PSMC5, 19S Proteasomal ATPase, stjórnar kókainvirkni í Nucleus Accumbens (2015)

PLoS One. 2015 maí 11; 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710. eCollection 2015.

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, Nakamura T3, Ohno M4, Kennedy PJ5, Yasuyuki O6, Nishi A7, Neve R8, Tsuzuki T4, Nestler EJ5.

Abstract

ΔFosB er stöðugur umritunarstuðull sem safnast fyrir í nucleus accumbens (NAc), lykilþáttur í umbunarrás heilans, til að bregðast við langvarandi útsetningu fyrir kókaíni eða öðrum misnotkunarlyfjum. Þó að vitað sé að ΔFosB myndast við Jun fjölskyldumeðlim til að mynda virkan umritunarstuðul flókið, hefur hingað til ekki verið opinn könnun á öðrum mögulegum bindiefnum fyrir ΔFosB í heilanum. Hér, með því að nota ger tvöfalda blendinga, greinum við PSMC5 - einnig þekkt sem SUG1, undireiningu sem inniheldur ATPasa af 19S proteasomal complex - sem nýtt samspil prótein við ΔFosB. Við staðfestum slík samskipti milli innrænna ΔFosB og PSMC5 í NAc og sýnum fram á að bæði prótein mynda einnig fléttur við önnur litskiljunarprótein sem tengjast virkjun gena. Við höldum áfram að sýna fram á að langvarandi kókaín eykur kjarnorku, en ekki umfrymið, magn PSMC5 í NAc og að oftjáning PSMC5 á þessu heila svæði stuðlar að hreyfingarviðbrögðum við kókaíni. Saman lýsa þessar niðurstöður nýjan búnað sem stuðlar að aðgerðum ΔFosB og í fyrsta skipti felur í sér PSMC5 í kókaín framkölluðum sameinda- og hegðunarvandleika.

Tilvitnun: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O, o.fl. (2015) PSMC5, 19S Proteasomal ATPase, stjórnar reglugerð um kókaín í Nucleus Accumbens. PLOS ONE 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710

Ritstjóri: James Edgar McCutcheon, Háskólinn í Leicester, BRESKA KONUNGSRÍKIÐ

Móttekið: Desember 10, 2014; Samþykkt: Apríl 7, 2015; Útgáfuár: Kann 11, 2015

Höfundaréttur: © 2015 Ohnishi o.fl. Þetta er grein með opnum aðgangi sem dreift er samkvæmt skilmálum Creative Commons Attribution License, sem leyfir ótakmarkaða notkun, dreifingu og æxlun á hvaða miðli sem er, að því tilskildu að upphaflegir höfundar og heimildir séu lögð fram

Gögn Availability: Öll viðeigandi gögn eru innan blaðsins.

Fjármögnun: Þessi vinna var studd af styrkjum frá National Institute of Health, National Institute for Drug Abuse, og af Ishibashi Foundation og Japanska félaginu til eflingar vísinda (KAKENHI tölur: 24591735, 26290064, 25116010). Styrktaraðilarnir höfðu ekkert hlutverk í rannsóknarhönnun, gagnaöflun og greiningu, ákvörðun um útgáfu eða gerð handritsins.

Samkeppnis hagsmunir: Höfundarnir hafa lýst því yfir að engar hagsmunir séu til staðar.

Hvernig gengur lífið dag frá degi? Er það í jafnvægi og allt eins og það á að vera? Er jafnvægi hvort sem litið er á veraldlega stöðu eða andlega? Lífið er eins og það er. Það er ekki alltaf sólskyn. Það koma reglulega lægðir með rok og rigningu. Við vitum að í heildar samhenginu er lægð hluti af vistkerfi að leita að jafnvægi. Stundum erum við stödd í miðju lægðarinnar. Þar er logn og gott veður, sama hvað gengur á þar sem stormurinn er mestur. Sama lögmál gildir varðandi þitt eigið líf. Ef þú ert í þinn miðju, þínum sannleik þá heldur þú alltaf jafnvægi átakalaust. Sama hvað gustar mikið frá þér þegar þú lætur til þín taka. Huldufólk hefur gefið okkur hugleiðslu sem hjálpar okkur að finna þessa miðju, finna kjarna okkar og sannleikann sem í honum býr. Þegar þú veist hver þú ert og hvers vegna þú ert hér, mun líf þitt vera í flæðandi jafnvægi. Hugleiðslan virkjar þekkinguna sem er í vitund jarðar og færir hana með lífsorkunni inn í líkama okkar. Þar skoðar hún hugsana og hegðunar munstrið og athugar hvort það myndar átakalausu flæðandi jafnvægi. Hinn möguleikinn er falskt jafnvægi sem hafa þarf fyrir að viðhalda með tilheyrandi striti, áhyggjum og ótta. Síðan leiðbeinir þessi þekking okkur að því jafnvægi sem er okkur eðlilegt. Við blómstrum átakalaust, líkt og planta sem vex átakalaut frá fræi í fullþroska plöntu sem ber ávöxt.

ΔFosB, stytt vara frá FosB gen, tilheyrir Fos fjölskyldunni umritunarþátta, sem fela einnig í sér c-Fos, FosB í fullri lengd, Fra-1 og Fra-2. ΔFosB, eins og önnur Fos prótein, heteródimerísar með Jun fjölskyldupróteini — c-Jun, JunB eða JunD — til að mynda virkt AP-1 (virkjunarprótein-1) umritunarstuðul flókið, sem örvar eða bælir tjáningu tiltekinna markgena. [1,2].

Sýnt hefur verið fram á að FOSB gegnir lykilhlutverki í eiturlyfjafíkn [2]. Einstakt meðal Fos fjölskyldupróteina safnast það upp í nucleus accumbens (NAc) og öðrum umbunartengdum heyrnasvæðum eftir endurtekna lyfjagjöf vegna mikils stöðugleika [3,4], sem er miðlað af skorti á C-endalegu degron lénum og með fosfórýleringu af nokkrum próteinkínösum [5-7]. Slík örvun ΔFosB í NAC miðlar auknum hegðunarviðbrögðum við misnotkun lyfja. Þannig ofvöxtur ΔFosB á þessu heila svæði fullorðinna dýra, annað hvort með því að nota veiruveirur eða örvandi bitransgena músa, eykur næmi dýra fyrir hreyfitilfærandi og gefandi áhrifum kókaíns og ópíata auk hvata dýra til að gefa sjálfan sig kókaín [7-11]. Aftur á móti veldur ofþekking á ríkjandi neikvæðum mótmælum ΔFosB andstæðar hegðunar svipgerðir [10-12].

Við og fleiri höfum áður staðfest, með notkun á hlaupaskiptaprófum, að JunD og ef til vill önnur Jun-fjölskylduprótein eru helstu bindingaraðilar ΔFosB í heilanum in vivo [13-15]. Hins vegar hefur til þessa ekki verið opið, óhlutdrægt mat á bindandi samstarfsaðilum FosB í heila. Hér leituðum við að því að bera kennsl á nýjar bindingaraðilar fyrir osFosB með því að nota tveggja-blendinga ger úr greinum [16,17]. Gögn okkar leiddu í ljós að PSMC5, einnig þekktur sem SUG1, er öflugur félagi ΔFosB bæði in vitro og í NAc in vivo, þar sem það gengur til liðs við osFosB sem hluta af kókaín-framkallaðri uppskriftarflækju sem inniheldur einnig CBP (CREB bindandi prótein) ) og p300 — báðir histón asetýltransferasar (HAT) - sem og BRG1 (krómatín uppbyggingarprótein). Við höldum áfram að sýna að langvarandi útsetning fyrir kókaíni breytir kjarnastiginu í PSMC5, ATPase sem inniheldur eining 19S próteasomal flókins, í NAc og að PSMC5 aftur á móti stjórnar hegðunarviðbrögðum við kókaíni.

Efni og aðferðir

Ger tveggja tvinnblandað skimun

MaV203 gerfrumur (Invitrogen Life Technologies) voru samflengdar með pDBLeu sem dró úr mismunandi brotum af osFosB próteininu og músheilasafn var undirklónað í pPC86 (Invitrogen Life Technologies). Umbreyttar frumur voru ræktaðar á SC-miðli sem vantar leucín, tryptófan og histidín og innihélt 10 mM 3-aminotriazol. Binding milli FosB-brota og frambjóðanda er framkallað þrjú gen fréttaritara (His3, Ura3og LacZ), og örvunin gerir Transformants færar um að lifa við ræktaðar aðstæður sem notaðar voru. Jákvæðir klónar voru prófaðir með nýjum pDBLeu-osFosB brotum með endurbreytingargreiningum í MaV203 frumum.

Frumulínur

Neuro 2A taugaæxlisfrumum (ATCC) músar var haldið í lágmarks nauðsynlegum miðli Eagle (EMEM) (ATCC), bætt við 10% fósturs nautgripasermi (FBS) við 37 ° C og 5% CO2. Rotta 1A frumur voru gjöf frá Yusaku Nakabeppu (Fukuoka, Japan) [18] og viðhaldið í DEMBECCO MEM (DMEM) (Life Technologies), bætt við 10% FBS við 37 ° C og 5% CO2. Aðlögun frumna með plasmíð DNA var framkvæmd með því að nota Effektene (Qiagen) samkvæmt leiðbeiningum framleiðandans.

PSMC5 og osFosB smíðar

Nokkur stökkbreytt form PSMC5, hvert FLAG-merkt á N-endanum þeirra, var búið til til notkunar í ónæmisfrumnafsláttum eða veirumiðluðum genaflutningartilraunum. Þessir fela í sér: PSMC5-K196M, PSMC5-Δ vafnings-spólu lén (PSMC5-ΔCC, skortir amínósýrur 27 – 68), PSMC5-NT (sem samanstendur af N-endabragði próteinsins, amínósýrur 1 – 151), -CT (samanstendur af C-enda brot próteinsins, 5 amínósýrur) (sjá Mynd 1). Við notuðum einnig N-terminal MYC-merktar gerðir af villigerð ΔFosB sem og ΔFosB með stökkbreytingu í leucine-rennilás léninu (stökkbreyting á amínósýrum 182 til 205 sem vitað er að eyðileggur heterodimerization með Jun fjölskyldupróteinum [6].

smámynd
Mynd 1. ΔFosB binst PSMC5 in vitro.

 

A. Aðaldráttur fyrir ΔFosB, ΔFosB-LZM þar sem leucine rennilásar lénið er stökkbreytt til að útrýma imerFosB heteródímerisering með Jun próteinum, og Δ2ΔFosB sem skortir fyrstu 78 amínósýrurnar í FosB N-endanum. B. Aðaldráttur fyrir PSMC5, PSMC5-NT sem samanstendur af fyrstu 151 amínósýrunum af PSMC5, PSMC5-CT sem skortir fyrstu 235 amínósýrurnar í PSMC5, og PSMC5-ΔCC sem skortir spólu-spólu lénið-X X X . AAA lénið samsvarar mótíf, ATPases sem tengjast fjölbreyttri frumuvirkni, til staðar í mörgum ATPases. C. 28 μg af pcDNA68-osFosB (brautir 2.4 – 3.1) eða ΔFosB-LZM (braut 1) var samflætt með 4 μg af FLAG-merktu PSMC5 eða ýmsum eyðingarmissum í Neuro2.4a frumur. Tveimur dögum eftir transfection voru frumur lýsaðir og látnar í ónæmisfrestun með andstæðingur-FLAG mótefni og síðan vestrænar með and-ΔFosB eða andstæðingur-FLAG mótefni. Athugaðu að ΔFosB, en ekki ΔFosB-LZM, binst sterkt við PSMC5 eða PSMC2-NT, en ekki PSMC5-CT eða PSMC5-ΔCC. Gögnin sem sýnd eru á myndinni voru afrituð í þríriti í hverri af þremur aðskildum tilraunum.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

Dýr

Níu til 11 vikna gamlar C57BL / 6J karlmýs (The Jackson Laboratory) voru notaðar við allar tilraunir. Dýr voru hýst í 12 klst ljósdimmu hringrás með aðgang að mat og vatni ad libitum og var venja 1 viku fyrir tilraun. Tvær kókaínmeðferðir voru notaðar. Til að kanna lífefnafræðilega áhrif kókaíns fengu dýr 7 daglega skammta af kókaíni (20 mg / kg) eða saltvatni og drápu við höfnunina 24 klst. Eftir síðustu inndælingu. Þetta er stöðluð siðareglur, sem hefur verið sýnt fram á að framleiðir fjölmörg sameindar- og frumusvörun við lyfinu [7]. Til að kanna áhrif PSMC5 í kjarnahúsi á hegðunarviðbrögð við kókaíni notuðum við undirþrýstingsskammt lyfsins (7.5 mg / kg; sjá Locomotor næmni hér að neðan) út frá þeirri tilgátu að PSMC5 myndi, eins og ΔFosB, auka næmi dýra fyrir kókaín [8]. Allar dýratilraunir voru samþykktar af stofnananefnd um dýraumönnun og notkun á Sínaífjalli.

Ónæmisfrestur og vestræna blotting

Neuro 2A frumur voru transfected með villigerð eða stökkbreyttu formi PSMC5. Tveimur dögum eftir transfection voru frumur þvegnar í PBS, lysaðir í RIPA jafnalausn (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% natríum deoxycholate, 10 mM natríumbútýrat, próteasahemill hanastél) . Lýsöt voru skipt og ræktað með annaðhvort ónæmis IgG (Sigma) eða andstæðingur-FLAG mótefni (Sigma) í 3 klst. Við 4 ° C. Ónæmisfrestun var framkvæmd með G prótein G perlum (Invitrogen) eins og lýst er [19]. Í stuttu máli voru ónæmisupptaka prótein látin vera á SDS-PAGE og greind með Western blotting með því að nota and-FosB / ΔFosB mótefni (Cell Signaling Technology) byggt á útgefnum samskiptareglum [7]. Við próteinbindandi próf in vivo notuðum við hreinsað kjarnaþætti úr kýldisgreindum NAc músum eftir langvarandi kókaínmeðferð (20 mg / kg IP daglega í 7 daga, með músum sem voru notaðar 24 klst. Eftir síðustu inndælingu). Samhliða ónæmisútfelling úr kjarnaþáttum var framkvæmd með því að nota Kjarnakomplex Co-IP búnaðinn (Active Motif) samkvæmt leiðbeiningum framleiðandans. Eftirfarandi mótefni voru notuð: MYC eða ß-actin, Cell Signaling Technology (Danvers, MA), PSMC5 og histone H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 og BRG1, Santa Cruz líftækni (Santa Cruz, CA) og FLAG M2, Sigma.

Immunohistochemistry

Ónæmissjúkdómafræði var framkvæmd samkvæmt útgefnum aðferðum [20]. Mýs voru svæfðar og parfaðir í hjarta með 4% paraformaldehýði í PBS. Heilinn var krotvarinn með 30% súkrósa og síðan fryst og geymdur við -80 ° C þar til notkun. Kransæðahlutar (40 μm) voru skornir á kryostat og unnir til ónæmisgeislunarefna. Frífljótandi hlutar voru fyrirfram ræktaðir í hindrandi biðminni sem innihélt 0.3% Triton og 3% venjulegt asnasermi. Δ FosB fannst með geislamikla mótefni, sem var alið upp á N-enda hluta próteinsins (1 / 1000 Santa Cruz líftækni). PSMC5 fannst með því að nota polyclonal mótefni gegn kanínu (1 / 100 Abcam, Cambridge, MA). Myndir voru teknar með rugli smásjá (stækkun 60x; Zeiss).

Næmi fyrir hreyfingu

Allar mýs fengu daglega IP sprautur af saltvatni í 3 daga til að venja þá við streitu inndælinganna. Daginn eftir var músum sprautað IP með saltvatni eða undirþrýstingsskammti af kókaíni (7.5 mg / kg; sjá undir dýrum hér að ofan) og settir strax í nýjar hreyfitöskjur. Vélknúin virkni músanna var skráð með ljósgeislakerfi sem brot á geislun í 30 mín. Þessar meðferðir voru endurteknar daglega í 3 daga.

Veirumiðlað genaflutning

Við notuðum ítarlega birtar aðferðir til veirumiðlaðs genaflutnings [7,8,11,19]. Í stuttu máli voru tjáningarplasmíð fyrir PSMC5 eða fyrir nokkur af stökkbrigðum þess (sjá PSMC5 og ΔFosB smíðin hér að ofan) undirklönnuð í tvíeykið p1005 (+) HSV plasmíð sem tjáir GFP undir stjórn CMV verkefnisstjórans, og PSMC5 eða stökkbrigði þess undir því að CMV verkefnisstjórinn, og PSMC4 eða stökkbrigði þess undir því að IE5 / 100 kynningarstjóri. Undir ketamíni (10 mg / kg) / xýlazíni (0.5 mg / kg) svæfingu voru mýs staðsettar í litlu dýrum staðalímyndunartæki og kraníaryfirborðið var afhjúpað. Þrjátíu og þrjár gauge sprautunálar voru notaðir til að gefa tvíhliða innrennsli 10 μl af HSV vektor í NAc við 1.6 ° horn (AP + 1.5; ML + 4.4; DV -0.1) á 2 μl / mín. Dýr sem fengu HSV sprautur fengu að jafna sig í XNUMX daga eftir aðgerð fyrir tilraun.

Tölfræði

ANOVA og t-próf ​​nemenda voru notuð, leiðrétt fyrir margfeldi samanburð, með marktækni stillt á p <0.05.

Niðurstöður

PSMC5: skáldsaga bindandi félagi ΔFosB

Við gerðum frumtilraunir til að bera kennsl á viðeigandi brot af FosB sem þjónaði sem agn í tveggja gerða tvinnblöndu geri án þess að virkja kerfið sjálfvirkt. Holo-ΔFosB olli virkni fréttaritara á eigin spýtur, eins og N-terminal 1 – 78 amínósýrubrot próteinsins. Samt sem áður, styttri N-flugstöð ΔFosB (Mynd 1A), kallað Δ2ΔFosB, sem skortir fyrstu 78 amínósýrur próteinsins, höfðu ekki þessi áhrif. Þess vegna notuðum við Δ2ΔFosB sem beituprótein.

Til að skima fyrir hugsanlegum bindingaraðilum notuðum við músheilasafn undirklónað í pPC86. Við greindum 11 frambjóðendur fyrir bindandi félaga. Þrátt fyrir að þessi prótein innihéldu þekkta heteródímerisunaraðila ΔFB, c-Jun og JunD (Tafla 1), langalgengasti frambjóðandinn var PSMC5. Þótt þetta kom á óvart var þetta athyglisverð niðurstaða þar sem PSMC5 var sýnt í einni skýrslu fyrir mörgum árum að binda c-Fos in vitro [21]. Hins vegar eru engar skýrslur um fyrri þátttöku PSMC5 í kókaínaðgerðum. Engu að síður, vegna styrks PSMC5 merkisins í gerinu með tvennum blendingum gerðar, lögðum við okkur af stað til að kanna frekari mögulegar ΔFosB-PSMC5 samspil.

smámynd
Tafla 1. Niðurstöður tvíblendinga skimunar með ger með Δ2ΔFosB.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

Í fyrsta lagi, til að staðfesta líkamlega samspil osFosB og PSMC5, gerðum við in vitro sam-ónæmisprófunartilraunir. Við fundum að FLAG-merkt PSMC5 (Mynd 1B), transfected í Neuro 2A frumur, dreginn í raun niður ΔFosB (Mynd 1C). Í öðru lagi, til að bera kennsl á svæðið í PSMC5 sem er ábyrgt fyrir bindingu þess við osFosB, myndum við nokkur FLAG-merkt PSMC5 stökkbrigði (Mynd 1B) og endurtók tilraunina með samhliða ónæmisaðstoð. Δ FosB var dregið niður á áhrifaríkan hátt með N-endalokum 151 amínósýrum af PSMC5 (PSMC5-NT), en ekki með C-endanlegu 172 amínósýrubroti próteinsins (PSMC5-CT) (Mynd 1C). PSMC5 skortur vafningslóðasviðs þess (PSMC5-ΔCC) var einnig árangurslaust við útfellingu ΔFosB. Þessar niðurstöður benda til þess að PSMC5 bindist ΔFosB um lénið með spólu-spólu (amínósýrur 27 – 68). Ennfremur, FLAG-merkt PSMC5 felldi ekki út stökkbreytt form af osFosB með stökkbreytt leucine rennilásar lén (domainFosB-LZM) (Mynd 1C), sem gefur til kynna að ΔFosB bindur annað hvort PSMC5 í gegnum þetta lén eða, líklegra, að ΔFosB heteródímerisering sé nauðsynleg fyrir PSMC5 bindingu.

PSMC5-ΔFosB binding í NAc eftir langvarandi gjöf kókaíns

Byggt á þessum niðurstöðum in vitro, könnuðum við hvort PSMC5 gildi í NAC hafi verið breytt sem svar við langvarandi gjöf kókaíns. Við fundum með frumuskiptingu og vestrænum blotting að langvarandi kókaín eykur kjarnastig PSMC5 á þessu heila svæði án þess að breyting sé á umfrymis stigum (Mynd 2A). Þessi áhrif sáust ekki eftir staka skammta af kókaíni (gögn ekki sýnd). Við skoðuðum næst staðsetningu PSMC5 og ΔFosB í NAc með confocal ónæmisflúrljómun smásjá. Við greindum mýs 24 klst. Eftir síðasta endurtekna skammt af kókaíni, tímapunkti þegar osFosB er eini greinanlegi FosB genafurð (sjá Nestler 2008). Við fundum sterka PSMC5 ónæmisvirkni í NAc, þar með talið sterkt kjarnorkumerki. ~ 85% af ΔFosB + kjarna samlitaðir fyrir PSMC5 (Mynd 2B). Að auki gerðum við samtímis ónæmisframsogtilraunir á NAc útdrætti og komumst að því að eftir langvarandi kókaínmeðferð var osFosB dregið niður á áhrifaríkan hátt með and-PSMC5 mótefni (Mynd 2C). Aftur á móti leiddi í ljós greining á NAF-lyfjum sem ekki höfðu verið gefin út (eftir endurteknar inndælingar í saltvatni) engin greinanleg ΔFosB draga niður (gögn eru ekki sýnd). Þessi gögn eru í samræmi við niðurstöður okkar í frumurækt og staðfesta að ΔFosB og PSMC5 hafa samskipti við NAc in vivo.

smámynd
Mynd 2. PSMC5 reglugerð í mús NAc.

 

A. Western blotting af kjarna- og cytosolic brotum af NAc músum meðhöndluð daglega með saltvatni eða kókaíni (20 mg / kg) í 7 daga, þar sem dýr voru greind 24 klst eftir síðustu inndælingu. Kókaín eykur kjarnorku en ekki cýtósólísk gildi PSMC5. Histone H3 og ß-aktín, sem ekki voru fyrir áhrifum af kókaíni, voru notuð sem hleðsluviðmið. Gögn eru meðaltal ± SEM (n = 8-10 / hópur, * p <0.05). B. Samlokun á innrænu PSMC5 (grænu) og ΔFosB (bláu) í NAc hjá músum sem fengu langvarandi meðferð með kókaíni eins og í AC Kjarnalýsat af mús NAc eftir langvarandi kókaínmeðferð var undir ónæmisútfellingu með and-PSMC5 mótefni eða IgG músa og síðan Western blotað með and-FosB / ΔFosB mótefni. Myndin sýnir PSMC5-ΔFosB milliverkanir í NAc in vivo. Gögn í B og C voru endurtekin í tvíriti í hverri af þremur aðskildum tilraunum.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 eykur expressionFosB tjáningu in vitro

Þar sem PSMC5 er þekktur meðlimur í proteasome fléttunni, prófuðum við hvort það stjórnar levelsFosB stigum með því að nota Rat 1A frumur. PSMC5 oftrygging hafði engin áhrif á grunnþéttni ΔFosB, en olli litlum en verulegum aukningu ΔFosB örvunar við örvun sermis í frumum (Mynd 3A). Svipuð þróun sást fyrir FosB í fullri lengd en áhrifin náðu ekki tölfræðilegri þýðingu. Hins vegar hafði bæling á innrænum PSMC5 tjáningu í rotta 1A frumum, sem náðst var með því að nota siRNA sem miða við PSMC5, ekki áhrif á basal ΔFosB gildi en hamlaði sterklega ΔFosB örvun með örvun í sermi (Mynd 3B). Svipuð áhrif sáust á FosB í fullri lengd. Þessi gögn benda til þess að PSMC5 stuðli ekki að niðurbroti easFosB í æð, eins og búast mætti ​​við sem kjarnaeining proteasome, en í staðinn er krafist fyrir hámarks uppsöfnun á FosB genafurðir in vitro, kannski með stöðugleika próteina.

smámynd
Mynd 3. PSMC5 stjórnun á FosB / ΔFosB tjáningu í 1A frumum úr rottum.

 

A. Rotta 1A frumur voru smitaðar með 4 μg af PSMC5 eða samanburðar DNA. Yfirtjáning PSMC5 hafði engin áhrif á grunntjáningarstig FosB eða ΔFosB próteins eins og það var ákvarðað með Western blotting, en framkallaði litla en marktæka aukningu á örvun ΔFosB með sermisörvun (F (2,21) = 9.75, p = 0.001). B. Rotta 1A frumur voru smitaðar með 5 pmól af hvoru tveggja siRNAs eða spæna RNA (viðmið). Bæði siRNAs lækkuðu í raun PSMC5 próteinmagn samanborið við samanburðaraðstæður (siRNA # 1, 23 ± 5% viðmiðunar; siRNA # 2, 18 ± 6%; p <0.05; n = 4). PSMC5 rothögg hafði engin áhrif á grunnþéttni FosB eða ΔFosB en dempaði framköllun bæði FosB og ΔFosB með sermisörvun (FosB: F (2,6) = 20.99, p = 0.002; ΔFosB: F (2,6) = 22.83 , p = 0.002).

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

ΔFosB og PSMC5 mynda fléttur með CBP, p300 og BRG1 í NAc

Til að skilja betur afritunarleiðina sem PSMC5 gæti haft áhrif á ΔFosB virka, könnuðum við mögulega viðbótarbindingaraðila fyrir próteinin tvö í NAc við langvarandi meðferð með kókaíni. Það er ein skýrsla sem PSMC5 binst CBP — HAT — og eykur histón H3 asetýleringu við MHC-II nærliggjandi kynningu í HeLa frumum [22]. Þar að auki sýna mýs sem eru með skort á CBP skert hegðun næmi fyrir kókaíni og einnig minnkað histón asetýlering við FosB verkefnisstjóri [23]. Við prófuðum þannig hvort PSMC5 gæti bindst við ΔFosB sem hluta af fléttum sem innihalda einnig CBP og ef til vill aðra afritunarvirkja.

Við sýndu fyrst fram á að osFosB dró í raun niður bæði CBP og p300, tengt HAT, í Neuro2A frumum (Mynd 4A). Aftur á móti sýndi leucine rennilás stökkbreytt form ΔFosB, eins og búist var við, ekki þessa virkni. Á sama hátt dró PSMC5 í raun niður CBP og p300 (Mynd 4B). Athyglisvert er að þessi áhrif sáust einnig fyrir PSMC5-ΔCC, sem dró ekki niður ΔFosB, sem benti til þess að PSMC5 hafi samskipti við CBP og p300 í gegnum önnur svið próteinsins og óháð bindingu þess við osFosB.

smámynd
Mynd 4. ΔFosB og PSMC5 hafa samskipti við CBP, p300 og BRG1 in vitro og in vivo.

 

A. Neuro2A frumur voru transfected með 2.4 μg af MYC-merktu ΔFosB eða MYC-merktu ΔFosB-LZM. Frumu útdrættir voru ónæmisbældir með and-CBP eða and-p300 mótefni og botnfellingar voru vestrænar með sama mótefni eða með and-MYC mótefni. Bæði CBP og p300 hafa samskipti við ΔFosB og slíkar milliverkanir þurfa ósnortinn rennilás af leucíni. B. Neuro2A frumur voru transfected með 2.4 μg af FLAG-merktu PSMC5 eða FLAG-merktu PSMC5-ΔCC. Frumu útdrættir voru ónæmisbældir með and-CBP eða and-p300 mótefni og botnfellingar voru vestrænar með sama mótefni eða með FLAG mótefni. Bæði CBP og p300 hafa samskipti við PSMC5 og slík samskipti þurfa ekki CC lén. C. Kjarnalýsata af NAc músum eftir langvarandi kókaínmeðferð voru látin fara í ónæmisframsog með and-CBP eða and-p300 mótefni. Síðari vestræn þétting af útfelldum botnfallum með and-FosB / ΔFosB mótefni sýndi innræn samskipti milli ΔFosB og CBP / p300. D. Alquots af sömu kjarnalýsötum voru látnir fara í ónæmisfellingu með and-BRG1 eða and-PSMC5 mótefni, fylgt eftir með vestrænu útfellingu botnfalls með and-FosB / ΔFosB eða and-BRG1 mótefni. Niðurstöðurnar sýna innræn samskipti milli betweenFosB og BRG1, og BRG1 og PSMC5. E. Ritræn mynd af uppskriftarvirkjunarsamstæðu sem samanstendur af ΔFosB: JunD heterodimers sem hafa samskipti við CBP / p300, BRG1 og PSMC5.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

Til að staðfesta að þessar milliverkanir eiga sér einnig stað í in vivo gáfum við kókaíni langvarandi til að framkalla ΔFosB og kjarna PSMC5 stig, síðan ónæmisfrumuðu NAc útdrætti með and-CBP eða and-p300 mótefnum. Í samræmi við frumuræktunargögn okkar, ónæmisfrestun á CBP eða p300 dregin í raun niður ΔFosB (Mynd 4C). Við prófuðum hvort BRG1, kjarnaundireining SWI-SNF chromatin remodeling complex, gæti einnig bundist ΔFosB og PSMC5, byggt á fyrri niðurstöðu okkar um að BRG1 sé ráðinn til ákveðinna ΔFosB marka gena í samvinnu við virkjun þeirra í NAc eftir langvarandi kókaín [24]. Við komumst að því að ónæmisfrumnafjöldi BRG1 dró niður BFosB í NAc útdrætti og að ónæmisfrumnafjöldi PSMC5 sömuleiðis endurfjármagnaði innræn BRG1 (Mynd 4D). Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að ΔFosB-PSMC5 myndi fléttur í NAc sem innihalda einnig CBP / p300 og BRG1 (Mynd 4E).

PSMC5 oftrygging eykur svörun hreyfingar við kókaíni

Hin áberandi binding PSMC5 við osFosB í NAc hvatti okkur til að kanna hvort að hækka stig PSMC5 á þessu heilasvæði stjórnar hegðunarviðbrögðum við kókaíni. Við bjuggum til Herpes Simplex Virus (HSV) vektor sem ofreynir annað hvort villtan PSMC5 eða einn af stökkbrigðum þess og staðfesti vektorana í NAc in vivo (Mynd 5A). Veirumiðuð tjáning PSMC5 er aðallega í frumukjarnanum (Mynd 5B). Mýs sem ofreyndu villta gerð PSMC5 sýndu ekki breytt viðbrögð við upphafsskömmtum af kókaíni, en sýndu aukna hreyfingu á hreyfingu til að bregðast við endurteknum kókaínskömmtum samanborið við GFP-tjáandi stjórnarmús. Aftur á móti sýndi mýs ofþjöppun á stökkbreyttu formi PSMC5 sem skortir vafningsspólulénu þess (PSMC5-ΔCC) ekki þessi áhrif (Mynd 5B). Athyglisvert er að ofsjá PSMC5-K196M, sem skortir ATPase virkni villtra próteins, styrkti einnig hreyfingarviðbrögð kókaíns.

smámynd
Mynd 5. PSMC5 of-tjáning í NAc eykur svörun hreyfingar við kókaíni.

 

A. Fulltrúi HSV-miðlaðrar tjáningar á genum í miðlægu NAc. AC, fremri commissure. NAc kjarna og skel undirsvæði eru skráð á myndinni. B. Fulltrúi hærri stækkunar (60x) ónæmis-efnafræðilegrar litunar á PSMC5 í NAc taugafrumum eftir HSV-PSMC5 inndælingu sem sýnir að próteinið er aðallega kjarnakennt eins og merkt er með DAPI litun. C. Mýs fengu tvíhliða HSV-sprautur í NAc og síðan daglegar IP-inndælingar af skammtinum af kókaíni undir þröskuldi (7.5 mg / kg). Hreyfisvörun er sýnd til að bregðast við fyrsta og síðasta af 3 dagskömmtum lyfsins. Yfirtjáning PSMC5 eða PSMC5-K196M eykur hreyfiviðbrögð við endurteknu kókaíni, áhrif sem ekki sést með PSMC5-ACC. Það voru engin marktæk áhrif transgena á hreyfisvörun við upphafsskammtum kókaíns. ANOVA F (3,125) = 4.163, * p <0.05 eftir Dunnett's posthoc próf.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

Discussion

Niðurstöður þessarar rannsóknar leiða í ljós nýjan fyrirkomulag þar sem ΔFosB miðlar áhrifum þess á heilann og nýjan gangverk sem hefur áhrif á kókaínverkun. Með því að nota óhlutdræga nálgun, ger tveggja-blendinga próf, bentum við á PSMC5 sem nýjan bindifélag fyrir osFosB. Við staðfestum þessa niðurstöðu bæði í ræktuðum frumum in vitro og í NAc in vivo með því að sýna fram á öfluga PSMC5-osFosB bindingu. Mikilvægt er að kjarnorkustig PSMC5 er framkallað í NAc með langvarandi gjöf kókaíns. Við sýndum ennfremur að PSMC5-ΔFosB binding á sér stað í samvinnu við nokkur önnur afritunarprótein, sem nefnist CBP og p300 (tvö HAT) og BRG1 (lykilhluti SWI-SNF litskiljunarkomplexa). Saman styðja niðurstöður okkar þá tilgátu að PSMC5 sé hluti af aðlögunarvirkjunarkomplexinu sem er ráðið í að minnsta kosti ákveðin ΔFB-örvuð gen meðan á langvinnri kókaíngjöf stendur (Mynd 4E). Samræmi við þessa tilgátu er sú viðbótaruppgötvun að ofþjöppun PSMC5 í NAc, eins og of tjáning ΔFosB sjálfs, stuðlar að hegðunarviðbrögðum við kókaíni. Það væri áhugavert í framtíðarrannsóknum að fylgja eftir þessum in vivo athugunum með persónusköpun PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1 milliverkana með því að nota in vitro fréttarannsóknir.

Aðkoma PSMC5 að kókaínaðgerðum er alveg ný. Í upphafi hefur verið sýnt fram á að meðlimur í stórri fjölskyldu ATPases sem samanstendur af próteasóminu, PSMC5 hefur í gegnum árin sýnt sig hafa samskipti við nokkra umritunarþátta, þar á meðal c-Fos, p53, kjarnahormónviðtaka og innihaldsefni grunnuppskriftarsamstæðunnar [25], þó hafa nokkrar starfhæfar rannsóknir verið gerðar í gegnum tíðina [26]. Bestu staðfestu aðgerðir þess eru að stuðla að virkni MYC umritunarþátta í ræktuðum frumum [27]. Afleiðing PSMC5 í umritunaraðgerðum hefur bent til hugsanlegs hlutverks fyrir starfsemi alls staðar og forstigs í stjórnun genafritunar, en þátttaka PSMC5 í slíkri reglugerð er nánast óprófuð fram til þessa [28,29].

Mjög lítið er vitað um virkni PSMC5 í heila. Fyrri rannsókn sýndi fram á víðtæka tjáningu PSMC5 mRNA um heila [30], en hagnýtur virkni þess hefur haldist ónefnd. Niðurstöður okkar hvetja nú til frekari rannsókna á þessu áhugaverða próteini til að skilja betur hlutverk þess í að stjórna umritun gena og tengsl þess við alls staðar nálægðarproteasomal virkni í heila. Binding PSMC5 við ΔFosB er miðluð af vafningsspólu lén PSMC5. Ennfremur þarf hæfileiki PSMC5 til að stuðla að svörum við hreyfingum við kókaíni, meðan það er krafist léns spólu-spólu, ekki ATPase virkni sem er eðlislæg prótíninu. Þessar niðurstöður vekja möguleika á að að minnsta kosti í kerfinu okkar gæti meginstarfsemi PSMC5 verið miðluð með því að binda það við osFosB og önnur eftirlits reglugerðarprótein en ekki með því að vera proteasomal tengd virkni í sjálfu sér. Frekari vinnu er nauðsynleg til að prófa þetta og aðra möguleika með beinum hætti. Tilgátan um að veirumiðuð ofspá á PSMC5 hafi aukið hreyfiviðbrögð við kókaíni með milliverkunum við osFosB er trúverðug, þrátt fyrir notkun 3 daga meðferðar með kókaíni, því það er vitað að umtalsvert magn af osFosB safnast upp í heila á þessum tíma [3].

Þessar niðurstöður styrkja enn frekar gagnsemi þess að nota óhlutdrægar, opnar tilraunaaðferðir til að rannsaka sameindagrundvöll heilastjórnunar. Okkar fyrstu athygli á PSMC5 byggðist eingöngu á áberandi bindingu þess við FosB í ger tveggja tveggja blendinga greiningar, en samt virðist það vera mikilvægur þáttur í umbreytingarbreytingum sem eru ráðnar í NAc með endurtekinni gjöf kókaíns. Betri skilningur á ítarlegum aðferðum með því að framkalla kjarna magn PSMC5 af kókaíni og aftur á móti, með hvaða hætti PSMC5 stuðlar síðan að kókaín-framkallaðri uppskriftarvirkni fléttu eru í brennidepli núverandi rannsókna. Á sama tíma leiddi í ljós tveggja-blendinga greiningin á okkur ýmsar viðbótaráhrifa bindandi samstarfsaðilar ΔFosB (Tafla 1) sem einnig gefur tilefni til beinnar skoðunar á kókaínlíkönum. Saman stuðlar þessi vinna að auknum skilningi á flóknum sameindaaðferðum sem kókaín breytir NAc virkni.

Acknowledgments

Þessi vinna var studd af styrkjum frá National Institute for Drug Abuse, og af Ishibashi Foundation og Japan Society for the Promission of Science (KAKENHI tölur: 24591735, 26290064, 25116010).

Höfundur Framlög

Hugsuð og hannað tilraunirnar: YHO YNO EJN. Framkvæmdu tilraunirnar: YHO YNO PJK RN. Greindi gögnin: YHO YNO EJN. Framlög hvarfefni / efni / greiningartæki: TN MO OY AN RN TT. Skrifaði blaðið: YHO EJN.

Meðmæli

  1. 1. Morgan JI, Curran T (1995) Strax-snemma gen: tíu ár í viðbót. Þróun Neurosci 18: 66 – 67. pmid: 7537412 doi: 10.1016 / 0166-2236 (95) 80022-t
  2. 2. Nestler EJ (2008) Yfirfærsluferli fíknar: hlutverk deltaFosB. Philos Trans R Soc London B Biol Sci 363: 3245 – 3255. doi: 10.1098 / rstb.2008.0067. pmid: 18640924
  3. Skoða grein
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Skoða grein
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Skoða grein
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Skoða grein
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Skoða grein
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Skoða grein
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Skoða grein
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Skoða grein
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Skoða grein
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Skoða grein
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Skoða grein
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Skoða grein
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Skoða grein
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Skoða grein
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Skoða grein
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Skoða grein
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Skoða grein
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Skoða grein
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Skoða grein
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Skoða grein
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Skoða grein
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Skoða grein
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Skoða grein
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Skoða grein
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Skoða grein
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Skoða grein
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Skoða grein
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Skoða grein
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Skoða grein
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. 3. Vona BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, o.fl. (1994) Innleiðing langvarandi AP-1 fléttu sem samanstendur af breyttum Fos-líkum próteinum í heila með langvarandi kókaíni og öðrum langvinnum meðferðum. Neuron 13: 1235 – 1244. pmid: 7946359 doi: 10.1016 / 0896-6273 (94) 90061-2
  91. 4. Hiroi N, Brown J, Haile C, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ (1997) FosB stökkbreyttar mýs: Tap á langvarandi kókaín framköllun Fos tengdra próteina og aukið næmi fyrir geðhreyfingum og gefandi áhrifum kókaíns. Proc Natl Acad Sci USA 94: 10397–10402. pmid: 9294222 doi: 10.1073 / pnas.94.19.10397
  92. 5. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ (2006) Reglugerð ΔFosB stöðugleika með fosfórýleringu. J Neurosci 26: 5131 – 5142. pmid: 16687504 doi: 10.1523 / jneurosci.4970-05.2006
  93. 6. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, o.fl. (2007) Skortur á varðveittu C-terminal degron léni stuðlar að einstökum stöðugleika ΔFosB. Eur J Neurosci 25: 3009 – 3019. pmid: 17561814
  94. 7. Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M, o.fl. (2013) Hegðunar- og uppbyggingarviðbrögð við langvarandi kókaíni krefjast fram-lykkju sem felur í sér ΔFosB og CaMKII í skel kjarna accumbens. J Neurosci 33: 4295 – 4307 doi: 10.1523 / JNEUROSCI.5192-12.2013. pmid: 23467346
  95. 8. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, o.fl. (1999) Tjáning á umritunarstuðlinum os FosB í heila stjórnar næmi fyrir kókaíni. Náttúra 401: 272 – 276. pmid: 10499584
  96. 9. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) ΔFosB eykur hvata fyrir kókaín. J Neurosci 23: 2488 – 2493. pmid: 12657709
  97. 10. McClung CA, Nestler EJ (2003) Reglugerð um genatjáningu og kókaínlaun hjá CREB og DFosB. Nat Neurosci 11: 1208 – 1215. pmid: 14566342 doi: 10.1038 / nn1143
  98. 11. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy þingmaður, Kelz MB, o.fl. (2006) ΔFosB: Nauðsynlegt hlutverk fyrir ΔFosB í kjarnanum sem samanstendur af í morfínvirkni. Nature Neurosci 9: 205 – 211. pmid: 16415864 doi: 10.1038 / nn1636
  99. 12. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, o.fl. (2003) Örvandi, sértæk tjáning á heila svæðinu á ríkjandi neikvæðum stökkbrigði af c-Jun hjá erfðabreyttum músum dregur úr næmi fyrir kókaíni. Heilaupplausn 970: 73 – 86. pmid: 12706249 doi: 10.1016 / s0006-8993 (03) 02230-3
  100. 13. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, o.fl. (1995) Reglugerð á delta FosB og FosB-líkum próteinum með rafleiðsluflogum og kókaínmeðferð. Mol Pharmacol 48: 880 – 889. pmid: 7476919
  101. 14. Hiroi N, Marek GJ, Brown J, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, o.fl. (1998) Nauðsynlegt hlutverk fosB-gensins í sameinda-, frumu- og atferlisaðgerðum rafseglingafloga. J Neurosci 18: 6952 – 6962. pmid: 9712664
  102. 15. Perez-Otano I, Mandelzys A, Morgan JI (1998) MPTP Parkinsonismi fylgir viðvarandi tjáningu D-FosB-lík próteins í dópamínvirkum leiðum. Mol Brain Res 53: 41 – 52. pmid: 9473580 doi: 10.1016 / s0169-328x (97) 00269-6
  103. 16. Ma J, Ptashne M (1988) Að umbreyta heilkjörnungar umritunarhemli í virkju. Hólf 55: 443 – 446. pmid: 3180218 doi: 10.1016 / 0092-8674 (88) 90030-x
  104. 17. Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, Fields S (1991) Tvíblendingakerfið: aðferð til að bera kennsl á og klóna gen fyrir prótein sem hafa samskipti við prótein sem vekur áhuga. Proc Natl Acad Sci USA 88: 9578 – 9582. pmid: 1946372 doi: 10.1073 / pnas.88.21.9578
  105. 18. Nakabeppu Y 1, Oda S, Sekiguchi M (1993) Proliferative örvun róandi Rat-1A frumna með delta FosB. Mol Cell Biol 13: 4157 – 4166. pmid: 8321220
  106. 19. Scobie KN, Damez-Werno D, Sun H, Shao N, Gancarz A, Panganiban CH, o.fl. (2014) Nauðsynlegt hlutverk fjöl (ADP-ríbósýl) ation í kókaínverkun. Proc Natl Acad Sci USA 111: 2005 – 2010. doi: 10.1073 / pnas.1319703111. pmid: 24449909
  107. 20. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, o.fl. (2008) Greinilegt mynstur ΔFosB örvunar í heila með misnotkun lyfja. Synapse 62: 358 – 369. doi: 10.1002 / syn.20500. pmid: 18293355
  108. 21. Wang WL, Chevray PM, Nathans D (1996) Mammalian Sug1 og c-Fos í kjarnorku 26S proteasome. Proc Natl Acad Sci USA 93: 8236 – 8240. pmid: 8710853 doi: 10.1073 / pnas.93.16.8236
  109. 22. Koues OI 1, Dudley RK, Truax AD, Gerhardt D, Bhat KP, McNeal S, o.fl. (2008) Reglugerð um asetýleringu í aðal vefjameðferðarsamhæfisflokks II stigfrumukennara af 19S proteasomal ATPase Sug1. Mol Cell Biol 28: 5837 – 5850. doi: 10.1128 / MCB.00535-08. pmid: 18662994
  110. 23. Levine AA, Guan Z, Barco A, Xu S, Kandel ER, Schwartz JH (2005) CREB-bindandi prótein stýrir svörun við kókaíni með því að asetýlera históna við fosB kynningarefnið í músarstratum. Proc Natl Acad Sci USA 102: 19186 – 19191. pmid: 16380431 doi: 10.1073 / pnas.0509735102
  111. 24. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, o.fl. (2005) Krómatín endurgerð er lykillinn sem liggur til grundvallar kókaín af völdum plastleysis í striatum. Neuron 48: 303 – 314. pmid: 16242410 doi: 10.1016 / j.neuron.2005.09.023
  112. 25. St-Arnaud R (1999) Tvöföld virkni fyrir eftirlitsstofnana með uppskrift: goðsögn eða veruleiki. J Cell Biochem Suppl 32/33: 32–40. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4644 (1999) 75: 32+ <32 :: aid-jcb5> 3.0.co; 2-x
  113. 26. Ferrell K, Wilkinson CRM, Dubiel W, Gordon C (2000) Samspil reglugerða undireininga 26S proteasome, flókið vandamál. Trends Biochem Sci 25: 83 – 88. pmid: 10664589 doi: 10.1016 / s0968-0004 (99) 01529-7
  114. 27. von der Lehr N, Johansson S, Larson LG (2003) Áhrif ubiquitin / proteasome kerfisins í myc-stjórnaðri umritun. Frumuhringrás 2 – 5: 403 – 407. doi: 10.4161 / cc.2.5.484
  115. 28. Geng FQ, Wenzel S, Tansey WP (2012) Ubiquitin og proteasomes í umritun. Annu Rev Biochem 81: 177 – 201. doi: 10.1146 / annurev-biochem-052110-120012. pmid: 22404630
  116. 29. Collins GA, Tansey WP (2006) Proteasome: tól til að umrita? Curr Op Genet Dev 16: 197 – 202. pmid: 16503126
  117. 30. Sun DH, Swaffield JC, Johnston SA, Milligan CE, Zoeller RT, Schwartz LM (1997) Auðkenning með fylgjandi varðveittu Sug1 CAD fjölskyldumeðlim sem kemur fram með mismunandi hætti í taugakerfi músarinnar. Dev Neurobiol 33: 877–890. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4695 (199712) 33: 7 <877 :: aid-neu2> 3.0.co; 2-5