Optogenetics kemur í ljós að hlutverk er að safna miðlungs spiny taugafrumum sem tjá dópamín D2 viðtaka í kókaínvöldum hegðunarsynstri (2014)

Fara til:

Abstract

Langvarandi aðlögun að völdum lyfja innan nucleus accumbens (NAc) hefur verið lagt til að stuðla að eiturlyfjameðferð ávanabindandi hegðunar. Hér höfum við notað optogenetic aðferð til að skoða hlutverk NAc miðlungs spiny taugafrumna (MSNs) sem tjá dópamín D2 viðtaka (D2Rs) í hegðun næmi kókaíns. Adeno-tengdum veiruvektum sem umrita channelrhodopsin-2 (ChR2) voru gefnir í NAc hjá D2R-Cre transgenic músum. Þetta gerði okkur kleift að selja D2R-MSNs í NAc að eigin vali. D2R-MSN mynda staðbundnar hindrunarrásir, vegna þess að ljósmunun á D2R-MSN vakti hamlandi postsynaptic strauma (IPSC) í nálægum MSN. Ljósmyndun á NAc D2R-MSN in vivo hafði hvorki áhrif á upphaf né tjáningu á hegðunarnæmingu af völdum kókaíns. Hins vegar, örvun ljóstillífs á tímabilinu sem dregur úr lyfinu, minnkaði tjáningu á hegðunarnæmingu af völdum kókaíns. Þessar niðurstöður sýna að D2R-MSN af NAc gegna lykilhlutverki í afturköllunarvökva og geta stuðlað að bakslagi eftir að eiturlyf misnotkun hefur verið hætt.

Leitarorð: optogenetics, miðlungs spiny taugafrumur, Dopamine D2 viðtakar, kókaín, eiturlyfjafíkn

Hvernig gengur lífið dag frá degi? Er það í jafnvægi og allt eins og það á að vera? Er jafnvægi hvort sem litið er á veraldlega stöðu eða andlega? Lífið er eins og það er. Það er ekki alltaf sólskyn. Það koma reglulega lægðir með rok og rigningu. Við vitum að í heildar samhenginu er lægð hluti af vistkerfi að leita að jafnvægi. Stundum erum við stödd í miðju lægðarinnar. Þar er logn og gott veður, sama hvað gengur á þar sem stormurinn er mestur. Sama lögmál gildir varðandi þitt eigið líf. Ef þú ert í þinn miðju, þínum sannleik þá heldur þú alltaf jafnvægi átakalaust. Sama hvað gustar mikið frá þér þegar þú lætur til þín taka. Huldufólk hefur gefið okkur hugleiðslu sem hjálpar okkur að finna þessa miðju, finna kjarna okkar og sannleikann sem í honum býr. Þegar þú veist hver þú ert og hvers vegna þú ert hér, mun líf þitt vera í flæðandi jafnvægi. Hugleiðslan virkjar þekkinguna sem er í vitund jarðar og færir hana með lífsorkunni inn í líkama okkar. Þar skoðar hún hugsana og hegðunar munstrið og athugar hvort það myndar átakalausu flæðandi jafnvægi. Hinn möguleikinn er falskt jafnvægi sem hafa þarf fyrir að viðhalda með tilheyrandi striti, áhyggjum og ótta. Síðan leiðbeinir þessi þekking okkur að því jafnvægi sem er okkur eðlilegt. Við blómstrum átakalaust, líkt og planta sem vex átakalaut frá fræi í fullþroska plöntu sem ber ávöxt.

Merki dópamíns (DA) tengist verðbólguvæntingum og markvissri hegðun (vitur, 2004; Goto og Grace, 2005; Berridge, 2007). Eitt af þekktum meinafræðingum dópamínvirkra kvilla er eiturlyfjafíkn (Robinson og Berridge, 1993, 2003). Eftir endurtekna váhrif ávanabindandi efna eiga sér stað aðlögunarbreytingar á sameinda- og frumustigi í DA mesolimbic ferli; þetta getur leitt til fíkniefnaóháðs, sem er langvinnur, afturkallaður kvilli þar sem áráttuhegðun og eiturlyfjameðferð er viðvarandi þrátt fyrir alvarlegar neikvæðar afleiðingar þeirra (Thomas o.fl., 2008; Baik, 2013). Einkenni breytinganna sem eiga sér stað í mesólimbískum dópamínvirka kerfinu er þannig lykillinn að skilningi á fíkn.

Dópamín D1 viðtökur (D1R) og D2 viðtökur (D2R) eru mjög tjáðar í miðlungs spiny taugafrumum (MSNs) í striatum. Lagt hefur verið til að langvarandi aðlögun af völdum lyfja í ventral striatum, betur þekktur sem nucleus accumbens (NAc), stuðli að þróun áfíknar sem og eiturlyfjaleitandi og bakslagshegðunar (Lobo og Nestler, 2011; Smith o.fl., 2013). Dópamínvirka frumulíkamir frá legu svæði í miðlægu þéttingu leggjum aðallega mið af NAc. Yfir 95% frumanna innan NAc eru MSN, sem fá örvandi aðföng frá fjórum helstu heilasvæðum: forstilla heilaberki, ventral undiráætlun hippocampus, basolateral amygdala og thalamus (Sesack og Grace, 2010; Lüscher og Malenka, 2011). MSNs innan NAc má skipta í tvo helstu undirflokka: bein leið MSN sem tjá D1R og verja beint til DA-svæðis á miðhjálp, og óbein MSN leið sem lýsir D2R og verkefni til ventral pallidum (Kreitzer og Malenka, 2008; Sekkur og náð, 2010; Lüscher og Malenka, 2011; Smith o.fl., 2013). Vegna þess að MSN eru GABAergic mun virkjun MSNs taugafrumna hamla markmiðum þeirra sem liggja að neðan sem eru einnig GABAergic (Chevalier og Deniau, 1990). Þess vegna mun virkjun D1R-MSN örva miðtaug DA taugafrumna, sem síðan stuðlar að stjórnun á launatengdri hegðun (Lüscher og Malenka, 2011; Bocklisch et al., 2013).

Nýlegar rannsóknir á erfðabreyttum músum sem tjá Cre-raðbrigða á frumutegundarlegan hátt hafa leitt í ljós mismunandi hlutverk fyrir D1R-MSN og D2R-MSN við hegðun kókaínfíknar. Slíkar mýs gera kleift erfðamiðun sértækra eiturefna, optogenetic prófa eða DREADD (viðtaka hönnuða sem eru eingöngu virkjaðir af hönnuðum lyfjum) til að meðhöndla val á D1R-MSN eða D2R-MSN. Þessi aðferð hefur leitt til nokkurrar samstöðu um hlutverk MSN í ávanabindandi hegðun: D1R-MSN stuðla greinilega að ávanabindandi hegðun, en ekki hefur verið lagt til að sérstakt hlutverk (eða hindrandi hlutverk) í þróun eiturlyfjafræðilegrar ávanabindandi hegðunar fyrir D2R-MSN (Hikida o.fl., 2010; Lobo o.fl., 2010; Ferguson o.fl., 2011; Bock o.fl., 2013). Útsetning fyrir kókaíni veldur greinilega synaptískri breytingu og breytingum á tjáningu gena í báðum MSN-stofnum (Lobo o.fl., 2010; Lobo og Nestler, 2011; Grueter o.fl., 2013). Þrátt fyrir að svo virðist sem D1R-MSN og D2R-MSN gegni andstæðu hlutverki í ávanabindandi hegðun kókaíns er nákvæm hlutverk D2R-MSN ekki ljóst.

Áður hefur verið sýnt fram á að D2R knockout (KO) mýs sýna eðlilega hegðun næmni af kókaíni og kókaínleitandi hegðun, með aðeins lítilsháttar lækkun á næmi sem stafar af fjarveru D2R (Baik o.fl., 1995; Chausmer o.fl., 2002; Sim o.fl., 2013). Samt sem áður, útsetning fyrir streitu við afturköllun lyfja bælir tjáningu hegðunarnæmis af völdum kókaíns sem og kókaínleitar og bakslagshegðun hjá D2R KO músum (Sim o.fl., 2013). Sértæk niðurbrot D2R í NAc hefur ekki áhrif á hreyfingu basal hreyfihreyfingar, né hegðun næmni af kókaíni, en veitir getu streitu til að hindra tjáningu á hegðun næmi kókaíns (Sim o.fl., 2013). Þessar niðurstöður benda eindregið til þess að hindrun D2R í NAC komi ekki í veg fyrir kókaín-miðlað atferlisofnæmi. Frekar virðist sem D2R í NAc gegni sérstöku hlutverki við stjórnun á áreynslu á synaptískum breytingum við afturköllun sem leiða til aukinnar hegðunar kókaínleitar og bakslags (Sim o.fl., 2013).

Hér höfum við notað optogenetics til að meta frekar hlutverk NAc D2R-MSN í hegðun næmni kókaíns. Með því að nota heilasneiðar komumst við að því að ljósmyndun á D2R-MSN virkjar staðbundnar hindrunarrásir í NAc sem nær til MSN nærliggjandi. Ljósmyndun á NAc D2R-MSN in vivo hefur hvorki áhrif á upphaf né tjáningu á hegðunarnæmingu af völdum kókaíns. Hins vegar endurtekur virkjun NAc D2R-MSN á meðan á lyfjaganginum stendur dregur úr ávanabindandi hegðun af kókaíni. Niðurstöður okkar sýna að D2R-MSN af NAc gegna lykilhlutverki í afturköllunarvökva og geta stuðlað að bakslagi eftir að eiturlyf misnotkun hefur verið hætt.

Efni og aðferðir

Mýs

D2-Cre BAC erfðabreyttar mýs á C57Bl / 6 bakgrunni voru fengnar frá MMRRC (Mutant Mouse Regional Resource Centers, B6.FVB (Cg) -Tg (Drd2-cre) ER44Gsat / Mmucd). Í hegðunartilraunum voru ruslfélagar sem skortu D2-Cre transgenið notaðir sem stjórntæki fyrir D2-Cre músin. Músum var haldið við í sérstakri sýklafrjálsri hindrunaraðstöðu við stöðugt hitastig og rakastig, og á 12-h léttu, 12-h dökkum áætlun. Umhirða dýra og meðhöndlun var framkvæmd í samræmi við staðla sem samþykktir voru af stofnanadýra- og notkunarnefndum Kóreuháskóla og KIST.

Virus vektor undirbúningur

pAAV-EF1a-DIO-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE var ríkulega veitt af Karl Deisseroth (Stanford Univ.). Til framleiðslu á AAV voru HEK293T frumur ræktaðar í DMEM miðlum með sýklalyfjum og FBS. Daginn fyrir transfection voru fjórir plötur umfram 90% ármót frá 10 cm skálum settir á fimm 15 cm diska og ræktaðir í 18 – 22 klst. Eða þar til 60 til 70% ármót. HEK293T frumur voru transfected með pAAV-DIO-ChR2-EYFP, pAAV-DJ og pHelper með því að nota jetPEI transfection hvarfefni (QBiogene). DNA / DMEM / PEI kokteilinn var hvirfilbeygður og ræktaður við stofuhita í 20 mín. Eftir ræktun var transfection blöndunni bætt við hvern 15 cm fat. Transfected frumur voru safnað 48 klst eftir transfection og ræktað með 0.5% natríum deoxycholate (Sigma; D6750) og 50 einingar / ml af benzonase nuclease (Sigma; E1014) við 37 ° C í 1 klst. Eftir að frumu rusl var fjarlægt með skilvindu við 3000 × g í 15 mín., Var flotið síað í gegnum 0.45 mm PVDF síu (Millipore). Hreinsun AAV-DJ agna var framkvæmd með því að nota HiTrap heparín sækni dálka (GE Healthcare). Til styrks AAV voru Amicon ultra-15 miðflótasíueiningar með 100,000 mólmassa niðurskurð notaðir. Einbeittur vírusur er aðgreindur og frystur til geymslu við −80 ° C. Lokaþéttni veirunnar var 3 ~ 6 × 1012 vírusaagnir í ml fyrir hvert AAV.

Stereótaxísk innspýting og staðsetningu ljósleiðara

Dýr voru svæfð með ip sprautum af 1.6 µl af Zoletil og 0.05 µl af xylazine (Rompun, Bayer) á hvert gramm af líkamsþyngd og sett í stereotaxic tæki (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). Til inndælingar á vírusum var 31 gauge sprautunál notuð til tvíhliða innrennslis 2 µl vírus í NAc við 0 ° horn (AP +1.7; ML ± 1.3; DV -4.5) með 0.1 ul / mín. Nálin var látin vera á sínum stað í 10 mínútur eftir inndælingu áður en hún var dregin hægt út. Ljósleiðarapípan til ígræðslu samanstóð af zirconia hylki (1.25 mm í þvermál og 4.5 mm að lengd) og sléttum oddi ljósleiðara (200 µm í þvermál). Ígræðsla ljósleiðarakannunnar í NAc til lýsingar á D2-MSN var gerð strax eftir vírusinndælingu. Hnitin fyrir ígræðslu ljósleiðarakúlunnar voru 0 ° horn (AP +1.7; ML ± 1.35; DV -4.2) til að miða á NAc. Til að hjálpa ljósleiðaranum við festingu voru tvær skrúfur festar í hauskúpuna aftan á ígræðslustað ljósleiðarans. Til að festa ljósleiðarakanúluna á höfuðkúpunni var C&B Superbond (Sun Medical) borið á yfirborð höfuðkúpunnar í kringum botn kúlunnar. Þegar C&B Superbond harðnaði var losað um kanylinn úr festingunni og tannsementi (Poly-F, Dentsply) var borið utan um kanúluna og skrúfur. Til að loka skurðinum í kringum kanuleringsstaðinn var notað Vetbond vefjalím (3 M, 7003449). Eftir ígræðslu voru mýs gefnar með sýklalyfjum undir húð (Enrofloxacin, 5 mg / kg, q 12 klst.) Og verkjastillandi (Carprofen, 5 mg / kg, q 24 klst.) Í 3 daga samfleytt.

In vivo ljósörvun

200 µm plástrasnúra var tengd við ytra hlutann af langvinnu ígræðanlegu ljósleiðaranum með ermi. Ljós trefjar voru festir í gegnum FC / PC millistykki við bláa leysir díóða (473 nm, MBL-III 473-150 mW) og ljóspúlsar voru búnir til með örvun (BNC 575). Til að örva ChR2-tjáandi taugafrumur var örvunarviðmiðið 20 Hz tíðni, 5 ms púlslengd og 2 – 5 mW af ljósstyrk. Ljósafli, sem sendur var úr plástrasnúrunni, var mældur með rafmagnsmæli (PM100D) með S121C ljósnemi.

Hegðunargreining

Hegðartilraunir voru gerðar með karlkyns D2-Cre músum við 11 – 13 vikna aldur, að undanskildum músum sem voru látnar fara í rafgreiningarfræðilegar greiningar sem voru 5 – 6 vikna aldur. Aldurssamsvarandi D2-Cre og Cre neikvæðar samanburðar mýs voru sprautaðar með vírus og hýstar hver fyrir sig og leyfðar að aðlagast búrinu þar til hegðunarprófið. Fyrir hverja meðferð voru mýs fluttar í tilraunaherbergið 60 mín áður en tilraunin hófst til að gera ráð fyrir búsetu og til að draga úr streitu (birtustig tilraunaherbergisins var 70 lux). Hver tilraunabúnaður var hreinsaður með 70% etanóli milli tilrauna til að fjarlægja hugsanlegar lyktartölur.

Kókaínnæmi

Til að hefja næmingu á kókaíni voru músar að venjast saltvatnssprautum (ip) í 3 daga samfellt og sprautað síðan með saltvatni eða kókaíni (15 mg kg-1, ip) í 5 daga í röð. Músum var sprautað í kviðarhol (ip) með annað hvort kókaínhýdróklóríð (Johnson Mattney, Edinborg, Bretlandi) uppleyst í saltvatni (0.9% NaCl) eða saltvatni með 30 G nál. Strax eftir hverja inndælingu voru mýs prófaðar á láréttri hreyfingarvirkni í víðavangshólfinu í 30 mín. Til að mæla áhrif ljóstillifunar á upphaf og tjáningu næmingar (mynd (Mynd​​​5), 5), músum var gefin blá ljóslýsing tvíhliða í gegnum tvöfalda ljósleiðara plástrasnúrur á NAc í fjögur 3 mín. tímabil á 30 mín. fundum í búrum. Plástrengir frá ljósleiðarakönnu, sem staðsettir voru á músarhausnum, voru fjarlægðir og mýs fengu að minnsta kosti 10 mín. Hvíld. Músum var síðan sprautað með annað hvort kókaíni eða saltvatni (kók 1d-kók 5d). Eftir að næmi var hafin var kókaín dregið út í 14 daga án þess að saltvatni hafi verið sprautað. Á þessu afturköllunartímabili var engin ljósörvun beitt. Tjáning hegðunarnæmis fyrir kókaíni var síðan ákvörðuð með því að sprauta áskorunarskammti af lyfinu (10 mg kg-1, ip) eftir myndstillingu NAc eins og sýnt er á mynd Mynd5A.5A. Til að mæla áhrif ljóstillifunar á afturköllunartíma kókaíns (mynd (Figure6), 6), mýs voru látnar vera sömu siðareglur fyrir næmingu og lýst er hér að ofan (fyrir mynd Figure5) 5) nema ljóstillífun var gefin. Eftir að kókaínnæming var hafin var ljóstillífun beitt á NAc daglega í 1 klst. Á heildar fráhvarfstímabilinu 14 daga. Eftir 14 daga afturköllun voru allir hópar músa sprautaðir með áskorunarskammtinum af kókaíni, (10 mg kg-1).

Mynd 1 

Sértæk ljósstimun á miðlungs spiny taugafrumum í nucleus accumbens. (A) Sértæk tjáning ChR2 í NAc D2R taugafrumum með afhendingu AAV-DIO-ChR2-EYFP veirutækjum. mælikvarða bars: bakgrunnur mynd, 1 mm: setja inn, 200 um. (B) Ruglmyndir ...
Mynd 2 

Ljósstimulun D2RCre-MSNs rekur staðbundnar hindrunarrásir. (A) Samskiptamynd af lifandi NAc-sneið, sem sýnir litunarefnafyllta taugafrumu sem tjáir ekki ChR2 og nálæga frumu (örhausinn) sem tjáði ChR2 og hægt væri að myndstimla hann. (B) IPSC ...
Mynd 3 

Eiginleikar NAc frumna. (A) Tvær ljóseindar flúrljómunarmynd af taugafrumum fylltar með Alexa 594. (A1) sýnir taugafrumu úr ChR2 + / AP hópnum, meðan (A3) sýnir taugafrumu úr ChR2− / IPSC hópnum. (A2) og (A4) eru stórstækkaðar myndir frá ...
Mynd 4 

Áhrif af in vivo optogenetic virkjun D2-MSN í NAc á basal hreyfingu virkni. (A) Sagittal mynd af D2 Cre músum sprautað í NAc með AAV-DIO-ChR2-EYFP fylgt eftir með tvíhliða ígræðslu ljósleiðarakönnu. 473 nm blátt ljós örvun ...
Mynd 5 

Áhrif örvunar D2-MSN við næmingu fyrir kókaíni. (A) Tilraunaáætlun til að örva myndun D2-MSN við upphaf og tjáningu á næmi fyrir kókaíni. Bláljós lýsing (2 ~ 5 mW, 5 ms, 20 Hz) var afhent fyrir fjóra ...
Mynd 6 

Áhrif örvunar D2-MSN við fráhvarf til endurtekinna útsetningar fyrir kókaíni. (A) Tilraunaáætlun til að örva ljósmynd af D2-MSN við fráhvarf til kókaíns. Bláljós lýsing (2 ~ 5 mW, 5 ms, 20 Hz) var afhent í átta 3 mín. Tímabil ...

Ónæmisflúrljómun og rugluð smásjá úr leysi

Fyrir ónæmisflúrljómun voru mýs svæfðar með Zoletil (Virbac, 1.6 μl / g, í kviðarhol) og 0.05 μl / g Rompun (Bayer) og blandaðir með síu-sótthreinsuðu 0.1 M PBS og síðan festing með 4% paraformaldehýð / PBS lausn (Sigma). Heilinn var síðan fjarlægður og eftir festur í 4 klst. Með ísköldum lagfærandi eins og hér að ofan. Gáfarnir voru síðan þurrkaðir í 30% súkrósa / 0.1 M PBS í 2 daga. Gáfur voru síðan frystar og 40-pm þykkur í röð kransæðahlutar voru framleiddir á kryostat (Leica CM 1900, Þýskalandi). Hlutum (40 um) var lokað fyrir 1 h í 0.1 M PBS sem innihélt 5% venjulegt geitasermi og 0.2% Triton X-100 og var ræktað með marghliða kanínu gegn D2R (1: 500, Millipore, AB5084P) yfir nótt. Eftir skolun með PBS sem innihélt 4% Triton X-0.2 voru sýni rækjuð við RT fyrir 100 h með Alexa Fluor 1 geit gegn kanínu IgG (568: 1; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) og 500 µl / ml 0.2, 4-diamidino-6-fenyl-indol HCl (DAPI; Sigma, St. Louis, MO, USA) í PBS sem inniheldur 2% venjulegt geitasermi og 1% Triton X-0.2. Sem neikvæð stjórn var sýni ræktað með DAPI og aukamótefninu eingöngu. Hlutar voru skoðaðir á C100 Plan Apo × 1 / 40 vatnskonfellu leysiskönnunarkerfi (LSM 1.4, Zeiss, Berlín, Þýskalandi).

Rafgreining og ljósörvun í sneiðum af kjarna accumbens

Mýs voru notaðar í tilraunum 4 vikum eftir inndælingu vírusa, til að ná fram hámarks tjáningu ChR2-EYFP. Mýs voru síðan svæfðar og deyflaðar til að framleiða bráða heilasneiðar. Heilinn var fljótt fjarlægður og settur strax í ískaldan skurðarlausn sem innihélt (í mM) 250 súkrósa, 26 NaHCO3, 10 D-glúkósa, 3 Myo-inositol, 2.5 KCl, 2 Na-pyruvat, 1.25 NaH2PO4, 0.5 askorbínsýra, 1 kynúrensýra og 7 MgCl2 sem var freyðandi með 95% O2/ 5% CO2 (pH = 7.4). Kransæðaheilum (250 um þykkt) sem innihélt NAc voru framleiddar með titringi (Leica VT 1200 S) og voru síðan ræktaðir í gervi gervi heila- og mænuvökva (ACSF) sem innihélt (í mM): 11 D-glúkósa, 125 NaCl, 25 NaHCO3, 1.25 NaH2PO4, 2.5 KCl, 1.25 MgCl2 og 2.5 CaCl2 við 34 ° C í 1 klst. fyrir upptöku. Sneiðar voru síðan færðar yfir í upptökuhólf undir botninn þar sem O2-mettað ACSF lausn var stöðugt ofgnæfuð. Frumur í NAc og VTA voru sýndar með 2-ljóseindarsmásjá (Olympus FV1000 MPE, Tókýó, Japan) sem var útbúinn með 25X vatnsdýpri linsu og innrauða DIC ljósfræði. Upptökur á klemmum úr heilum frumum voru fengnar úr NAc frumum með Multiclamp 700B magnara og Digidata 1440A stafrænu myndinni (Molecular Devices, LLC). Gögn voru tekin með pCLAMP 10.2 hugbúnaði og greind frekar með Clampfit 10.2 hugbúnaði (Molecular Devices, LLC). Plástrað rafskaut með viðnám milli 3 – 5 MΩ voru fyllt með innri lausn sem innihélt (í mM): 130 K-glúkónat, 2 NaCl, 2 MgCl2, 20 HEPES, 4 Na2ATP, 0.4 Na3GTP, 0.5 EGTA og 10 Na2- fosfókreatín, með pH stillt á 7.3 með 1 N KOH. Tvíkúlúlín (10 µM) var borið á heila sneið til að hindra GABA viðtaka í undirmengi tilrauna.

NAc frumur sem tjáðu ChR2-EYFP voru ljósstilltir með LED ljósgjafa (460 ± 27 nm, UHP-Mic-LED-460, Prizmatix). Blátt ljós frá ljósdíóðunni var síað frekar og dregið úr með síubotni búinn örvunar síu (470 – 495 nm); ljósblikkar (10 ms lengd, 0.0366 – 0.354 mW / mm2) voru afhentar í heilasneiðina með 25X hlutalinsunni á tíðnum 5 – 40 Hz. Í undirmati tilrauna voru ljósstraumar mældir í ChR2-tjáandi frumum sem svörun við tímaljós 2.

Tölfræðileg greining

Gögn eru kynnt sem meðaltal ± sem og voru greind með tvístíguðum nemanda t-próf, eða með tvíhliða greining á dreifni í kjölfar Bonferronis post hoc próf. A Pgildi <0.05 var talið tölfræðilega marktæk.

Niðurstöður

Sértæk ljósörvun miðlungs spiny taugafrumna í nucleus accumbens

Til að ákvarða hlutverk NAc D2R-MSN í kókaín-miðluð ávanabindandi hegðun, notuðum við optogenetic nálgun til að örva NAc D2R taugafrumur. Til að stýra virkni D2R-MSNs í NAc með ljósum, voru veiruvektar, sem kóðu AAV-DIO-ChR2-EYFP, sprautaðir með stereotaxic hætti í NAc D2R-Cre BAC transgena músa. 4 vikum eftir veiruinnspýting sást öflug tjáning ChR2-EYFP í NAc (mynd (Mynd1A) .1A). Sértækni ChR2 tjáningar í D2R-MSN voru staðfest með ónæmisflúrljómandi ruglingslegri greiningu: tjáning á YFP-merktu ChR2 var staðbundin með D2R í NAc (mynd (Figure1B), 1B), sem sýnir að ChR2 var tjáð í D2R-tjáandi taugafrumum í NAc.

Þrátt fyrir að slík aðferð hafi verið notuð í öðrum rannsóknum (td Lobo o.fl., 2010), upplýsingar um innspýtingaraðgerðir við vírusa eru breytilegar frá einu rannsóknarstofu til annars, sem gerir það að verkum að það er mikilvægt að skjalfesta optogenetic stjórnun undir sérstökum tilraunaaðstæðum okkar. Við metum virkni tjáningar ChR2 með því að gera plöntuupptökur úr heilum frumum úr MSN í NAc sneiðum. MSN voru auðkennd með: (1) tiltölulega ofpólariseruðum möguleika á hvíldarhimnu (RMP), venjulega neikvæðari en −80 mV; (2) venjulegt mynstur af AP hleypur í svörun við beitt straumpúls; (3) löng leynd til að skjóta fyrsta AP á núverandi púls; (4) skortur á spennu „lafandi“ við ofpólunun af völdum ofstyrkaðs katjónsstraums (I)h); og (5) tiltölulega lítil stærð frumuhluta þeirra (Chang og Kitai, 1985; O'Donnell og Grace, 1993; Le Moine og Bloch, 1996; Taverna o.fl., 2008). Blátt ljós (470 nm) var beitt yfir allt sjónsviðið (0.78 mm2) meðan spenna er klemmd MSNs við geymslugetu −69 mV. Sum MSN tjáðu ChR2, augljós sem YFP flúrljómun í sómata þeirra (örvar á myndum 1C1, C3). Slíkar taugafrumur sýndu verulegar ljósstrauma með bjartari ljósáreiti sem vekur upp stærri ljósstrauma (mynd (Mynd1D) .1D). Sambandið á milli hámarks ljósvíddar amplitude og ljósstyrks (mynd (Mynd1E) 1E) hafði hálf hámarks ljósnæmi 0.054 ± 0.0023 mW / mm2 og hámarks toppur amplitude 1.16 ± 0.16 nA (meðaltal ± sem, n = 4).

Við núverandi klemmuskilyrði, MSNs sem tjá ChR2 reku AP áreiðanleg til að bregðast við lestum á ljóspúlsum (10 ms lengd; mynd Mynd1F) .1F). Við þessar aðstæður er ljósstyrkur meiri en 0.1 mW / mm2 nægðu til að kalla fram AP (mynd (Mynd1G, 1G, n = 5). AP voru kallaðir fram á áreiðanlegan hátt við ljósnæmis tíðni allt að 20 Hz, en við 40 Hz voru ljóssvörunin kölluð til að valda viðvarandi afskautun sem var minna árangursrík við að kalla fram AP (myndir 1F, G).

Ljósstimulun D2R-MSNs rekur staðbundnar hindrunarrásir

Til að kanna afleiðingar virkni D2R-MSNs á staðbundnar brautir í NAc, tókum við myndstillt MS-forstillingar sem tjáðu ChR2 meðan við mældum svörun við samstillingu í ChR2-neikvæðum MSN (mynd) (Mynd2A) .2A). Taugafruman sem sýnd er á mynd Mynd2A2A tjáir ekki ChR2, eins og gefið er til kynna með skorti á flúrljómun EYFP sem og skortur á ljóskerum með stuttum leynd eins og sýnt er á mynd Mynd1D.1D. Hins vegar þegar MSN-skilaboðin voru haldin sem möguleiki á −69 mV, blikkar 10 ms tímaljós til útstrauma eftir seinkun 9.0 ± 0.42 ms (mynd (Mynd2B, 2B, n = 15). Til að ákvarða eðli þessara svara var möguleiki postsynaptic himna mismunandi milli −99 mV til −39 mV, meðan ljósflassi var beitt (mynd (Mynd2C) .2C). Ljósviðbrögð voru misjöfn með himnufærni (mynd (Mynd2D, 2D, n = 6) og snéri pólun sinni við −81 ± 3.4 mV. Í ljósi þess að jafnvægisgeta klóríðjóna er −80 mV við jónaraðstæður, gætu ljósstraumar út á við stafað af klóríðflæði sem miðlað er af postsynaptic GABAA viðtaka. Til að prófa þennan möguleika, GABAA viðtakablokki tvísúlu (10 μM) var bætt við ytri lausnina. Lyfið lokaði fullkomlega á svör við ljósi (mynd (Figure2B), 2B), sem staðfestir að svörin sem framkölluð voru ljós voru GABAergic hamlandi postsynaptic straumar (IPSC).

Byggt á svörum þeirra við ljósmyndun, var hægt að flokka MSN sem við tókum upp í einn af 4 hópum: (1) frumur sem tjáðu nægjanlegt magn af ChR2 til að skjóta APs til að bregðast við ljósstillingu (ChR2 + / AP), sem lýst var hér að ofan; (2) frumur sem tjáðu lítið magn af ChR2, sem sýndu afskautun undirþrýstings sem svar við ljósi (ChR2 + / No AP); (3) hljóðlausar frumur sem höfðu enga tjáningu á ChR2 en fengu létt afleiddar IPSC frá forstillta MSN sem tjáðu ChR2 (ChR2− / IPSC); og (4) ChR2-neikvæðar frumur sem sýndu ekki IPSC sem svar við ljósmunun annarra MSN (ChR2− / No IPSC). Hlutfall frumna í hverjum þessara flokka er sýnt á mynd Mynd2E2E (n = 53). Í heildina tjáði næstum helmingur frumanna (45.3%) ChR2 (summa hópa (1) og (2)). Ekkert MSN sem við tókum upp sýndi bæði ljósstrauma og IPSC sem svar við ljósmunun; þetta bendir til þess að D2R-jákvæð MSN gefi ekki með sér aðra meðlimi í þessum sama frumubúningi innan NAc.

Þessi flokkun svara við ljósi gefur til kynna að ljósmyndun á ChR2 + / No AP frumum (hópur 2) og ChR2− / Engin IPSC frumur (hópur 4) muni ekki mynda nein rafmagnsmerki sem gætu stuðlað að virkni hringrásarinnar. Til að skilgreina áhrif ljóstillifunar á virkni hringrásar einkenndum við í smáatriðum eiginleika ChR2 + / AP MSNs (hópur 1), sem mun búa til AP þegar NAc er stillt upp, og ChR2− / IPSC frumur (hópur 3), sem eru samstilltar við ChR2 + / AP MSNs vegna þess að þeir fá IPSC-valda sem eru létt af völdum. ChR2 + / AP og ChR2− / IPSC frumur í NAc voru báðar auðkenndar sem spiny taugafrumur (mynd (Mynd3A) .3A). Enginn marktækur munur var á útlitsfræðilegum eða raf-lífeðlisfræðilegum eiginleikum taugafrumna í þessum tveimur hópum. Sem dæmi voru líkurnar á taugafrumunum í þessum tveimur hópum svipaðar að stærð (mynd (Mynd3B) .3B). Að auki RMP þeirra (−83.0 ± 1.7 vs. −85.0 ± 1.8 mV; meðaltal ± sem; n = 10, Mynd Mynd3C) 3C) og inntaksmótstöðu (113 ± 15 vs. 133 ± 13 MΩ, n = 6, Mynd Mynd3D) 3D) voru heldur ekki ólíkar (p > 0.05 tvískiptur námsmaður t-prófun) meðan AP hleypir upp mynstri til að bregðast við núverandi púlsum (myndum 3E, F) voru líka svipaðar (p > 0.05 tvískiptur námsmaður tpróf, n = 6). Í stuttu máli, þá er ljósmyndun á D2R-MSN í NAc virkjað staðbundin hamlandi hringrás með postsynaptísk taugafrumum sem eru mjög svipuð D2R-MSN en ekki tjá D2R.

Optogenetic örvun NAc D2R-MSN við hegðun næmni af kókaíni

Við skoðuðum næst hegðunarafleiðingar in vivo ljósörvun NAc D2R-MSN. Vegna þess að ljósmyndun á D2R-MSN í ristli á baki dregur úr hreyfingu hreyfisins (Kravitz o.fl., 2010), byrjuðum við með því að einkenna áhrif accumbens D2R-MSN örvunar á hreyfingu basal locomotor. Í þessu skyni var D2R-Cre músum sprautað með DIO-AAV-ChR2-EYFP vírus tvíhliða í NAc (D2-Cre (+) NAc-ChR2). D2R-MSN voru síðan ljósstillt með bláu ljósi (473 nm, 5 ms púlslengd, 20 Hz) afhent til NAc um ljósleiðara. Photostimuli var beitt á fjórum 3 mín. Tímabilum innan 50 mín. Fundarins þegar músum var haldið inni í upptökuhólfinu fyrir hreyfingu. (Mynd4A) .4A). Samhliða, sem stjórnandi WT littermate músum sem ekki voru Cre var sprautað á svipaðan hátt með vírus og fengu svipaða lýsingu á bláu ljósi. D2-Cre (+) NAc-ChR2 mýs sýndu sambærilegt eða örlítið hækkað basal hreyfivirkni í samanburði við samanburðar við D2R-Cre (-) NAc-ChR2 mýs (myndir) 4B, C). Ljósstimun D2R-MSNs í D2-Cre (+) NAc-ChR2 músum olli verulegri lækkun hreyfingarvirkni sem náði sér eftir að ljósörvunin stöðvaðist (mynd (Mynd4B) .4B). Engin slík áhrif komu fram í samanburðar D2R-Cre (-) NAc-ChR2 músum (Myndir 4B, C), sem gefur til kynna að áhrif ljóstillifunar hafi stafað af virkjun ChR2, frekar en mögulegum ósértækum áhrifum, svo sem upphitun á heilavef. Þess vegna bentu gögn okkar til þess að ljósmyndun á D2R-MSN í NAc vakti minnkun á hreyfingarvirkni.

Þessar niðurstöður staðfestu getu okkar til að stjórna virkni D2R-MSN innan NAc in vivo. Við notuðum næst þennan hæfileika til að kanna áhrif D2R-MSN virkni á hegðunarofnæmi fyrir endurtekinni gjöf kókaíns. Með hegðunarofnæmi er átt við ferlið sem gerir kleift að verða fyrir fyrstu geislameðferð, svo sem kókaíni, til að auka getu síðari váhrifa á lyfjum til að örva hreyfingu. Þessu ferli er hægt að aðgreina í upphafs- og tjáningarfasa: upphaf lýsir skjótum taugatilvikum sem framkalla næmni hegðunar (Vanderschuren og Kalivas, 2000; Sim o.fl., 2013), en vitað er að tjáning er langvarandi mynd af hegðunarplastík sem er viðvarandi eftir að lyf hefur verið hætt (Vanderschuren og Kalivas, 2000; Sim o.fl., 2013). Við könnuðum því hegðunarofnæmi af völdum kókaíns við endurteknar inndælingar á kókaíni í æð (ip) meðan við notuðum optogenetics til að stjórna virkni D2R-MSN í NAc á hverjum þessum stigum.

Eftir að hafa verið vanist við saltvatnssprautun á 3 dögum, var músum sprautað með kókaíni (15 mg / kg) á 5 dögum samfleytt og svörun við hreyfingu var skráð í 30 mín. Eftir hverja inndælingu (mynd (Mynd5A) .5A). Photostimuli voru afhentir á 30 mín. Fundum fyrir kókaíninnspýtingu, þar sem 3 mín. Uppljóstrunartímar voru blandaðir 5 mín. Tímabil þar sem slökkt var á ljósinu (mynd (Mynd5A) .5A). Í ljósi þess að ljóstillifun D2R-MSN í NAc dregur úr hreyfingu basal hreyfihreyfingar (mynd (Figure4), 4), voru photostimuli afhentir rétt fyrir gjöf kókaíns til að forðast hugsanleg truflun á hegðunarviðbrögðum við kókaínsprautun.

Báðir stjórna D2-Cre (-) NAc-ChR2 músum og D2-Cre (+) NAc-ChR2 músum sýndu verulega aukningu á hreyfingarvirkni sem svar við endurteknum kókaínsprautum (mynd (Figure5B), 5B), sem gefur til kynna upphaf næmingar. Ljósmyndun á D2R-MSN í NAc virtist ekki hafa áhrif á upphaf hegðunarofnæmingar, vegna þess að kókaín af völdum hegðunarnæmis var svipað hjá D2-Cre (+) NAc-ChR2 músum og stjórna D2-Cre (-) NAc-ChR2 músum.

Eftir örvun á hegðunarofnæmi með því að endurtaka slíkar inndælingar af kókaíni (15 mg / kg) í 5 daga var lyfið dregið út í 14 daga og stig tjáningarnæmis var skoðað með því að ögra músunum með lægri skammti af kókaíni (10 mg / kg). Tjáning næmingar er langvarandi mynd af hegðunarplastík sem er viðvarandi eftir að lyf hefur verið hætt (Steketee og Kalivas, 2011; Sim o.fl., 2013). Til að kanna hlutverk D2R-MSN við tjáningu næmingar var NAc ljósstillt strax fyrir gjöf kókaíns (mynd (Figure5A) 5A) og næming var mæld sem magn hreyfingarvirkni af völdum kókaínsprautunnar.

Í báðum hópum af kókaíni sem eru meðhöndlaðir með músum - D2-Cre (-) NAc-ChR2 mýs (D2-Cre (-) :: coc-coc) og D2-Cre (+) NAc-ChR2 (D2-Cre (+): : kók-kók) - sterk tjáning næmingar átti sér stað (mynd (Mynd5C) .5C). Tímaferill breytinga á hreyfingu á kókaíni örvaði var einnig svipaður milli hópanna tveggja (mynd (Mynd5C), 5C), þar sem enginn marktækur munur sást á milli tveggja hópa. Samanlagt benda þessar tvær ljósörvunartilraunir til þess að virkjun D2R-MSN í NAC hafi ekki áhrif á upphaf eða tjáningu á hegðunarofnæmi fyrir kókaíni.

Ljósörvun NAc D2R-MSN við fráhvarf lyfsins

Langvarandi streita við afturköllun lyfja eftir endurtekna útsetningu fyrir kókaíni hefur í för með sér sértæka ráðningu D2R-háðs aðlögunarferlis sem stjórnar streituvöldum aukningu á hegðun kókaíns og bakslagi í tengslum við breytingar á synaptískri plastleika í NAc (Sim o.fl., 2013). Þetta bendir til þess að aðferðirnar sem eru gerðar við afturköllun lyfja séu frábrugðnar þeim sem taka þátt í næmingu á eiturlyfjum. Þess vegna skoðuðum við næst hvort ljósmyndun á D2R-MSN í NAc við afturköllun kókaíns hefur áhrif á tjáningu á hegðunarofnæmi fyrir kókaíni.

Eftir örvun á hegðunarofnæmi með endurtekinni inndælingu á kókaíni eins og hér að ofan, voru D2-Cre (-) og D2-Cre (+) músar skipt í tvo hópa fyrir 14 daga afturköllunartímabil: einn hópur var látinn taka daglega blá ljós örvun á NAc í 1 klst. (3 mín. X 8 sinnum) en hinn hópurinn var ekki (mynd (Mynd6A) .6A). Endurtekin ljósörvun D2R-MSN í NAc við afturköllun kókaíns hafði ekki áhrif á tjáningu næmingar hjá D2-Cre (-) :: kók-kókamúsum (mynd (Mynd6B) .6B). Aftur á móti, í D2-Cre (+) :: kók-kókamúsum, var tjáning næmingarinnar verulega dregin úr með síendurtekinni örvun við afturköllun lyfsins (mynd (Figure6B), 6B), þó ekki hafi áhrif á tímaferli örvunar á hreyfingu kókaíns á hreyfingu (mynd (Mynd6C) .6C). Þannig minnkaði ljósmyndun á D2R-MSNs af NAc við afturköllun lyfja tjáningu hegðunarnæmis af völdum kókaíns (kókaín × samspil örvunar ljósmyndaörvunar) F(1,18) = 11.08, P = 0.0037, Mynd Figure6B) .6B). Þessar upplýsingar benda til þess að virkjun D2R-NAc MSN á tímabilinu þar sem lyfið sé afturkallað hafi áhrif á kókaínsleit og bakslag hegðunar.

Discussion

Töluverðar vísbendingar benda til þess að hegðun næmir fyrir kókaíni af völdum kókaíns tengist aukinni dópamínvirkri sendingu í mesocorticolimbic kerfinu sem samanstendur af ventral tegmental area, prefrontal cortex og nucleus accumbens (NAc). Sérstaklega einkennist tjáningarstig hegðunarofnæmingar af viðvarandi ofviðbragði eiturlyfja eftir að lyfið er hætt, sem tengist falli aðlögunarferla (Kalivas og Duffy, 1990; Robinson og Berridge, 1993; Kalivas o.fl., 1998) sem gætu stuðlað að áráttu þrá lyfja (Robinson og Berridge, 1993; Kalivas o.fl., 1998; Steketee og Kalivas, 2011). Lagt hefur verið til að breytingar af völdum kókaíns í sameinda-, frumu- og atferlisplastleika innan NAc, í tengslum við DA-viðtakamerki í MSN, geti stjórnað eiturlyfjameðferð ávanabindandi hegðunar (Lobo o.fl., 2010; Schmidt og Pierce, 2010; Ferguson o.fl., 2011; Pascoli et al., 2011; Bocklisch et al., 2013; Grueter o.fl., 2013).

Nýlegar rannsóknir á erfðabreyttum músum sem skilyrt skilning á Cre-raðbrigða, hafa leitt í ljós hlutverk D1R-MSN eða D2R-MSN við ávanabindandi hegðun kókaíns. Optogenetic virkjun D1R-MSNs NAc eftir 6 daga endurtekna gjöf kókaíns eykur hreyfingu á hreyfingu en virkjun D2R-MSN lyfja hefur að sögn engin áhrif (Lobo o.fl., 2010). Þessar upplýsingar benda til að endurtekin útsetning fyrir kókaíni auki afköst D1R-MSNs NAC. Hömlun á D1R-tjáandi MSN með stífkrampatoxíni (Hikida o.fl., 2010) dregur úr kókaínskilyrtri staðvali (CPP), en engar breytingar á CPA af kókaíni komu fram eftir að aflétta samstillingu í D2R-MSN (Hikida o.fl., 2010). Optogenetic örvun D1R-MSNs í ristli á baki örvar þráláta styrkingu, en örvandi D2 viðtakar sem tjáir taugafrumur örva tímabundna refsingu (Kravitz o.fl., 2012). Í nýlegri rannsókn hefur einnig verið greint frá því að hömlun D2R-MSN með efnafræðilegum aðferðum auki hvata til að fá kókaín, en optogenetic virkjun D2R-MSN bælir sjálfsstjórnun kókaíns (Bock o.fl., 2013). Aftur á móti, Bocklisch o.fl. (2013) greint frá því að D1R-MSNs af NAc verkefninu til VTA, sérstaklega til GABAergic taugafrumna innan VTA, en D2R-MSNs verkefni ekki beint til VTA. Þessi hringrás þýðir að optogenetic virkjun D1R-MSN hemlar DA taugafrumum, sem endanlega eykur ávanabindandi hegðun af kókaíni (Bocklisch o.fl., 2013).

Þrátt fyrir að því er virðist einfalt skipulag þessara tveggja hópa MSN, þá staðreynd að MSN fá margfeldi aðföng og hafa mismunandi afköst frá / til annarra heila svæða, ásamt því að mynda staðbundnar brautir milli MSN og annarra flokka interneurons, sem leiðir af sér D1R- MSN og D2R-MSN geta leitt til flókinna og mismunandi afleiðinga af sameindum, frumum og atferli.

Áður hefur verið sýnt fram á að D2R stuðlar að breytingum á samstillingu sem framkallað var við afturköllun lyfja og þau styrkja bakslag kókaínleitar án þess að hafa áhrif á upphaf lyfjameðferðar eða lyfjaleit (Sim o.fl., 2013). Núverandi gögn okkar benda til þess að ljósmyndun á D2R-MSN í NAc leiði til minnkandi hreyfingar á basal hreyfingu. Lobo o.fl. (2010) uppgötvaði enga breytingu á hreyfingu þegar annað hvort MSN undirtegund var virkjuð, en þau skoðuðu aðeins heildar hreyfingarvirkni frekar en að kanna tafarlaus viðbrögð basal hreyfivirkni við ljósmyndun. Kravitz o.fl. (2010) fann einnig að optogenetic virkjun D2R-MSNs í ryggisstratum dregur einnig úr hreyfingu á hreyfingum. Þannig eru gögn okkar fyrstu til að sýna fram á að basal locomotor virkni er hindruð með photostimulation D2R-MSNs af NAc og þeir fyrstu til að skoða kerfisbundið tímaferli basal locomotor virkni við photostimulation þessara taugafrumna.

Í þessari rannsókn sáum við að optogenetic virkjun D2R-MSN í NAc hafði ekki áhrif á upphaf eða tjáningu á hegðunarnæmingu. Samt sem áður, ljóstillífun D2R-MSN á meðan á lyfjagjöf stóð yfir, ógnaði tjáningu ofnæmis af völdum kókaíns. Þess vegna benda gögn okkar til þess að D2R-MSN séu að ráða eitthvert merki sérstaklega á afturköllunartímabilinu sem heldur áfram að breyta genatjáningu eða annars konar merkjasendingum og koma þar af leiðandi af stað breytingum á synaptískri plastleika, sem leiðir til breytinga á hegðun næmi kókaíns. Ekki er vitað hvernig þessar MSN nota frumutegundaraðlögun sem getur haft afdrifaríkar afleiðingar þeirra í hegðunartengdum hegðun. Grueter o.fl. (2013) lagði til að ΔFosB í NAc breytir mismunandi aðgerðum á samstillingu og umbunartengdri hegðun á frumugerðar- og undirsvæðasértækum hætti. Nýlega, Chandra o.fl. (2013) greint frá því að endurtekin ChR2 örvun D1R-MSN en ekki D2R-MSN olli lækkun á Tiam1 geninu, próteini sem felur í sér að endurskipuleggja frumuvirkjun aktínsins, svipað og áhrif kókaíns. Þess vegna, til að skilja fyrirkomulag sem skila varanlegum áhrifum af völdum lyfja, er mikilvægt að afmarka frumusamhæfða framköllun sameindaatburða í þessum MSN sem stjórna aðlögun að aðlögun að endurteknum eiturlyfjum.

Í tengslum við endurtekna váhrif á lyfjum hefur verið lagt til að fráhvarf muni gegna mikilvægu hlutverki vegna þess að sumar breytingar birtast aðeins nokkrum vikum eftir lokaútsetningu fyrir kókaíni. Þetta bendir til þess að bindindi sé mikilvægur sáttasemjari við þróun plastlegheitanna (Robinson og Berridge, 2003; Boudreau og Úlfur, 2005; Boudreau o.fl., 2007; Kourrich o.fl., 2007). Þessar athuganir vekja möguleika á að afturköllunin sjálf gæti verið kveikjan að breytingunum á NAC sem eru undir stjórn D2R háðra merkja. Niðurstaða okkar sem sýnir að virkjun D2R-MSN í NAc við afturköllun lyfja hefur áhrif á hegðunarnæmingu af völdum kókaíns veitir sannfærandi stuðning við þessa hugmynd.

Það hefur áður verið sýnt fram á að ítrekuð útsetning fyrir streitu við afturköllun lyfja bælir tjáningu hegðunarnæmis af völdum kókaíns sem og kókaínsleitni og bakslagshegðun hjá D2R KO músum (Sim o.fl., 2013). Það er því athyglisvert að ljósmyndun á D2R-MSN við afturköllun lyfja dregur einnig úr ofnæmi. Streita af völdum synaptískrar plastleiki við glutamategic synapses er breytt í NAc D2R KO músanna (Sim o.fl., 2013). Þrátt fyrir að ekki sé enn vitað hvort ljóstillífun á D2R MSN eða langvarandi streitu á afturköllunartímabilinu vekur svipaðar breytingar á synaptískri plastleika, styðja núverandi niðurstöður tilgátu okkar að D2R-MSNs NAc gegni lykilhlutverki í afturköllun af völdum plastleiki og geti stuðlað að bakslag eftir að fíkniefnamisnotkun var hætt. Frekari rannsókna verður nauðsynleg til að finna út hagnýtur taugrásir þar sem D2R MSN taka þátt í afturköllun lyfja og til að greina og bera saman afleiðingar ljóstillits D2R-MSN og langvarandi streitu á synaptískan plastleika í þessari tilteknu hringrás.

Annað mögulegt hlutverk fyrir D2R-tjáandi MSN gæti verið að hindra afköst D1R-MSN frá NAc. Fyrri rannsóknir benda til þess að þrátt fyrir að MSN vísa löngum axonum að afskekktum markmiðum, gerist víðtæk skörun á milli axons veðra og dendritic trjáa í aðliggjandi kyrtil vörpun taugafrumum (Grofová, 1975; Preston o.fl., 1980; Wilson og Groves, 1980). Þetta gæti bent til hugsanlegs staðbundinnar tengingar fyrir MSN innan NAc. Upptök innanfrumna frá parum með spiny vörpun taugafrumum hafa bent á virkar hamlandi tengingar milli MSN í rottu striatum (Czubayko og Plenz, 2002; Tunstall o.fl., 2002; Koos o.fl., 2004; Gustafson o.fl., 2006). Einnig hefur verið greint frá því að samstillingar, sem myndast af endurteknum tryggingaröxlum MSN í striatum, eru ekki handahófi, D2R-MSN gera samstillingar tengingar bæði við önnur D2R-MSN og með D1R-MSN, en D1R-MSN mynda næstum eingöngu synaptísk tengsl við önnur D1R-MSNs (Taverna o.fl., 2008). Þrátt fyrir að greint hafi verið frá GABAergic samtengingu staðbundinna endurtekinna axonal collaterals milli uppsöfnunar MSNs (Taverna o.fl., 2004), enn er ekki ljóst hvort D2R-MSN mynda handahófskennt örrásir eða þær stuðla að örrásum í NA með ákjósanlegri tengingu eins og gerist í striatum. Gögn okkar benda til þess að D2R-MSN í NAc sem tjái ChR2 geri samstillingarleg tengsl við nálæg MSN sem tjá D1R og að D2R-MSN beiti síðan hamlandi snertingu við D1-MSN til að móta D1R-miðlaða kynningu á ávanabindandi hegðun.

Að lokum höfum við sýnt að optogenetic örvun NAc D2R-MSNs breytir plöntun vegna fráhvarfs sem verður við kókaínfíkn. Í ljósi þess að virkni D2R háðra merkjatöku á afturköllunartímabilinu virðist vera lykileftirlit með tjáningu á hegðunarnæmingu af völdum kókaíns, leggjum við til að D2R-MSN séu mikilvægur sáttamaður við langvarandi aðlögun vegna eiturlyfjaleitingar og afturhalds. Auðkenning sameinda hvarfefna D2R háðra merkja, ásamt auðkenningu á sértækum hringrás NAc D2R-MSN sem notuð eru við endurteknar váhrifalyf, ættu að bjóða upp á ný markmið um meðferðaraðgerðir við bakslag lyfja.

Hagsmunaárekstur

Höfundarnir lýsa því yfir að rannsóknirnar hafi farið fram án þess að viðskiptabundin eða fjárhagsleg tengsl gætu talist hugsanleg hagsmunaárekstur.

Acknowledgments

Þessi vinna var studd af National Research Foundation of Korea (NRF) styrk sem var styrkt af vísinda-, upplýsingatækni- og framtíðarskipulagi af heilarannsóknaráætluninni (til Ja-Hyun Baik; Styrk nr. 2013M3C7A1056101) og af lífeyris- og lækningatækni Þróunaráætlun (til Ja-Hyun Baik; Styrk nr. 2013M3A9D5072550) og World Class Institute (WCI) áætlun National Research Foundation of Korea (NRF) styrkt af vísinda-, upplýsingatækni- og framtíðarskipulagi (til George J. Augustine) ; WCI 2009-003), sem og af háskólastyrk frá Kóreu (til Ja-Hyun Baik) og CRP styrk frá National Research Foundation of Singapore (til George J. Augustine).

Meðmæli

  1. Baik JH (2013). Dópamín merki í launatengdri hegðun. Framhlið. Taugrásir 7: 152 10.3389 / fncir.2013.00152 [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Cross Ref]
  2. Baik JH, Picetti R., Saiardi A., Thiriet G., Dierich A., Depaulis A., o.fl. (1995). Parkinsonian-svipuð hreyfingarskerðing hjá músum sem skortir dópamín D2 viðtaka. Náttúra 377, 424 – 428 10.1038 / 377424a0 [PubMed] [Cross Ref]
  3. Berridge KC (2007). Umræðan um hlutverk dópamíns í umbun: málið vegna hvataheilsu. Psychopharmaology (Berl) 191, 391 – 431 10.1007 / s00213-006-0578-x [PubMed] [Cross Ref]
  4. Bock R., Shin JH, Kaplan AR, Dobi A., Markey E., Kramer PF, o.fl. (2013). Með því að styrkja óbeina óbeina leiðina eykst seigla gagnvart nauðungar kókaínnotkun. Nat. Neurosci. 16, 632 – 638 10.1038 / nn.3369 [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Cross Ref]
  5. Bocklisch C., Pascoli V., Wong JC, House DR, Yvon C., de Roo M., o.fl. (2013). Kókaín hindrar dópamín taugafrumur með því að auka GABA-sendingu á ventral tegmental svæðinu. Vísindi 341, 1521 – 1525 10.1126 / vísindi.1237059 [PubMed] [Cross Ref]
  6. Boudreau AC, Reimers JM, Milovanovic M., Wolf ME (2007). AMPA viðtaka frumna á yfirborði rottukjarna aukast við frásog kókaíns en innvortis eftir áreynslu kókaíns í tengslum við breytt virkjun mítógenvirkra próteinkínasa. J. Neurosci. 27, 10621 – 10635 10.1523 / jneurosci.2163-07.2007 [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Cross Ref]
  7. Boudreau AC, Wolf ME (2005). Hegðunarnæmi fyrir kókaíni tengist aukinni tjáningu AMPA viðtaka í kjarnanum. J. Neurosci. 25, 9144 – 9151 10.1523 / jneurosci.2252-05.2005 [PubMed] [Cross Ref]
  8. Chandra R., Lenz JD, Gancarz AM, Chaudhury D., Schroeder GL, Han MH, o.fl. (2013). Optogenetic hömlun D1R sem inniheldur kjarna accumbens taugafrumur breytir kókaín-miðluðu reglugerð Tiam1. Framhlið. Mol. Neurosci. 6: 13 10.3389 / fnmol.2013.00013 [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Cross Ref]
  9. Chang HT, Kitai ST (1985). Vörn taugafrumur kjarna accumbens: rannsókn á innanfrumuvökva. Brain Res. 347, 112 – 116 10.1016 / 0006-8993 (85) 90894-7 [PubMed] [Cross Ref]
  10. Chausmer AL, Elmer GI, Rubinstein M., Low MJ, Grandy DK, Katz JL (2002). Kókaínvöldum hreyfivirkni og mismunun kókaíns í dópamíni D2 viðtaka stökkbreyttum músum. Psychopharmaology (Berl) 163, 54 – 61 10.1007 / s00213-002-1142-y [PubMed] [Cross Ref]
  11. Chevalier G., Deniau JM (1990). Hömlun sem grunnferli við tjáningu fósturþroska. Þróun Neurosci. 13, 277 – 280 10.1016 / 0166-2236 (90) 90109-n [PubMed] [Cross Ref]
  12. Czubayko U., Plenz D. (2002). Fljótur samstilltur flutningur á milli taugafrumna frá stríði spiny. Proc. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin 99, 15764 – 15769 10.1073 / pnas.242428599 [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Cross Ref]
  13. Ferguson SM, Eskenazi D., Ishikawa M., Wanat MJ, Phillips PE, Dong Y., o.fl. (2011). Tímabundin taugahömlun sýnir andstæð hlutverk óbeinna og beinna ferla við næmingu. Nat. Neurosci. 14, 22 – 24 10.1038 / nn.2703 [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Cross Ref]
  14. Goto Y., Grace AA (2005). Dópamínvirka mótun á útlimum og barkstýringu kjarnaaðganga í markvissri hegðun. Nat. Neurosci. 8, 805 – 812 10.1038 / nn1471 [PubMed] [Cross Ref]
  15. Grofová I. (1975). Auðkenning á drepfæddum og brjósthimluðum taugafrumum sem verja til substantia nigra. Rannsóknarrannsókn með retrograde axonal flutningi á piparrót peroxidasa. Brain Res. 91, 286 – 291 10.1016 / 0006-8993 (75) 90550-8 [PubMed] [Cross Ref]
  16. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC (2013). Δ FosB mótar mismunandi aðgerðir kjarna accumbens beina og óbeina ferli. Proc. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin 110, 1923 – 1928 10.1073 / pnas.1221742110 [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Cross Ref]
  17. Gustafson N., Gireesh-Dharmaraj E., Czubayko U., Blackwell KT, Plenz D. (2006). Samanburðarspenna og straum-klemmagreining á endurgjöf og framsæknum synaptískum sendingum í ristil örrásinni in vitro. J. Neurophysiol. 95, 737 – 752 10.1152 / jn.00802.2005 [PubMed] [Cross Ref]
  18. Hikida T., Kimura K., Wada N., Funabiki K., Nakanishi S. (2010). Greinileg hlutverk samskiptasendinga í beinum og óbeinum stríðsleiðum til að umbuna og andstyggilegri hegðun. Neuron 66, 896 – 907 10.1016 / j.neuron.2010.05.011 [PubMed] [Cross Ref]
  19. Kalivas PW, Duffy P. (1990). Áhrif bráðrar og daglegrar kókaínmeðferðar á utanfrumu dópamín í kjarnanum. Synapse 5, 48 – 58 10.1002 / syn.890050104 [PubMed] [Cross Ref]
  20. Kalivas PW, Pierce RC, Cornish J., Sorg BA (1998). Hlutverk fyrir næmingu í þrá og afturför í kókaínfíkn. J. Psychopharmacol. 12, 49 – 53 10.1177 / 026988119801200107 [PubMed] [Cross Ref]
  21. Koos T., Tepper JM, Wilson CJ (2004). Samanburður á IPSC-lyfjum sem framkallaðust með spiny og hratt-toppandi taugafrumum í neostriatum. J. Neurosci. 24, 7916 – 7922 10.1523 / jneurosci.2163-04.2004 [PubMed] [Cross Ref]
  22. Kourrich S., Rothwell PE, Klug JR, Thomas MJ (2007). Kókaín reynsla stýrir samstillingarplastleika í báða áttina í kjarnanum. J. Neurosci. 27, 7921 – 7928 10.1523 / jneurosci.1859-07.2007 [PubMed] [Cross Ref]
  23. Kravitz AV, Freeze BS, Parker PR, Kay K., Thwin MT, Deisseroth K., o.fl. (2010). Reglugerð á mótorhegðun parkinsonian með optogenetic stjórnun á basal ganglia rafrásum. Náttúra 466, 622 – 626 10.1038 / nature09159 [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Cross Ref]
  24. Kravitz AV, Tye LD, Kreitzer AC (2012). Greinileg hlutverk fyrir beina og óbeina ferli striatal taugafrumna í styrkingu. Nat. Neurosci. 15, 816 – 818 10.1038 / nn.3100 [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Cross Ref]
  25. Kreitzer AC, Malenka RC (2008). Striatal plasticity og basal ganglia circuit function. Náttúra 60, 543 – 554 10.1016 / j.neuron.2008.11.005 [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Cross Ref]
  26. Le Moine C., Bloch B. (1996). Tjáning D3 dópamínviðtaka í peptidergic taugafrumum í kjarna accumbens: samanburður við D1 og D2 dópamínviðtaka. Taugavísindi 73, 131 – 143 10.1016 / 0306-4522 (96) 00029-2 [PubMed] [Cross Ref]
  27. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D., Friedman AK, Sun H., Damez-Werno D., o.fl. (2010). Sértækt tap frumna á BDNF merkjum líkir eftir myndunarvaldi á kókaínlaun. Vísindi 330, 385 – 390 10.1126 / vísindi.1188472 [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Cross Ref]
  28. Lobo MK, Nestler EJ (2011). Jafnvægisaðgerðir á fæðingu í eiturlyfjafíkn: sérstök hlutverk beinna og óbeinna miðlungs spýta taugafrumna. Framhlið. Neuroanat. 5: 41 10.3389 / fnana.2011.00041 [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Cross Ref]
  29. Lüscher C., Malenka RC (2011). Lyfja-vaktur synaptic plasticity í fíkn: frá sameindabreytingum í hringrás endurgerð. Neuron 69, 650 – 663 10.1016 / j.neuron.2011.01.017 [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Cross Ref]
  30. O'Donnell P., Grace AA (1993). Lífeðlisfræðilegir og formfræðilegir eiginleikar accumbens kjarna- og skeltaugafrumna skráðir in vitro. Synapse 13, 135 – 160 10.1002 / syn.890130206 [PubMed] [Cross Ref]
  31. Pascoli V., Turiault M., Lüscher C. (2011). Afturköllun á synaptískri aukningu kókaíns endurstilla aðlögunarhegðun vegna lyfja. Náttúra 481, 71 – 75 10.1038 / nature10709 [PubMed] [Cross Ref]
  32. Preston RJ, Bishop GA, Kitai ST (1980). Miðlungs spiny taugafrumvörp frá rottum taugakerfi: rannsókn á peroxidasa í piparfrumum. Brain Res. 183, 253 – 263 10.1016 / 0006-8993 (80) 90462-x [PubMed] [Cross Ref]
  33. Robinson TE, Berridge KC (1993). Taugagrundvöllur lyfjaþrá: hvatningarofnæmiskenning um fíkn. Brain Res. Brain Res. Séra 18, 247 – 291 10.1016 / 0165-0173 (93) 90013-p [PubMed] [Cross Ref]
  34. Robinson TE, Berridge KC (2003). Fíkn. Annu. Séra Psychol. 54, 25 – 53 10.1146 / annurev.psych.54.101601.145237 [PubMed] [Cross Ref]
  35. Schmidt HD, Pierce RC (2010). Taugaaðlögun af völdum kókaíns í glútamatsendingu: hugsanleg meðferðarmarkmið fyrir þrá og fíkn. Ann. NY Acad. Sci. 1187, 35 – 75 10.1111 / j.1749-6632.2009.05144.x [PubMed] [Cross Ref]
  36. Sesack SR, Grace AA (2010). Cortico-basal ganglia umbunanet: örrásir. Neuropsychopharmology 35, 27 – 47 10.1038 / npp.2009.93 [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Cross Ref]
  37. Sim HR, Choi TY, Lee HJ, Kang EY, Yoon S., Han PL, o.fl. (2013). Hlutverk dópamín D2 viðtaka í mýkt vegna ávanabindandi hegðunar af völdum streitu. Nat. Kommún. 4: 1579 10.1038 / ncomms2598 [PubMed] [Cross Ref]
  38. Smith RJ, Lobo MK, Spencer S., Kalivas PW (2013). Aðlögun af völdum kókaíns sem framkallað er í D1 og D2 uppskeru taugafrumum (tvísýni er ekki endilega samheiti við beinar og óbeinar brautir). Curr. Opin. Neurobiol. 23, 546 – 552 10.1016 / j.conb.2013.01.026 [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Cross Ref]
  39. Steketee JD, Kalivas PW (2011). Vímuefnaleysi: hegðun næm og að baki við hegðun í leit að lyfjum. Pharmacol. Séra 63, 348 – 365 10.1124 / pr.109.001933 [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Cross Ref]
  40. Taverna S., Ilijic E., Surmeier DJ (2008). Endurteknar tryggingatengingar á miðlægum, spiny taugafrumum eru truflaðar í líkön af Parkinsonsveiki. J. Neurosci. 28, 5504 – 5512 10.1523 / JNEUROSCI.5493-07.2008 [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Cross Ref]
  41. Taverna S., van Dongen YC, Groenewegen HJ, Pennartz CM (2004). Beinar lífeðlisfræðilegar vísbendingar um tengslamyndun milli meðalstórra, spiny taugafrumna í rottum kjarna accumbens á staðnum. J. Neurophysiol. 91, 1111 – 1121 10.1152 / jn.00892.2003 [PubMed] [Cross Ref]
  42. Thomas MJ, Kalivas PW, Shaham Y. (2008). Taugakerfi í mesólimbískum dópamínkerfum og kókaínfíkn. Br. J. Pharmacol. 154, 327 – 342 10.1038 / bjp.2008.77 [PMC ókeypis grein] [PubMed] [Cross Ref]
  43. Tunstall MJ, Oorschot DE, Kean A., Wickens JR (2002). Hamlandi milliverkanir milli spiny vörpun taugafrumna í rottu striatum. J. Neurophysiol. 88, 1263 – 1269 10.1152 / jn.00886.2001 [PubMed] [Cross Ref]
  44. Vanderschuren LJ, Kalivas PW (2000). Breytingar á dópamínvirkum og glútamatergískum smiti við framkalla og tjáningu hegðunarnæmingar: gagnrýnin endurskoðun á forklínískum rannsóknum. Psychopharmaology (Berl) 151, 99 – 120 10.1007 / s002130000493 [PubMed] [Cross Ref]
  45. Wilson CJ, Groves PM (1980). Fín uppbygging og synaptísk tenging á sameiginlega spiny taugafrumum rotta neostriatum: rannsókn þar sem notað er innspýting í innanfrumu af piparrótperoxídasa. J. Comp. Neurol. 194, 599 – 615 10.1002 / cne.901940308 [PubMed] [Cross Ref]
  • Vitur RA (2004). Dópamín, nám og hvatning. Nat. Séra Neurosci. 5, 483 – 494 10.1038 / nrn1406 [PubMed] [Cross Ref]