Dissociable dópamín virkari til að læra og hvetja (2019)

Dópamínvörpunin frá ventral tegmental area (VTA) til nucleus accumbens (NAc) er mikilvæg fyrir hvatningu til að vinna að umbun og verðlaunadrifnu námi. Hvernig dópamín styður báðar aðgerðir er óljóst. Dópamínfrumukrabbamein geta kóðað spávillur, sem eru lífsnauðsynleg námsmerki í reiknikenningum um aðlögunarhegðun. Hins vegar losar dópamín upp þegar dýr nálgast umbun og spegla umbunarvæntingu. Þetta misræmi gæti endurspeglað mun á hegðunarverkefnum, hægar breytingar á toppi dópamínfrumna eða spikaháðri mótun á losun dópamíns. Hér berum við saman toppa greindar VTA dópamín frumur og NAc dópamín losun í sömu ákvarðanatöku verkefni. Vísbendingar sem gefa til kynna væntanleg umbun juku bæði spik og losun. Hins vegar losar NAc kjarna dópamín einnig við umbun væntingar um umbun, án samsvarandi breytinga á VTA dópamín frumum. Niðurstöður okkar benda til grundvallarmunar á því hvernig losun dópamíns er stjórnað til að ná fram sérstökum aðgerðum: útsendingar springa merki stuðla að námi en staðbundin stjórnun hvetur hvatningu.

Dópamín er frægt í tengslum við „umbun“ - en hvernig nákvæmlega? Ein aðgerð felur í sér að læra af óvæntum umbun. Stutt hækkun á dópamínfrumumetningu umritar villur í spá fyrir umbun (RPE)^1,2,3—Lærandi merki til að hámarka hvata til framtíðar. Notkun dópamíns getur haft áhrif á nám eins og þau séu að breyta RPE^4,5,6, en þær hafa einnig áhrif á áhugasama hegðun strax, eins og dópamín merki umbuna væntingum (gildi)⁵. Ennfremur stigmagnar NAc dópamín við hvata nálgun, í samræmi við dópamín kóðunargildið^7,8,9,10,11.

Með fáum undantekningum^2,12,13, hefur verið skoðað dopamínskot á miðhjálp við klassíska skurðaðgerð hjá höfuðföstum dýrum^3,14, ólíkt losun dópamíns fyrir heila. Við bárum því saman skothríð og sleppingu við sömu aðstæður. Við greindum VTA dópamín taugafrumur með því að nota optogenetic merkingu^3,13. Til að mæla losun NAc dópamíns notuðum við þrjár óháðar aðferðir - örgreining, voltammetry og sjónskynjarann ​​dLight¹⁵— Með samleitnum árangri. Aðal niðurstaða okkar er sú að þrátt fyrir að RPE-kvarðaðir VTA dópamín gaddabylgjur hafi skyndilegar breytingar á losun dópamíns sem henta til náms, aðskildir NAc dópamínsveiflur í tengslum við hvatningu myndast óháð VTA dópamínfrumumælingum.

Við þjálfuðum rottur í 'ræningi' sem var starfandi⁵ (Mynd. 1a, b). Í hverri prufu kallaði lýsing á nefpokaport ('Light-on') nálgun og inngöngu ('Center-in'). Eftir breytilegt biðtímabil (0.5-1.5 s) leiddi hvítur hávaði ('Go cue') rottuna til að draga sig út ('Center-out') og pota aðliggjandi höfn ('Side-in'). Í umbunuðum tilraunum fylgdi þessum hliðartilburði smellur á matartré sem hvatti rottuna til að nálgast matarhöfn („Food-port-in“) til að safna sykurpilla. Vinstri vinstri og hægri valkostur var hver um sig verðlaunaður með sjálfstæðum líkindum, sem stundum breyttust án viðvörunar. Þegar rottur voru líklegri til að fá umbun voru þeir áhugasamari um að framkvæma verkefnið. Þetta kom fram í „leynd“ þeirra - tíminn milli kveikjunnar og miðjunnar-sem var næmur fyrir niðurstöðu fyrri rannsókna á undan (Ítarleg gögn Fig. 1) og þar með minnkað öfugt með umbunartíðni (mynd. 1b).

a, Bandit-verkefni atburðir. b, Dæmi fundur. Efsta röð, umbunar líkur í hverri blokk (vinstri: hægri); röð tvö, ticks benda til niðurstöðu hverrar prufu (hár, verðlaunaður; stuttur, ólaunaður); röð þrjú, leki-samþættir áætlun um umbunarhlutfall (svart) og hlaupandi meðaltal leyndar (blágrænt; öfugt logskala); neðri röð, NAc kjarna dópamín í sömu lotu (1-mín sýni). DA, dópamín. c, Efst, örgreiningar staðir í miðlægum framhluta heilaberki og striatum (sjá einnig Ítarleg gögn Fig. 1). n = 51 rannsakastaðsetning frá 12 rottum, hver með 2 smáskilgreiningar sem voru lækkaðir á milli lota. Stiklalitur gefur til kynna fylgni milli dópamíns og umbunarhlutfalls. ACC, anterior cingulate cortex; dPL, dorsal prelimbic cortex; vPL, ventral prelimbic cortex; IL, infralimbic cortex; DMS, dorsal-medial striatum. Miðju, meðaltal kross-fylgni milli dópamíns og umbunarhlutfalls. Rauðir súlur gefa til kynna 99% öryggisbil frá uppstokkuðum tímaröðum. Neðst, tengsl milli taugefnaefna og umbunarhlutfalls (margföldun) NA, noradrenalín; 5-HT, serótónín; ACh, asetýlkólín; GABA, γ-amínósmjörsýra; Glu, glútamat; NM, normetadrenalín; DOPAC, 3,4-díhýdroxýfenýldiksýra; 3-MT, 3-metoxýtýramín; HVA, homovanillic sýra; 5-HIAA, 5-hýdroxýindólediksýra. d, Áhrif blokkbreytinga á umbunartíðni (vinstri), leynd (miðja) og NAc kjarna dópamíns (hægri). Skiptingar voru flokkaðar eftir því hvort upplifað verðlaunahlutfall hækkaði (n = 25) eða lækkað (n = 33). Gögn eru frá öllum 14 lotunum þar sem NAc kjarni dópamíns var mældur (ein á rottu, þar sem gögn frá nýjum og áður greint voru sameinuð⁵ dýr), og teiknað sem meðaltal ± sem e, Samsett kort af fylgni milli dópamíns og umbunarhraða (n = 19 rottur, 33 fundir, 58 rannsóknarstaðsetningar). Heilbrigðisatlas útlínur í þessari mynd voru endurteknar með leyfi frá Paxinos og Watson, 2005⁵¹.

Full stærð mynd

Við greindum frá því áður⁵ fylgni milli losunar NAc dópamíns og umbunarhraða, í samræmi við hvatningarhlutverk mesólimbísks dópamíns¹⁶. Hér miðuðum við fyrst að því að ákvarða hvort þetta samband sést í öllum framheilamarkmiðum, í samræmi við „dópamín merkjasendingar“ á heimsvísu.¹⁷, eða er takmarkað við sérstök undirsvæði. Við héldum enn frekar fram að þessi dópamínvirkni væri mismunandi á milli striatum og heilaberkis, þar sem þessi mannvirki eru með mismunandi dópamínupptöku – niðurbrots hreyfiorku.¹⁸ og getur notað dópamín fyrir mismunandi aðgerðir^19,20.

Með því að nota smásjárgreiningu með hágæða vökvaskiljun – massagreining (HPLC – MS), könnuðum við miðlæga framan heilaberki og striatum (mynd. 1c, Ítarleg gögn Fig. 1). Við prófuðum samtímis 21 taugaboðefni og umbrotsefni með 1-mínútu tímarupplausn og notuðum aðhvarf til að bera saman efnafræðilega tímaröð við hegðunarstærðir (Extended Data Fig. 2).

Við afrituðum fylgni milli umbunarhlutfalls og NAc dópamíns, í mótsögn við aðrar taugaboðefni (mynd. 1c, d). Hins vegar voru þessi tengsl staðbundin við NAc kjarna og héldu ekki í NAc skelinni eða riddaranum - miðlungs striatum. Öfugt við tilgátu okkar, sáum við svipað staðbundið mynstur í framhluta heilabólgu: losun dópamíns var í samanburði við umbunartíðni í miðlæga heilabólgu í miðhluta, en ekki í fleiri hluta bors- eða vöðvasvæðis (mynd. 1c, e). Þótt óvæntir séu þessir tvíburar „heitir punktar“ af gildi tengdum dópamínútgáfu forvitnilegir samsíða í taugamyndun hjá mönnum: súrefnisháð merki í blóði er í samræmi við huglægt gildi, sérstaklega í NAc og miðlæga, miðlæga forstilltu heilaberki.²¹.

Við ræddum næst hvort þetta hvatningarskylda heila dópamín stafar af breytilegri hleðslu á dópamínfrumum í heila. NAc kjarninn fær dópamíninntak frá hliðarhlutum VTA (VTA-l)^6,22,23. Í höfuðföstum músum hafa að sögn VTA-l dópamín taugafrumna einsleit, RPE-lík svör við skilyrtu áreiti³. Til að skrá VTA-l dópamínfrumur smituðum við VTA með adeno-tengdum vírus (AAV) til Cre-háðs tjáningar á channelrhodopsin (AAV-DIO-ChR2) í rottum sem tjá Cre recombinase undir týrósín hýdroxýlasa (TH) kynningu (sjá) aðferðir). Optrodes (mynd. 2a, b) skráðar eininga viðbrögð við stuttum blá-leysirpúlsum (mynd. 2c, Útbreidd gögn. 3, 4, Viðbótarupplýsingar Mynd 1). Við fundum 27 vel einangruð VTA-l frumur með áreiðanlegum skammtímatoppum og greindu þær sem dópamín taugafrumur.

a, Vinstri, sjóntækjateikning með 16 tetrodum í kringum 200 µm ljósleiðara. Hægri, dæmi um staðsetningu gleraugu innan hliðar VTA. Mælikvarði, 1 mm. Rauður, dópamínfrumumerki týrósínhýdroxýlasi; grænt, ChR2 – EYFP; gulur, skarast. Fyrir allar staðsetningar, sjá Útbreidd gögn mynd. 3. b, VTA dópamínfrumur toppar. Rauðir strikar gefa til kynna springa og fjölda toppa í hverju springi (sjá aðferðir). Vog, 0.5 s, 0.5 mV. c, Dæmi taugafrumvörp við leysipúlsi sem eykur lengd. d, Session-wide skothraði á móti gaddur breidd (að hálfu hámarki) fyrir hverja VTA klefa. Bláir, merktir dópamínfrumur; fjólublár, greinilegur þyrping af áformuðum taugafrumum sem ekki eru dópamín. Innsetning, dæmi um meðalbylgjulögun (neikvæð spenna upp). e, Skothríð (blár; 1 mín. Ruslakörfur) VTA dópamín taugafrumu meðan á ræningi stendur. Leyfi (blágrænt) með lágmarkshlutfall, en skothríð ekki. f, Hleðsluhlutfall fyrir allar VTA taugafrumur (blátt, dópamín; fjólublátt, ekki dópamín; grátt, óflokkað) í lágu móti háu verðlaunahlutum. Enginn sýndi marktækan mun (Wilcoxon undirritað röðunarpróf með 1-mín. Ruslakörfum, öll P > 0.05 eftir leiðréttingu fyrir margfeldi samanburð). g, Meðal krosssamsvörun milli skothríð dópamínfrumna og umbunartíðni sýnir engin marktæk tengsl. h, Greining á hleðsluhraða dópamíns við blokkbreytingar (sama snið og mynd. 1d). n = 95 umbun hækkar, 76 lækkar. i. Dreifing millibils-millibils (ISI, vinstri) og gaddur springur (til hægri) er óbreytt milli hærri og lægri verðbólguhlutfalls (Kolmogorov – Smirnov tölfræði: ISI, 0.138, P = 0.92; springur, 0.165, P = 0.63).

Full stærð mynd

Allar dópamín taugafrumur voru tónn virkar, með tiltölulega lága skothraða (meðaltal 7.7 Hz, bil 3.7-12.9 Hz; samanborið við allar VTA-l taugafrumur skráðar saman við dópamínfrumur, P <0.001 Mann-Whitney einpróf). Þeir höfðu einnig lengri gaddabylgjuform (P <5 × 10^-6, Mann-Whitney próf með einum hala, þó að þar væru undantekningar (mynd. 2d), sem staðfestir að tímalengd bylgjulaga er ófullnægjandi merki dópamínfrumna in vivo^3,24. Sérstakur þyrping VTA-l taugafrumna (n = 38, frá sömu lotum) með stuttum bylgjulögnum og hærri skothraða (> 20 Hz; meðaltal 41.3 Hz, bil 20.1–97.1 Hz) innihélt engar merktar dópamínfrumur. Við gerum ráð fyrir að þessar hraðvirkari frumur séu GABAergic og / eða glutamatergic^3,25, og vísa til þeirra sem „ekki-dópamíns“ hér að neðan.

Við skráðum sömu dópamínfrumur í mörgum atferlisverkefnum. VTA-l dópamínfrumur svöruðu sterklega við handahófi tímasettum smelli á matarhoppi og smám saman minna en þegar þessum smellum var gert meira fyrirsjáanlegt með fyrri vísbendingum (Ítarleg gögn Fig. 5). Þetta er í samræmi við kanónískan RPE-eins kóðun með dópamínfrumum í Pavlovian verkefnum^2,3,26.

Á grundvelli sönnunargagna frá svæfðum dýrum hefur því áður verið haldið fram að breytt dópamínþéttni mælt með örskilun stafar af breytingum á skothríðleika dópamínfrumna²⁷ og / eða hlutfall virkra á móti óvirkum dópamín taugafrumum²⁸. Hins vegar, í ræningi verkefnisins, tonic dópamínfrumur skothríð í hverri prófraun var áhugalaus gagnvart umbunartíðni (mynd. 2e, g). Engin marktæk breyting varð á hraðastigi einstakra dópamínfrumna eða annarra VTA-l taugafrumna milli hærri og lægri verðlaunablokka (mynd. 2f, h; sjá einnig tilvísun. ²⁹ fyrir samkvæmar niðurstöður í höfuðföstum músum). Ekki var heldur nein breyting á heildarhraða þar sem dópamínfrumur brenna springa af toppa (mynd. 2i). Ennfremur sáum við engar dópamínfrumur sem skiptust á milli virkra og óvirkra ríkja. Hlutfall tímans sem dópamínfrumum var varið óvirkt (langt millibili með gaddur) var mjög lítið og breyttist ekki milli hærri og lægri verðlaunablokka (mynd. 2i).

Líffærafræði VTA – NAc dópamín vörpun hefur verið rannsökuð ákaflega^6,22,23, en - miðað við þetta augljósu virka misræmi milli skothríðs og lausnar - staðfestum við að við værum að taka upp úr réttum hluta VTA. Lítil innspýting á afturkölluðu rekja kóleru eiturefni B (CTb) í NAc kjarna leiddi til þéttra merkinga á TH⁺ taugafrumur innan sama VTA-l svæðis og optrode upptökurnar okkar (Extended Data Fig. 3). Innan áætlaðs upptökusvæðis er 21% af TH⁺ frumur voru einnig CTb⁺og þetta er líklegt til að vanmeta brot NAC kjarna VTA-l dópamínfrumna, þar sem sprautusprautur okkar fylltu ekki NAc kjarna fullkomlega. Þannig sýnishorn okkar af n = 27 merktar VTA dópamínfrumur (auk margra fleiri ómerktra frumna) innihalda nær örugglega NAc kjarnafrumandi taugafrumur. Að lokum, í viðbótar rottu tókum við upp tvær merktar VTA-l dópamín frumur eftir að AAV var blásið sértækt í NAc kjarna (Extended Data Fig. 3). Báðar smitaðar frumur með skriðdreka höfðu skothríð sem svipaði mjög til hinna merktu dópamínfrumna í alla staði, þar á meðal skortur á skothríðarbreytingum með mismunandi umbunarhlutfalli (Viðbótarmynd 1). Við komumst að þeirri niðurstöðu að breytingar á tonic VTA-l dópamínfrumumælinga séu ekki ábyrgar fyrir hvatningu tengdum breytingum á losun dópamíns fyrir heila.

Losar NAc dópamín umbunartíðni í sjálfu sér, eins og lagt er til í sumum kenningum³⁰, eða er þessi fylgni knúin af kraftmiklum sveiflum í losun dópamíns sem er of hratt til að leysa með örgreining? Við héldum því fram fyrir síðarnefnda möguleikann á grundvelli gögnum um voltammetry⁵, en leitaðist staðfestingar með því að nota sjálfstæðan mælikvarða á losun dópamíns sem getur spannað mismunandi tímarit. DLight1 föruneyti erfðafræðilega kóðuðra dópamínvísanna var hannað með því að setja hringlaga permutaða GFP í dópamín D1 viðtaka.¹⁵. Binding dópamíns veldur mjög sértækri aukningu á flúrljómun (mynd. 3a). Við innrenndum AAV í NAc til að tjá annað hvort dLight1.1 (fjórar staðfestar NAc staðsetningar frá þremur rottum) eða bjartara afbrigði dLight1.3b (sex staðfestar NAc staðsetningar frá fjórum rottum) og fylgjumst með flúrljómun með ljósleiðarljósi. Við sáum skýr NAc dópamín svör við Pavloian umbunarspár, svipað og VTA dópamínfrumuhleyping (Ítarleg gögn Fig. 5).

a, Flúrljósvörun dLight1.3b. Innfelling, títrun dópamíns (n = 15 áhugasvæði (ROI)) og noradrenalín (n = 9). Aðalmynd, taugaboðefni sem eru notuð á bað (öll n = 12 arðsemi). Hans, histamín. b, Sýnishorn af ræningi með þ.mt staðlað NAc dLight1.3b merki (1 mín. Kassar). c, dLight merki breytist við lokun umbreytinga. n = 35 umbunarhlutfall hækkar, 45 lækkar. d, Kross-fylgni milli dLight og umbunarhlutfalls. e, Nánari sýn á skyggða hlutann af b. Örvar: svartar, mið-nef-inn; ljósrautt, hlið-í (verðlaunað); ljósblátt, hlið-í (óbætt); dökkrautt, Food-port-in (verðlaunað); dökkblár, Food-port-in (ólaunað). Næstu línur: mat leka samþættara um umbunarhlutfall; dLjós við lága upplausn (1 mín); dLjós í mikilli upplausn (50 Hz, grænt; fimm punkta miðgildi síað, svart); gildi fyrirmyndarástands (blágrænt); og RPE (magenta). Eftir nokkrar ólaunaðar rannsóknir eru ástandsgildi snemma í rannsókninni lág, þá vekur umbun afhendingu jákvæða RPE og meðfylgjandi mikla aukningu á dópamíni. Árangursríkar verðlaunaðar rannsóknir draga úr RPE, en auka ástandsgildi, ásamt ramping dópamíni. f, Stutt tímaskekkja krossstengingar sýna náið samband milli dLight og gildi, og minni tengsl við RPE. g, Fylgni innan prufu milli líkanabreytna og dLight með mismunandi töfum; fylgni við bæði gildi og RPE er sterkust við dLight um 0.3 s síðar. h, Í öllum lotum var hámarks fylgni meiri fyrir gildi en fyrir RPE eða umbunarhlutfall.

Full stærð mynd

Fyrir ræningi verkefnisins skoðuðum við fyrst dLight merkið í 1-mín. Ruslaföllum (mynd. 3b) til samanburðar við örgreining. Við sáum aftur skýr tengsl milli losunar og umbunarhlutfalls NAc dópamíns, bæði í kross-fylgni og greiningu á blokkarskiptum (mynd. 3c, d). Við skoðuðum næst betur hvernig þessi tengsl myndast. Frekar en hægt og rólega að breytilegu eftir tímamörkum, sýndi dLight merkið mjög öflugar sveiflur innan og milli hverrar rannsóknar (mynd. 3e). Við bárum þessar sveiflur saman við tafarlaust gildismat og RPE-gildi sem áætlaðar voru út frá styrkingar-námslíkani (hálf-Markov ákvörðunarferli⁵). Eins og áður var greint frá með því að nota voltammetry⁵, NAC dópamín augnablik sýndi sterka fylgni við gildismat (mynd. 3f), sjáanlegt sem hlaup upp innan rannsókna þegar búist var við umbun (mynd. 3e). Við sáum einnig tímabundna hækkun með minna væntingum um verðlaun, í samræmi við RPE (skoðað hér að neðan). Í hverri dLight lotu sýndi dópamín sterkari fylgni við gildi en annað hvort RPE eða umbunarhlutfall (mynd. 3h, Ítarleg gögn Fig. 6). Fylgni við bæði ástandsgildi og RPE var hámarks með tilliti til dLight merkisins ~ 0.3 s síðar, í samræmi við stutta töf af völdum taugavinnslu vísbendinga og svörunartíma skynjara (mynd 3g; með voltammetry tilkynntum við um töf 0.4–0.5 s)⁵.

Við bárum næst saman dópamínfrumumyndun og losuðum um atburði í ræningi. Ytri áreiti við Light-on, Go cue og verðlaunaður hlið-inn (matar-hoppari smellur) vakti hvor um sig skjóta aukningu (mynd. 4a). Þessi svör komu fram í langflestum dópamínfrumum (mynd. 4c), þó að hlutfallsleg svörun við mismunandi vísum hafi verið mismunandi frá klefi til frumu (Viðbótarupplýsingar Mynd 1). NAc dLight merkið brást einnig hratt og áreiðanlegt við hvern og einn af þessum mikilvægu vísbendingum (mynd. 4b, c), í samræmi við sprengingu af dópamínfrumum sem dró úr losun dópamíns.

a, Atburðargreind virkni VTA-l dópamínfrumna. Efst, gaddur rasters fyrir einn fulltrúa klefa; neðst, meðalhraðahlutfall (n = 29). Í öllum spjöldum gefa villubönd til kynna ± sem b, Atburður-samstillt NAc dLight. Efst, fulltrúaráð; botn, meðaltal (n = 10), eðlilegt að hámarki umbunað hliðarsvörun. Í allri þessari mynd eru dLight merki sýnd miðað við 2-s 'baseline' tímabil sem endar 1 s fyrir Center-in. Athugasemd eykst (örvar) skömmu fyrir miðju og matarinngang. c, Uppsöfnuð dreifing tíma sem tekið var fyrir dópamínfrumur (fast efni; n = 29), dLight (strikað; n = 10), til að auka eftir upphaf vísbendinga (uppstokkunarpróf samanborið við upphafsgildi, 10,000 uppstokkun, P <0.01, margfeldi samanburður leiðréttur). Þegar kveikt er á ljósinu eru aðeins seinkanir <1 s innifaldar; fyrir réttarhöld sem hljóta aðeins hliðar. Miðgildi leynda (frá sigmoid fitu): Kveikt, kveikir á 152 ms, dLight 266 ms; Gakktu frá, hleyptu af 67 ms, dLight 212 ms Side-in, skjóta 85 ms, dLight 129 ms. Frumur sem ekki eru dópamín voru yfirleitt áhugalausar um upphaf vísbendinga (Extended Data Fig. 8). d, Áberandi vísbending vakin, nálgunartengd dópamínlosun. Top, meðaltal dopamine klefi hleypa af (n = 29); miðju, meðaltal dLight (n = 10); botn, voltammetry (n = 6), eðlilegt til að ná hámarki skammtímatíma viðbragðs ljós. Vinstri spjöld, töf <1 s, hægri, töf> 2 s. Gögnum er raðað saman við ljós kveikt (solid) eða miðju (punktað); rauð strikuð lína, miðgildi leyndar. Fyrir lengri biðtíma er engin aukning í skothríð nálægt Center-in, en dLight og voltammetry sýna verulega aukningu. e, Dreifing samsæri og bera saman hámarksmerki sem eru samstillt á ljós (y ás) eða miðju inn (x ás). Fyrir hverja klefa benda línur sem tengjast fundi gögn fyrir sérstök biðtímabil (<1 s,> 2 s). Dópamínhleyping (efst) sýnir stöðugt ljós á svörun fyrir stuttar leyndarprófanir (tvíhliða dreifigreining (ANOVA), röðun × leyndarvirkni, F = 7.47, P = 0.0008). dLight (miðja), voltammetry (neðst) merki eru stöðugt betur samstillt við Center-in (tvíhliða ANOVA fyrir dLight: röðun × leyndarvirkni, F = 9.28, P = 0.0043). f, Dópamín eykst við nálgun, magngreind sem skábrautarhorn (sjá aðferðir). Hringir benda til einstakra dópamínfrumna (n = 29), dLight fundur (n = 10).

Full stærð mynd

Við sáum einnig skýra aukningu á losun NAc dópamíns þegar rottur nálguðust upphafshöfnina (rétt fyrir Center-in) og matarhöfnina (rétt áður en Food-port-in). Þetta fellur vel að umfangsmiklum bókmenntum um voltametry sem sýna að áhugasöm hegðun fylgir hröð aukning á dópamíni í NAc^{5,7,8,9,10,11}. Samt sem áður sýndi VTA-l dópamínfrumu ekki samsvarandi aukningu á skothríð á þessum tímum (mynd. 4a; sjá Ítarleg gögn Fig. 7 til viðbótar samanburðar, þar með talið við frumur sem ekki eru dópamín).

Til að aðgreina betur cue-framkallaðan og nálgunartengdan dópamínvirkni, skildum við rannsóknir með stuttum (<1 s) og löngum (> 2 s) töfum (mynd. 4d, e). Aukning á skothríð dópamínfrumna var stöðugt læst við upphaf bendinga við Ljós kveikju, ákjósanlegast til skamms tíma rannsókna. Allar 25 dópamínfrumur með umtalsverða hækkun hraðastigs eftir að kveikt var á voru í meira samræmi við ljós á en Center-in (mynd. 4e). Aftur á móti var aukning á losun NAc dópamíns fyrir Center-in aðgreind frá losun dópamíns sem kom fram með vísbendingum (mynd. 4d, e). dLight merki jukust stöðugt fyrir Center-in í rannsóknum með langa leynd (tíu af hverjum tíu fundum) og áður en mat-höfn var hafin (níu af hverjum tíu fundum), án samsvarandi aukningar á dópamínskotum (mynd. 4f).

Að lokum íhuguðum við hvernig atburðir tengdir dópamínmerki eru háðir nýlegum umbunarsögu. Á fyrri hluta hverrar rannsóknar var skothríð dópamínfrumna ekki háð umbunartíðni (mynd. 5a), þrátt fyrir áhrif launahlutfalls á hvatningu (mynd. 5b). Í kjölfarið voru stigsviðbrögðin við umbunarbendingunni við Side-in áreiðanlega sterkari þegar umbunarhlutfallið var lægra (mynd. 5a), í samræmi við jákvæða RPE kóðun. Þegar þessari umbunarkerfi var sleppt gerðu hlé á dópamínfrumum skothríð, þó að umritun neikvæðra RPE væri mun veikari eða fjarverandi, hvort sem þau voru skoðuð á íbúafjölda (mynd. 5a, b) eða sem einstakar frumur (Extended Data Fig. 8). Áður hefur verið lagt til að neikvæð RPE séu kóðuð meðan á dópamínhléum stendur³¹, en þetta kom fram hjá aðeins 2 af 29 einstökum taugafrumum. Svipaðar niðurstöður fengust ef umbun um væntingar um umbun var metin á annan hátt, þar með talið reynslumiðað styrktarnámslíkön (leikaragagnrýnandi og Q-nám) eða einfaldlega með því að telja nýleg umbun (Extended Data Fig. 8).

a, Efst, meðaltal hleðsluhlutfalls á dópamínfrumum (n = 29) stillt við hlið-inn, sundurliðað eftir umbunarhlutfalli (terciles, reiknað sérstaklega fyrir hverja klefi). Fyrir Side-in fer virkni ekki eftir væntingum um umbun. Eftir Side-in verðlaunaðar (rauðar) og ólaunaðar (bláar) rannsóknir eru sýndar sérstaklega. Svar við matarsmellum er sterkara þegar umbunarhlutfall er lágt, í samræmi við kóðun jákvæðra RPE. Botn, brot af einstökum dópamínfrumum með skothraða sem er verulega breytilegt með umbunarhlutfalli á hverju augnabliki (uppstokkunarpróf, P <0.01, margfeldi samanburður leiðréttur). Merkimiðar efst gefa til kynna tíma þegar þetta brot var marktækt hærra en tilviljun (tvílitni, P <0.01). Eftir Side-in eru aðeins prófaðar neikvæðar fylgni — það er hugsanleg RPE kóðun. b, Aðhvarfsgreinar fyrir samkomur með skráðum dópamínfrumum, sem sýnir áhrif nýlegra umbunasagna á (log-) leynd (toppur) og dópamíngró. Stjörnumerki benda til verulegs aðhvarfsvægis (tpróf, P <0.05). Meðan á 0.5 sekúndunum stendur áður en Go cue fer fram (meðan rottur verður að halda stöðugum nefpoka til að hægt sé að prófa sig áfram) hefur dópamín toppur ekki áhrif á verðlaunasögu (miðja). Þetta breytist þegar niðurstaðan er ljós (botn; metur hámark eða lægð virkni í 0.5 sek. Eftir Side-in), en aðeins fyrir umbunaðar rannsóknir. c, d, Sama og hér að ofan, nema fyrir dLight (staðlað til hámarks viðbragða við hliðina). Losun dópamíns vogar sér áreiðanlegan hátt með umbunartíðni, jafnvel áður en Side-in.

Full stærð mynd

Losun dópamíns við hlið inn sýndi einnig skýra, tímabundna kóðun jákvæðra RPE, en ekki neikvæða RPE (mynd. 5c, d). Þetta dLight svar var seinkað og lengt í samanburði við skothríð, í samræmi við tíma sem gefinn var til losunar og endurupptöku³², en var áfram undirsekkt fyrirbæri. Ólíkt skothríð voru dLight merki snemma í hverri rannsókn meiri þegar nýlegar rannsóknir höfðu verið umbunaðar (mynd. 5c), í samræmi við gildiskóðun. Við sáum þetta háð verðlaunasögunni, jafnvel þegar rottan hreyfðist ekki virkan, heldur hélt í nefpokann í miðjuhöfninni á meðan beðið var eftir Go cue (mynd. 5d). Á heildina litið komumst við að þeirri niðurstöðu að losun NAc dópamíns endurspegli bæði viðbrögð við vísbendingum og umbun eftirvæntingar og að aðeins sé hægt að gera grein fyrir þeim fyrri með VTA-l dópamínfrumur.

VTA-l veitir aðal uppsprettu dópamíns til NAc kjarna^6,23,24. VTA-l dópamínfrumur, þar með taldar þær sem verja til NAc kjarna, sýna stöðugt RPE-kóðunargos^3,12. Talið er að VTA-springur séu sérstaklega mikilvægar fyrir akstur NAc dópamíns³², og reyndar komumst við að því að VTA-springa sem stafaði af vísbendingum var samsvarandi útgáfu NAc. Hins vegar fundum við auk þess gildi-tengt mynstur af losun NAc dópamíns sem voru ekki búin til með því að skjóta VTA-l dópamínfrumur, hvorki á löngum (tonic) eða stuttum (fasískum) tímaskilum. Aðrir undirflokkar dópamíns geta haft sérstök merki^13,33,34, og við getum ekki útilokað þann möguleika að skothríð dópamínfrumu íbúa sem ekki eru skráð héðan framleiði gildatengt dópamín í NAc kjarna. Hins vegar hefur aldrei verið tilkynnt um gildistengdan skothríð fyrir neinar dópamínfrumur, í fjölmörgum rannsóknum. Niðurstöður okkar benda til þess að virkni NAc dópamíns sé stjórnað á mismunandi vegu, á mismunandi tímum og fyrir mismunandi aðgerðir, og að skráning dópamínfrumna sé mikilvæg en ekki nægjanleg til að skilja dópamínmerki.³⁵.

Losun frá dópamínstöðvum er undir sterkum áhrifum af staðbundnum aðferðum sem ekki eru toppandi^{36,37,38,39,40}. Til dæmis er losun NAc dópamíns mótuð með basolateral amygdala, jafnvel þegar VTA spiking er lyfjafræðilega bæla^41,42. Það hefur verið tekið fram í áratugi að staðbundin stjórnun á losun dópamíns gæti náð aðgerðum sem eru frábrugðnar þeim sem eru í dópamínfrumu^36,43, en þetta hefur ekki verið fellt inn í fræðilegar skoðanir á dópamíni. Greinilegir strádýru undirsvæði stuðla að mismunandi tegundum ákvarðana og geta haft áhrif á eigin losun dópamíns eftir þörfum⁴⁴. Enn á eftir að ákvarða hversu staðbundin þessi stjórnun á losun dópamíns getur verið. Ein takmörkunin sem deilt er með þeim 3 leiðum sem við mældum losun dópamíns er að þær sýni allar á staðbundnum mælikvarða að minnsta kosti 100 µm, en in vivo smásjá bendir til að losun dópamíns geti verið ólík í töluvert minni mælikvarða¹⁵.

Niðurstöður okkar styðja ekki tilvist sérstaks tonic dópamín merkis sem gæti miðlað hvatandi áhrifum dópamíns. Í staðinn leysast dópamínvaktir sem virðast hægt ef þær eru mældar hægt (með örskiljun) fljótt ef þær eru mældar hratt (með voltammetry eða dLight). Ennfremur upptökur af greindum VTA dópamínfrumum af okkur sjálfum og öðrum³⁰ leggja fram sterkar sannanir gegn hugmyndinni²⁹ að breytingar á tonic dopamine frumu hleypa fram tonic breytingum á losun dopamine. Þó að hægt sé að breyta tonic skothríð með meinsemdum eða meðhöndlun lyfja²⁸, við erum ekki meðvituð um viðvarandi breytingar á skothríð í neinu hegðunarverkefni. Skothríð getur hrapað niður á tímamörkum um það bil 1 sek meðan á aðdraganda hvatningarviðburða kemur^45,46. Þessi lækkun er hins vegar þveröfug við það sem þyrfti til að auka losun dópamíns með verðbólguvæntingu og ber í staðinn meiri líkingu við tímabundnar neikvæðar spávillur⁴⁷. Þrátt fyrir að viðvarandi merki sem umriti áframhaldandi umbunartíðni gætu verið computational gagnleg³⁰, dópamín gefur í staðinn hratt sveiflukennd villu- og gildimerki. Enn er mögulegt að viðvarandi merki séu reiknuð í næsta skrefi með innanfrumu merkjaslóðabrautum niður fyrir dópamínviðtaka.

Margir hópar hafa fylgst með losun dópamíns þegar rottur nálgast umbun^{5,7,8,9,10,11}, í samræmi við kóðun vaxandi verðbólguvæntinga. Sumir hafa haldið því fram að þessi dópamínrampur endurspegli einfaldlega RPE, með því að ætla að rottur gleymi fljótt gildi⁴⁸ eða að þeir séu með snurðulaust framboð ríkisstjórna⁴⁹. Síðarnefndu hugmyndin er ekki studd af athugun okkar á því að hömlun er hratt breytt frá prufi til prófs á grundvelli uppfærðra verðbólguvæntinga, og verður sterkari innan skamms röð af röð umbunar á meðan RPE-lík viðbrögð við vísbendingum verða veikari (mynd. 3e). Almennt, allar kenningar þar sem dópamín miðlar eingöngu RPE (námsmerki) geta ekki gert grein fyrir mjög vel þekktri tengingu milli áframhaldandi mesólimbísks dópamíns og hvata¹⁶. NAc kjarninn er ekki þörf fyrir mjög þjálfuð viðbrögð við skilyrtu áreiti, en er sérstaklega mikilvægt þegar ákveðið er að vinna tímafrekt starf til að fá umbun⁵⁰. NAc kjarna dópamín virðist veita nauðsynleg kraftmikil merki um hversu þess virði það er að ráðstafa tíma og fyrirhöfn til að vinna^5,44, jafnvel þó að þetta merki sé ekki til staðar í VTA dópamínfrumuhleðslu.

Dýr

Allar dýrarannsóknir voru samþykktar af háskólanum í Michigan eða háskólanum í San Francisco, stofnananefndum um notkun og umhirðu dýra. Karlrottur (300–500 g, annaðhvort villt tegund Long-Evans eða TH-Cre⁺ með Long-Evans bakgrunn⁵²) var haldið á öfugum stað 12: 12 ljós: dökkt hringrás og prófað á myrkrinu. Rottum var lítillega svipt fæðu og fengu 15 g af venjulegu rannsóknarstofu rotta chow daglega til viðbótar við matarlaun sem fengin voru við framkvæmd verkefnisins. Engin forútreikningur sýnisstærðar var framkvæmd. Rannsakendur voru ekki blindaðir vegna úthlutunar meðan á tilraunum og mati á niðurstöðum stóð.

Hegðun

Forþjálfun og prófanir voru framkvæmdar í tölvustýrðum Med Associates aðgerðaklefum (25 cm × 30 cm á breiðasta punkti) hvor með fimm holu nefpokavegg, eins og áður var lýst⁵. Bandit-verkefni fundur notaði eftirfarandi breytur: blokklengd var 35-45 rannsóknir, valdar af handahófi fyrir hverja blokk; halda tímabili áður en Go bending var 500 – 1,500 ms (samræmd dreifing); Líkur vinstri og hægri umbunar voru 10, 50 og 90% (fyrir raflífeðlisfræði, ljósmælingu, voltammetry og áður greint frá rafeindagreiningarrottum⁵) eða 20, 50 og 80% (nýlega tilkynntar rafeindagreiningarottur).

Núverandi umbunarhlutfall var metið með tímabundinni leka samþættara⁵³. Verðlaunarhlutfall var aukið í hvert skipti sem umbun barst og rýrnað veldishraða við það hlutfall sem stillt var með færibreytu τ (tíminn í s að verðlaunahlutfallið lækkar um ~ 63%, það er 1 − 1 / e). Fyrir allar greiningar, τ var valinn á grundvelli hegðunar rottunnar, hámarka (neikvæð) fylgni milli umbunarhlutfalls og logs (leynd) í hverri lotu. Fylgnin milli dópamíns í framheilanum og umbunartíðni voru ekki mjög viðkvæm fyrir þessu vali τ (Útbreidd gögn Fig. 1).

Til að flokka lokabreytingar sem „aukning“ eða „lækkun“ í umbunartíðni, bárum við saman meðaltal leka-samþættingarhlutfalls síðustu 5 mín. Af reitnum við meðaltal umbunarhlutfalls í fyrstu 8 mín. Af síðari reitnum.

Rottur sem notaðar voru við rafgreiningu og ljósmælingu unnu einnig Pavlovian aðflugsverkefni, í sama skurðstofuhúsinu og húsljósið var á meðan á lotunni stóð. Þrjár heyrnar vísbendingar (2 kHz, 5 kHz og 9 kHz) voru tengdar mismunandi líkum á fæðusendingu (mótvægi þvert á rottur). Vísbendingar voru spilaðar sem lest af tónpípum (100 ms á, 50 ms af) í heildarlengd 2.6 sek. Og síðan 500 milljón seinkunartímabil. Vísbendingar og ófyrirsjáanlegar umbunarsendingar voru afhentar í dulspeki með breytilegu millirannsóknartímabili (15-30 s, einsleit dreifing).

Örvræðsla

Skurðaðgerðir

Rottur voru ígræddar tvíhliða með leiðslukúlum (CMA, 830 9024) í heilaberki og striatum. Einn hópur (n = 8) fékk eina leiðbeiningarhnúta sem miðaði á forlákn og bólgu í hjarta (anteroposterior (AP) +3.2 mm, miðhliða (ML) 0.6 mm miðað við bregma; og dorsoventral (DV) 1.4 mm undir yfirborði heila) og annað sem miðar á dorsomedial striatum og nucleus accumbens á gagnstæðu himni (AP +1.3, ML 1.9 og DV 3.4). Báðar ígræðslurnar voru hallaðar 5 gráður frá hvor öðrum meðfram rostral – caudal planinu. Annar hópur (n = 4) fékk einn leiðarhnúta sem miðar á framhimnuberki (AP +1.6, ML 0.8 og DV 0.8) og annan miðar á accumbens (kjarna / skel í gagnstæðu heilahveli við AP +1.6, ML 1.4 og DV 5.5 (n = 2) eða AP +1.6, ML 1.9 og DV 5.7 (n = 2). Ígræðsluhliðunum var vegið upp á móti rottum. Dýrum var leyft að jafna sig í eina viku áður en þau endurmenntuðu sig.

efni

Vatn, metanól og asetónítríl fyrir farsíma voru úr Burdick & Jackson HPLC bekk, keypt af VWR (Radnor). Öll önnur efni voru keypt frá Sigma Aldrich nema annað sé tekið fram. Gervi heila- og mænuvökvi (aCSF) samanstóð af 145 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 1.40 mM CaCl₂, 1.01 mM MgSO₄, 1.55 mM Na₂HPO₄ og 0.45 mM NaH₂PO₄, aðlagað pH að 7.4 með NaOH. Askorbínsýru (250 nM lokastyrkur) var bætt við til að draga úr oxun greiniefna.

Sýnasöfnun og HPLC-MS

Á prófunardegi var dýrum komið fyrir í aðgerðaklefanum með húsaljósið á. Sérsmíðuðum samsöfnuðu fjölakrýlónítrílhimnu örgreiningaraðstæðum (1-mm skilun AN69 himnu; Hospal) var sett tvíhliða í leiðslukúlu og blandað stöðugt (Chemyx, Fusion 400) með CSF við 2 µl / mín í 90 mín til að leyfa jafnvægi. Eftir 5-mínútu grunnsöfnun var húsljósið slökkt og vísað dýrinu til þess að hægt væri að fá ræningi. Sýnasöfnun hélt áfram með 1 mín. Millibili og sýnin voru strax afleidd⁵⁴ með 1.5 jl natríumkarbónati, 100 mM; 1.5 | il bensóýlklóríð (2% (rúmmál / hlutfall) bensóýlklóríð í asetónítríli); og 1.5 µl samsæta merkt innri staðallblöndu þynnt í 50% (v / v) asetónítríl sem inniheldur 1% (v / v) brennisteinssýru, og spiked með deuterated ACh og kólín (C / D / N samsætur) að lokastyrk 20 nM. Sýnishornasöfnun var skipt á milli tveggja rannsaka með 30 s millibili í hverri 26 lotu, fyrir utan eina lotu þar sem brotin himna leiddi til aðeins einnar seríu (samtals 51 sýnisröð). Sýni voru greind með Thermo Scientific UHPLC kerfum (Accela, eða Vanquish Horizon tengt við Quantum Ultra þrefalda fjórfalda massagreiningu með HESI II ESI rannsaka), sem unnu í margvíslegu viðbragðseftirliti. Fimm míkrólítra sýnum var sprautað á Phenomenex kjarna-skel bifenýl Kinetex HPLC dálk (2.1 mm × 100 mm). Farslegur fasi A var 10 mM ammóníumformat með 0.15% maurasýru og hreyfanlegur fasi B var asetónítríl. Hreyfanlegur áfangi var afhentur skolunarstig við 450 µl / mín eins og hér segir: upphaf, 0% B; 0.01 mín, 19% B; 1 mín, 26% B; 1.5 mín, 75% B; 2.5 mín, 100% B; 3 mín, 100% B; 3.1 mín, 5% B; og 3.5 mín, 5% B. Thermo Xcalibur QuanBrowser (Thermo Fisher Scientific) var notaður til að vinna sjálfkrafa og samþætta toppa. Hver af 100,000 toppunum var sjónrænt skoðaður sérstaklega til að tryggja rétta samþættingu.

Greining

Öllum taugakemískum styrkstyrknum var sléttað með þriggja stiga hreyfandi meðaltali (y′ = [0.25 × (y−1) + 0.5y + 0.25 × (y+ 1)]) og z-skora eðlilegt innan hverrar lotu til að auðvelda samanburð á milli lota. Fyrir hvert marksvæði var myndað krossgildi fyrir hverja lotu og meðaltal lotanna var lagt upp. Eitt prósent öryggismörk voru mynduð fyrir hverja undirfléttu með því að stokka eina tímaröð 100,000 sinnum og búa til dreifingu á fylgistuðlum fyrir hverja lotu. Mörg aðhvarfslíkön voru búin til með því að nota aðhvarfsaðgerð í MATLAB, með taugaefnafræðilega sem útkomubreytu og atferlismælikvarða sem spá. Aðhvarfsstuðlar voru ákvarðaðir marktækir við þrjú stig alfa (0.05, 0.0005 og 0.000005), eftir Bonferroni-leiðréttingu fyrir margvíslegan samanburð (alfa / (21 efni × 7 svæði × 9 atferlisþrengingar)). Til greiningar á umbreytingum á lokum var gögnum slegið inn í þriggja mínútna tímabil, þar sem sýninu sem var með aðlögunartímanum var hent.

Rafgreiningarfræði

Rottur (n = 25) voru ígrædd með sérhönnuðum akstursskautum, hver samanstóð af 16 tetrodum (smíðaðir úr 12.5 µm nichrome vír, Sandvik) límdir á hlið 200 µm ljósleiðara og teygðu sig allt að 500 µm undir trefjaroddinum. Í sömu skurðaðgerð sprautuðum við 1 µl AAV2 / 5-EF1a-DIO-ChR2 (H134R) -EYFP í hliðar VTA (AP 5.6, ML 0.8, DV 7.5) eða NAc kjarna (AP 1.6, ML 1.6, DV 6.4) . Sýnishorn af breiðbandi (1–9,000 Hz) voru tekin í heila (30,000 sýni á s) með því að nota Intan stafrænar höfuðmyndir. Optrodes voru lækkuð að minnsta kosti 80 µm í lok hverrar upptöku. Einstakar einingar voru einangraðar án nettengingar með MATLAB útfærslu á MountainSort⁵⁵ fylgt eftir með nákvæmri handvirkri skoðun.

Flokkun

Til að greina hvort einangruð VTA-l eining væri dópamínvirk (TH⁺), notuðum við áreititengd leyndarpróf⁵⁶. Í stuttu máli, í lok hverrar tilraunatíma, tengdum við optrode við laser díóða og afhentum léttar púls lestir með mismunandi breidd og tíðni. Til að eining væri auðkennd sem ljósviðbrögð þurfti hún að ná mikilvægi stigi P <0.001 fyrir 5-ms og 10-ms púlsalestir. Við bárum einnig ljós sem kallast fram bylgjulög (innan 10 ms frá upphafi leysipúls) við meðaltöl yfir þingið; allar einingar með ljós sem kallast fram höfðu Pearson fylgnistuðul> 0.9. Dópamín taugafrumur voru skráðar með góðum árangri frá fjórum rottum með VTA-l AAV innrennsli (IM657, 1 eining; IM1002, 3 einingum; IM1003, 15 einingum; IM1037, 9 einingum) og einni rottu með NAc kjarna AAV (IM-1078, 2 einingum) . Hámarksbreidd var skilgreind sem full-breidd-við-hálf-hámark mest áberandi neikvæða þáttar samstillts, meðaltals toppbylgjuforms. Ómerktar VTA taugafrumur með lotuhraða skothraða> 20 Hz og hámarksbreidd <200 µs voru flokkaðar sem frumur utan dópamíns. Til að tryggja að við værum að bera saman dópamín og frumur utan dópamíns innan sömu undirsvæða greindum við aðeins frumur sem ekki voru dópamín sem skráðar voru á fundum með að minnsta kosti einni ljósmerktri dópamín frumu.

Greining

Gormagos fannst við hefðbundna „80 / 160 sniðmát“ nálgun⁵⁷: í hvert skipti sem millispik-bil sem nemur 80 ms eða minna á sér stað, eru þessir og síðari toppar álitnir hluti af springa þar til millibili er 160 ms eða meira. Til samanburðar á „skothríð“ til að verðlauna hlutfall voru dópamín toppar taldir í 1 mínútna ruslafötum. Til að kanna hraðari breytingar voru toppþéttniaðgerðir smíðaðar með því að snúa saman topplestum með Gauss-kjarna með 20 ms dreifni. Til að ákvarða hversu fljótt taugafruma brást við tiltekinni vísbendingu notuðum við 40-ms ruslatunnur (renndu í skrefum 20 ms) og notuðum uppstokkunarpróf (10,000 uppstokkanir) fyrir hvern tíma ruslatunnu samanborið við skothraða eftir upphaf vísitölu við skothraða í 250 ms strax á undan vísbendingunni. Fyrsta ruslatunnan þar sem skothríðin eftir vöktun var verulega (P <0.01, leiðrétt fyrir margfeldi samanburð) hærri en upphafsskot var talinn tíminn til að benda á svörun.

Háhraðahraði var reiknaður sem hámarks (Gaussian-sléttað) hraðastig hverrar rannsóknar í 250-ms glugga eftir hlið inn fyrir verðlaunaðir rannsóknir og dalurinn var reiknaður sem lágmarks skothríð í 2-s glugga, byrjun einni sekúndu eftir hliðarlínuna fyrir óreyndar raunir.

Til að reikna út skábrautarhorn við aðferðahegðun, sléttuðum við meðalhleðsluhraða með 50-ms Gauss-kjarna, uppgötvuðum hámark / lágmark af leiðandi merki í 0.5-s glugga fyrir hvern atburð (miðju-eða matar-höfn-í ) og mældi undirritaða hornið sem tengdi extrema tvö. Til að bera saman hleðsluhlutfall í 'háum' og 'lágum' umbunablokkum gerðum við fyrir hverja lotu miðgildi skiptingar á meðaltali leka-samþættarahlutfalls í hverri reit.

Voltammetry og reiknilíkan

Hraðskannaðar niðurstöður hringrásar voltamælingar sem sýndar eru hér endurhreinsa gögn sem áður voru kynnt í smáatriðum⁵. Mat innan áætlunarinnar um gildi ríkisins og umbunarspá fyrir villur var reiknað með því að nota hálf-Markov ákvörðunarferli til að styrkja námslíkan, nákvæmlega eins og áður hefur verið lýst⁵.

Ljósmæling

Við notuðum veiruaðferð til að tjá erfðafræðilega kóðuða dópamínnemann dLight¹⁵. Undir deyfingu ísófluran er 1 μl af AAV9-CAG-dLight (1 × 10¹² vírus erfðamengi á ml; UC Davis vektor kjarna) var sprautað hægt (100 nl / mín) (Nanoject III, Drummond) í gegnum 30 µm gler örpípettu í ventral striatum tvíhliða (AP: 1.7 mm, ML: 1.7 mm, DV: -7.0 mm). Í sömu skurðaðgerð voru ljósleiðara (400 µm kjarna, 430 µm heildarþvermál) fest við málmhylki (Doric) (miðdýpi 200 µm hærra en AAV) og steypt á sinn stað. Gögnum var safnað> þremur vikum síðar, til að gera kleift að tjá dLight.

Fyrir dLight örvun voru bláar (470 nm) og fjólubláar (405 nm; stjórn) LED sinusoidal mótuð við mismunandi tíðni (211 Hz og 531 Hz, í sömu röð⁵⁸). Bæði örvunar- og losunarmerki sem fóru í gegnum smásíur (Doric) og magnflúrljómun var mæld með femtowatt skynjara (Newport, líkan 2151) sýnatöku við 10 kHz. Lækkun framleiddi aðskilin 470 nm (dópamín) og 405 nm (stjórn) merki, sem síðan voru endurskaluð hvert öðru með minnsta fermetra passa⁵⁸. Brún flúrljómun (dF/F) var síðan skilgreint sem (470–405_fit) / 405_fit. Fyrir allar greiningar var þetta merki tekið niður í 50 Hz og slétt með fimm punkta miðgildi síu. Til kynningar á 470 nm og 405 nm merkjum sérstaklega, sjá Extended Data Fig. 7.

Gögn frá ljósleiðarastaðsetningu voru tekin með í greiningum ef trefjaroddurinn var í NAc og flúrljósvörun við að minnsta kosti einni verkefnaskilum hafði z-stig> 1. Þessi viðmið útilokuðu eina rottu og skiluðu þremur rottum / fjórum staðsetningum (IM1065-vinstri, IM1066-tvíhliða, IM1089-hægri) fyrir dLight1.1 og fjórum rottum / sex staðsetningum (IM1088-tvíhliða, IM1105-hægri, IM1106-tvíhliða, IM1107-hægri) fyrir dLight1.3b. Svipaðar niðurstöður fengust fyrir dLight1.1 og dLight1.3 (Extended Data Fig. 7), svo gögn voru sameinuð.

Til að reikna skábrauthorn meðan á aðferðarhegðun stendur, uppgötvuðum við hámarks / lágmark merkisins sem myndaðist í 0.5-s glugga fyrir hvern atburð (miðju inn eða matar-höfn) og mældum undirritaða hornið sem tengdi tvö extrema.

Sækni og sameindasértækni dLight1.3b

In vitro mælingar voru gerðar eins og áður hefur verið lýst¹⁵. Í stuttu máli voru HEK293T (ATCC CRL # 1573) frumur ræktaðar og transfekteraðar með plasmíðum sem umrita dlight1.3b ekið af CMV kynningu og þvegin með HBSS (Life Technologies) bætt við Ca²⁺ (4mM) og Mg²⁺ (2 mM) fyrir myndatöku. Myndataka var gerð með 40 × olíumarkmiði á öfugri Zeiss Observer LSN710 confocal smásjá með 488 nm / 513 nm (örvun / losun) bylgjulengd. Til að prófa flúrljómunviðbrögð skynjarans var taugaboðefnum beint beint á baðið meðan á myndatöku stóð, í að minnsta kosti tveimur sjálfstæðum tilraunum. Títranir af dópamíni og noradrenalíni voru fengnar með því að framkvæma tífalda raðþynningar til að ná átta mismunandi styrk. Allir aðrir taugaboðefni voru prófaðir við þrjá styrkleika í röð (100 nM, 1 µM og 10 µM). Allur styrkur taugaboðefnisins fékkst með þynningu úr 1 mM stofnstyrk í HBSS, tilbúinn ferskur. Hráa flúrljómunarstyrk frá myndatöku með tímanum var magnaður á Fídjieyjum; hver arðsemi var dregin handvirkt á himnu einstakra frumna. Flúrljómun breyting (ΔF/F) var reiknað sem F hámarki (meðaltal flúrljómunarstyrks fjögurra ramma) - F basal (meðaltal flúrljómunarstyrkur fjögurra ramma áður en bindill er bætt við) /F basal. Graf og tölfræðigreining voru framkvæmd með því að nota GraphPad Prisma 6. Gagnapunktar voru greindir með einum stað sérstakan bindiferð til að fá K_d gildi. Í reitum kassa-og-hvítrauka nær kassinn yfir 25% til 75% svið og whiskers ná frá lágmarks- til hámarksgildum.

Skýrsla yfirlit

Nánari upplýsingar um rannsóknarhönnun er að finna í Yfirlit yfir skýrslur náttúrulækninga tengd þessari grein.

AAV.Synapsin.dLight1.3b vírusinn sem notaður var í þessari rannsókn hefur verið afhentur Addgene (nr. 125560; http://www.addgene.org). Öll gögn verða aðgengileg á vefsíðu gagnarnámskeiðs um samvinnurannsóknir á taugavísindum (https://doi.org/110.6080/K0VQ30V9).

Sérsniðin MATLAB kóða er fáanleg ef óskað er frá JDB

Tilkynning útgefanda: Springer Nature er hlutlaus með tilliti til lögfræðilegra krafna í birtum kortum og stofnanatengslum.

Við þökkum P. Dayan, H. Fields, L. Frank, C. Donaghue og T. Faust fyrir ummæli sín um snemma útgáfu af handritinu, og V. Hetrick, R. Hashim og T. Davidson fyrir tæknilega aðstoð og ráðgjöf. Þessi vinna var studd af National Institute on Drug Abuse, National Institute of Mental Health, National Institute for Neurological Disorders and Stroke, University of Michigan, Ann Arbor og University of California, San Francisco.

Upplýsingar gagnrýnenda

Nature þakkar Margaret Rice og öðrum nafnlausum gagnrýnendum fyrir framlag sitt til ritrýni þessa verks.

Skýringar höfundar

1. Þessir höfundar lögðu sitt af mörkum jafnt: Ali Mohebi, Jeffrey R. Pettibone

Samstarfsaðilar

1. Neurology Department, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA

   • Ali Mohebi
   • , Jeffrey R. Pettibone
   •  & Joshua D. Berke

2. Taugavísindadeild, Brown University, Providence, RI, Bandaríkjunum

   • Arif A. Hamid

3. Efnafræðideild Háskólans í Michigan, Ann Arbor, MI, Bandaríkjunum

   • Jenny-Marie T. Wong
   •  & Robert T. Kennedy

4. Neuroscience Graduate Program, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA

   • Leah T. Vinson
   •  & Joshua D. Berke

5. Deild lífefnafræði og sameindalækninga, læknadeild Háskólans í Kaliforníu, Davis, Davis, CA, Bandaríkjunum

   • Tommaso Patriarchi
   •  & Lin Tian

6. Weill Institute for Neurosciences og Kavli Institute for Fundamental Neuroscience, University of California, San Francisco, San Francisco, USA

   • Joshua D. Berke

Framlög

AM framkvæmdi og greindi rafgreiningarfræði og ljósmælingu og beitti reiknilíkani. JRP framkvæmdi og greindi örgreininguna með aðstoð frá J.-MTW og eftirliti RTKAAH þróaði hegðunarverkefnið og upphaf ljósmyndatryggingarinnar og framkvæmdi voltammetry. LTV framkvæmdi eftirlit og greiningar. TP og LT þróuðu dLight skynjarann ​​og deildu sérþekkingu. JDB hannaði og hafði umsjón með rannsókninni og skrifaði handritið.

hagsmuna

Höfundarnir lýsa því yfir að engar hagsmunir hagi sér.

Samsvarandi höfundur

Samsvar við Joshua D. Berke.