Fjölmargar rannsóknir með taugavirkjunarmerkinu Fos benda til þess að kókaín virkjar aðeins lítinn hluta strjál dreifðra taugafrumna. Fram til þessa voru skilvirkar aðferðir ekki tiltækar til að meta taugaaðlögun sem var sérstaklega framkölluð innan þessara virkjuðu taugafrumna. Við notuðum flúrljómunarvirkar frumuflokka (FACS) til að hreinsa drepfæra taugafrumur sem voru virkar við hreyfingu af völdum kókaíns í barnalegu og kókaínnæmdu. cfos-lacZ erfðabreyttar rottur. Virkar taugafrumur voru merktar með mótefni gegn ß-galaktósídasa, próteinafurð lacZ gensins. Cocaine olli sértækum genatjáningarsniðum að eigin vali í litlu hlutfalli virkjuðu taugafrumna sem ekki sást í óvirktum meirihluta taugafrumna. Þessi gen innihéldu breytt stig snemma genanna boga, fosBog nr4a3, sem og gen sem taka þátt í p38 MAPK merki og frumugerð. Við leggjum til að hægt sé að nota þessa FACS aðferð til að rannsaka sameinda taugaaðlögun í sértækum taugafrumum sem umrita hegðunaráhrif misnotaðra lyfja og annarrar lærðrar hegðunar.

Dýr

kvenkyns cfos-lacZ erfðabreyttar rottur (Kasof o.fl., 1995; Koya o.fl., 2009) og kvenkyns Sprague-Dawley rottur (Charles River, Raleigh, NC, USA) voru til húsa aðskildar í stöðluðum plastkvíum í hitastigs- og rakastýrðu herbergi. Þeim var haldið við 12: 12 h öfugt ljós: dökk hringrás (ljós logað við 20.00 h) og leyfðu ókeypis aðgang að mat og vatni. Þeir voru aðlagaðir að þessum húsnæðisskilyrðum í að minnsta kosti 7 daga fyrir lyfjameðferð. Tilraunaaðferðir voru samþykktar af NIDA dýraverndun og notkunanefnd.

Lyf meðferðir

Fyrir bráða kókaíntilraunir voru rottum sprautaðar með kókaíni (30 mg / kg, ip; n = 8) eða saltvatni (1 ml / kg; n = 6) og sett í kringlótt plexiglerhólf (38 cm í þvermál). Rottum var fórnað 90 mínútum eftir inndælingu til að fá heilavef. Þessi meðferð var endurtekin þrisvar á aðskildum dögum til að fá þrjú líffræðileg endurtekning til greiningar á örörkum. Að auki voru þrjú óháð líffræðileg endurtekning framleidd á svipaðan hátt fyrir magn PCR (qPCR). Fyrir QPCR greiningar á boga, pdyn, adora2avoru aðeins þessi þrjú óháðu líffræðilega endurtekning notuð. Fyrir QPCR greiningar á fosB, nr4a3, kcnc1 og kort2k6, notuðum við einnig RNA frá hverju örsýni.

Við endurteknar kókaíntilraunir voru kvenrottur næmar með fjórum inndælingum af kókaíni (15 mg / kg ip) gefið einu sinni á öðrum degi. Á inndælingardögum var hver rotta sett í 43 × 43 cm ferningur Plexiglas hreyfitækni (Med Associates, St Albans, VT, USA) til að venja sig í 30 mínútur. Rottum var sprautað með kókaíni og hreyfivirkni var skráð þegar vegalengd var í 60 mínútur. Í kjölfar fjórðu endurteknu kókaínsprautunnar voru rottur áfram í heimabúrinu í 7 – 8 daga. Á prufudeginum voru rottur venja í 30 mín. Í hreyfihólfunum og síðan sprautað með kókaíni (30 mg / kg ip) eða saltvatni. Rottum var skipt niður og gáfur voru dregnar út níutíu mínútum eftir inndælingu. Öll næmingarmeðferðin var endurtekin þrisvar á aðskildum vikum til að fá þrjú líffræðilega endurtekningu hvers hóps fyrir qPCR greiningu.

Frumudreifing

Striatal vefur var aðgreindur til að fá einfruma sviflausn. Rottum var skipt á höfði og striata þeirra dregin út innan tveggja mínútna. Hvert striatum var hakkað með rakvélum á ísköldum glerplötu og sett í 1 ml af vetrardvala A (Cat # HALF; Brain Bits, Springfield, IL). Striata voru melt með ensímum í 1 ml af Accutase á hvert stratum (Cat # SCR005; Chemicon, Billerica, MA) með blöndun endaloka í 30 mín. Við 4 ° C. Vefið var skilvindt í tvær mínútur við 425 × g og blandað aftur í 300 μl af ísköldu vetrardvala A. Öll síðari skilvindunarskref voru framkvæmd við 4 ° C.

Meltur ristill vefur var vélrænt aðgreindur með rifnun. Fjórum striata voru sameinuð í eitt Eppendorf túpu og rifin tífalt með Pasteur pipettu með stórum þvermál (~ 1.3mm). Rör voru sett stutt á ís fyrir stóra vefjahluta til að setjast; 600 μl af skýjaðri dreifu sem innihélt aðskildar frumur voru fluttar í 15 ml Falcon rör á ís. 600μL af ferskum dvala A var bætt við upprunalega Eppendorf túpuna og síðan voru rifin skref endurtekin eins og hér að ofan með miðlungs og litlum þvermál pípum (~ 0.8mm og ~ 0.4mm). Hver skýjuð dreifa sem innihélt aðskildar frumur var sameinuð með fyrri sviflausn.

Eftirstöðvar frumuklasar í sameinuðu frumusviflausninni voru fjarlægðir með síun í gegnum bleyti 100 μm og 40 μm frumustofna (Falcon vörumerki, BD Biosciences, San Jose, CA). Lítil frumu rusl í sviflausninni var minnkuð með því að skilvindu síuvökvinn í 3 mín. Við 430 × g í gegnum þriggja þrepa þéttleika Percoll (Cat # P1644; Sigma, St. Louis, MO). Hinu skýjaða efsta lagi (u.þ.b. 2 ml) sem innihélt rusl var hent. Frumur í lögunum sem eftir voru voru blandaðir aftur í Percoll lausnina sem eftir var og skilvindt í fimm mínútur við 550xg. Pellinum var blandað aftur í 1 ml af dvala A.

Ónæmismerki og FACS

Aðskildar frumur voru festar og síað saman með því að bæta við jöfnu magni af etanóli fyrir lokastyrk 50% etanóls og haldið á ís í 15 mínútur með stöku blöndun. Frumur voru skilvindaðar í tvær mínútur við 425xg og blandaðir aftur í RNase-frjálsu fosfatjafnalausu saltvatni (PBS). Frumur voru ræktaðar með lítínýleruðu aðal mótefni gegn NeuN (1: 1000 þynning, Cat # MAB377B, Chemicon) og aðal mótefni gegn ß-galaktósídasa ((ß-gal; 1: 10000 þynning, Cat # 4600-1409, Biogenesis, Poole Frumur.) Frumum var snúið endalokum í aðal mótefni í 30 mínútur við 4 ° C og skilvindt í þrjár mínútur við 425xg. Frumur voru þvegnar með 800 μl af PBS og blandaðir aftur í 700 μl af PBS. með blómstrandi merktu streptavidíni (Streptavidin-phycoerythrin, 1: 1000 þynning, Cat # SA1004-1, Invitrogen, Carlsbad, CA) og aukamótefni (Alexa Fluor 488-merkt andstæðingur-geitar IgG, 1: 1000-þynning, Cat # A 11055, Invitrogen) og snúið endalokum í 15 mín. Frumur voru þvegnar með 800 μl af PBS, skilvindaðir í þrjár mínútur við 425 × g, og blandaðir aftur í 1 ml af PBS.

Ónæmismerktar frumur voru skannaðar og flokkaðar á frumuaðstöðu Johns Hopkins Bayview háskólasvæðisins. A FACS Aría (BD, Franklin Lakes, NJ) var notuð við flokkun frumna. Eftirlitssýni voru greind fyrst til að ákvarða ákjósanlegustu viðmiðanir fyrir flokkun prófasýna. Sérstaklega voru fastar frumur án mótefnameðferðar notaðar til að stilla ljósdreifishliðið. Fastar frumur sem voru meðhöndlaðar með flúrljómandi aukamótefni, en engu frummótefni, voru síðan notaðar til að setja viðmiðunarmörk fyrir innrænan flúrljómun og ósértæka bindingu með streptavidini eða aukamótefni. Næst voru stjórnarsýni, sem voru merkt með aðal og aukamótefni fyrir hvert prótein (NeuN eða ß-gal), notuð til að bæta upp flúrljómandi skörun í nálægum rásum. Að lokum voru prófunarsýni merkt með báðum flúrljósmerkjum greind og flokkuð. Raðaðri frumur var safnað í lágt bindandi rör (Cat # 022431081, Eppendorf, Westbury, NY) með 100 μl af PBS í hverju túpu.

RNA útdráttur

Eftir flokkun voru sýni sem innihéldu annað hvort βgal-jákvæða eða βgal-neikvæða frumu úr kókaínsprautuðum rottum eða allar NeuN-jákvæðar frumur frá saltvatnssprautuðum rottum skilvindt í 8 mín við 2650 × g við 18 ° C. NeuN-neikvæðar frumur frá rottum með saltvatni, sem sprautaðar voru, voru skilvindaðar í 8 mín. Við 6000 ×g við 18 ° C. Fyrir tilraunir með örörkum var RNA dregið út með Trizol Hvarfefni (Cat # 15596-026, Invitrogen) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Gæði og magn RNA voru metin með Bioanalyzer Picochip (Cat # 5067-1513, Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Fyrir qPCR tilraunir var RNA dregið út með RNEasy Micro Kit (Cat # 74004; Qiagen, Valencia, CA) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda með DNase meðferð. Magn og hreinleiki RNA var metið með Nanodrop litrófsmæli (Thermo Scientific, Wilmington, DE).

Microarray tilraunir

Örlyppir voru notaðir til að greina RNA frá NeuN-jákvæðum og NeuN-neikvæðum frumum frá saltvatni sprautuðum rottum og βgal-jákvæðum og βgal-neikvæðum taugafrumum úr rottum með kókaínsprautuðu. Eins og lýst er hér að ofan í lyfjameðferðarhlutanum, innihéldu örvörn þrjú líffræðileg endurtekning fyrir hverja af fjórum sýnategundunum. Fimm pl af heildar RNA úr hverju sýni voru merktir með því að nota Illumina TotalPrep RNA magnunarbúnaðinn (Cat # IL1791; Ambion, Austin, TX) í tveggja þrepa ferli cDNA myndunar og síðan vitro RNA umritun með biotin-16-UTP. 0.75 μg af biotin-merktu cRNA var blandað saman í 16 klukkustundir til Illumina Sentrix Rat Ref12_v1 BeadChips (Cat # BD-27-303; Illumina, San Diego, CA). Biotinylated cRNA hybridized to the chip fannst með Cy3-merktu streptavidini og magngreint með því að nota Illumina's BeadStation 500GX Erfðagreiningarkerfi skanni. Allar merkingar og greiningar voru gerðar í Johns Hopkins Bayview Medical Campus Lowe Family Genomics Core.

Rauntíma magn PCR

Töluleg PCR í rauntíma var notuð til að staðfesta FACS og niðurstöður örörvunar. RNA var umritað í cDNA með RETROscript búnaðinum (Cat # AM1710, Ambion) með oligo (dT) grunni. Hver 25 μl PCR viðbrögð innihéldu 12.5 μl af Taqman Gene Expression Master Mix (Cat #4369514; Applied Biosystems, Foster City, CA), 1.1 μl hver og einn af 20 μM fram og afturábak grunnur, 0.25 μl af 100 μM FAM-merktum rannsaka, μl af vatni, og 5 μl af 5 ng / μl cDNA. Grunn og rannsaka samsetningar [Tafla 1] voru hönnuð með því að nota Roche Universal Probe Library Assay Design Center til að vera breiðvirkni. Fylgst var með PCR viðbrögðum með því að nota Opticon Light Cycler (Biorad, Hercules, MD). Forritið hófst með 20 plötulestrum við 50 ° C til ljósmyndbleikju, síðan 5 mín. Við 95 ° C, og síðan 40 lotur af 20 sek við 94 ° C, 1 mín. Við 60 ° C og plata lesin.

 

Tafla 1

Grunnur og prófanir notaðir við qPCR

Hefðbundin viðbrögð við ferli voru fyrst keyrð fyrir hvert gen til að ákvarða magnunarvirkni [Tafla 1]. Tjáningarstig fyrir hvert magnað gen voru reiknuð með því að nota skilvirkni ^ ΔC_q þar sem ΔC_q = C_q(tilrauna gen) - C_q(tilvísunargen) fyrir hvert líffræðilegt eftirmynd. Gorasp2 var valið sem viðmiðunargen vegna þess að það var ekki á annan hátt gefið upp á milli taugafrumna og glia í greiningar á örtæki. Það var enn fremur staðfest sem viðmiðunargen vegna jafnrar magnunar qPCR yfir öll sýni þegar sama magn af sniðmáti var hlaðið. Tæknileg próf þrírit C_q gildi voru að meðaltali áður en reiknað var með ΔC_q fyrir hvert gen í úrtaki. Fyrir hvert mRNA mælt í qPCR voru gildi tjáningar gena að meðaltali yfir líffræðilega endurtekningu. Síðan til að endurspegla gildi fyrir breytingu á skiptum, skiptum við þessu meðaltali með meðaltali genatjáningargilda NeuN-jákvæðra frumna frá saltvatnssprautuðum rottum. Þessi gildi eru táknuð sem leið og staðalskekkjur í myndritum og töflum.

Immunohistochemistry

Heilavef var fengin úr villtum tegundum kvenkyns Spraque-Dawley rottum í kjölfar sömu bráða og endurteknu kókaínmeðferðar og lýst er hér að ofan fyrir örörpu og qPCR tilraunirnar. Samt sem áður 90 mínútum eftir inndælingu á prufudeginum voru rottur svæfðar djúpt með isoflurani og blandaðar með 100 ml af PBS og síðan 400 ml af 4% paraformaldehýði (PFA). Gáfur voru lagaðir eftir PFA í 2 klukkustundir og fluttar yfir í 30% súkrósa lausn við 4 ° C í 2 – 3 daga. Gáfur voru frystar á þurrum í duftformi og haldið við −80 ° C þar til þær voru brotnar niður. Kransæðum var skorið 40 μm á þykkt milli Bregma 2.5 og −0.5 (Paxinos og Watson, 1998).

Hlutar voru ónæmismerktir fyrir Fos og Arc. Stuttlega, hlutar voru þvegnir þrisvar í Tris-jafnalausu salti (TBS) og síað í 30 mín. Í TBS með 0.2% Triton X-100. Þáttum voru þvegnar aftur í TBS og ræktaðar í aðal mótefnum þynnt í PBS með 0.3% Triton X-100 í 24 klukkustundir á hristara við 4 ° C. Við notuðum polyclonal kanína gegn c-Fos mótefni (1: 500 þynningu, Cat # sc-52, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) og mús einstofna Arc mótefni (1: 100 þynning, Cat # sc-17839, Santa Cruz líftækni). Þáttum var þvegið þrisvar í TBS og ræktað í efri mótefni þynnt í PBS í 1.5 klukkustundir á hristara við stofuhita. Við notuðum Alexa Fluor 488-merkt asna gegn kanínu mótefni (1: 200 þynning, Cat # A21206, Invitrogen) og Alexa Fluor 568-merkt geitar gegn mús mótefni (1: 200 þynning, Cat # A11004, Invitrogen). Hlutar voru þvegnir í TBS, festir á króm-alhúðuðu rennibrautir og hyljaðir með VectaShield harðsettu festingarefni.

Flúrljósmyndir af ónæmisvirkni Fos og Arc í caudate-putamen og NAc (u.þ.b. 2.0 mm fremri við Bregma) voru teknar með CCD myndavél (Coolsnap Photometrics, Roper Scientific Inc., Trenton, NJ) fest við Zeiss Axioskop 2 smásjá. Myndir til að telja merktar frumur voru teknar með 200x stækkun; myndir til að ákvarða samstillingu Fos og Arc voru teknar með 400x stækkun. Merktar frumur úr fjórum heilahvelum á hverja rottu voru sjálfkrafa taldar með IPLab hugbúnaði fyrir Macintosh, útgáfu 3.9.4 r5 (Scanalytics, Inc., Fairfax, VA). Talning úr öllum fjórum heilahvelum var að meðaltali til að fá eitt gildi fyrir hverja rottu.

Gagnagreining

Upplýsingar um næmi fyrir hreyfihreyfingu voru greindar með því að nota einstefnu ANOVA með endurteknum ráðstöfunum fyrir helstu áhrif tímans yfir 4 inndælingardaga. Tölfræðileg marktækni var stillt á p <0.05. Upplýsingar um örflokka voru greindar með því að nota DIANE 6.0, töflureikna örflagsgreiningarforrit byggt á SAS JMP 7.0, eins og áður hefur verið lýst (Garg o.fl., 2009). Gögn flúrljómunarstyrks frá örfléttum voru háð síun með uppgötvun p-gildi og Z eðlileg. Gæði sýnisins voru greind með dreifilotum, greiningum á helstu efnisþáttum og genasýni Zstigatöfluðu stigveldisþyrpingu til að útiloka mögulega útúrskarendur. ANOVA próf voru síðan notuð til að útrýma genum með stærri fráviki innan hvers samanburðarhóps. Gen voru auðkennd sem mismunadreifð ef p <0.01, alger Z-hlutfall ≥ 1.5 og rangt uppgötvunarhlutfall (fdr) <0.07. Fyrir qPCR gögn var einstefna ANOVA notuð til að bera saman gögn fyrir hvert gen. Tölfræðileg marktækni var stillt á p <0.05. Fyrir ónæmis- og lífefnafræði Fos og Arc var t-próf ​​miðað við ójafna dreifni notað til að reikna tölfræðilega marktækni, stillt á p <0.05.

CFOS-lacZ erfðabólga rottur

The cfos-lacZ transgen í þessum rottum er stjórnað af a c-fos kynningarefni svipað og hjá innrænu c-fos gen og er þannig svipað virkjað í taugafrumum með miklu magni örvandi synaptísks inntaks (Shin o.fl., 1990; Labiner o.fl., 1993; Sgambato o.fl., 1997). Próteinafurðin cfos-lacZ transgen, β-galaktósídasi (βgal), er samhliða tjáð með c-Fos í mjög virkjuðum taugafrumum (Koya o.fl., 2009) og notuð til að merkja virkjaðar striatal taugafrumur í eftirfarandi FACS hreinsunaraðferð.

FACS hreinsun virkjaðra stíga taugafrumna eftir stakar bráðar kókaínsprautur

Heil striata fengin frá cfos-lacZ rottur 90 mínútur eftir bráða inndælingu af 30 mg / kg kókaíni eða saltvatni utan heimabúrsins. Aðgreindar stofnfrumur úr svipuðum meðhöndluðum rottum voru sameinuð áður en FACS hreinsun var gerð fyrir hvert líffræðilega afritið í síðari örörvun og magn PCR (qPCR) greiningum. Aðgreindar stofnfrumur voru upphaflega greindar í samræmi við fram- og hliðarljósdreifingareinkenni [Mynd 1a]. Meirihluti NeuN-merktra taugafrumna fannst innan ræmis atburða meðfram neðri hluta lóðsins. Þannig voru allar síðari greiningar framsendar til að taka aðeins til atburða sem finnast innan þessa ræmis.

 

Mynd 1

Flúrljómun virkjað frumusöfnun á ßgal-merktum taugafrumum frá rottum sem meðhöndlaðar voru með einni inndælingu kókaín

Frumur innan þessa hlið voru aðgreindar í samræmi við stig ónæmismerkjunar með taugamerkinu NeuN og tauga örvunarmerkinu βgal. Í vefjum fengnum úr rottum með kókaínsprautuðu efni höfðu u.þ.b. 15% NeuN-merktra taugafrumna mikið magn af ßgal [Mynd 1b], sem samsvaraði um það bil 100,000 ßgal-merktum taugafrumum á hverja rottu. Allar ßgal-merktar frumur tjáðu NeuN samhliða, sem bendir til að aðeins taugafrumur hafi tjáð βgal. Aftur á móti tjáðu mjög fáir NeuN-merktir taugafrumur fengnar úr saltvatnssprautuðum rottum virkjunarmerkina βgal eða Fos, sem styður βgal og Fos ónæmisvirkni sem merki fyrir taugavirkjun í rottum með kókaínsprautuðu. Lág fjöldi βgal-tjáandi taugafrumna frá saltvatnssprautuðum rottum veitti ekki nægar frumur til síðari sameindagreiningar. Þannig notuðum við eingöngu NeuN-merkingu til að aðgreina taugafrumur frá frumum sem ekki voru taugafrumur í öllum síðari tilraunum með striatal vef sem fenginn var frá saltvatnssprautuðum rottum. Á heildina litið voru um það bil 30% allra stofnfrumulíkama NeuN-jákvæðir, sem samsvaraði um það bil 600,000 stofnfrumum í hverri rottu. Þegar FACS-hreinsaðar frumur voru skoðaðar með flúrljómun smásjá, voru allar frumur kringlóttar og lausar við ferla [Mynd 2]. Smásjá athugun staðfesti að FACS-flokkaðar frumur voru merktar á viðeigandi hátt fyrir NeuN- og βgal-ónæmisviðbrögð. Sýnishorn af FACS-hreinsuðum frumum reyndust vera> 90% hrein þegar þau voru metin með annarri lotu af flæðiritum (gögn ekki sýnd).

 

Mynd 2

Smásjá myndir af FACS-hreinsuðum frumum og rusli

Við ákvörðuðum sértækni FACS hreinsunaraðferðar okkar með örörvum til að greina tjáningarmynstur gena FACS-hreinsuðu frumanna. Við bárum saman tjáningu gena í βgal-jákvæðum og βgal-neikvæðum taugafrumum frá rottum með kókaínsprautuðu auk NeuN-jákvæðra og NeuN-neikvæðra frumna frá saltvatnssprautuðum rottum. Helstu þættir og klasagreining bentu til þess að aðal aðgreiningarþátturinn væri hvort frumurnar væru taugafrumur eða glia [Mynd 3a]. Annar aðgreiningarþátturinn var βgal tjáning sem notuð var til að aðskilja virkjaða frá óvirkum taugafrumum. Gen voru auðkennd sem mismunadreifð ef p <0.01, alger Z-hlutfall ≥ 1.5 og rangt uppgötvunarhlutfall (fdr) <0.07. Við komumst að því að 125 genum var fjölgað og 467 genum fækkað í βgal-jákvæðum taugafrumum miðað við βgal-neikvæðar taugafrumur sem fengnar voru úr sama striatalvef rottna sem sprautað voru með kókaíni [Mynd 3b]. Þegar sömu βgal-jákvæðu taugafrumurnar frá rottum sem voru sprautaðar með kókaíni voru bornar saman við samanburðarsýni af öllum NeuN-merktum taugafrumum frá saltvatnssprautuðum rottum var 133 genum fjölgað og 890 genum fækkað í βgal-jákvæðum taugafrumum. Sérstaklega voru samanburðarhóparnir tveir - βgal-neikvæðir taugafrumur frá rottum sem voru sprautaðir með kókaíni og allir NeuN merktir taugafrumur frá saltvatni sem sprautaðir voru með salti - framleiddu mjög svipað genatjáningarmynstur; genatjáning var ekki marktækt frábrugðin milli þessara samanburðarhópa [Mynd 3b].

 

Mynd 3

Örlyfjagreining á frumum sem flokkaðar voru úr rottuþráðum eftir staka inndælingu af kókaíni eða saltvatni

Sértæk gen sem fundust í mismunandi úrtakshópum staðfestu aðskilnað virkjuðra frá óvirkjuðum taugafrumum, svo og taugafrumum frá frumum sem ekki voru taugafrumur með því að nota FACS [Tafla 2]. ßgal jákvæðir taugafrumur frá rottum með kókaínsprautuðu tjáðu hærra magn margra tauga örvunarmerkjamerkja miðað við βgal-neikvæðar taugafrumur frá sömu rottum með kókaínsprautuðu lyfi eða öllum NeuN-merktum taugafrumum úr saltvatnssprautuðum rottum [Mynd 3c]. Þessi virkni merkja gen voru með c-fos, junB, hring, egr fjölskylda (1, 2, 4) og nr4a3 (Guzowski o.fl., 2005). Athyglisvert er að þessar ßgal jákvæðu taugafrumurnar tjáðu einnig marktækt hærra stig D1 dópamínviðtaka frumutegundarsértækra pródynorfín gena og marktækt lægra gildi D2 dópamínviðtaka gensins.

 

Tafla 2

Samantekt á gögnum um örveru og qPCR frá bráða kókaíntilrauninni.

Gögn um tjáningu örörvunar voru staðfest með qPCR. Genin í virkni merkisins fosB, hringog nr4a3 voru sett fram við hærra stig í βgal-jákvæðum taugafrumum frá rottum með kókaínsprautuðu miðað við bæði βgal-neikvæða taugafrumur frá sömu rottum sem sprautaðar voru með kókaíni og öllum taugafrumum úr rottum með saltvatni sem sprautað var [Mynd 4a; gögn og tölfræðilegar upplýsingar í Tafla 2]. ß-jákvæðir taugafrumur tjáðu einnig hærra magn af pródynorfín geninu [Mynd 4b]. Þó að ßgal-jákvæðir taugafrumur höfðu greinilega lægri tjáningarstig fyrir nokkur gen, þar á meðal A2A adenósínviðtakann, Kv3.1 kalíumrásina og map2k6 / MEKK6 gen voru aðeins Kv3.1 og map2k6 / MEKK6 tjáningarstigP tölfræðilega mismunandi með qMynd 4c]. Á heildina litið voru breytingar á genatjáningu, sem metnar voru með qPCR, næstum því eins og breytingar á genatjáningu, metnar með tilraunum með örtæki.

 

Mynd 4

Magnleg PCR sýnir mismunandi genatjáningu fyrir ßgal jákvæða taugafrumur eftir bráða kókaínsprautur, samanborið við ßgal-neikvæðar taugafrumur frá sömu rottum, eða öllum taugafrumum frá saltvatnssprautuðum rottum.

Til að ákvarða hvort breytingar á mRNA í virkjuðum taugafrumum endurspegluðust á próteinstiginu notuðum við ónæmisfræðilega greiningu á kransæðaheilum úr kókaín- og saltvatnssprautuðum kvenkyns rottum [Mynd 5]. Þessir hlutar fóru hvorki undir sundurliðun né FACS og þess vegna var ónæmisfræðileg greining ekki fyrir áhrifum af frumudreifingu sem fannst í FACS málsmeðferðinni. Í ventral striatum frá rottum með kókaínsprautuðu [Mynd 5a], voru taugastarfsemerkirnir Fos og Arc samtryggðir í sömu frumum: 85 ± 4% allra Fos-jákvæðra frumna voru Arc-jákvæðar, en 82 ± 3% allra Arc-jákvæðra frumna voru Fos-jákvæðar. Kókaín stungulyf framleiddi 2.7-föld aukningu á Fos-merktum taugafrumum og 2.7-faldri aukningu á Arc-merktum taugafrumum. Í riddarastriki frá rottum með kókaínsprautuðu [Mynd 5b], 80 ± 2% allra Fos-jákvæðra frumna voru Bog-jákvæðar, en 86 ± 3% allra Arc-jákvæðra frumna voru Fos-jákvæðar. Kókaín stungulyf framleiddi 4.4-föld aukningu á Fos-merktum taugafrumum og 3.8-faldri aukningu á Arc-merktum taugafrumum.

 

Mynd 5

Fos og Arc eru samhliða tjáð í (a) ventral striatum og (b) riddarastrimli eftir staka inndælingu af kókaíni

FACS hreinsun virkjaðra striatal taugafrumna frá kókaínnæmum rottum

Í annarri FACS tilrauninni voru allar rottur næmar með endurteknum kókaínsprautum. Endurtekin gjöf kókaíns í hreyfitöskunni jók fram hreyfingu af völdum kókaíns: hreyfing á 7 degi var 180 ± 18% dags 1 hreyfingar (aðaláhrif tímans yfir 4 endurteknar inndælingar, F_{3, 363} = 24.9, p <0.001), sem benti til verulegrar næmni á geðhreyfingum. Sjö dögum síðar á tilraunadeginum var kókaíni eða saltvatni gefið rottum í sama hreyfiboxinu. Níutíu mínútum síðar var striatalvefur þ.mt NAc dreginn út og frumur voru FACS-hreinsaðar með aðferðinni sem lýst er hér að ofan.

Frumur innan sömu ljósdreifðar hliðar ræmunnar af atburðum og í fyrri tilraun voru aðskildar í samræmi við stig ónæmismerkjunar þeirra með taugamerkinu NeuN og taugavirkjunarmerkinu Pgal. Í vefjum fengnum úr rottum með kókaínsprautuðu efni höfðu u.þ.b. 10% NeuN-merktra taugafrumna mikið magn af ßgal [Mynd 6], sem samsvaraði um það bil 60,000 ßgal-merktum taugafrumum á hverja rottu. Allar ßgal-merktar frumur tjáðu NeuN samhliða, sem bendir til þess að aðeins taugafrumur hafi tjáð βgal. Aftur framleiddi vefir fengnir úr rottum, sem sprautaðir voru með saltvatni á prófunardegi, mjög fáar βgal- eða Fos-tjáandi taugafrumur, og þar með ekki nægar frumur til síðari sameindagreiningar. Þess vegna notuðum við aðeins NeuN-merkingu til að aðgreina taugafrumur frá frumum sem ekki voru taugafrumur fengnar úr saltvatnssprautuðum rottum. Um það bil 30% allra frumulíkama í saltvatnssprautuðum rottum voru NeuN-jákvæðir, sem í þessari tilraun samsvaraði um það bil 400,000 drepfæra taugafrumum á hverja rottu.

 

Mynd 6

Flúrljómun virkjað frumuflokkun á ßgal-merktum taugafrumum frá næmum rottum sem voru mótmælt með kókaíni 7 dögum eftir endurtekna kókaínmeðferð

Við notuðum qPCR til að bera saman genatjáningu í βgal-jákvæðum og βgal-neikvæðum taugafrumum frá rottum sem voru sprautaðar með kókaíni sem og öllum NeuN-jákvæðum taugafrumum frá saltvatnssprautuðum rottum í kjölfar næmingar á kókaíni. βgal-jákvæðar taugafrumur frá rottum sem voru sprautaðar með kókaíni sýndu hærra stig þriggja taugaverkunargena– fosB, hringog nr4a3–Tengd βgal-neikvæðum taugafrumum frá sömu rottum með kókaíni og öllum taugafrumum frá saltvatnssprautuðum rottum [Mynd 7a; gögn og tölfræðilegar upplýsingar í Tafla 3]. β-jákvæðir taugafrumur tjáðu einnig hærra stig af pródynorfín geninu svipað og í stakri kókaínsprautunartilraun [Mynd 7b]. Aftur á móti höfðu ßgal jákvæðir taugafrumur lægri tjáningarstig fyrir nokkur gen [Mynd 7c], þ.m.t. Drd2 sem umritar D2 dópamínviðtaka og Kort2k6 sem umritar kínasa sem virkjar p38 MAPK, svipað og staka bráð kókaín sprautunartilraun. Að lokum höfðu ßgal jákvæðir taugafrumur aukið tjáningu rökkva1, einnig þekkt sem mkp1 [Mynd 7c], sem umbreytir fosfatasa sem óvirkir p38 MAPK (Sgambato o.fl., 1998).

 

Mynd 7

Tölulegar PCR sýna fram á mismunandi genatjáningu í ßgal jákvæðum taugafrumum frá næmum rottum með kókaínsáskorun, samanborið við βgal-neikvæðar taugafrumur frá sömu rottum, eða allar taugafrumur úr rottum með saltvatni.

 

Tafla 3

Samantekt á gögnum um QPCR frá ítrekuðu kókaíntilrauninni.

Til að ákvarða hvort breytingar á mRNA í virkjuðum taugafrumum endurspeglast á próteinstiginu notuðum við ónæmisheilbrigðagreiningu á kransæðaheilum úr villtum tegundum kókaínnæmdra kvenrottna í kjölfar ýmist kókaín- eða saltvatnssprautunar á prófdegi. Í ventral striatum frá rottum með kókaínsprautuðu, voru taugastarfsemerkirnir Fos og Arc samhliða tjáðir í sömu frumum: 90 ± 2% allra Fos-jákvæðra frumna voru Arc-jákvæðar, og 83 ± 2% allra Arc-jákvæðra frumur voru Fos-jákvæðar. Kókaínrannsóknarsprautur framkallaði 2.3-faldan aukningu á Fos-merktum taugafrumum og 2.2-faldri aukningu á Arc-merktum taugafrumum. Í riddarastræti frá rottum með kókaínsprautuðu rottum voru 93 ± 2% allra Fos-jákvæðra frumna Arc-jákvæðar og 90 ± 3% allra Arc-jákvæðra frumna voru Fos-jákvæðar. Kókaínrannsóknarsprautur framkallaði 4.4-faldan aukningu á Fos-merktum taugafrumum og 4.5-faldri aukningu á Arc-merktum taugafrumum. Svona, mjög fáir ekki-Fos-merktar frumur tjáðu Arc og mjög fáar non-Arc-merktar frumur tjáðu Fos sem styður niðurstöður okkar frá flokkuðum frumum.

Þessar rannsóknir voru studdar af innra rannsóknaráætlun Þjóðstofnunar um vímuefnavanda. D. Guez-Barber var studdur af NIH MSTP TG 5T32GM07205, verðlaunanúmer F30DA024931 frá National Institute for Drug Misnotkun og Charles BG Murphy formaður í geðlækningum við Yale háskólann. Við þökkum Joe Chrest fyrir framúrskarandi tæknilega aðstoð við FACS, og Chris Cheadle, Tonya Watkins og Alan Berger fyrir störf sín í örbylgjunni. Við þökkum Yavin Shaham fyrir gagnlegar athugasemdir við handritið.

Það eru engin hagsmunaárekstrar fyrir neina höfunda þessa handrits.

1. Badiani A, Oates MM, Day HE, Watson SJ, Akil H, Robinson TE. Umhverfismótun c-fos tjáningar af völdum amfetamíns í D1 á móti D2 striatal taugafrumum. Behav Brain Res. 1999; 103: 203 – 209. [PubMed]
2. Berretta S, Robertson HA, Graybiel AM. Dópamín og glútamat örvar örva taugafrumum-sértæka tjáningu Fos-eins próteins í striatum. J Neurophysiol. 1992; 68: 767 – 777. [PubMed]
3. Bolshakov VY, Carboni L, Cobb MH, Siegelbaum SA, Belardetti F. Dual MAP kinase ferlar miðla andstæðu formi til langs tíma plastleiki við CA3-CA1 samstillingar. Nat Neurosci. 2000; 3: 1107 – 1112. [PubMed]
4. Bowers MS, Chen BT, Bonci A. AMPA viðtaka synaptic plasticity af völdum geðörvandi lyfja: fortíð, nútíð og lækninga framtíð. Neuron. 2010; 67: 11 – 24. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
5. Cenci MA, Campbell K, Wictorin K, Björklund A. Striatal c-fos Innleiðsla af kókaíni eða apómorfíni kemur helst fram í framleiðsla taugafrumum sem varpað er út í efnið Nigra í rotta. Eur J Neurosci. 1992; 4: 376 – 380. [PubMed]
6. Curran T, Franza BR., Jr Fos og Júní: AP-1 tengingin. Hólf. 1988; 55: 395 – 397. [PubMed]
7. Garg S, Nichols JR, Esen N, Liu S, Phulwani NK, Syed MM, Wood WH, Zhang Y, Becker KG, Aldrich A, Kielian T. MyD88 tjáning CNS-íbúa frumna er lykilatriði til að vekja verndandi ónæmi í heila ígerð. ASN Neuro. 2009: 1. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
8. Gerfen CR, Keefe KA, Gauda EB. Virkni D1 og D2 dópamínviðtaka í striatum: samvirkni D1- og D2-dópamínviðtaka á aðskildum hópum taugafrumna leiðir til aukinnar tafarlausrar svörunar gena í taugafrumum sem innihalda D1. J Neurosci. 1995; 15: 8167 – 8176. [PubMed]
9. Guzowski JF, Timlin JA, Roysam B, McNaughton BL, Worley PF, Barnes CA. Kortleggja hegðunarviðbragð sem skiptir máli hegðunar með strax snemma snemma tjáningu gena. Curr Opin Neurobiol. 2005; 15: 599 – 606. [PubMed]
10. Hernandez-Lopez S, Bargas J, Surmeier DJ, Reyes A, Galarraga E. D1 viðtaka örvun eykur framköllun í taugafrumum með miðlæga taugafrumum með því að breyta L-gerð Ca2 + leiðni. J Neurosci. 1997; 17: 3334 – 3342. [PubMed]
11. Hope B, Simmons D, Mitchell T, Kreuter J, Mattson B. Vökvavirkni af völdum kókaíns og Fos-tjáningu í kjarnahúsum eru næm fyrir 6 mánuði eftir endurtekna gjöf kókaíns utan heimabúrsins. Eur J Neurosci. 2006; 24: 867 – 875. [PubMed]
12. Izumi Y, Tokuda K, Zorumski CF. Langvarandi örvunarhömlun með lágu stigi N-metýl-D-aspartat viðtaka felur í sér kalsínúrín, nituroxíð og p38 mitógenvirkt próteinkínasa. Hippocampus. 2008; 18: 258 – 265. [PubMed]
13. Jaber M, Cador M, Dumartin B, Normand E, Stinus L, Bloch B. Bráðar og langvarandi amfetamínmeðferðir stjórna misjafnlega RNA stigum taugapeptíðboðaboða og Fos ónæmisvirkni í rottum taugafrumum. NEUROSCIENCE. 1995; 65: 1041 – 1050. [PubMed]
14. Kalivas PW. The glutamate homeostasis tilgátan um fíkn. Nat Rev Neurosci. 2009; 10: 561-572. [PubMed]
15. Kasof GM, Mahanty NK, Pozzo Miller LD, Curran T, Connor JA, Morgan JI. Sjálfkrafa og framkallað glutamat merki hefur áhrif á Fos-lacZ tjáningu og pýramíðafrumudauða í hippocampal sneiðaræktum frá erfðabreyttum rottum. Brain Res Mol Brain Res. 1995; 34: 197 – 208. [PubMed]
16. Koya E, Golden S, Harvey B, Guez-Barber D, Berkow A, Simmons D, Bossert J, Nair S, Uejima J, Marin M, Mitchell T, Farquhar D, Ghosh S, Mattson B, Hope B. Markviss röskun á kókaínvirkjaður kjarna accumbens taugafrumna kemur í veg fyrir samhengissértæka næmingu. Nat Neurosci. 2009; 12: 1069 – U1152. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
17. Kwon B, Houpt TA. Samsett aðferð við að ná leysigeyðingu í örgreiningu og X-Gal vefjafræði til að greina tjáningu gena í c-Fos sértækum taugafrumum. J Neurosci Aðferðir. 2010; 186: 155 – 164. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
18. Labiner DM, Butler LS, Cao Z, Hosford DA, Shin C, McNamara JO. Örvun c-fos mRNA með kveiktum krampa: flókið samband við taugafrumutöku. J Neurosci. 1993; 13: 744 – 751. [PubMed]
19. Liberles SD, Buck LB. Annar flokkur efnafræðilegra viðtaka í lyktarþekju. Náttúran. 2006; 442: 645 – 650. [PubMed]
20. Lobo MK, Karsten SL, Gray M, Geschwind DH, Yang XW. FACS-array prófíll á undirtegundum frá fósturvísisvörn í ungum og músum heila. Nat Neurosci. 2006; 9: 443 – 452. [PubMed]
21. Loebrich S, Nedivi E. Virkni virknistýrðra gena í taugakerfinu. Physiol séra 2009; 89: 1079 – 1103. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
22. Mattson B, Koya E, Simmons D, Mitchell T, Berkow A, Crombag H, Hope B. Samhengissértæk næming hreyfivirkni af völdum kókaíns og tilheyrandi taugafrumum í hópum rottukjarna. Eur J Neurosci. 2008; 27: 202 – 212. [PubMed]
23. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: sameindaskipti fyrir langtímaaðlögun í heilanum. Brain Res Mol Brain Res. 2004; 132: 146-154. [PubMed]
24. Nestler E, Hope B, Widnell K. Lyfjafíkn - líkan fyrir sameindagrundvöll taugakerfis. Neuron. 1993; 11: 995–1006. [PubMed]
25. Nestler EJ. Molecular grundvöllur langvarandi plasticity undirliggjandi fíkn. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 119-128. [PubMed]
26. Nicola SM, Surmeier J, Malenka RC. Dópamínvirka mótun örvunar taugafrumna í striatum og nucleus accumbens. Annu séraður Neurosci. 2000; 23: 185 – 215. [PubMed]
27. Nicola SM, Hopf FW, Hjelmstad GO. Andstæðaaukning: lífeðlisfræðileg áhrif striatal dópamíns? Frumuvef Res. 2004; 318: 93 – 106. [PubMed]
28. O'Donnell P. Dópamín hlið á taugasemblum í heila. Eur J Neurosci. 2003; 17: 429 – 435. [PubMed]
29. Paxinos G, Watson C. Rottuheilinn í stereótaxískum hnitum. 4. San Diego: Academic Press; 1998.
30. Pennartz CM, Groenewegen HJ, Lopes da Silva FH. Kjarninn safnast saman sem flókið aðgerðir sem eru aðgreindir í taugafrumum: sameining atferlisfræðilegra, lífeðlisfræðilegra og líffærafræðilegra gagna. Prog Neurobiol. 1994; 42: 719 – 761. [PubMed]
31. Peters RV, Aronin N, Schwartz WJ. c-Fos tjáning í rottum samloðandi fylgiseðli: ljóseðferð, samtímis staðsetning með Fos-B og frumugreining. Brain Res. 1996; 728: 231 – 241. [PubMed]
32. Sgambato V, Abo V, Rogard M, Besson MJ, Deniau JM. Áhrif raförvunar heilabarkar á tjáningu Fos próteins í grunnganga. Neurosci. 1997; 81: 93 – 112. [PubMed]
33. Sgambato V, Pages C, Rogard M, Besson MJ, Caboche J. Extracellular signal-regulated kinase (ERK) stýrir tafarlausum örvun gena á örvun barkstera. J Neurosci. 1998; 18: 8814 – 8825. [PubMed]
34. Shaham Y, Hope BT. Hlutverk taugaaðlögunar við bakslag lyfjaleitar. Nat Neurosci. 2005; 8: 1437 – 1439. [PubMed]
35. Shin C, McNamara JO, Morgan JI, Curran T, Cohen DR. Framköllun c-fos mRNA tjáningar með eftirdreifingu í hippocampus barnalegra og kveikts rottna. J Neurochem. 1990; 55: 1050 – 1055. [PubMed]
36. Wilson CJ, Kawaguchi Y. Uppruni hugsanlegra sveiflna í óeðlilegri himnu í tveggja ríkja með óeðlilegt himna. J Neurosci. 1996; 16: 2397 – 2410. [PubMed]
37. Wolf ME, Ferrario CR. AMPA viðtaka plastleiki í kjarna safnanna eftir endurtekna váhrif á kókaíni. Neurosci Biobehav Rev 2010 [PMC ókeypis grein] [PubMed]