Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2011 Apríl; 300 (4): R876 – R884.
Birt á netinu 2011 Feb 9. doi: 10.1152 / ajpregu.00655.2010
PMCID: PMC3075076
1,2 Abstract
Við höfum áður greint frá því að gjöf insúlíns í boginn kjarna undirstúkunnar dregur úr hvata fyrir súkrósa, metin með sjálfstjórnunarverkefni, hjá rottum. Þar sem mynstur miðtaugakerfis (CNS) örvunar í tengslum við sjálfsstjórnun súkrósa hefur ekki verið metið, í þessari rannsókn mældum við tjáningu c-Fos sem vísitölu fyrir örvun taugafrumna. Við þjálfuðum rottur í bar-press fyrir súkrósa, í samræmi við fast-hlutfall (FR) eða framsækið hlutfall (PR) áætlun og kortlagði tjáningu c-Fos ónæmisvirkni í miðtaugakerfinu, samanborið við c-Fos tjáningu í meðhöndluðum stjórntækjum. Við sáum einstaka tjáningu c-Fos í miðlægum undirstúku (bogadregnum, miðlægum, retrochiasmatic, dorsomedial og ventromedial kjarna) í tengslum við upphaf PR frammistöðu og tjáningu c-Fos í hlið undirstúku og rúmkjarna. af stria terminalis í tengslum við upphaf FR frammistöðu. tjáningu c-Fos jókst í kjarnaaðildum bæði FR og PR rottna. Rannsókn okkar leggur áherslu á mikilvægi bæði hypothalamic orkuþéttnibrautar og limbískra hringrásar við framkvæmd matarlaunverkefnis. Í ljósi hlutverks miðgildi undirstúku við stjórnun orkujafnvægis bendir rannsókn okkar til þess að þetta rafrásir geti stuðlað að umbun reglugerðar í stærra samhengi orkunotkunar.
Mesolimbic dopaminergic (DA) rafrásir, þar með talið ventral tegmental area (VTA) og spár á striatum og cortical staði, hafa verið greindar gegna mikilvægu hlutverki í hvetjandi eða umbunandi þáttum fjölmargra flokka misnotkunarlyfja (13, 22-24, 26, 48). Nýlegar rannsóknir frá rannsóknarstofu okkar og annarra benda til þess að þessi rafrásir spili að sama skapi stórt hlutverk í hvetjandi eða gefandi þáttum matarins. Tilkynnt er um virkni og líffærafræðileg samskipti við rafrásir sem stjórna stöðugleika í orku með skýrslum um mótun matarlauna eftir næringarástandi dýra (10, 14, 16, 43). Breytingar á umbun, þ.mt mat umbun, eftir næringar- eða efnaskiptaáhrifum, eru sterkar undir áhrifum frá taugum og innkirtlum, þ.mt insúlíni (15), leptín (11, 18, 21, 30, 32), ghrelin (35), melanín-styrkjandi hormón (MCH) (45) og orexin (5, 7): Tilvist viðtaka, lífefnafræðileg og frumuvirkni og in vivo eða hegðunarvirkni þessara merkja í miðtaugakerfinu (CNS) hefur verið sýnt mikið á undanförnum árum.
Sýnt hefur verið fram á að útvíkkuðu rafrásirnar hafa aukið hlutverk í fóðrun og umbun matar (2, 19, 28). Hins vegar eru fleiri sem stuðla að miðtaugakerfi. Athygli vekur að hliðar undirstúkan (LH) hefur lengi verið þekkt fyrir að vera staður sem miðlar fóðrun og sjálfsörvunarhegðun (4, 31). Orexinergic taugafrumur og leptínmerki í LH hafa verið skilgreind sem mikilvæg fyrir fóðrun og matarlaun (5, 29, 30). Við sáum nýlega að insúlín sem gefið var annað hvort í þriðja heila slegilinn eða í boginn kjarna undirstúkunnar (ARC) gæti dregið úr sjálfsstjórnun súkrósa, en gjöf insúlíns í VTA eða nucleus accumbens hafði engin áhrif á þessa sérstöku umbunar hugmyndafræði (15). Þannig virðist sem margar hypothalamic staður geta spilað verulegt hlutverk í hvatningu til matarleitar og öflunar, og í samræmi við þetta myndi maður kenna að hypothalamic svæði séu virkilega virk í tengslum við sjálfstjórnun matvæla. Til að byrja að prófa þessa tilgátu höfum við kortlagt tjáningu C-Fos í miðtaugakerfinu hjá rottum sem hafa verið þjálfaðar í súkrósa sjálfstjórnunaráætlun, eftir föstum hlutföllum (FR) þjálfun, eða eftir stigvaxandi hlutföll (PR) þjálfun, strangara verkefni til að meta hvata (20).
EFNI OG AÐFERÐIR
Efni.
Einstaklingar voru Albino rottur (325–425 g) karlkyns frá Simonsen (Gilroy, CA). Rottum var haldið á chow ad libitum. Þeim var haldið í 12: 12 klst ljós-dökkum hringrás með ljósin kveikt á 6 AM og voru þjálfaðir og prófaðir á milli 7 AM og hádegi, í ástandi eftir máltíð og eftir aðdráttarafl. Allar aðgerðir sem gerðar voru á rottunum fylgdu leiðbeiningum heilbrigðisstofnunarinnar um umönnun dýra og voru samþykktar af undirnefnd nefndarinnar um rannsóknir og þróun hjá VA Puget Sound Health Care System.
Sjálfsstjórnun súkrósa.
Aðferðir voru byggðar á útgefinni aðferðafræði okkar (15) og voru framkvæmdar á fóðruðum rottum. Tilraunin náði til þriggja áfanga: sjálfskipting til að hefja þjálfun, FR þjálfun og framsækin hlutföll (PR) þjálfun með því að nota PR reiknirit Richardson og Roberts (38). PR reikniritið krefst 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, 251, 331, 437, 575, 759, 999, 999, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX o.fl.) stangarpressur til að ná árangri í verðlaunum innan þings (38). Rottur voru þjálfaðar í að gefa sjálfan 5% súkrósa (0.5 ml umbun) skilað í ílát með vökvadropi. Aðgerðarkassarnir, stjórnaðir af Med Associates (Georgia, VT) kerfinu, höfðu tvær stangir, en aðeins ein stöng (virk, útdraganleg stöng) virkjaði innrennslisdælu. Ýtt var á hina stöngina (óvirk, kyrrstöng). Eins og áður hefur komið fram var fjöldi pressna á óvirku stönginni mjög lágur (minna en 10 pressar / lota). Súkrósa lausnin var afhent í ílát fyrir vökvadropa til inntöku (Med Associates, St. Albans, VT). Grunnþjálfun var gerð á 1-klst lotum undir stöðugu styrkingartímabili (FR1: hver stöngpressa var styrkt). Hver lota hófst með því að setja virku lyftistöngina í og lýsing á hvítu húsaljósi sem stóð áfram allan fundinn. Tónn 5-s (2900 Hz, 20 dB fyrir ofan bakgrunn) og ljós (7.5 W hvítt ljós fyrir ofan virka stöngina) stakur samsettur bending fylgir hverri umfjöllun um afhendingu, með 20-tíma fresti sem byrjar með súkrósa afhendingu. FR þjálfun var gerð í 10 daga; stöðugt svar er náð á fimmta þinginu. PR þjálfun var framkvæmd í hámarks mögulega 3 klst. / Dag í 10 daga. PR fundum lauk eftir að 30 mín. Af því að engin virk stöng ýttu á svör við, á þeim tímapunkti var slökkt á húsljósinu sjálfkrafa og virku stönginni dregin til baka; rottur voru teknar út úr hólfunum og fluttar aftur í búr þeirra. „Stopptími“ greint frá í Tafla 2 táknar þann tíma sem slökkt var á kerfinu; því hefði síðasti virki stöngvapressan átt sér stað 30 mín fyrir stopptímann. Hegðunargögn (Tafla 2) tákna meðaltöl fundur 6-10 fyrir FR þjálfun, og fundur 1-9 fyrir PR þjálfun. Rottur sem voru meðhöndlaðar með stjórn voru teknar úr húsrýminu og settar í hreint skurðstofu með húsljós í 60 mín., Innan aðferðarherbergisins, til að líkja eftir meðhöndlun og herbergjareynslu rottanna sem gefa sjálfan sig súkrósa. Þeim var ekki gefið neitt að borða eða drekka meðan þeir voru í rekstraröskunum og höfðu engan aðgang að stangir.
Á lokadeginum voru rottur settar í hólfin eins og á æfingadögum og þeim var haldið í hólfunum í 90 mínútur, eftir það voru þær fjarlægðar, til svæfingar, perfusion og síðari ónæmisfræðiefnafræði. Samanburðarrottur voru sömuleiðis færðar inn í aðgerðasalinn og geymdar í hreinu aðgerðaklefa, eins og á æfingadögum, í 90 mínútur og síðan voru þeir svæfðir og fylltir. Strax í kjölfar síðustu 90 mínútna lotunnar voru rottur svæfðir djúpt með innöndun ísóflurans og þeir perfundaðir með 0.9% NaCl og síðan kalt 4% paraformaldehýðlausn. Tímasetning svæfingar og líknardráps var byggð á þekktu tímaferli hátjáningar á c-Fos próteini 90-120 mín eftir atburðinn. Þannig myndi c-Fos tjáning endurspegla virkjun CNS við upphaf hegðunarverkefnisins, frekar en að vera afleiðing þess að dýrin upplifðu verkefnið og fengu súkrósa. Heilinn var fjarlægður og eftir fastur í paraformaldehýði í nokkra daga; síðan voru þeir settir í 20% súkrósa-PBS, eftir það voru þeir settir í 30% súkrósa-PBS lausn. Heilinn var skorinn á cryostat (Leica CM 3050S cryostat) til ónæmisfræðiefnafræði.
c-Fos ónæmisheilbrigðafræði og magngreining.
Við notuðum viðurkennda aðferðafræði okkar til að magngreina c-Fos prótein í heilaþáttum (12). Upphaflegur eigindlegur skjár allan heilann var gerður fyrir c-Fos tjáningu. 12-μm kransæðahlutar með rennilásum voru renndir 3 sinnum í PBS (Oxoid, Hampshire, Bretlandi). Hlutum var síðan lokað fyrir 1 klst. Við stofuhita í PBS sem innihélt 5% venjulegt geita- eða asnasermi. Þáttum var síðan þvegið margfalt í PBS og ræktað yfir nótt við 4 ° C í frum mótefnalausnum sem gerðar voru upp í PBS. Þáttum voru þvegnar þrisvar í PBS og síðan ræktaðar út í myrkrinu við stofuhita í annarri mótefnalausn sem gerð var upp í PBS fyrir 1 klst. Þáttum var síðan þvegið aftur í PBS og komið fyrir og hlífinni rennt í festingarmiðil Vectashield harðsætis (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Stafrænar myndir af hlutum voru aflað með Nikon Eclipse E-800 flúrljómun smásjá sem var tengt við Optiphot myndavél og með Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) hugbúnaði.
Í kjölfarið lögðum við áherslu á takmarkaðan fjölda svæða sem sýndu greinilegan mun á skilyrðum, til magngreiningar og fyrir svipgerð á taugafrumum. Sérstaklega einbeittum við okkur að kjarna og skel kjarna og skeljar (NAc); fremri og aftari rúmkjarni stria terminalis (aBNST, pBNST); miðgildi undirstúku svæða [slegils í miðlægum miðjum (VMH), undirliðs undirstúku (DMH), miðtaugakjarni (PVN), retrochiasmatic area (RCh), og ARC]; hliðar undirstúku (LH), þar með talið hross- og legslóðir og Kaliforníu (peF) svæðið; VTA; heila stilkur [óæðri ólífuolía, hypoglossal (nXII) kjarninn í einangrunarkjarna, hliðarfrumukjarni og C1 / A1 adrenalín / noradrenalínkjarnar]. 12-μm hlutar frá Atlas voru metnir með tilliti til c-Fos tjáningar og magngreiningar í samsvarandi köflum og svæðum, byggð á atlasi Paxinos og Watson (34). Vinsamlegast sjáðu Tafla 1 fyrir sérstök staðalímörk hnit. Aðal áhersla greininganna var að bera saman hvert atferlisverkefni við viðkomandi stjórnun (PR vs. PRC; FR vs. FRC). Til að hámarka mögulegan mismun byggða á hegðun og samanburðaraðstæðum voru hámarki flytjenda úr PR og FR hópunum valdir til greiningar. Þannig voru 4 / 12 PR og 3 / 12 FR rottur greindar: Þessar rottur voru með virkan stangarpressunúmer (aðal atferlisendapunktur) sem var meira en eitt staðalfrávik yfir meðaltali fyrir viðkomandi hegðunarhóp. Einnig var greint frá undirflokki samanburðarrottna (5 PRC og 3 FRC rottur, sem var til staðar í aðferðarherberginu á sama tíma og FR eða PR rotturnar). Viðbótarhópur þriggja rottna var tekinn í gegnum FR málsmeðferðina („FRext“) til að líkja eftir aukinni lengd PR aðferðarinnar (þ.e. í samtals 20 daga, þar sem PR rottur eru teknar í gegnum FR og síðan PR) til að meta hvort munur á FR og PR var vegna hegðunarverkefnis eða tímalengdar aðgerðar. FRext gáfur voru ekki greindar og skimaðar kerfisbundið, en sérstök svæði sem vekur áhuga voru greind með hinum fjórum hópunum, til að gera kleift að bera saman magn, eins og tilgreint var sérstaklega í niðurstöðum.
Til magngreiningar (við 40 × stækkun) voru atlas-samsvarandi svæði valin. ImagePro Plus hugbúnaður (Media Cybernetics) var notaður til að taka mynd af viðkomandi svæði. Svæði var afmarkað til talninga og sett var þröskuldur fyrir jákvæða frumutalningu. Sama svæði og bakgrunnur (þröskuldur) var notaður fyrir hluta úr viðkomandi tilraunahópum og talning hugbúnaðar á jákvæðum frumum (magngreining) var framkvæmd á sömu lotu fyrir alla tilraunahópa til að koma í veg fyrir breytingar milli funda í bakgrunnsstillingu. Til tölfræðilegrar greiningar voru tölur aðeins teknar úr einstökum rottum ef samsvarandi eða heill hluti um hvert svæði (eins og skilgreint er í Tafla 1) voru í boði; gögn fyrir tiltekið svæði voru ekki tekin úr rottum ef ófullkomin tvíhliða framsetning var fyrir það svæði.
Eigindleg tvímerkt ónæmisflúrljómagreining.
Heilaskurðir voru teknir úr rottunum þar sem c-Fos var magnaður, fyrir tvöfalt merkt ónæmisfræðiefnafræði. Vegna þess að við vildum ekki trufla hegðun frammistöðu dýranna voru þau ekki meðhöndluð með colchicine í því skyni að hámarka sjón á peptíð taugaboðefnum. Þess vegna var sjón af taugafrumugerðum virkjuðum í tengslum við sjálfsumsýsluverkefnið takmörkuð. Til að hefja mat á svipgerðum virkra taugafrumna á fjölda miðtaugakerfa voru stafrænar myndir (fengnar eins og lýst er í kaflanum hér að ofan) teknar með stækkun 20 ×, 40 × eða 60 × (eins og fram kemur í myndsögunum) . Tvöföld litunaraðferð fyrir glútamat dekarboxýlasa (GAD), týrósín hýdroxýlasa (TH), CRF, taugapeptíð Y (NPY), Agouti-tengt peptíð (AgRP) og tryptófan hýdroxýlasa var sambærileg við greiningu á c-Fos ónæmisvirkni eiga, nema að blanda af c-Fos-Ab og einu af hinum aðal mótefnum var notuð við ræktun á einni nóttu við 4 ° C; sömuleiðis voru bæði efri mótefni í sömu lausn og ræktuð í 1 klst í myrkri við stofuhita. 20 mín 50% etanólþvottur fyrir hindrunarskrefið var notaður við orexínprófið. Fyrstu hagræðingarprófanir voru gerðar til að ákvarða viðeigandi þynningu á aðal mótefnum. Aðal mótefni sem notuð voru voru kanína and-c-Fos (1: 500) (sc-52) og mús and-c-Fos (1: 800) (bæði frá Santa Cruz líftækni, Santa Cruz, CA); andstæðingur-GAD músa (1: 1,000), and-týrósín hýdroxýlasa músa (1: 500) og and-tryptófan hýdroxýlasa úr sauðfé (allt frá Chemicon, Temecula, CA); kanína gegn CRF (1: 500) (gjöf frá Dr. Wylie Vale, Salk Institute, CA); kanína gegn NPY (1: 1,000), kanína gegn AGRP (1: 1,000) og geitum gegn orexíni A (1: 5,000) allt frá Phoenix Pharmaceutical (St. Joseph, MO). Önnur mótefni sem notuð voru voru Cy3-samtengt geita andstæðingur-kanína eða and-mús (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA), Alexa Fluor 488 geit and-mús eða and-kanína eða asni and-sauð IgG (Molecular Probes, Eugene, OR) ; öll efri mótefni voru þynnt við 1: 500. c-Fos / MCH tvöföld ónæmislitun var greind í röð; í fyrsta lagi fyrir MCH (1: 2,500 aðal mótefni, Millipore) með Alexa-488-geita and-kanínu (1: 500) efri mótefni. Rennibrautir voru aftur læstar með 5% venjulegu geitasermi og litaðar fyrir and-c-Fos (1: 500) og cy3-geitar and-kanínu sem aukamótefni. 20 mín 50% etanólþvottur fyrir hindrunarþrepið var notaður við MCH prófunina.
Tölfræðilegar greiningar.
Hópgögn eru kynnt sem meðaltæki ± SE í texta, töflum og tölum. Mikilvægi er skilgreint sem P ≤ 0.05. Tölfræðilegur samanburður er gerður á milli tilraunahópa (FR á móti PR) eða milli tilraunahópa og samsvarandi viðmiðunar (PR á móti PRC; FR á móti FRC) með ópöruðum námsmanni t-próf. Pearson fylgnistuðlar milli virkra lyftistykkja og c-Fos tjáningar á mismunandi heilasvæðum, sem og fylgni c-Fos tjáningar milli ýmissa heila svæða við sömu tilraunaaðstæður, voru reiknuð með StatPlus: mac LE tölfræðilegu greiningaráætluninni fyrir útgáfu Mac OS 2009 af AnalystSoft. Við prófuðum hvort línuleg fylgni (Pearson's R tölfræði) á milli c-Fos tjáningar á mismunandi CNS svæðum. Við skoðuðum einnig fylgni milli tjáningar c-Fos á mismunandi virkjuðum miðtaugasvæðum og hegðun. FR og PR gögn frá rottum, sem c-Fos magn var framkvæmd fyrir, voru notuð við þessar fylgni.
NIÐURSTÖÐUR
c-Fos magn.
Eins og áður hefur komið fram var fjöldi virkra stangarþrýstings verulega meiri fyrir PR eða FR frammistöðu (Tafla 2), og fjöldi verðlauna súkrósa var meiri við FR frammistöðu. Lengd lotu PR PR-rottanna var um það bil 90 mín. (Stöðvunartími - 30). Tafla 3 er listi yfir c-Fos ónæmisaðgerðafjölda á öllum miðtaugakerfissvæðum þar sem magn var framkvæmt. Mynstur c-Fos tjáningar fyrir FR og PR rotturnar er dregið saman í Fig. 1. Veruleg virkjun var á miðlægum undirstúku (MH)Tot, samsettur af ARC, PVN, RCh, DMH og VMH) af rottum sem starfa við PR lyftistöng til að ýta á súkrósa, en engin heildarvirkjun hjá rottum sem stunda FR-stöngina ýta á súkrósa, samanborið við viðkomandi stjórntæki. Innan miðgildi undirstúku PR-rottna fór þessi örvun fram í PVN, ARC og VMH (Fig. 2). FR lyftistöng ýtt, en ekki PR lyftistöng, tengdist verulegri virkjun innan LH (byggði aðallega á virkjun innan Kaliforníu svæðisins). Báðir virkir stangarpressar og undirstúku c-Fos tjáning voru sambærilegir milli FRext og FR hópa (MHTot, 946 ± 26 og 911 ± 118; ARC, 176 ± 18 og 186 ± 10; LHTot, 468 ± 79 og 378 ± 34; LHpeF, 200 ± 31 og 173 ± 15, hver um sig), sem bendir til þess að munurinn á tjáningarmynstri milli FR og PR hópa tengist ekki lengd þjálfunar / reynslu heldur eðli tækniaðferðar. Hjá FR hópnum var marktæk aukning á tjáningu c-Fos í BNST, bæði hjá aBNST og pBNST. Bæði FR og PR lyftistöng voru tengd aukinni c-Fos ónæmisbælandi taugafrumum í NAc skelinni; talningu c-Fos var aukin verulega í NAc kjarna frá rottum sem fengu að þrýsta á FR lyftistöng, með ómerkilegri stefnu í átt til aukinnar tjáningar á c-Fos hjá rottum sem fengu PR pressustöng. c-Fos var ekki aukið í VTA með PR-verkefninu, þó að fram hafi komið ómerkileg þróun í átt að aukningu með FR-verkefninu. Að lokum var c-Fos marktækt aukið í blóðþrýstingslækkun (kraníug taugar XII) í heila stilkur rottna sem voru þjálfaðir í PR, en ekki fyrir FR.
c-Fos tjáning sást á öðrum miðtaugakerfissvæðum, þar á meðal amygdala og heilabarki (Fig. 3). Samt sem áður var vart við tjáningu bæði í stjórnunaraðstæðum sem og í tengslum við PR og FR verkefni sem bentu til þess að ósértækir þættir aðferðarinnar (meðhöndlun, flutningur inn í aðferðarherbergið) gætu hafa valdið þessari virkjun. Ekki var framkvæmt magn á þessum svæðum. Sömuleiðis sást örvun innan heila stofnasvæða önnur en nXII, en átti sér stað í tengslum við bæði stjórnunar- og verkefnatengd skilyrði, sem bendir einnig til hlutverks í ósértækri örvun eða virkjun hegðunar.
Við prófuðum hvort fylgni væri á milli tjáningar c-Fos á mismunandi miðtaugasvæðum. Með því að sameina gögn frá hnappi sem þrýsta á lyftistöng fundum við neikvæða fylgni milli tjáningar c-Fos í LH og VMH; þannig að virkjun VMH tengdist minni heildar virkjun LH (Pearson's R, −0.7986; t = -3.7534; P = 0.0056). Einnig sáum við verulega jákvæða fylgni á milli tjáningar c-Fos í hverfi LH og VTA (Pearson's R, 0.7772; t = 3.493; P = 0.0082), í samræmi við þekkt monosynaptic tengsl milli þessara tveggja svæða (sjá umfjöllun í Refs. 2 og 13). Við fundum verulega neikvæða fylgni milli tjáningar c-Fos í VTA samanborið við NAc-skel, hvort sem prófað var sérstaklega fyrir árangur FR (Pearson's R, −0.9262; t = -4.9125; P = 0.008) eða fyrir PR flutning (Pearson's R, −0.9897; t = -9.7624; P = 0.0103), í samræmi við þekkt gagnkvæm inngang milli stríðslögsvæða til substantia nigra og VTA (2, 13). Við prófuðum einnig hvort fylgni væri á milli tjáningar c-Fos á mismunandi svæðum í miðtaugakerfi og hegðunar. Með því að sameina gögn frá hópum sem ýttu á lyftistöng, sáum við verulega jákvæða fylgni milli c-Fos í ARC og virkum lyftistöngum (Pearson's R, 0.8208; t = 3.8017; P = 0.0067).
Auðkenning taugafrumna virkjuð með súkrósainntöku og hvatning fyrir súkrósa.
Í heila stofninum sýndu c-Fos-jákvæðir taugafrumur ekki jákvætt ónæmislyf fyrir TH, takmarkandi ensím fyrir epinefrín og noradrenalín (og dópamín); þess vegna virtust þessar katekólamínvirku taugafrumur ekki vera gerðar virkar með FR eða PR verkefnum. Hins vegar sýndu nokkrar c-Fos-jákvæðar taugafrumur jákvætt ónæmislækkun fyrir tryptófanhýdroxýlasa, sem benti til þess að fjöldi serótónín taugafrumna væri virkur. Eins og sést á Fig. 4, í ARC, voru c-Fos-jákvæðir frumulíkamir umkringdir AGRP-lituðum trefjum og svipað mynstur fyrir NPY trefjar / c-Fos ónæmisþéttingu sást (ekki sýnt). Í PVN virtust c-Fos-jákvæðir taugafrumur umkringja CRF-jákvæðar taugafrumur, en engin colocalization sást (gögn ekki sýnd). Fig. 5 sýnir ónæmisþéttingu fyrir bæði orexin og MCH í LH. Orexin taugafrumur fundust bæði í dLH og peLH. Þrátt fyrir að við fylgjumst með MCH-jákvæðum taugafrumum í peLH, þá var í meginatriðum engin kölnun með c-Fos á því svæði í LH. Hins vegar sáum við c-Fos colocalization í orexin-jákvæðum taugafrumum innan peLH (Fig. 6, efst), og mjög takmörkuð c-Fos nýtingu með MCH í vLH (Fig. 6, botn). Rétt er að leggja áherslu á að bæði staðsetning og samlokun með c-Fos má vanmeta fyrir peptíð taugaboðefnin eins og CRH vegna þess að rottur voru ekki meðhöndlaðar með colchicini. Að lokum, innan kjarnans accumbens kjarna og skeljar (Fig. 7), c-Fos samtímis að þéttast við GAD, tilbúið ensím fyrir taugaboðefnið GABA, bæði fyrir FR og PR rottur. Það var öflug litun fyrir TH innan VTA; þó sáust sjaldan c-Fos jákvæðar taugafrumur og virtust ekki einvörðungu nýta sér stað við TH.
Umræða
Í núverandi rannsókn notuðum við tjáningu strax snemma gensins, c-Fos, til að meta munstur bráðrar örvunar miðtaugakerfis sem tengist upphafsstýringu á virkni súkrósa með sjálfstjórnun, annað hvort sem tiltölulega krefjandi verkefni (FR) eða smám saman meira krefjandi verkefni sem var hugsað til að endurspegla áhugasama leit að umbun, svo sem súkrósa, og taka sterklega þátt í útlimum hringrásum (22, 24, 49) (PR). Mismunandi virkjunarmynstur var mismunandi á milli verkefnanna tveggja, þar sem LH / limbic örvun ríkti aðallega í FR verkefninu og medial hypothalamic / limbic örvun aðallega í PR verkefninu (sjá Fig. 1). Það eru nokkrar mögulegar ástæður fyrir þessu. Í fyrsta lagi gætu þessar hugmyndafræði „kortlagt“ sem eðlisfræðilega ólíka reynslu í miðtaugakerfinu. Rottur, sem eru þjálfaðir í frammistöðu FR, áttu von á auðveldri, mikilli umbun. Að búast við gefandi fæðu ætti að hafa mikil áhrif á c-Fos mynstrið sem sést hjá FR rottunum. Sá greinilegi eigindlegi munur á virkjunarmynstri bendir til þess að annar möguleiki - að PR dýrin hafi einfaldlega meiri reynslu af verkefninu - sé ólíklegri, og þetta var studd með mælingu okkar á c-Fos í undirstúku rottna sem fengu 20 FR lotur , sem sýndi virkni svipuð FR hópnum, ekki PR hópnum. Báðir þessir möguleikar gætu verið prófaðir með því að auka kerfisbundið erfiðleikana við þjálfun FR og meta breytingar á örvun miðtaugakerfisins, í því tilviki myndi maður spá fyrir um eigindlega breytingu á virkjunarmynstri. En þó að fjöldi þjálfunarreynna gæti ekki gert grein fyrir virkjunarmynstri miðtaugakerfisins, þá gæti meðalfjöldi súkrósa umbun á fundi: PR verkefnið gæti einfaldlega verið lært sem „minna gefandi“ reynsla og þetta gæti tengst virkni við skortur á virkjun LH. Þannig gæti virkjunarmynstur miðtaugakerfisins í byrjun lotu endurspeglað innsýn ástand, svo sem ástand skilyrðisstefnunnar: styrkur virkjunar innan limbískra hringrásar er bundinn við nám og hvatningu. Við sáum breytileika á tjáningu c-Fos í miðgildi undirstúku hjá FRC dýrum. Sérstaklega innan PVN, þessi breytileiki gæti verið að gríma virkjun hjá FR rottum, þar sem þróun í átt að aukinni c-Fos samanborið við FRC rottur (Tafla 3). Samt sem áður var meðaltal lyfjameðferð á undirstúku ekki mismunandi á milli FR og FRC dýra.
Það skal tekið fram að þrátt fyrir að markmið okkar hafi verið að bera kennsl á vefsvæði miðtaugakerfisins sem stuðla að upphafi hegðunar er tímabundin upplausn nokkuð í huga. Eins og fjallað er um hér að neðan, er það nú vel þegið að mismunandi undirþættir hljóðfæraleikja eða aðgerðarhegðunar eru miðlaðir af virkjun mismunandi hópa taugafrumna (13, 23, 33, 49). Við getum ekki alveg útilokað að örvun vegna mjög tafarlausrar barpressunar eða sleikju á umbun gæti hafa stuðlað nokkuð að virkjunarmynstrunum sem við sáum. Niðurstöður okkar eru grundvöllur frekari rannsóknar á hlutverkum tiltekinna staðla í miðtaugakerfinu í mismunandi þáttum eða íhlutum sjálfsstjórnunarverkefnis, og fyrir slíkar rannsóknir, mæling á öðrum skjótum genum sem eru snemma með mismunandi „á“ og „slökkt“ tímaferli (36) verður mjög gagnlegt.
Fylgnin sem við fundum í c-Fos tjáningu milli mismunandi heila svæða styðja þekkta virkni tengingu undirstúku og aðal limbískra svæða fyrir þetta tiltekna verðlaunaverkefni, svo sem milli LH og VMH, og milli Kaliforníu svæðisins í LH og VTA (sjá umfjöllun í Refs. 2 og 13). Við skoðuðum einnig fylgni milli tjáningar c-Fos á mismunandi virkjuðum svæðum og hegðunar. Fylgni milli c-Fos í ARC og virkum stangarpressum passar við vel skilgreint hlutverk ARC virkni í fæðuinntöku (1); með fyrri athugun okkar um að insúlíninnspýting sérstaklega í ARC minnkaði sjálfsstjórnun súkrósa (15); með fyrri skýrslum um mikilvægt hlutverk ARC, og endorfínvirka taugafrumur þess, við öflun og árangur af sjálfsstjórnun kókaíns (40-42); og með tilgreindum áætlunum frá ARC til NAc (17). Þannig gegnir ARC líklega lykilhlutverki í áhugasömu hegðuninni til að leita að og fá margar tegundir af gefandi áreiti, þar á meðal, en ekki takmarkað við, mat. Að lokum sáum við verulega virkjun PVN og VMH við upphaf PR súkrósaleitar. Þetta er í samræmi við vel einkennd hlutverk þessara miðla undirstúku kjarna við stjórnun neyslu fæðu, beinni samstillingu tengsl við ARC og greind tengsl við útlimum hringrásina (1, 27, 37).
Við fundum verulega neikvæða fylgni milli tjáningar c-Fos í VTA samanborið við NAc-skelina, hvort sem það var prófað fyrir FR eða PR árangur. Það kom nokkuð á óvart að ekki kom fram sterkari virkjun VTA í tengslum við sjálfstjórnun PR eða FR súkrósa (samanborið við viðkomandi eftirlit). Kannski endurspeglar þessi niðurstaða tímasetningu mælinga okkar með áherslu á hugsanlega staðla á miðtaugakerfinu sem voru virkir við upphaf verkefnis, sem þessi dýr voru vel þjálfaðir í. Þetta væri í samræmi við athuganir og ritgerð Schultz (44), að örvun taugafrumna í dópamíni þjónar sem merki um óvænt áreiti eða umbun og þessi örvun minnkar í tengslum við þjálfun. Hins vegar hefur verið sýnt fram á að dópamínlosun við súkrósa í þjálfuðum dýrum er mjög nákvæm og tímabundið stakur atburður (39). Þannig er mögulegt að þróunin sem við fylgjumst með væri veruleg með stærri rannsóknarhóp (þ.e. meiri tölfræðilegan kraft). Við fylgjumst með virkjun NAc í tengslum við upphaf bæði FR og PR súkrósa. Tilkynnt hefur verið um bæði virkjun og hömlun á NAc taugafrumum í tengslum við árangursríka umbun og verkun / virkni er háð þjálfun og umhverfi og tengist mismunandi þáttum hegðunarinnar (td stefnumörkun, nálgun, inntaka) (6, 33, 50). Eins og fjallað var um hér að ofan myndi mæling á c-Fos ekki fanga slíka sérstaka virkni. Carlezon hefur lagt til að „umbun“ tengist aðallega lækkun á virkni NAc taugafrumna, þ.e.a.s.3). Þetta er ekki í samræmi við athuganir okkar - verulega bætandi NAc c-Fos samanborið við meðhöndlun stjórna og c-Fos jákvæðir taugafrumur sem voru staðsettar með GAD, í samræmi við virkjun miðlungs spinal taugafrumna (GABAergic) - en við höfum ekki metið NAC taugafrumum „hömlun“ sérstaklega “. NAc virkjun og hömlun geta bæði átt sér stað meðan á verkfærum stendur, bæði með líffærafræði og tímabundna sérstöðu. Út frá sjónarhóli þessarar rannsóknar má draga þá ályktun að NAc taki þátt í upphaf tæknilegs súkrósaupptöku, þar sem NAc kjarninn stuðlar að hreyfifræðilegri virkjun og NAc skelinni stuðlar bæði að mótorlegum og hvetjandi þáttum verkefnisins.
Við fylgjumst einnig með virkjun beggja helstu svæða BNST (fremri og aftari) hjá FR rottum. BNST er hluti af útlimum hringrásum sem mótar taugaboðefni við endurteknum áreynsluupplifun (8, 9), og í stærri skilningi, tengist það að læra um endurtekið áreiti. Þrátt fyrir að hlutverk þess hafi verið skýrt ítarlegast í tengslum við endurtekna reynslu af streituvaldi bendir niðurstaða okkar til að hlutverk BNST sé víðtækara: BNST gæti mótað viðbrögð miðtaugakerfisins við endurteknum jákvæðum, svo og neikvæðum eða streituvaldandi áreiti. Þar sem við fylgjumst með þessari örvun við upphaf FR, en ekki PR, árangur, þá getur ráðning BNST verið bundin við aukna súkrósa umbun FR þjálfunar. Athugun okkar á engri beinni virkjun CRF taugafrumna bendir til þess að tæki sem bregðast við fyrir súkrósa sé ekki mikill stressandi; samt sem áður er tjáning c-Fos í öðrum PVN taugafrumum í samræmi við mótun streiturásarinnar (46). Reyndar hafa Ulrich-Lai og samstarfsmenn greint frá því að með því að nota mismunandi mataræði / fóðrunarmöguleika mótar súkrósa inntaka PVN virkni (47). Að lokum, við fylgjumst með virkjun kjarna hypoglossal tauga í tengslum við PR en ekki FR árangur. Aðeins er hægt að spekúlera um mikilvægi þessa; einn möguleiki er sá að smekksvægi súkrósa getur aukist hjá rottum sem neyta færri súkrósa umbuna.
Sykrós leita og súkrósa taka ætti að teljast fjölþætt reynsla, kraftmikil í tíma þar sem inntaka myndi leiða til útlægra merkja sem tengjast kaloríuinnihaldi súkrósa, svo og að venja og innan vökvahreyfingar innan fundar (25). Þó að rannsóknir okkar hafi beinst að áhrifum útlægra innkirtlamerkja, þ.e. insúlíns og leptíns, til að móta umbun matvæla, geta áhrif þeirra aftur á móti miðlað beint miðlægum af sendum og taugapeptíðum sem gegna hlutverki til skemmri eða lengri tíma fóðrun eða matarlaun (sjá umfjöllun í Ref. 14). Núverandi rannsókn veitir nokkra innsýn í þetta; við fylgjumst með virkjun taugafrumna sem tjá annað hvort MCH eða orexin, tvö taugafeptíð sem eru orexigenic. Þessar niðurstöður geta í raun vanmetið hlutverk MCH eða orexins í matarlaunum, þar sem ónæmisfrumuefnafræði hjá rottum sem ekki voru meðhöndlaðar með kólchicíni takmarkaði eflaust sjón á báðum þessum taugapeptíðum. Auðkenning virkjaðra orexín taugafrumna í LH er í heild í samræmi við þær fjölmörgu rannsóknir sem hafa áhrif á orexín taugafrumur í fóðrun, matarlaun og almennari áreiti umbun (td 5, 7, 29). Við sáum virkjun peFLH orexín taugafrumna. Aston-Jones og samstarfsmenn (5) hafa valið hlutverk ólíkra íbúa LH orexin taugafrumna í umbunarhegðun og hafa beitt peFLH orexin taugafrumum í upphafi, öfugt við umbun í sjálfu sér. Okkar niðurstaða bendir því til hlutverks fyrir LH orexin við að vekja upp og ef til vill stefna að virku stönginni eða vísbendingum um súkrósaupptöku.
Verðugt í framtíðinni er sérstaða eða alhæfileiki súkrósa sem gefandi hvati. Enn á eftir að ákvarða hvort mynstrið snemma örvunar miðtaugakerfisins sem við greinum frá er sérstaklega fyrir fæðu sem áreiti, eða alhæfir til annars gefandi áreitis. Eins og vísað er til hér að framan, sérstaklega í FR-verkefninu, má búast við að inntaka fjölda súkrósa umbuna hafi efnaskiptaafleiðingar með mótun hormónalosunar (til dæmis kólecystokiníns, ghrelin, insúlíns) og breytinga á úttaugum og taugakerfisvirkjun. Ekki var búist við að þessar breytingar myndu gegna beinu hlutverki í fyrstu örvunarmynstrum miðtaugakerfisins sem við mældum en kunna að gegna hlutverki við að læra um súkrósa umbun við þjálfun. Aftur, neuropeptíð eins og orexin geta verið gagnrýnin.
Rannsókn okkar táknar, að þekkingu okkar, fyrsta sýningin á virkjun á sérstökum miðlægum undirstúku kjarna við upphaf sjálfsstjórnunar súkrósa, þar með talið bæði PVN, sem felur í sér meltingarveg og streituviðbrögð, og ARC, sem er mikilvægt fyrir heimastöðvun orku, næringarrannsóknir og stjórnun á fæðuinntöku. Mikilvægt er að við fylgjumst með virkjun á miðlægum undirstúku og NAC, í tengslum við upphaf PR, sem bendir til þess að bæði staðbundin staða og sumar limbískir staðir gegni hlutverki við að hefja sjálfsstjórnun súkrósa. Hægt er að ráða fleiri limbískar rafrásarstaðir á síðari tímapunkti í verkefninu.
Perspektiv og mikilvægi
Þó sögulega séð hafi rannsóknir á hvatningar- og umbunarhegðun haft mest áhrif á limbískt rafrásir á miðtaugakerfið, það hefur safnast mikill fjöldi sönnunargagna sem leggja áherslu á mikilvæg gagnvirk samskipti milli limbísks og orkusjúkdómsrásar. Núverandi rannsókn bendir nú til líklegs mikilvægis sértækra miðgildis undirstúku kjarna við áhugasama vinnu fyrir súkrósa. Framhaldsrannsóknir, útdráttar úr þessari rannsókn, geta metið hvort hlutverk miðlægs undirstúku sé krafist og hvort virkjun þess felist í hvati til að leita annarra umbóta, svo sem misnotkunarlyfja. Að auki eru niðurstöður þessarar rannsóknar rökstuðningur fyrir því að rannsaka breytingar á áhugasömum hegðun við aðstæður samhliða breyttri læknisfræðilegri undirstúku lífeðlisfræði, svo sem í offitu.
STYRKIR
Þessi rannsókn var studd af National Institute of Health Grant DK40963. Dr. Dianne Figlewicz Lattemann er yfirmaður vísindarannsókna í rannsóknarstörfum, rannsóknaráætlun fyrir lífeindafræðirannsóknarstofur, Department of Veterans Affairs Puget Sound Health System, Seattle, Washington. Dr. Sipols er studdur af Lettneska vísindaráðinu 04.1116.
UPPLÝSINGAR
Engir hagsmunaárekstrar, fjárhagslegir eða á annan hátt, eru lýstir af höfundum.
Þakkir
Við þökkum dr. Yavin Shaham, Stephen Benoit, Christine Turenius og JE Blevins til að fá ráð og gagnlegar umræður.
HEIMILDIR
;