Þar sem þessi áhrif gætu hugsanlega haft áhrif á stöðugleika ΔFosB, greindum við áhrif breiðvirka kínasa hemilsins H-8 (Hidaka og Kobayashi, 1992) á ΔFosB veltu í styrk (200 μm) sem vitað er að hamlar TFIIH-tengdum kínasa en ekki CK2 (Yankulov o.fl., 1995). Eins og sýnt er í Mynd 4E, meðferð með H-8 hafði ekki áhrif á veltuhlutfall ΔFosB. Svipaðar niðurstöður fengust með H-7, öðrum breiðvirku kínasa hemli, notaður við styrk sem hindrar TFIIH tengda kínasa en ekki CK2 (gögn ekki sýnd). Þessi gögn styðja ennfremur þá túlkun að minnkun á ΔFosB stöðugleika af völdum DRB sé líklegast rakin til hömlunar á CK2.

Til að staðfesta frekar hlutverk CK2 í ΔFosB veltu, könnuðum við afleiðingar þess að slá niður CK2 í gegnum siRNA. Við gerðum þessar tilraunir með PC12 frumum sem voru fyrst transfected með siRNA stjórnun (ekki miðun) eða siRNA sem miðar á mRNA hvata undireiningar rotta CK2 (CK2α) og 24 klst síðar transfected með ΔFosB. Eins og sést á Mynd 4F, aðlögun með CK2α siRNA á skilvirkan hátt og sló sérstaklega niður CK2α próteinmagn án þess að hafa áhrif á osFosB stig (efsta spjaldið). Púls eltingargreining leiddi í ljós að það að slá niður CK2 leiddi til verulegrar aukningar á turnoverFosB veltuhraði eins og sést af hraðari niðurbroti próteinsins. Sú staðreynd að hindra virkni CK2 (hvort sem er með DRB meðferð eða siRNA) eykur veltu ΔFosB og leiðir til þess að hægfara hluti tvífasa ferilsins hvarf, en CK2 örvun eykur hægt stig ferilsins, veitir sterkan stuðning við hugmyndin að CK2 gegni hlutverki við að stjórna ΔFosB stöðugleika.

CK2 fosfórýlöt ΔFosB á Ser27

Til að byrja að bera kennsl á staðina / staðina á osFosB fosfórýlerað með CK2, gerðum við fosfó-amínósýru greiningu á raðbrigða ΔFosB fosfórýleruðu með CK2 vitro og ΔFosB fosfórýlerað í PC12 frumum. Þessar tilraunir leiddu í ljós að í báðum tilvikum var eina fosfó-amínósýran sem fannst var fosfó-Ser (Fig. 5A). Þessi uppgötvun, ásamt stoichiometry fenginni fyrir CK2 vitro fosfórunarviðbrögð (∼50%) (Fig. 3B) og nærveru aðeins einn marktækur blettur á CK2 fosfóepteptíð kortinu (Fig. 4A), bendir til þess að CK2 fosfórun á ΔFosB sé líklega takmörkuð við eina serínleif. Þessi ályktun er í samræmi við greiningar á fosfórlónunarsamstöðu (Fig. 2B), sem spáði aðeins einum frambjóðandi seríni, þ.e. Ser27, fyrir CK2. Taxonomic greining leiddi í ljós að Ser27 er mjög varðveitt með þróun meðal fjölskyldumeðlima Fos (Fig. 5B), sem bendir til að það geti haft mikilvæga lífeðlisfræðilega virkni.

Skoða stærri útgáfu:

Hlaða niður sem PowerPoint Slide

Mynd 5.

CK2 fosfórýlat ΔFosB á Ser27. A, Fosfóamínósýrugreining á CK2-fosfórýleruðu (vitro) og PC12 frumufosfórýlerað ΔFosB sem sýnir að í báðum tilvikum er aðalleifin sem fosfórýleruð er serín. B, Krossategundagreining á FosB / ΔFosB amínósýruröð leiddi í ljós mikla varðveislu Ser27 meðal fjölskyldumeðlima Fos frá mönnum til sebrafisks (dökk hápunktur). Hins vegar er súrleifin í stöðu + 3, sem er nauðsynleg fyrir CK2 samkvæmisstaðinn, ekki varðveitt (ljós ljós). C, HeLa frumur voru transfected tímabundið með annað hvort villtri gerð ΔFosB (WT) eða ΔFosB sem innihélt punktbreytingu til að koma í stað Ser27 með Ala (S27A). Frumur voru umbrotnar merktar með ³²PH₃PO₄ og meðhöndlað með farartæki eða með sæði (SP) til að virkja CK2. Sýnt er á dæmigerð sjálfstæðaútfelling (efsta spjaldið) og ónæmisblöðru (neðri spjaldið) af fengnu osFosB ónæmisfrumunum. Ónæmisfrumun á spotta-transfected frumum (vektor) er sýnd.

Til að ákvarða hvort Ser27 er fosfórýlerað í ΔFosB, stökkbreyttum við þessa leif til Ala og greindum afleiðingarnar á fosfórýleringu próteinsins. Í þessu skyni notuðum við HeLa frumur (sem hægt er að transfected með meiri skilvirkni) til að tjá tímabundið annað hvort WT eða S27A stökkbrigði ΔFosB. Um það bil 24 klst. Eftir transfection voru frumurnar efnaskiptar merktar með ³²P-ortófosfat, og heilfrumulýsata voru framleidd. Eftir ónæmisframsog og SDS-PAGE, ³²P-osFosB greindist með sjálfvirkri myndgreiningu og heildar ΔFosB með ónæmisblokka. Eins og sést á Mynd 5C (neðri pallborð), ΔFosB fannst ekki í vektor-transfected frumum, en frumur transfected með annað hvort WT eða S27A stökkbrigði ΔFosB tjáði próteinið með góðum árangri. Við fundum að S27A stökkbreytingin olli verulegri (∼30%) lækkun árið ³²P-ΔFosB stig (Fig. 5C, efsta spjaldið og línuritið), sem gefur til kynna að í lifandi frumum sé osFosB fosfórýlerað á Ser27. Í tilraun til að komast að því hvort í frumum Ser27 er örugglega fosfórýlerað með CK2, gerðum við saman getu CK2 virkjunar sæðisins til að breyta fosfórýleringu WT og S27A ΔFosB. Eins og við höfum áður séð í PC12 frumum (Fig. 4B), meðferð HeLa frumna með sæði hækkaði marktækt fosfórun á WT próteininu. S27A stökkbreytingin dró verulega úr þessum áhrifumFig. 5C) styður þá túlkun að Ser27 í ΔFosB sé lífeðlisfræðilegt undirlag fyrir CK2.

Fosfórun Ser27 stjórnar stöðugleika ΔFosB

Eftir að hafa komist að því að stöðugleiki isFosB minnkar þegar CK2 er hindrað og aukið þegar CK2 er virkjað (Fig. 4), og að CK2 fosfórýlöt ΔFosB á Ser27 (Fig. 5), spáðum við því að koma í veg fyrir fosfórun á þessum vef ætti að koma á stöðugleika í próteininu. Rannsóknir á púls elta sem gerðar voru með HeLa frumum tímabundið sem tjáðu annað hvort WT eða S27A stökkbrigði ΔFosB leiddu í ljós að eins og spáð var, leiddi S27A stökkbreytingin til marktækrar aukningar á hraða niðurbrots rateFosB og samhliða lækkun á helmingunartíma próteinsins (Fig. 6A). Við könnuðum þá hvort þetta regluverk komi einnig fyrir í taugafrumum eins PC12 frumulínu. Þessar tilraunir leiddu í ljós að eins og við höfum komið auga á í HeLa frumum, veldur stökkbreyting S27A-punkta stórkostlega lækkun á helmingunartíma ΔFosB í PC12 frumum (úr ∼11 til ∼4 klst.) (Fig. 6B). Sú staðreynd að þessi óstöðugleiki er svipuð og orsakast af CK2 hömlun eða niðurbroti (Fig. 4) veitir frekari stuðning við þá hugmynd að CK2-miðluð fosfórýlering Ser27 stýrir stöðugleika ΔFosB. Viðbótarupplýsingar um eftirlitshlutverk Ser27 fosfórýleringu á turnoverFosB próteinveltu fengust með því að nota fosfómímetískan Ser27 til Asp stökkbreytingu (S27D). S27D stökkbreytingin er talin fosfóímímísk, vegna þess að hún setur stóran neikvætt hlaðinn (karboxýl) hóp við amínósýru 27 og líkir þar með að hluta til við fosfórýleringu Ser27. Eins og sést á Mynd 6C, S27D stökkbreytingin olli gagnstæðum áhrifum S27A stökkbreytingarinnar og leiddi til próteina sem var marktækt stöðugra en WT próteinið. Svipað og þau áhrif sem fengust eftir virkjun CK2 (Fig. 4D), S27D stökkbreytingin leiddi til uppsöfnunar og jókst þannig ΔFosB stig fyrstu klukkustundir eltingarinnar.

Skoða stærri útgáfu:

Hlaða niður sem PowerPoint Slide

Mynd 6.

Fosfórun Ser27 stjórnar stöðugleika ΔFosB. A, C, Pulse-elta greining sem sýnir áhrif Ser27 fosfórýleringu á veltuhlutfall ΔFosB. Niðurbrotsnið og áætlaður helmingunartími villtra tegundar osFosB (WT), Ser27 til Ala stökkbrigðisins (S27A) og fosfómímetíska Ser27 til Asp stökkbrigðisins (S27D) eru sýndir. Sömu niðurstöður fengust í HeLa frumum (A) og PC12 frumur (B, C).

Ser27 fosfórun stöðugast ΔFosB með því að koma í veg fyrir niðurbrot proteasomal þess

Til að byrja að skýra fyrirkomulagið sem fosfórýlering á Ser27 stöðugleika ΔFosB, skoðuðum við getu proteasome hemla MG132 (Palombella o.fl., 1994; Tsubuki o.fl., 1996) og epoxomicin (Hanada o.fl., 1992; Kim og fleiri, 1999) til að móta niðurbrotshraða WT og S27A stökkbrigði ΔFosB. Púls-eltingartilraunir voru gerðar með því að nota PC12 frumur smitaðar með raðbrigða HSV sem tjáðu annað hvort WT eða S27A ΔFosB og voru meðhöndlaðar með annað hvort DMSO eða einum af tveimur próteasóm hemlum. Þessar tilraunir leiddu í ljós að þó að niðurbrotshraði WT próteins sé tiltölulega ónæmur fyrir nærveru annars hvors tveggja próteasome hemla (Fig. 7A), að S27A stökkbrigði er viðkvæm fyrir þessum lyfjum (Fig. 7B). Þetta bendir til þess að, ólíkt WT próteininu, sé S27A stökkbrigðið markmið um niðurbrot proteasomal. Reyndar gengu meðferð frumna með annað hvort MG132 eða epoxomicin til baka að fullu til baka áhrif S27A stökkbreytingarinnar á niðurbrotshraða ΔFosB, sem sést af aukningu á helmingunartíma S27A stökkbreytingarinnar úr ∼4 til ∼9 klst. Fyrir MG132 og til ∼ 12 klst. Fyrir epoxomicin (Fig. 7B). Saman benda þessar niðurstöður til þess að fosfórýlering á osFosB á Ser27 verndar próteinið gegn niðurbroti proteasomal og er því mikilvægt fyrir óvenjulegan stöðugleika þess.

Skoða stærri útgáfu:

Hlaða niður sem PowerPoint Slide

Mynd 7.

Fosfórun Ser27 stöðugar ΔFosB með því að koma í veg fyrir niðurbrot proteasomal þess. A, B, Pulse-elta greining með HSV-sýktum PC12 frumum sem sýna niðurbrotsnið og áætlaða helmingunartíma villtra tegundar ΔFosB (A) eða S27A ΔFosB (B) í fjarveru eða nærveru annars hvors tveggja próteasome hemla [MG132 og epoxomicin (Epoxo)]. Athugið þá staðreynd að hvorugt lyfið hefur veruleg áhrif á veltu villtra tegundar ΔFosB en meðferð frumna með hvorum tveggja próteasóm hemlinum leiddi til stöðugleika S27A ΔFosB. C, Fyrirmynd fyrir hlutverk Ser27 fosfórýleringu í getu ΔFosB til að miðla langtímaheilplastleika. Þegar það hefur verið örvað er hluti af ΔFosB stöðugur í heila með CK2-miðluðu fosfórýleringu S27. Þetta hefur í för með sér uppsöfnun þess sem aftur hefur í för með sér langvarandi breytingar á genatjáningu. Þessar stöðugu breytingar á tjáningu gena stuðla að stöðugu aðlögun hegðunar. Aftur á móti hefur affosfórun S27 af Ser / Thr fosfatasa PP1 og / eða PP2A afleiðingu á óstöðugleika próteins og vinnslu þess með mótmælendavélum.

Fyrri hluti Næsta kafli

Discussion

Í þessari rannsókn sýnum við að osFosB hefur helmingunartíma ∼10 klst. Í frumurækt, sem gerir það stöðugt miðað við FosB í fullri lengd og flestir aðrir framkallaðir uppskriftarþættir, sem helmingunartími frumuræktar getur verið eins stuttur sem nokkrar mínútur og fer sjaldan yfir 3 klst (Hann og Eisenman, 1984; Dobrazanski o.fl., 1991; Roberts og Whitelaw, 1999; Ferrara o.fl., 2003; Hirata o.fl., 2004). Að auki komumst við að því að ΔFosB er fosfórýlerað í heila og að fosfórun þess er viðkvæm fyrir PP1 / PP2A hemlinum okadaic sýru. Rannsóknir á frumurækt okkar sýna fram á að stöðugleiki FosB er mótaður með CK2, með hærri CK2 virkni sem stöðugar próteinið. Að lokum benda niðurstöður okkar til þess að CK2 fosfórýlöt ΔFosB á mjög varðveittu N endamörkum serine (S27) og sýni fram á að fosfórýlering S27 verndar ΔFosB gegn niðurbroti proteasomal. Við leggjum því til líkan þar sem fosfórýlering á osFosB á S27 af CK2 er mikilvægur reglur um veltu ΔFosB (Fig. 7C). Slík fosfórýleringstengd stöðugleiki ΔFosB er virkni mikilvægur vegna þess að sýnt hefur verið fram á að aukið magn ΔFosB í sérstökum heilaumdæmum beinlínis stjórnar fjölmörgum taugafrumum. in vivo og til að beita öflugum hegðunaráhrifum í dýralíkönum af nokkrum taugasjúkdómum (sjá Inngang).

Þrátt fyrir að fosfórýlering sé fljótleg og afturkræf leið til að stjórna umritunarvirkni tiltekinna umritunarþátta, svo sem CREB (cAMP svörunarþátta sem bindur prótein) (Bohmann, 1990), með því að breyta niðurbroti umritunarþátta veitir enn öflugara (minna auðveldlega afturkræft) reglugerð (Desterro o.fl., 2000). Uppskriftarþættir þar sem virkni þeirra er stjórnað á stigi niðurbrots þeirra eru NFκB (Desterro o.fl., 2000), c-Myc (Sears o.fl., 1999), og c-Fos (Ferrara o.fl., 2003), meðal annarra. Í mörgum tilvikum er fosfórýlering lykilstjórnandi fyrir stöðugleika umritunarstuðils, eins og sýnt hefur verið fram á c-Fos (Okazaki og Sagata, 1995; Tsurumi o.fl., 1995), Fos-tengt mótefnavaka-1 (Fra-1) (Hettuglasið og Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe o.fl., 2001), c-júní (Fuchs o.fl., 1996), JunB (Fuchs o.fl., 1997), ATF2 (Fuchs o.fl., 2000) og p53 (Buschmann o.fl., 2001). Rannsóknir okkar bæta þannig ΔFosB við þennan lista yfir uppskriftarþætti sem starfa með virkni eftir fosfórýleruðu háð stöðugleika.

CK2 er alls staðar nálægur og virkt Ser / Thr kínasi sem hefur> 300 meint hvarfefni sem tilgreindir hafa verið hingað til og er hluti af mörgum líffræðilegum ferlum, þ.m.t.Litchfield, 2003; Unger o.fl., 2004), streituviðbrögð við frumu (Yanagawa o.fl., 1997; Kato o.fl., 2003), og DNA viðgerðir og litskiljun enduruppbyggð (Barz o.fl., 2003; Krohn o.fl., 2003). Meira en þriðjungur af líklegri hvarfefni CK2 eru prótein sem taka þátt í stjórnun genatjáningar (Meggio og Pinna, 2003). Reyndar hefur verið sýnt fram á að CK2 er áberandi kjarnakínasa (Krek o.fl., 1992) (til skoðunar, sjá Yu et al., 2001) og til að hafa samskipti við bZIP lén nokkurra uppskriftarþátta (Yamaguchi o.fl., 1998). Sýnt hefur verið fram á að CK2-miðluð fosfórýlering mótar niðurbrot (annað hvort að auka eða minnka það) margra próteina, þar á meðal IkB (Schwarz o.fl., 1996), PTEN (Torres og Pulido, 2001), linsutenging (Yin o.fl., 2000), chromatin-tengt prótein HMG1 (Wisniewski o.fl., 1999) og nokkrir uppskriftarþættir eins og HMGB (Stemmer o.fl., 2002), Myf-5 (Winter o.fl., 1997), og c-Myc (Channavajhala og Seldin, 2002). CK2 er algengastur í heila (Alcazar o.fl., 1988; Girault o.fl., 1990) og hefur virkni þess verið beitt í mörgum þáttum heilastarfsemi, þar með talið lifun taugafrumna (Boehning o.fl., 2003), aðgreining (Nuthall o.fl., 2004), jónarásaraðgerð (Jones og Yakel, 2003; Bildl o.fl., 2004) og langvarandi aukningu og taugafrumum ()Diaz-Nido o.fl., 1992; Lieberman og Mody, 1999; Reikhardt o.fl., 2003).

Þrátt fyrir þessar vaxandi vísbendingar um hlutverk CK2 í stjórnun taugafrumna er lítið vitað um hvað stjórnar virkni þess. Talið er að CK2 sé virkilega virkur með reglugerð um getu þess til að fosfórlera sérstök hvarfefni og treysta að mestu leyti á breytingar á staðsetningu innanfrumna (td cýtósól vs kjarna) (Ahmed og Tawfic, 1994; Yu et al., 1999). Þessar upplýsingar vekja upp mikilvæga spurningu varðandi hvaða merki eru nauðsynleg til að framkalla ΔFosB uppsöfnun í heila eftir langvarandi örvun (Fig. 7C). Ein krafa er endurtekin virkjun fosB gen og örvun ΔFosB mRNA (Chen et al., 1995). Gögn okkar benda til þess að CK2 fosfórýlering á FosB skipti sköpum fyrir stöðugleika þess, sem bendir til þess að annað merki gæti verið nauðsynlegt fyrir langtímaáhrif ΔFosB á genatjáningu, nefnilega merki sem örvar fosfórun próteins með CK2. Þetta gæti falið í sér virkjun CK2 með einhverjum óþekktum fyrirkomulagi eða umbreytingu þess í kjarnann. Að öðrum kosti getur CK2 fosfórýlering af FosB verið myndandi, þannig að eins og ΔFosB prótein er þýtt til að bregðast við hverju áreiti, verður hluti þess fosfórýleraður og stöðugast þannig, þannig að með endurtekinni örvun safnast það upp að miklu magni í áhrifum taugafrumum.

Niðurstöður okkar sýna að CK2 og S27 eru líklega ekki eini kínasinn og staðurinn sem er ábyrgur fyrir ΔFosB fosfórýleringu, því hvorki hömlun á CK2 né S27A stökkbreytingunni tókst að koma í veg fyrir algerlega ΔFosB fosfórun. Að sama skapi, þá staðreynd að S27A stökkbreytingin hefur í för með sér 30% minnkun fosfó-osFosB heldur því fram að S27 sé megin fosfórýlunarstaður próteinsins. Við erum engu að síður að rannsaka aðra líklega kínasa og fosfórýlatset á osFosB. Á endanum mun það líka vera mikilvægt að greina fosfórýleringu S27 og allra annarra fosfórunarlóða í ΔFosB í heila in vivo eftir ýmsar tegundir af langvarandi örvun, til dæmis með notkun á litrófsgreiningum eða fosfósértækum mótefnum.

Eins og getið er hér að ofan er S27 í ΔFosB mjög varðveitt í gegnum þróunina og meðal annarra Fos fjölskyldupróteina. Samt sem áður er samkomusíðan fyrir CK2 ekki: eins og sést á Mynd 5B, aðeins FosB / ΔFosB (og Zebrafish xenolog), en ekki c-Fos eða Fra-2, hafa súr leifar við + 3, lykilákvörðunarefni CK2 fosfórýleringu (Marin et al., 1986; Meggio o.fl., 1994). Þannig getur skortur á CK2 fosfórýleringu á S27 skýrt hvers vegna önnur Fos fjölskylduprótein eru ekki eins stöðug og ΔFosB. En þetta skýrir ekki hvers vegna FosB í fullri lengd, sem hefur sama samkomulagsstað CK2 og ΔFosB, er ekki með jafnvægi. Við vitum ekki hvort FosB í fullri lengd er fosfórýlerað með CK2 á þessari varðveislu leifar. Einu skýrslur FosB (Skinner o.fl., 1997) og c-Fos (Okazaki og Sagata, 1995; Chen et al., 1996) fosfórun lýsir stöðum á C-enda svæði þessara próteina, sem er fjarverandi í entFosB. Hugsanleg fosfórun á FosB í fullri lengd og öðrum Fos fjölskyldupróteinum með CK2 krefst beinnar rannsóknar. En jafnvel þótt þau séu fosfórýleruð, er vitað að önnur Fos fjölskyldupróteinin innihalda myndefni á C-endum þeirra sem miða próteinin fyrir hratt niðurbrot (Papavassiliou o.fl., 1992; Jariel-Encontre o.fl., 1997; Acquaviva o.fl., 2002). Til dæmis hefur verið sýnt fram á að teygja á N21 leifum sem eru til staðar í C endanum á öllum Fos fjölskyldupróteinum, en ekki í ΔFosB, virkar sem óstöðugleika lén fyrir c-Fos (Acquaviva o.fl., 2001). Við fundum að þó að þessi röð óstöðugleika á svipaðan hátt FosB í fullri lengd (Carle o.fl., 2004), skortir þetta lén í ΔFosB ekki að fullu fyrir stöðugleika þess. Öllu heldur virðist samsetning fjarveru þessa C enda léns og Ser27 fosfórýleringu gera fulla grein fyrir u.þ.b. fimmfaldri mun á stöðugleika á milli FosB og FosB.

Þrátt fyrir að niðurbrot Fos-fjölskyldupróteina sé flókið og ekki skilið að fullu, virðist niðurbrot próteasóm vera helsta leiðin sem um ræðir (Salvat o.fl., 1999; Acquaviva o.fl., 2002; Ferrara o.fl., 2003). Gögn sem kynnt eru hér, þar sem próteasomal hemlar breyta ekki marktækt hraða ΔFosB niðurbrots, halda því fram að, ólíkt öðrum Fos fjölskyldupróteinum, ΔFosB forðist 26S proteasome og þetta gegnir meginhlutverki í stöðugleika þess. Við leggjum því til áætlun þar sem aukinn stöðugleiki ΔFosB má rekja til samsetningar tveggja meginþátta: (1) skorts á óstöðugleika lén C-stöðva og (2) fosfórun S27 með CK2.

Í stuttu máli, þessi rannsókn veitir vélrænni innsýn í af hverju ΔFosB, afurð strax snemma gensins fosB, er, ólíkt öllum öðrum Fos fjölskyldumeðlimum, tiltölulega langlíft prótein. Þrátt fyrir að talið sé að önnur Fos fjölskylduprótein miðli hraðri en skammvinnri áritunartengingu (Morgan og Curran, 1995), hlutfallslegur stöðugleiki ΔFosB veitir því getu til að miðla lengra umbreytingarbreytingum af völdum langvarandi örvunar. Þetta styður þá skoðun að osFB virki sem viðvarandi sameindaskipti í heila og breytir smám saman bráðum svörum í langvarandi aðlögun. Að bera kennsl á Ser27 fosfórýleringu sem aðalkerfi fyrir stöðugleika ΔFosB opnar nýja leiðir til að þróa leiðir til að stjórna virkni ΔFosB og þannig breyta langtímaáhrifum þess á tauga- og hegðunarplastleika.

Fyrri hluti Næsta kafli

Neðanmálsgreinar

Móttekið nóvember 21, 2005.
Endurskoðun fékk febrúar 21, 2006.
Samþykkt apríl 2, 2006.

Þessi vinna var studd af National Alliance for Research on Geizophrenia and Depression Young Investigator Award til PGU, National Institute for Drug Abuse (NIDA) National Research Service Award til PGU, og styrkir frá National Institute of Mental Health og NIDA til EJN We þakkar Dr. James Bibb fyrir hjálpina við vitro mælingar á fosfórun, Dr. Ming-Hu Han fyrir hjálp sína við gerð heilasneiða sem notaðar eru við efnaskiptamerkingar, og Dr. Rachael Neve til að hjálpa henni við umbúðir raðbrigða HSV.
Núverandi ávarp G. Rudenko: Lífvísindastofnun og lyfjafræðideild Michigan-háskóla, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
Bréf skal beint til Eric J. Nestler, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070. Netfang: [netvarið]

Fyrri hluti

Meðmæli

Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) Auðkenning á C-flugstöðvum þrípeptíð mótífs sem tekur þátt í stjórnun á hröðu niðurbroti á proteasomal af C-Fos frumu-ónópróteini við G (0) -S-S fasa umskipti. Oncogene 20:7563-7572.

Abstract

Efni og aðferðir

Frumur spendýra og DNA smíði.

Púls-elta tilraunir.

Dýr og langvarandi rafflæðismeðferð.

32 P efnaskiptamerkingar.

Efna- og frumuræktarmeðferðir.

Δ FosB ónæmisfrestun, ónæmisblöðrun og sjálfdreifingargreining.

Ofþrýstingur og hreinsun raðbrigða ΔFosB frá skordýrafrumum.

In vitro rannsóknir á fosfórun.

Tvívídd fosfóepteptíð kort og fosfóamínósýru greining.

siRNA af völdum CK2α slegið niður.

Stökkbreyting á vefsvæðum.

Lífupplýsingafræði.

Magngreining gagna, útreikninga og tölfræði.

Niðurstöður

ΔFosB er óvenju stöðugur umritunarstuðull

ΔFosB er fosfóprótein í heila

CK2 en ekki PKC eða CaMKII fosfórýlat ΔFosB vitro

CK2 mótar fosfórýleringu og stöðugleika ΔFosB í ósnortnum frumum

CK2 fosfórýlöt ΔFosB á Ser27

Fosfórun Ser27 stjórnar stöðugleika ΔFosB

Ser27 fosfórun stöðugast ΔFosB með því að koma í veg fyrir niðurbrot proteasomal þess

Discussion

Neðanmálsgreinar

Meðmæli

Greinar sem vitna í þessa grein

Flýtileiðir hlekkur

³² P efnaskiptamerkingar.