Proc Natl Acad Sci US A. Apríl 29, 2014; 111 (17): 6455 – 6460.
Birt á netinu Apríl 15, 2014. doi: 10.1073 / pnas.1404323111
PMCID: PMC4036004
Neuroscience
Teruko Danjo,a Kenji Yoshimi,b Kazuo Funabiki,a Satoshi Yawata,a og Shigetada Nakanishia,1
Þessi grein hefur verið vitnað af Aðrar greinar í PMC.
Þýðingu
Dópamín (DA) taugafrumur á ventral tegmental svæðinu (VTA) bregðast við tálgandi áreiti að mestu með skammvinnri þögn. Enn er óljóst hvort þessi viðbrögð örva beinlínis andstyggileg viðbrögð hjá hegða músum. Við skoðuðum þessa spurningu með því að stjórna DA taugafrumum optogenetically í VTA og komumst að því að óvirkja DA taugafrumna leiddi til andstyggilegra svara og læra. Kjarninn accumbens (NAc), helstu framleiðslukjarnar VTA DA taugafrumna, var álitinn bera ábyrgð á þessu svari, svo við skoðuðum hver af grundvallarferlum í NAc skiptir sköpum fyrir þessa hegðun með því að nota niðurbrot D1 eða D2 viðtakans, og komst að því að D2 viðtakasértæk leið var mikilvæg fyrir þessa hegðun.
Abstract
Dópamín (DA) sending frá ventral tegmental area (VTA) er mikilvæg til að stjórna bæði gefandi og andstyggilegri hegðun. Tímabundin þögn á taugafrumum DA er ein af viðbrögðum við andstætt áreiti, en afleiðingar þess og taugakerfi varðandi svívirðileg viðbrögð og nám hafa að mestu haldist fimmti.. Hér, við greinum frá því að optogenetic óvirkjun á VTA DA taugafrumum hafi strax stjórnað DA stigum og komið fram stjórnun á taugavirkni í nucleus accumbens (NAc) eins og metið var með Fos tjáningu. Toptogenetic bæling hans á DA taugafrumuskotum vakti strax andstyggileg viðbrögð við áður myrku myrkrinu og leiddi til andlegrar náms í átt að optogenetically skilyrtum stað. Mikilvægt er að þessi andúð á þessum stöðum var afnumin með því að gera dópamín D2 viðtaka kleift en ekki af D1 viðtökum í NAc. Þögn af DA taugafrumum í VTA var þannig ómissandi til að örva svívirðileg viðbrögð og læra í gegnum dópamín D2 viðtaka í NAc.
Mesólimbíska dópamínvirka kerfið gegnir ekki aðeins lykilhlutverki í fjölmörgum hvatningum og námi (1-3), en vanvirkni þess hefur einnig verið beitt í alvarlegum taugasjúkdómum eins og sýnt er í Parkinson-sjúkdómi, geðklofa og eiturlyfjafíkn. Dópamín (DA) taugafrumur á ventral tegmental svæðinu (VTA) bregðast við gefandi áreiti með fasískri hleðslu, og aðalhlutverk þessarar skothríðs er kenning til að umrita „villuspá fyrir villu,“ mismuninn á gildi milli spáð umbun og raunveruleg umbun (4). Öfugt við svörun við gefandi áreiti eru viðbrögð þeirra við aversive áreiti langt frá því að vera einsleit; þ.e. sumar DA taugafrumur eru gerðar virkar til að bregðast við aversive áreiti, en flestar aðrar bregðast við með því að bæla tímabundið frá skothríð (5-9). Reyndar hafa nýlegar rannsóknir leitt í ljós að optogenetic virkjun GABAergic taugafrumna og afleiðing af því að DA taugafrumur eru virkar bæla umbun neyslu og framkalla andstæða svörun (10, 11). Hins vegar hefur það að mestu leyti haldist fimmti um hvaða aðferðir í taugakerfunum eru nauðsynlegar til að öðlast andstætt nám í kjölfar óvirks DA taugafrumna í VTA og hvernig hegðunarviðbrögðum er stjórnað til að bæla neyslu neyslu og framkalla andstæða hegðun.
Uppsafnaðar vísbendingar hafa leitt í ljós að hvatningar- og vitrænt nám sem svar við jákvæðu og neikvæðu áreiti er að mestu leyti stjórnað af taugakerfunum, þar með talið basal ganglia (12), sem fá mikið magn af dópamínvirka vörpun frá miðhjálpinni. Í striatum eru tvær grundvallar taugrásir samanstendur af tilgreindum meðalstórum spiny taugafrumum (MSN) sem hver um sig táknar sérstaka tegund DA viðtaka (13).
- Einn hringrás er bein leið, sem samanstendur af MSN-tækjunum sem beint varpa út að útgangskjarna basalganglanna, substantia nigra pars reticulata (SNr), og aðallega tjáir dópamín D1 viðtaka (D1Rs).
- Hin er óbeina leiðin, sem samanstendur af MSN-tækjum sem vinna óbeint í gegnum globus pallidus að SNr og tjá fyrst og fremst dópamín D2 viðtaka (D2R).
DA merki frá miðhjálp mótmæla þessum tveimur samsíða leiðum með öflugum hætti á gagnstæða hátt í gegnum D1Rs og D2Rs, og þessi mótun er ætluð til að auðvelda hvetjandi nám (3, 14).
- Hvað varðar gefandi áreiti, eru uppstýrð DA stig sem framkölluð eru með gefandi merkjum talin virkja D1R og auðvelda því aðallega beina leið í kjarna accumbens (NAc).
- Aftur á móti lækkar bæling á DA taugafrumum sem svörun við andstæða áreiti DA stigum í NAc; og þessum viðbrögðum er ætlað að stuðla sérstaklega að merkjasendingunni á óbeinni leið um virkjaða D2R.
Þrátt fyrir að rannsóknir á lyfjafræðilegum aðferðum og afturkræfri taugaboðablöndu (RNB) aðferð hafi stutt þennan gang reglugerðar í NAc (15, 16), það hefur verið óþekkt hvort bæling DA taugafrumumóts nægir til að stuðla að virkni óbeins ferils og í framhaldi af því koma fram forvarnarhegðun. Í þessari rannsókn tókum við á þessu máli með því að virkja DA taugafrumur í VTA með því að beita optogenetically meðhöndlun himna-ofpólariserandi Arch próteins (17) og sýndu beinlínis fram á að bæling DA taugafrumna í VTA lækkaði í kjölfarið DA stig í NAc og olli svívirðileg viðbrögð og nám. Ennfremur könnuðum við aðferðir við að stjórna þessum viðbrögðum og greindum frá því að þessum andstæða viðbrögðum var sérstaklega stjórnað af D2R í NAc.
Niðurstöður
Optogenetic óvirkjun DA Neurons Blocks Dark Room Preferences.
Til að virkja óvirka virkjun DA taugafrumna sprautuðum við inn Cre-örvandi adeno-tengdum veiruvirkjum sem umrita Arch-eGFP [AAV-tvöfaldur flotinn hvolfi opinn lesrammi (DIO) -Arch] (17) einhliða í VTA fullorðinna týrósínhýdroxýlasa (TH) -Cre músa (18) og villtra tegundir (WT) got félagar og settu ljósleiðara fyrir ofan VTA (Mynd S1 A og C). Tveimur vikum eftir aðgerð fannst Arch-eGFP takmarkandi í VTA (Mynd S1B). Við prófuðum ofskautunaráhrif Arch próteinsins með raflífeðlisfræðilegri skráningu og mældum áhrif sjónræns örvunar VTA TH-Cre músa sprautað með AAV-DIO-Arch. Rafeindarfræðilegar upptökur in vivo frá VTA af svæfðum TH-Cre músum leiddu í ljós að sjónörvun örvandi DA taugafrumna hamlaði skothríð þeirra (Mynd S2), sem benti til þess að sjónörvunin hafi verið pólýriseruð nægilega á himnuflæði Arch-tjáandi DA frumna og hamlaði því ósjálfráða skothríð þeirra.
Með því að nota þessar mýs skoðuðum við næst hvort sjónvirkjun DA taugafrumna í VTA gæti þjónað sem andstætt merki fyrir hegðunarnám. Mýs hafa meðfædda tilhneigingu til að kjósa dimmt umhverfi (19). Við hönnuðum atferlisbúnað þar sem mýs gátu frjálst að kanna myrka herbergið og opna bjarta rýmið (Fig. 1A). Eftir búsetu dvöldu WT-mýsnar helst í myrkrinu, annað hvort með eða án sjónörvunar í myrkrinu.Mynd S1D), sem tryggði að sjónörvunin sjálf hefði engin áhrif á hegðun þeirra sem myrtu herbergin. Við áætluðum hegðunartilraun dýra til að prófa áhrif ljósvirkjunar DA taugafrumna á hegðun þeirra (Mynd S1E). Eftir að hafa verið venja og prófað voru mýs skilyrt með því að örva DA taugafrumur í VTA þegar þær dvöldu í myrkrinu. Jafnvel á fyrstu 5 mín. Af loftkælingu héldu TH-Cre músin sig út úr myrku herberginu sem áður var valið og forðuðust myrkvaða herbergið í röð í öllu ástandinu (Fig. 1B). TH-Cre músin sneru sér ekki við að komast hjá myrkrinu þó að þeir fengju enga sjónörvun í kjölfar prófunar (Fig. 1C). Þessi gögn benda til þess að ofpólunun á DA taugafrumum hafi ekki aðeins framkallað tímabundna aversive hegðun heldur einnig þjónað sem merki um andstæða nám gegn myrkrinu og sýndi einnig fram á að óvirkja DA taugafrumna gegndi orsakasamlegu hlutverki bæði í tímabundinni andstyggilegri hegðun og langvarandi andstæðum námi.
Optogenetic Down-reglugerð um DA stig í NAc.
Við könnuðum næst hvort að virkja DA taugafrumur í VTA breytti í raun styrk DA á meginmarkmiðssvæðinu, NAc. Við mældum DA stig í NAc með hraðskannaðri hringrásarmælingu (FSCV) í svæfðum TH-Cre músum sem hafði verið sprautað með AAV-DIO-Arch í VTA þeirra. DA stigum í NAc voru tafarlaust hækkuð með raförvun VTA og framkallað DA losun var verulega minnkuð með samtímis sjónörvun VTA (Mynd S3). Við prófuðum síðan hvort sjónörvun VTA gæti dregið úr tonic DA stigi í NAc. Í sömu tilraunastöðum sáum við að DA stigið í NAc var tímabundið lækkað um 20 s af sjónörvun VTA (Fig. 2), sem er í samræmi við tilkynnt FSCV viðbrögð gegn hvetjandi áreiti (20). Þessi gögn sýna að sjónörvun VTA var nógu árangursrík til að gera VTA DA taugafrumum óvirkan og til að lækka DA stigið í NAc meðan á atferlisrauninni stóð.
Uppstýring á Fos genatjáningu með sjónvirkjun DA Neurons í VTA.
Hegðunarbreytingin sem stafaði af skilyrtri virkjun DA taugafrumna í VTA benti til þess að sjónörvun breytti beinvirkni tauga og leiddi til breytinga á hegðun. Svo við könnuðum næst svæðin þar sem taugastarfsemi var hækkuð með skilyrtu óvirkingu DA taugafrumna með því að skoða tjáningu Fos, strax snemma gen. Fljótlega eftir að skilyrðið var framkvæmt í myrkrinu prófinu voru mýs fljótt unnar til að ákvarða magn Fos tjáningar með megindlegri staðsetningargreining á staðnum (Fig. 3 og Mynd S4). NAc, svæðið sem fær mikið magn af dópamínvirku spá frá VTA, sýndi verulega aukið magn af Fos tjáningu í TH-Cre músunum (Fig. 3). Þessi upp reglugerð fannst einnig í hliðstæðu hliðar á sjónörvun, sem talið var að orsakaðist af litlu magni af veirusýkingu í þá hlið. Samt sem áður var uppstýringin mun meiri við ípsilateral hliðina en við hliðstæðu hliðina á sjónörvun, sem benti til þess að sjónvirkjun DA taugafrumna stjórnaði bein taugastarfsemi NAC beint. Aukin tjáning Fos sást einnig á öðrum heilasvæðum, þar með talið septum, miðlægum svæðum í striatum, basolateral amygdala (BLA) og hliðar undirstúku, en ekki í hliðarþokunni eða miðlægum forstilltu heilaberkinum (mPFC; Mynd S4). Þessar niðurstöður benda til þess að svæðin, sem virkjuð voru með sjónvirkjun DA taugafrumna, væru ekki takmörkuð við bein markmiðssvæði VTA DA taugafrumna, heldur væru þau svæði sem hægt væri að virkja með óbeinum hætti á taugakerfisháðan hátt. Þessi athugun bendir til þess að sjónvirkjun DA taugafrumna breytti taugafrumuvirkni í hringrásinni og gæti ekki aðeins kallað fram andúðleg viðbrögð heldur einnig hrundið af stað nokkrum öðrum heilastarfsemi eins og kvíða, ótta og streituviðbrögðum (21).
DA-merki í gegnum D2R er mikilvægt fyrir optogenetically afleiðingu ástand stað mótstöðu.
Meirihluti dópamínvirkra merkja frá VTA er send til MSN í NAc gegnum DA viðtaka, D1R og D2R. D1R er nær eingöngu tjáð í efninu P (kóðað með Tac1 geninu) sem tjáir MSN og D2R er aðallega tjáð í enkephalininu (kóðað með Penk geninu) sem tjáir MSN; hver tegund MSN myndar bein og óbein ferli, í sömu röð, í NAc (3). Þar sem skyldleiki DA er mun meiri fyrir D2R (nM röð) en fyrir D1R (µM röð) (22, 23) er talið að lækkun á DA stigum leiði til óvirkingar Gi-tengdu D2R en hafa engin merkjanleg áhrif á D1R (3, 24), þar með aukin stjórnun taugastarfsemi sérstaklega á óbeinni leið. Ennfremur kom fram virkjun Fos áberandi í Penk- eða Drd2 (D2R) tjáningarfrumum en í Tac1- eða Drd1a (D1R) tjáningarfrumum (Mynd S5). Byggt á þessum athugunum, gerðum við okkur í hugarlund að DA-merki í gegnum D2R gæti spilað stórt hlutverk í því að sjá andstæða skilyrðingu.
Til að prófa þessa tilgátu gerðum við þriggja hólfa skilyrt staðsetningarpróf (CPA) próf (Mynd S6). Við bjuggum til atferlisbúnað sem inniheldur tvö hólf með nánast eins aðstæðum og einum litlum gangi. Þetta óhlutdræga umhverfisástand í CPA prófinu gerði okkur kleift að kanna frekar hvort að virkjun VTA DA taugafrumna sé til þess fallin að örva svívirðileg viðbrögð og læra, auk þess að hindra val á myrkrinu. Þegar dýrum var leyft að hreyfa sig frjálst um allan búnaðinn, dvöldu flestir í tveimur hólfum án þess að dæmigerður hegðunarmunur væri fyrirfram. Ljósleiðslan var síðan framkvæmd með því að para sjónörvun við eitt fast hólf. Jafnvel þegar annaðhvort hólfanna var notað til að hreyfa sig, komust TH-Cre-mýsnar stöðugt og forðast verulega að vera í sjón-kældu hólfinu meðan á skilyrðingu stóð og eftir próf (Mynd S6 B-E). Tölfræðileg greining staðfesti verulega skerðingu á dvalartíma TH-Cre músanna í sjónhitaða hólfinu við prófun samanborið við dvalartíma WT músanna (Mynd S6F).
Við reyndum síðan að tilgreina DA viðtaka undirtegundir sem taka þátt í þessari andstyggilegu hegðun með því að bæla sérstaklega hverja DA viðtaka í NAc (Fig. 4 og Mynd S7). Við hönnuðum og staðfestu lentiviral vectors sem innihalda stutt hárnál RNA (shRNA) sem er sérstaklega fyrir hverja DA viðtaka með myndandi tjáningu mCherry. Þremur vikum eftir að sprautað var lentivirus í NAc var sterk tjáning mCherry staðbundin í NAc (Fig. 4B). Árangursrík niðurbrot mRNA tjáningar hvers viðtaka var staðfest með magn rauntíma PCR greiningar (mynd. S7A). Að mæla próteinmagn með vestrænum blotting leiddi einnig í ljós að innspýting á hvorum af lentivírusunum dró úr vali á markpróteinafurð sinni án þess að hafa áhrif á tjáningu annarrar undirgerðar DA viðtakans (Fig. 4C og Mynd S7 B-G). ShD1R- og shD2R-tjáandi lentivirus lækkuðu markpróteinmagn þeirra í 46.2 ± 1.1% og 38.4 ± 4.9%, í sömu röð, samanborið við stig fyrir samanburðarveiruna (Fig. 4C). Þessar niðurstöður staðfestu að lentiviral vigrarnir, sem tjáðu shRNA, sem voru sértækir fyrir D1R og D2R, voru valnir og bæru nægjanlega mark RNA þeirra og stjórnuðu magni viðkomandi próteinafurða. Við staðfestum einnig að vírusstýrð tjáning mCherry fannst ekki í VTA, að útiloka möguleikann á að lentivirus-miðluð shRNA hafði bein áhrif á VTA.
Með því að nota þessar lentiviruses sem innihalda shRNA, prófuðum við hvaða tegund DA viðtaka var ábyrgur fyrir andstæða hegðun af völdum optogenetic óvirkjunar DA taugafrumna. Við sprautuðum lentivirus sem inniheldur shRNA eða stjórnaði lentivirus í tvíhliða NAc ásamt AAV-DIO-Arch í vinstri VTA TH-Cre músanna. Ljósleiðarinn var einnig settur fyrir ofan VTA (Fig. 4A). Þegar þriggja hólf CPA próf var framkvæmt þremur vikum eftir aðgerð, sýndu TH-Cre músin sprautuð með lenti: shD1R-mCherry sýndu enn skýr CPA gegn sjón-örvupöruðu hólfinu sambærilegu og TH-Cre músunum sem sprautað var með stjórna lentivirus (lenti: mCherry). Aftur á móti, TH-Cre músunum, sem sprautað var með lenti: shD2R-mCherry, sýndu ekki augljós CPA við ástand (Fig. 4D). Einkarekinn námshalli TH-Cre músanna sem sprautað var með lenti: shD2R-mCherry var enn fremur rökstuddur með greiningu á andstyggilegu námi í kjölfar prófunar (Fig. 4E). Þessar niðurstöður sýna fram á að andstyggileg hegðun á staðnum þar sem DA taugafrumum var óvirk, var sérstaklega vakin með D2R, en ekki með D1R, í NAc.
Discussion
Í striatum hafa rannsóknir leitt í ljós að virkjun Gs-tengd D1R auðveldar skothríð sína en virkjun Gi-húðuð D2R leiðir til bældrar skothæfni (25). Acsamkvæmt sértækni DA viðtaka tjáningu, virkar fasískur hleypa af DA taugafrumum aðallega beina leið um D1R, en tímabundin lækkun á DA taugafrumumyndum stuðlar aðallega að óbeinni færni í gegnum D2R (3, 26). Byggt á þessum stjórnunarháttum hefur verið lagt til að þagga niður taugafrumum í DA til að bregðast við aversive áreiti sé aðallega unnið með óbeinu ferli og leiði til andstæða hegðunar (3). Nýlegar rannsóknir hafa sýnt að hindrun á samstilltum sendingu óbeins ferils hefur áhrif á öndunarhegðun sem raflost hefur vakið (15) og að þessi skerðing stafar af hömlun á D2R-miðluðum merkjasendingum (16). Égn að auki vekur optogenetic upp-reglugerð D2R-tjáandi MSN á óbeinni leið hegðunarvörn (27). Hins vegar, vegna þess að DA taugafrumur sýna bæði aukna og bælda skothríð til að bregðast við aversive áreiti og vegna þess að aðrar áfallatengdar skynjunarupplýsingar eru samtímis unnar í heilanum, enn á eftir að skýrast hvort þöggun DA taugafrumna gæti beinlínis kallað fram andúðleg viðbrögð og nám, og hvort stjórnað sé á þessum viðbrögðum með D2R-tjáandi MSN á óbeinni leið.
Í þessari rannsókn notuðum við optogenetic stjórnun á DA taugafrumum í tveimur hegðunarprófunum: Dark-room preference prófinu og þriggja hólf CPA prófinu. Optogenetic meðferð okkar sýndi skilvirka kúgun á DA taugafrumum í VTA og stjórnun DA stigs í NAC. Nákvæm optogenetic virkjun okkar á DA taugafrumum eingöngu á því tímabili sem dýrin dvöldu í skilyrtu hólfinu vöktu beinlínis andstæður viðbrögð og nám, sem sýndu fram á að tímabundin DA þögnun olli beinlínis óbeinum forðast hegðun. Ennfremur hefur þessi rannsókn komist að því að D2R-miðluð merkjavinnsla er lykilatriði fyrir framköllun þessara andstæða viðbragða og náms.
Þrátt fyrir að gögn okkar hafi sýnt fram á að D1R hafi engin áhrif í hegðunartilraunum til að kalla fram CPA, hafa nokkrar rannsóknir staðfest að fasísk skot á DA taugafrumum er krafist vegna óttaviðbragða og andstyggilegs náms (28, 29). Þessi munur er vegna tilrauna stillingarinnar; þ.e. optogenic nálgun okkar útilokaði möguleikann á að merkja í gegnum virkar DA taugafrumur til að vekja andstæða hegðun, sem benti til þess að óvirkja DA taugafrumum væri næg til að örva andstæða hegðun og nám. Aðgerð og merkjameðferð virkjaðs DA-skothríðs, sem vekur upp með andstyggilegu áreiti, hefði mismunandi framlög til andstyggilegs hegðunar frá þeim sem rannsakaðir eru hér og þarf að skýra það í framtíðinni.
DA taugafrumur varpa einnig til ýmissa annarra svæða þar á meðal mPFC, amygdala og hippocampus. Nýleg rannsókn benti til þess optogenetic örvun hliðarafbrigða taugafrumna sem varast til DA taugafrumna í VTA eru fær um að örva aversive hegðun og þessar DA taugafrumur miða aðallega og sérstaklega við mPFC (30), þó að optogenetic ástand þeirra væri frábrugðið því sem var í núverandi rannsókn okkar, þar sem optogenetic örvun þeirra var lengd í heila ástand. Þar sem greint hefur verið frá því að dópamínvirka inntakið í mPFC sé ekki aðeins virkjað með andstæða áreiti heldur einnig af langvarandi streitu (31, 32), það er mögulegt að stöðug virkjun þeirra á mPFC-varpandi DA taugafrumum yrði litið sem merki frá mjög streituvaldandi umhverfi; og sem afleiðing af uppsöfnun streituvaldandi ástandi myndu dýrin sýna andstæða hegðun í skilyrtu hólfinu. Aftur á móti hindraðum við skothríð á DA taugafrumum meðan dýrin dvöldu í skilyrtu hólfinu. Niðurstöður hegðunartilrauna okkar með því að nota tímatakmarkaðan skilyrðingu bentu til þess að skyndileg kúgun DA merkis yrði litið á skyndilega andstæða inntak, sem leiddi til skjóts andúðarsvörunar þeirra.
DA taugafrumur varpa einnig til amygdala, svæðisins sem að mestu leyti stuðlar að óttaviðbrögðum. Reyndar hefur DA-merkið við amygdala verið beitt í óttaviðbrögðum og öflun minni óttans (33, 34). Í rannsókninni okkar bentu DA taugafrumur í VTA á röð DA taugafrumna sem varpað var til BLA, en umfang þessara áætlana var mun lægra en það sem NAc sendi frá sér. Þrátt fyrir að við gætum ekki útilokað fíngerð áhrif af DA-merki sem var varpað af af völdum amygdala á merkjandi andúð á hegðun okkar, ættu aðaláhrif optogenetic óvirkjunar DA taugafrumna að vera á NAc, vegna þess að tilraunir okkar með sérstaka niðurbrot á D2R í NAc drógust verulega saman andstyggileg hegðun. Framtíðarrannsóknir sem snúa að mark-sértækum DA-merkjum eru nauðsynlegar til að skýra áhrif hringrásarbreytinga á DA taugafrumum á andstætt áreiti og hræðsluaðstæður.
Efni og aðferðir
Efni.
Týrósínhýdroxýlasa :: IRES-Cre (TH-Cre) músar (EM: 00254) (18) voru fengnar frá European Mouse Mutant Archive. Öllum tilraunadýrum hafði verið farið yfir í C57BL / 6J stofninn í meira en 10 kynslóðir. Mýs voru paraðar við C57BL / 6J WT músina og hýstar með venjulegu 12-h léttu / 12-h myrkrinu og fengu mat og vatn ad libitum. Cre+ og Cre- mýs frá sömu gotum (3 – 6 mo aldur) voru notaðar í tilraununum. Allar dýratilraunir voru samþykktar af dýraráð Osaka Bioscience Institute samkvæmt leiðbeiningum dýra tilrauna.
Hegðunarpróf.
Við öll hegðunarpróf voru mýs tengdar við ljósleiðara og leyfðu að fara um allt tækið. Fylgst var með hreyfingu músa svo að þeir gætu hreyft sig án hindrana, jafnvel þegar þeir voru tengdir með ljósleiðara á höfðinu. Staða músar var greind með vídeómyndavél sem hengd var yfir atferlisbúnaðinn og greind með sérsmíðuðu forriti með Labview hugbúnaði.
Myrkur herbergi próf próf.
Sérsmíðaða atferlisbúnaðurinn sem notaður var í prófinu var samsettur úr myrkri herbergi (15 × 9.5 cm) og björtu opnu rými (15 × 11 cm). Myrka herbergið var með veggjum, gólfi og þaki, sem allir voru litaðir í svörtu og höfðu inngang (4.5 cm langur) að opnu bjarta rýminu. Opna bjarta rýmið var í laginu eins og sporbaug og var með gólf úr málmi og skýrum veggjum án þaks. Fyrir prófið voru allar mýsnar venja í 10 mín í tækjabúnaðinum. Prófið samanstóð af þremur lotum: snemma hálfs dags 1 (próf: 5 mín.), Músum var leyft að skoða allt tækið. Síðla hluta dags 1 til dags 4 (ástand: 35 mín samtals) fengu mýs sjónörvun þegar þær dvöldu í myrkrinu. Á 5 degi var prófið á myrkrastofunni prófað án sjónörvunar (eftir próf: 5 mín.; Mynd S1E).
Þriggja hólfa CPA próf.
Sérsmíðaða þriggja hólfa skilyrtu staðval / CPA búnaðinn sem notaður var í prófinu var samsettur úr tveimur hólfum (10 × 17 cm) og tengigangi. Prófið samanstóð af þremur lotum. Dagur 1 (próf: 15 mín.): Mýs fengu að skoða allt tækið frjálst. Mýs sem dvöldu 1.5 sinnum lengur í einu hólfi en í hinu voru útilokaðar frá prófinu. Dagar 2 og 3 (skilyrðing: 15 mín. Hver): Mýs fengu sjónörvun þegar þeir dvöldu í léttpöruðu hólfinu. Jafnvægi var á valinu á léttpöruðu hólfinu. Dagur 4 (eftirprófun: 15 mín.): Prófið var framkvæmt við sömu aðstæður og í prófun (Mynd S6A).
Í hreinsunaraðgerðinni var sjónörvun stöðvuð í 30 s þegar mýs héldu stöðugt yfir 30 s í myrkrinu eða ljósapöruðu hólfinu til að forðast ofhitnun. Stýrt var á leysiraflið að vera um það bil 5 mW við oddinn á ljósleiðaranum í öllum hegðunarprófum.
In Vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry.
FSCV tilraunir voru gerðar með því að nota aðferðina sem lýst er í fyrri rannsóknum (35-37). Mýs voru svæfðar með ketamíni / xýlasínblöndu eins og lýst er í SI efni og aðferðir og sett í stereótaxískan ramma. Ljósleiðari sem notaður var til að örva Arch-expressing DA taugafrumur var staðsettur nálægt örvandi rafskautinu. Örvandi optrode var síðan komið fyrir í VTA (frá bregma: fremri – aftari, −3.2 mm; hlið, 0.5 mm; og riddar - miðlæg, 3.5 mm) og lækkuð með 0.25 mm millibili. Kolefnistrefillrafskaut (300 µm að lengd) fyrir voltammetric upptöku var lækkað í NAc (frá bregma: fremri – aftari, 1.0 mm; hlið, 1.0 mm; og bak - ventral, 3.5 mm). Spennuvökvamælingar voru gerðar á 100 ms fresti með því að beita þríhyrningsbylgjuformi (−0.4 V til + 1.3 V á −0.4 V á móti Ag / AgCl, við 400 V / s) á kolefnistrefjarafskautið. Sérsmíðuð potentiostat var notuð til að einangra bylgjulögun og núverandi magnun. Losun DA var kallað fram með raförvun DA taugafrumna með því að nota 24-púlsörvun (100 µA, 5 ms lengd, 30 Hz). Beitt var sjónfræðilegri örvun DA taugafrumna (532 nm, ∼5 mW afli við trefjaroddinn) fyrir 10 s sem hófu 5 s fyrir upphaf raförvunar. Koltrefja örraflekar voru kvarðaðir í lausn með þekktum styrk DA (0.2 | im, 0.5 | im, og 1.0 / im). Öll voltammetry gögn voru greind með sérsmíðuðum forritum með Labview og Matlab hugbúnaði. Lækkun DA stigs með sjónörvun var leyst með greiningum á meginþáttum með því að nota sniðmát DA bylgjulögun fengin úr rafmagns VTA örvun til að aðgreina dópamínmerki (35, 36).
Tölfræðigreining.
Tölfræðileg greining var gerð með því að nota GraphPad PRISM 5.0 (GraphPad hugbúnaður). Gögn voru greind með endurteknum mælingum ANOVA (Figs. 1B, , 4D,4Dog Mynd S6 D og E) eða aðra leið ANOVA (Figs. 1C, , 3D,3D, 4 C og Eog Fíkjur. S4 K-M, S6Fog S7A), og post hoc greiningar voru gerðar með Bonferroni prófinu. Öll merki / dálkar og súlur táknu meðaltal og ± SEM, hver um sig.
Öðrum tilraunaaðgerðum, þar með talinni undirbúningi og inndælingu veiru, rafeðlisfræðilegri skráningu og ónæmisfræðilegri og mRNA greiningu er lýst ítarlega í SI efni og aðferðir.
Acknowledgments
Við þökkum E. Boyden fyrir Arch smíðina, R. Matsui fyrir tæknilega ráðgjöf við framleiðslu og hreinsun lentivirus og Y. Hayashi fyrir tæknilega ráðgjöf við forritun gagnagreiningar. Þessi vinna var studd af rannsóknarstyrkjum 22220005 (til SN), 23120011 (til SY og SN), 24700339 (til TD) og 25871080 (til SY) frá menntamálaráðuneytinu, menningu, íþróttum, vísindum og Tækni Japans og styrkur frá Takeda Science Foundation (til SN).
Neðanmálsgreinar
Höfundarnir lýsa yfir engum hagsmunaárekstrum.
Þessi grein inniheldur stuðningsupplýsingar á netinu á www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSupplemental.
Meðmæli
;