ಪ್ರೊಕ್ ನಟ್ಲ್ ಅಕಾಡ್ ಸ್ಕೀ ಯು ಎ. 2005 ಫೆಬ್ರವರಿ 1; 102(5): 1737-1742.
ಅಮೂರ್ತ
ದುರುಪಯೋಗದ ಕೊಕೇನ್, ಆಕ್ಸಾನ್ ಟರ್ಮಿನಲ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಡೋಪಮೈನ್ ಮರುಸಂಗ್ರಹವನ್ನು ತಡೆಯುವ ಮೂಲಕ ಸ್ಟ್ರೈಟಂನಲ್ಲಿ ಸಿನಾಪ್ಟಿಕ್ ಡೋಪಮೈನ್ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ. ಸೈಕ್ಲಿನ್-ಅವಲಂಬಿತ ಕೈನೇಸ್ 5 (Cdk5) ಮತ್ತು ಅದರ ಆಕ್ಟಿವೇಟರ್ p35, ಪೋಸ್ಟ್ಮಿಟೋಟಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿನ ತಲಾಧಾರಗಳ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ನಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ಕೊಕೇನ್ಗೆ ದೀರ್ಘಕಾಲದವರೆಗೆ ಒಡ್ಡಿಕೊಂಡ ನಂತರ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲ್ಪಡುತ್ತವೆ ಎಂದು ಕಂಡುಬಂದಿದೆ. ಸ್ಟ್ರೈಟಲ್ ಡೋಪಮೈನ್ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಮತ್ತು ಪಿಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಪರಿಶೀಲಿಸಲು, ನಾವು ಎರಡು ಸ್ವತಂತ್ರ ಜೀವಾಂತರ ಮೌಸ್ ರೇಖೆಗಳನ್ನು ರಚಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದರಲ್ಲಿ ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಅಥವಾ ಪಿಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ನ್ಯೂರಾನ್ಗಳಲ್ಲಿ ಅತಿಯಾದ ಒತ್ತಡವನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ. P5 ನ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿದ Cdk35 ಚಟುವಟಿಕೆಯು Cdk5 ಅತಿಯಾದ ಒತ್ತಡದಿಂದಲ್ಲ, ಕೊಕೇನ್-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ಡೋಪಮೈನ್ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್‌ನ ಅಟೆನ್ಯೂಯೇಷನ್‌ಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಇಲ್ಲಿ ವರದಿ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ. ಡೋಪಮೈನ್ ಮತ್ತು ಸಿಎಎಂಪಿ-ನಿಯಂತ್ರಿತ ಫಾಸ್ಫೊಪ್ರೊಟೀನ್‌ನ ಹೆಚ್ಚಿದ ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್-ಥ್ರೊ-ಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್‌ಎಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಆಣ್ವಿಕ ದ್ರವ್ಯರಾಶಿ ಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಕೆಡಿಎ (ಡಿಎಆರ್ಪಿಪಿ-ಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್), ಥ್ರಾರ್-ಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್‌ಎಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಡಿಎಆರ್ಪಿಪಿ-ಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್‌ಎಕ್ಸ್‌ನ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ. Thr-35 ನಲ್ಲಿ ಬಾಹ್ಯಕೋಶೀಯ ಸಿಗ್ನಲ್-ನಿಯಂತ್ರಿತ ಕೈನೇಸ್ ಕೈನೇಸ್ 5 ನ ಹೆಚ್ಚಿದ Cdk35- ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಜೊತೆಗೆ ಬಾಹ್ಯಕೋಶೀಯ ಸಿಗ್ನಲ್-ನಿಯಂತ್ರಿತ ಕೈನೇಸ್ 5 / 5 ನ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ. ಈ ಪರಿಣಾಮಗಳು ಸಿಎಎಮ್‌ಪಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಅಂಶ-ಬಂಧಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಕೊಕೇನ್-ಪ್ರೇರಿತ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಅನ್ನು ಅಟೆನ್ಯೂಯೇಷನ್ ಮಾಡಲು ಮತ್ತು ಸ್ಟ್ರೈಟಟಮ್ನಲ್ಲಿ ಸಿ-ಫಾಸ್ನ ಕಡಿಮೆ ಪ್ರಚೋದನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಿವೆ. ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯು ಕೊಕೇನ್ಗೆ ದೀರ್ಘಕಾಲದ ಮಾನ್ಯತೆ ನೀಡಿದ ನಂತರ ಬದಲಾದ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಲ್ಲಿ ತೊಡಗಿದೆ ಮತ್ತು ಆದ್ದರಿಂದ ಕೊಕೇನ್ ಚಟಕ್ಕೆ ಆಧಾರವಾಗಿರುವ ನರಕೋಶದ ಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿನ ದೀರ್ಘಕಾಲೀನ ಬದಲಾವಣೆಗಳ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ.
ಕೊಕೇನ್ ಸ್ಟ್ರೈಟಂನಲ್ಲಿ ಸಿನಾಪ್ಟಿಕ್ ಡೋಪಮೈನ್ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಡೋಪಮಿನೊಸೆಪ್ಟಿವ್ ನ್ಯೂರಾನ್ಗಳಲ್ಲಿ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಡೋಪಮೈನ್ ಡಿಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಗ್ರಾಹಕದಿಂದ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗೆ ಆರಂಭಿಕ ಸಂಕೇತವನ್ನು ಪ್ರಸಾರ ಮಾಡುವ ಅಂತರ್ಜೀವಕೋಶದ ಮಾರ್ಗಗಳನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ.1). ಕೊಕೇನ್ಗೆ ದೀರ್ಘಕಾಲದ ಮಾನ್ಯತೆ ಹಲವಾರು ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಅಂಶಗಳನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ, ಇದರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಲ್ಲಿ ದೀರ್ಘಕಾಲೀನ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಕಂಡುಬರುತ್ತವೆ, ಇದು ಕೊಕೇನ್ ಚಟದಲ್ಲಿ ನರಕೋಶದ ರೂಪಾಂತರಗಳಿಗೆ ಆಧಾರವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಭಾವಿಸಲಾಗಿದೆ (2). OsFosB, ಅಂತಹ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಅಂಶವೆಂದು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ (3), ಕೊಕೇನ್ಗೆ ಪ್ರಾಣಿಗಳ ವರ್ತನೆಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ (4, 5). ಆದ್ದರಿಂದ, osFosB ಪ್ರಚೋದನೆಯಿಂದ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲ್ಪಡುವ ಗುರಿ ಜೀನ್‌ಗಳ ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಯು ಕೊಕೇನ್ ಚಟಕ್ಕೆ ಆಧಾರವಾಗಿರುವ ಆಣ್ವಿಕ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನದ ಬಗ್ಗೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ತಿಳುವಳಿಕೆಯನ್ನು ನೀಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಿರೀಕ್ಷಿಸಲಾಗಿದೆ. ಇತ್ತೀಚೆಗೆ, ಕೊಕೇನ್ ಹೊಂದಿರುವ ಪ್ರಾಣಿಗಳ ದೀರ್ಘಕಾಲದ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯು ಸೈಕ್ಲಿನ್-ಅವಲಂಬಿತ ಕೈನೇಸ್ 5 (Cdk5) ಮತ್ತು ಅದರ ಆಕ್ಟಿವೇಟರ್ p35 ಅನ್ನು ಸ್ಟ್ರೈಟಂನಲ್ಲಿ ΔFosB () ನ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ಮೂಲಕ ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.6, 7).
Cdk5 ಸಿಡಿಕೆ ಕುಟುಂಬದ ಸೆರೈನ್ / ಥ್ರೆಯೋನೈನ್ ಕೈನೇಸ್‌ಗಳ ಸದಸ್ಯ. ಕೋಶ-ಚಕ್ರ ಪ್ರಗತಿಯ ಪ್ರಮುಖ ನಿಯಂತ್ರಕರಾಗಿರುವ ಇತರ ಸಿಡಿಕ್‌ಗಳಂತಲ್ಲದೆ, ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಪೋಸ್ಟ್ಮಿಟೋಟಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್ಗಳಲ್ಲಿ ತಲಾಧಾರಗಳ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ನಲ್ಲಿ ತೊಡಗಿದೆ (8). ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ನರಕೋಶದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಅದರ ಆಕ್ಟಿವೇಟರ್ಗಳೊಂದಿಗಿನ ಒಡನಾಟದ ಮೂಲಕ ಸಾಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಪಿಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಅಥವಾ ಪಿಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್, ಇವುಗಳನ್ನು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಪೋಸ್ಟ್ಮಿಟೋಟಿಕ್ ನ್ಯೂರಾನ್ಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (8). ಮೆದುಳಿನ ಬೆಳವಣಿಗೆಯಲ್ಲಿ Cdk5 ನ ಅಗತ್ಯ ಪಾತ್ರದ ಜೊತೆಗೆ (9, 10), iಪ್ರಸವಪೂರ್ವ ಮೆದುಳಿನಲ್ಲಿ ಡೋಪಮಿನರ್ಜಿಕ್ ಪ್ರಸರಣದಲ್ಲಿ ಟಿ ಅನ್ನು ಸಹ ಸೂಚಿಸಲಾಗಿದೆ (11, 12). Cdk5 ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಪ್ರತಿಬಂಧವು ಸ್ಟ್ರೈಟಂನಲ್ಲಿ ಡೋಪಮೈನ್ ಬಿಡುಗಡೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಡೋಪಮೈನ್ ಬಿಡುಗಡೆಯ negative ಣಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಕವಾಗಿ Cdk5 ನ ಪ್ರಿಸ್ನಾಪ್ಟಿಕ್ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. (11). ಇದಲ್ಲದೆ, ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಪೋಸ್ಟ್‌ನ್ಯಾಪ್ಟಿಕ್ ಡೋಪಮೈನ್ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್‌ನ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿತ್ವವನ್ನು ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಟ್ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಡೋಪಮೈನ್- ಮತ್ತು ಸಿಎಎಮ್‌ಪಿ-ನಿಯಂತ್ರಿತ ಫಾಸ್ಫೊಪ್ರೊಟೀನ್, ಥ್ರೂ-ಎಕ್ಸ್‌ನ್ಯೂಎಮ್‌ಎಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಆಣ್ವಿಕ ದ್ರವ್ಯರಾಶಿ ಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಕೆಡಿಎ (ಡಿಎಆರ್ಪಿಪಿ-ಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್) (12).
ಈ ಅವಲೋಕನಗಳು Cdk5 ಮತ್ತು p35 ಕೊಕೇನ್ಗೆ ದೀರ್ಘಕಾಲದವರೆಗೆ ಒಡ್ಡಿಕೊಂಡ ನಂತರ ಡೋಪಮೈನ್ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್‌ನ ದೀರ್ಘಕಾಲದ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯ ಕೆಳಮಟ್ಟದ ನಿಯಂತ್ರಕರು ಮತ್ತು ಆದ್ದರಿಂದ ಕೊಕೇನ್ ಚಟದಲ್ಲಿವೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಸ್ಟ್ರೈಟಲ್ ಡೋಪಮೈನ್ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್‌ಎಕ್ಸ್‌ನ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಪರಿಹರಿಸಲು, ನಾವು ಎರಡು ಜೀವಾಂತರ ಮೌಸ್ ರೇಖೆಗಳನ್ನು ರಚಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದರಲ್ಲಿ ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಅಥವಾ ಪಿಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಪಿಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಪ್ರವರ್ತಕನ ನಿಯಂತ್ರಣದಲ್ಲಿ ನ್ಯೂರಾನ್ಗಳಲ್ಲಿ ಅತಿಯಾಗಿ ಒತ್ತಿಹೇಳಲಾಗಿದೆ. ನಮ್ಮ ಆವಿಷ್ಕಾರಗಳು ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್ಎಮ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿದ ಪಿಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ನೊಂದಿಗೆ ನಿಯಂತ್ರಿಸಿದೆ ಆದರೆ ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಲ್ಲ, ಇದು ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್ಎಮ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ದರವನ್ನು ಸೀಮಿತಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ನಾವು ಇಲ್ಲಿ ಒದಗಿಸುತ್ತೇವೆ ಜೀವಿಯಲ್ಲಿ p5 ಅತಿಯಾದ ಒತ್ತಡದ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ Cdk35 ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿದೆ ಎಂಬುದಕ್ಕೆ ಪುರಾವೆಗಳು, PKA ಮತ್ತು ಬಾಹ್ಯಕೋಶೀಯ ಸಿಗ್ನಲ್-ನಿಯಂತ್ರಿತ ಕೈನೇಸ್ (ERK) ಕ್ಯಾಸ್ಕೇಡ್‌ಗಳ ಪ್ರತಿಬಂಧಕದ ಮೂಲಕ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗೆ ಕೊಕೇನ್-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ಡೋಪಮೈನ್ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಸೆಳೆಯಲು ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.
ವಸ್ತುಗಳು ಮತ್ತು ವಿಧಾನಗಳು
ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳು. Cdk5 (C-8) ಮತ್ತು p35 (C-19) ಗೆ ಪಾಲಿಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳನ್ನು ಸಾಂತಾ ಕ್ರೂಜ್ ಜೈವಿಕ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನದಿಂದ ಖರೀದಿಸಲಾಗಿದೆ. ERK ಕೈನೇಸ್ (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2, ಮತ್ತು CAMP- ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಅಂಶ-ಬಂಧಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್ (CREB) ಗೆ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್-ಅವಲಂಬಿತ ಮತ್ತು ಅವಲಂಬಿತ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳನ್ನು ಸೆಲ್ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನದಿಂದ (ಬೆವರ್ಲಿ, MA) ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ. ಫಾಸ್ಫೋ- Thr-34 DARPP 32 ಗೆ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳು (13), ಫಾಸ್ಫೋ- Thr-75 DARPP-32 (12), ಒಟ್ಟು DARPP-32 (12), ಮತ್ತು ಸಿ-ಫಾಸ್ (14) ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತಿತ್ತು. ಸಿಗ್ಮಾದಿಂದ ಆಕ್ಟಿನ್‌ಗೆ ಪ್ರತಿಕಾಯವನ್ನು ಖರೀದಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಪ್ರಾಣಿಗಳು. ನಾವು ಈ ಮೊದಲು ಮೌಸ್ p35 ಜೀನ್ ಅನ್ನು ಕ್ಲೋನ್ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ Cdk5r1, ಇದು p35 ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಎನ್ಕೋಡ್ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅದರ ಜೀನೋಮಿಕ್ ರಚನೆಯನ್ನು ನಿರೂಪಿಸುತ್ತದೆ (15). P35 (Tgp35) ನ ನರಕೋಶದ ಅತಿಯಾದ ಒತ್ತಡದೊಂದಿಗೆ ಜೀವಾಂತರ ಮೌಸ್ ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು, 6-kb ಪ್ರತಿಧ್ವನಿಆರ್ಐ-ಪ್ರತಿಧ್ವನಿ1.2-kb ಪ್ರವರ್ತಕ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ RI ತುಣುಕನ್ನು pGEM9Z (-) ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ಗೆ ಸಬ್‌ಕ್ಲೋನ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು SV45 ನಿಂದ ಪಡೆದ 40-bp ಟ್ಯಾಗ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು ಕೆಪಿಎನ್ನಾನು ಪಾಲಿ (ಎ+) ಸಿಗ್ನಲ್ (ಅಂಜೂರ. 1A). ಟ್ಯಾಗ್ ಎ ಸ್ಪೀಪ್ರಾಣಿಗಳ ಜಿನೋಟೈಪಿಂಗ್ಗಾಗಿ ನಾನು ಸೈಟ್. 6-kb ತುಣುಕನ್ನು ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ನಿಂದ ಹೊರಹಾಕಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲಾಯಿತು, ನಂತರ ಜೀವಾಂತರ ಇಲಿಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಜೆನ್‌ನ ಪರಮಾಣು ಚುಚ್ಚುಮದ್ದನ್ನು ನೀಡಲಾಯಿತು. 1.2-kb p35 ಪ್ರವರ್ತಕನ ನಿಯಂತ್ರಕ ನಿಯಂತ್ರಣದಲ್ಲಿ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಜೆನ್‌ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಪ್ರೊಫೈಲ್ ಅನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ಜೀವಿಯಲ್ಲಿ, ಎರಡು-ಹಂತದ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಕಾರ್ಯತಂತ್ರವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಡಬಲ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಜೆನಿಕ್ ಮೌಸ್ (Tgp35; p35 - / -) ಅನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಉತ್ಪಾದಿಸಲಾಯಿತು, ಇದರ ಮೂಲಕ Tgp35 ಮೌಸ್ ಅನ್ನು ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ p35- ಶೂನ್ಯ ಹಿನ್ನೆಲೆಯಲ್ಲಿ ಪುನರುತ್ಪಾದಿಸಲಾಯಿತು. ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾದ ಇತರ ಮೌಸ್ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ p35 +/–, p35 - / -, Cdk5 +/–, ಮತ್ತು Cdk5 (TgCdk5) ನ ನರಕೋಶದ ಅತಿಯಾದ ಒತ್ತಡವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಜೀವಾಂತರ ಮೌಸ್ (9, 16, 17). ಬಾಲ ಬಯಾಪ್ಸಿಗಳಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಮೇಲೆ ಸದರ್ನ್ ಬ್ಲಾಟ್ ಅನಾಲಿಸಿಸ್ ಅಥವಾ ಪಿಸಿಆರ್ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಈ ಇಲಿಗಳ ಜಿನೋಟೈಪ್‌ಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಇಲಿಗಳನ್ನು 12-h light / 12-h ಡಾರ್ಕ್ ಸೈಕಲ್ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಗಿತ್ತು. ಪ್ರಯೋಗಾಲಯ ಮತ್ತು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಪ್ರಾಣಿಗಳ ಆರೈಕೆ ಮತ್ತು ಬಳಕೆಯ ಕುರಿತು ರಾಷ್ಟ್ರೀಯ ಆರೋಗ್ಯ ಸಂಸ್ಥೆಯ ಮಾರ್ಗಸೂಚಿಗಳಿಗೆ ಅನುಸಾರವಾಗಿ ಎಲ್ಲಾ ಕಾಳಜಿಯನ್ನು ನೀಡಲಾಯಿತು.
ಸದರ್ನ್ ಬ್ಲಾಟ್ ಅನಾಲಿಸಿಸ್. ಬಾಲ ಬಯಾಪ್ಸಿಗಳಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಜೀರ್ಣವಾಯಿತು ಪ್ರತಿಧ್ವನಿಆರ್ಐ ಮತ್ತು ಸ್ಪೀನಾನು, 0.9% ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೊರೆಸ್ಡ್ ಮಾಡಿದ್ದೇನೆ ಮತ್ತು ನೈಲಾನ್ ಮೆಂಬರೇನ್ಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸುತ್ತೇನೆ. ಮೆಂಬರೇನ್ ಅನ್ನು ಯಾದೃಚ್ -ಿಕ-ಪ್ರೈಮ್ಡ್ನೊಂದಿಗೆ ಹೈಬ್ರಿಡೈಜ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ 32ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ 42 at C ನಲ್ಲಿ ಪಿ-ಲೇಬಲ್ ತನಿಖೆ. P485 ನಾಕ್‌ out ಟ್ (p35 - / -) ಮತ್ತು Tgp35 ಇಲಿಗಳ ಜಿನೋಟೈಪಿಂಗ್ಗಾಗಿ 35-bp ತನಿಖೆ ಈ ಕೆಳಗಿನ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು PCR ನಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗಿದೆ: 5′-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 ′ ಮತ್ತು 5′-CCACTGTAAAA. ಹೈಬ್ರಿಡೈಸ್ಡ್ ಮೆಂಬರೇನ್ ಅನ್ನು 3 ನಿಮಿಷಕ್ಕೆ 2 ° C ನಲ್ಲಿ 0.1 × SSC / 42% SDS ನಲ್ಲಿ ಎರಡು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು 10 ನಿಮಿಷಕ್ಕೆ 0.1 × C ನಲ್ಲಿ ಎರಡು ಬಾರಿ 0.1 × SSC / 65% SDS ನಲ್ಲಿ 20 ನಿಮಿಷಕ್ಕೆ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಎಕ್ಸರೆ ಫಿಲ್ಮ್‌ಗೆ ಒಡ್ಡಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಡ್ರಗ್ ಟ್ರೀಟ್ಮೆಂಟ್. ಕೊಕೇನ್ (ಸಿಗ್ಮಾ) ಅನ್ನು ಬರಡಾದ ಲವಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಕರಗಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರಾಣಿಗಳನ್ನು ಕೊಕೇನ್ (15 mg / kg) ಅಥವಾ 3 ತಿಂಗಳ ವಯಸ್ಸಿನಲ್ಲಿ ಸಮಾನ ಪ್ರಮಾಣದ ಲವಣಯುಕ್ತವಾಗಿ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದು ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ನಂತರ ವಿಭಿನ್ನ ಸಮಯದ ಬಿಂದುಗಳಲ್ಲಿ (15, 30, 60, ಮತ್ತು 120 ನಿಮಿಷ) ಶಿರಚ್ itation ೇದದಿಂದ ಕೊಲ್ಲಲ್ಪಟ್ಟರು. ಐಸ್-ಕೋಲ್ಡ್ ಪಿಬಿಎಸ್ನಲ್ಲಿ ಮಿದುಳುಗಳನ್ನು ವೇಗವಾಗಿ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ತಣ್ಣಗಾಗಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಸ್ಟ್ರೈಟಾವನ್ನು ected ೇದಿಸಿ ಉತ್ತರ ಅಥವಾ ವೆಸ್ಟರ್ನ್ ಬ್ಲಾಟ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಇಮ್ಯುನೊಹಿಸ್ಟೋಕೆಮಿಕಲ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ನಂತರ ಸ್ಟ್ರೈಟಲ್ ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು ಇಲಿಗಳು 2 h ನಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.
ಉತ್ತರ ಬ್ಲಾಟ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. ಟಿಆರ್‌ಐಜೋಲ್ ಕಾರಕ (ಇನ್ವಿಟ್ರೋಜನ್ ಲೈಫ್ ಟೆಕ್ನಾಲಜೀಸ್, ಕಾರ್ಲ್ಸ್‌ಬ್ಯಾಡ್, ಸಿಎ) ಯೊಂದಿಗೆ ಸ್ಟ್ರೈಟಾದಿಂದ ಒಟ್ಟು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಉತ್ತರ ಬ್ಲಾಟ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು (18). ಸಿ-ಫಾಸ್ ಎಮ್ಆರ್ಎನ್ಎ ಪತ್ತೆಗಾಗಿ, ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಮೌಸ್ ಸಿ-ಫಾಸ್ ಸಿಡಿಎನ್‌ಎದ ಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಂಎಕ್ಸ್-ಬಿಪಿ ತುಣುಕನ್ನು ತನಿಖೆಯಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ (19). ಸಿ-ಫಾಸ್ ಎಮ್ಆರ್ಎನ್ಎ ಮಟ್ಟವನ್ನು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ನ ಆಪ್ಟಿಕಲ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಅಳೆಯುವ ಮೂಲಕ ಇಮೇಜ್ ಅನಾಲಿಸಿಸ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ ಅನ್ನು ನಿಹ್ ಇಮೇಜ್ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್, ಆವೃತ್ತಿ 1.62 ನೊಂದಿಗೆ ಅಳೆಯುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.
ವೆಸ್ಟರ್ನ್ ಬ್ಲಾಟ್ ಅನಾಲಿಸಿಸ್. ಸ್ಟ್ರೈಟಲ್ ಅಂಗಾಂಶಗಳನ್ನು 1% SDS ನಲ್ಲಿ sonicated ಮತ್ತು 10 ನಿಮಿಷಕ್ಕೆ ಕುದಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿನ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು BCA ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಸ್ಸೇ (ಪಿಯರ್ಸ್) ನಿರ್ಧರಿಸುತ್ತದೆ. ನೈಟ್ರೊಸೆಲ್ಯುಲೋಸ್ ಮೆಂಬರೇನ್ಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸುವ ಮೊದಲು ಸಮಾನ ಪ್ರಮಾಣದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು SDS / PAGE ನಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಯಿತು. 1% ಕೆನೆರಹಿತ ಹಾಲು ಮತ್ತು 5% ಟ್ವೀನ್ 0.05 ಹೊಂದಿರುವ 20 × PBS ನಲ್ಲಿ ಪೊರೆಗಳನ್ನು ನಿರ್ಬಂಧಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು 4 at C ನಲ್ಲಿ ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಪೆರಾಕ್ಸಿಡೇಸ್-ಸಂಯೋಜಿತ ಆಂಟಿ-ಮೌಸ್ ಅಥವಾ ಮೊಲ ಐಜಿಜಿ (ಸಿಗ್ಮಾ) ನೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡುವಿಕೆಯನ್ನು 60 ನಿಮಿಷಕ್ಕೆ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ವರ್ಧಿತ ಕೆಮಿಲುಮಿನೆನ್ಸಿನ್ಸ್ (ಪಿಯರ್ಸ್) ನಿಂದ ಸಂಕೇತವನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳ ಆಪ್ಟಿಕಲ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.
Cdk5 Kinase Assay. 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% ಟ್ರಿಟಾನ್ X-100 / 1mMDTT / 1 mM ಮಿಲಿ ಲ್ಯುಪೆಪ್ಟಿನ್ / ಫಾಸ್ಫಟೇಸ್ ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳು (ಫಾಸ್ಫಟೇಸ್ ಪ್ರತಿರೋಧಕ ಮಿಶ್ರಣ I ಮತ್ತು II, ಸಿಗ್ಮಾ). ಆಂಟಿ-ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ (ಸಿ-ಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್) ಅಥವಾ ಆಂಟಿ-ಪಿಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ (ಸಿ-ಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್) ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಲೈಸೇಟ್ಗಳನ್ನು ಇಮ್ಯುನೊಪ್ರೆಸಿಪಿಟೇಟ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್ಎಮ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಇಮ್ಯುನೊಪ್ರೆಸಿಪಿಟೇಟ್ಗಳನ್ನು ಲೈಸೇಟ್ನ ಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ (ಎಲ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ) ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್ಎಮ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಆಂಟಿಬಾಡಿ (ಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ μg) ನೊಂದಿಗೆ ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಎಕ್ಸ್ಎಮ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ at ಸಿ ಯಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡುವ ಮೂಲಕ ತಯಾರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಎ-ಅಗರೋಸ್ ಮಣಿಗಳ ಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ with ಎಲ್ ನೊಂದಿಗೆ ಮತ್ತಷ್ಟು ಕಾವುಕೊಡುತ್ತದೆ. 1 at C ನಲ್ಲಿ 1 h ಗಾಗಿ ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ% ಸ್ಲರಿ; ಸಾಂತಾ ಕ್ರೂಜ್ ಬಯೋಟೆಕ್ನಾಲಜಿ). P5 ಇಮ್ಯುನೊಪ್ರೆಸಿಪಿಟೇಟ್ಗಳ ತಯಾರಿಕೆಗಾಗಿ, ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಲೈಸೇಟ್ನ 8 μl (35 mg ಪ್ರೋಟೀನ್ಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತದೆ) ಆಂಟಿ-P19 ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ (5 μg) ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. ಇಮ್ಯುನೊಪ್ರೆಸಿಪಿಟೇಟ್ಗಳನ್ನು ಎರಡು ಬಾರಿ ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್ ಮತ್ತು ಎರಡು ಬಾರಿ 300 mM ಟ್ರಿಸ್ · HCl, pH 300 / 5 mM MgCl ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಕೈನೇಸ್ ಬಫರ್‌ನಿಂದ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, ಕೈನೇಸ್ ಬಫರ್‌ನ 60 inl ನಲ್ಲಿ ಮರುಸೇರ್ಪಡೆಗೊಂಡಿದೆ. ಹಿಸ್ಟೋನ್ H1 ಅನ್ನು ತಲಾಧಾರವಾಗಿ ಬಳಸುವ ಮೂಲಕ ಕೈನೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ (18).
ಇಮ್ಯುನೊಹಿಸ್ಟೊಕೆಮಿಸ್ಟ್ರಿ. ಅವರ್ಟಿನ್ (250 mg / kg, Fluka) ನ ಐಪಿ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನಿಂದ ಇಲಿಗಳನ್ನು ಅರಿವಳಿಕೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 0.1 M ಸೋಡಿಯಂ ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಬಫರ್, pH 7.4 ನೊಂದಿಗೆ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕಾರ್ಡಿಯಲ್ ಆಗಿ ಸುಗಂಧಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು, ನಂತರ ಸ್ಟ್ರೆಕ್ ಟಿಶ್ಯೂ ಫಿಕ್ಸೇಟಿವ್ (ಸ್ಟ್ರೆಕ್ ಲ್ಯಾಬೊರೇಟರೀಸ್, ಲಾ ವಿಸ್ಟಾ, NE), ಕ್ರಾಸ್‌ಲಿಂಕಿಂಗ್ ಅಲ್ಲದ ಫಿಕ್ಸೆಟಿವ್. ವಿಘಟಿತ ಮಿದುಳುಗಳನ್ನು ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಅದೇ ಸ್ಥಿರೀಕರಣದಲ್ಲಿ 37 at C ನಲ್ಲಿ ಸರಿಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ. ನಂತರ, ಮಿದುಳುಗಳನ್ನು ಪ್ಯಾರಾಫಿನ್‌ನಲ್ಲಿ ಹುದುಗಿಸಿ, 5-μm- ದಪ್ಪದ ಕರೋನಲ್ ವಿಭಾಗಗಳಾಗಿ ಕತ್ತರಿಸಿ, ಎವಿಡಿನ್-ಬಯೋಟಿನ್-ಪೆರಾಕ್ಸಿಡೇಸ್ ಕಾಂಪ್ಲೆಕ್ಸ್ ಟೆಕ್ನಿಕ್ (ವೆಕ್ಟರ್ ಲ್ಯಾಬೊರೇಟರೀಸ್) ಅನ್ನು ಡೈಮಿನೊಬೆನ್ಜಿಡಿನ್ ಅನ್ನು ತಲಾಧಾರವಾಗಿ ಬಳಸಿ ಇಮ್ಯುನೊಹಿಸ್ಟೊಕೆಮಿಸ್ಟ್ರಿಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು. 4 at C ನಲ್ಲಿ ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಸಿ-ಫಾಸ್ ವಿರುದ್ಧ ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು ಅಫಿನಿಟಿ-ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಪಾಲಿಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿಕಾಯವನ್ನು ಬಿಟ್ಟುಬಿಡುವುದರ ಮೂಲಕ ಕಲೆಗಳ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಣಯಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಫಲಿತಾಂಶಗಳು
ಪಿಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್‌ಎಕ್ಸ್‌ನ ನರಕೋಶದ ಅತಿಯಾದ ಒತ್ತಡದೊಂದಿಗೆ ಜೀವಾಂತರ ಇಲಿಗಳ ಉತ್ಪಾದನೆ. P35 ನ ಹೆಚ್ಚಿದ ನರಕೋಶದ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಸಾಧಿಸಲು ಬಳಸುವ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಜೆನ್ 6-kb ಪ್ರವರ್ತಕವನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಅಬೀಜ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಮೌಸ್ p35 ಜೀನ್‌ನ 1.2-kb ತುಣುಕನ್ನು ಮತ್ತು p35 ನ ಸಂಪೂರ್ಣ ಕೋಡಿಂಗ್ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ (ಅಂಜೂರ. 1 A). P35 - / - ಮತ್ತು Tgp35 ಇಲಿಗಳನ್ನು ಕಾಡು-ಮಾದರಿಯ ಇಲಿಗಳಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾದ ತನಿಖೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ದಕ್ಷಿಣ ಬ್ಲಾಟ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ಇಲಿಗಳ ಜೀನೋಟೈಪ್‌ಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (ಅಂಜೂರ. 1 A ಮತ್ತು B). 1.2-kb p35 ಪ್ರವರ್ತಕನ ನಿಯಂತ್ರಣದಲ್ಲಿ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಜೆನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು, ನಾವು ಡಬಲ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಜೆನಿಕ್ ಇಲಿಗಳನ್ನು (Tgp35; p35 - / -) ಉತ್ಪಾದಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದರಲ್ಲಿ p35 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಜೆನ್‌ನಿಂದ ಮಾತ್ರ ಚಲಿಸಲ್ಪಡುತ್ತದೆ. Tgp35; p35 - / - ನಲ್ಲಿನ p35 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮೆದುಳಿನಲ್ಲಿ ಮಾತ್ರ ಕಂಡುಬರುತ್ತದೆ (ಅಂಜೂರ. 1C), ಅಲ್ಲಿ ಪ್ರಾದೇಶಿಕ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಾದರಿಯು ಕಾಡು-ಮಾದರಿಯ ಇಲಿಗಳಂತೆಯೇ ಇತ್ತು (ಅಂಜೂರ. 1D). ಪಿಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್‌ಎಕ್ಸ್‌ನ ಕೊರತೆಯು ಸೆರೆಬ್ರಲ್ ಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್ ಮತ್ತು ಇಲಿಗಳ ಹಿಪೊಕ್ಯಾಂಪಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಅಸಹಜ ಲೇಯರಿಂಗ್ ರಚನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ (10). ಆದಾಗ್ಯೂ, Tgp35; p35 - / - ಇಲಿಗಳು p35 - / - ಮೆದುಳಿನ ಫಿನೋಟೈಪ್ (ಅಂಜೂರ. 1E). ಈ ಡೇಟಾವು 1.2-kb p35 ಪ್ರವರ್ತಕವು ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಜೆನ್‌ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ p35 ಜೀನ್‌ನಿಂದ p35 ಗೆ ಹೋಲುವ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಪ್ರೊಫೈಲ್‌ನೊಂದಿಗೆ ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
PxNUMX ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮಟ್ಟವು Cdk35 ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಅಪ್-ನಿಯಂತ್ರಣಕ್ಕಾಗಿ ದರ-ಮಿತಿಯಾಗಿದೆ. P35 - / -, p5 +/–, ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್, Tgp35, Cdk35 +/–, ಮತ್ತು TgCdk35 ಇಲಿಗಳಿಂದ 5 ನೇ ವಯಸ್ಸಿನಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಮೇಲೆ p5 ಮತ್ತು Cdk3 ಎನ್‌ಕೋಡಿಂಗ್ ಮಾಡುವ ಜೀನ್‌ಗಳ ಜೀನ್-ಡೋಸೇಜ್ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ನಾವು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ. P35 ಮತ್ತು Cdk5 ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಮಟ್ಟಗಳು ಕ್ರಮವಾಗಿ ಜೀನ್ ಡೋಸೇಜ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿವೆ (ಅಂಜೂರ. 2 A ಮತ್ತು B). ಕಾಡು-ಮಾದರಿಯ ಇಲಿಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ Tgp35 ಇಲಿಗಳು p1.6 ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ≈35-ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ತೋರಿಸಿದವು, ಆದರೆ Cdk5 ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮಟ್ಟಗಳು ವಿವಿಧ ಹಂತದ p35 ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನಿಂದ ಪ್ರಭಾವಿತವಾಗಲಿಲ್ಲ. ಕಾಡು-ಮಾದರಿಯ ಇಲಿಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ TgCdk5 ಇಲಿಗಳು Cdk1.9 ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ≈5 ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ತೋರಿಸಿದವು, ಆದರೆ p35 ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮಟ್ಟಗಳು ವಿಭಿನ್ನ ಮಟ್ಟದ Cdk5 ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನಿಂದ ಪ್ರಭಾವಿತವಾಗಲಿಲ್ಲ. Cdk35 ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಮೇಲೆ ವಿವಿಧ ಪ್ರಮಾಣದ p5 ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು, Cdk5 ಅನ್ನು ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ವಿರೋಧಿ ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ ಸ್ಟ್ರೈಟಲ್ ಸಾರಗಳಿಂದ ಇಮ್ಯುನೊಪ್ರೆಸಿಪಿಟೇಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕೈನೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ಅಂತೆಯೇ, ಕೈನೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಮೇಲೆ ವಿವಿಧ ಪ್ರಮಾಣದ ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು, ಪಿಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ಪಿಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ವಿರೋಧಿ ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ ಸ್ಟ್ರೈಟಲ್ ಸಾರಗಳಿಂದ ಇಮ್ಯುನೊಪ್ರೆಸಿಪಿಟೇಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕೈನೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಯಿತು. Cdk5 ಚಟುವಟಿಕೆಯು p5 ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಮಟ್ಟದೊಂದಿಗೆ ಉತ್ತಮ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಆದರೆ Cdk35 ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಮಟ್ಟದೊಂದಿಗೆ ಅಲ್ಲ (ಅಂಜೂರ. 2 C ಮತ್ತು D). ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು pxNUMX ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಪ್ರಮಾಣವು Cdk35 ಚಟುವಟಿಕೆಗೆ ದರ-ಸೀಮಿತಗೊಳಿಸುವ ಅಂಶವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ ಸ್ಟ್ರೈಟಲ್ ಡೋಪಮೈನ್ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿದ ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ತನಿಖೆ ಮಾಡಲು ನಾವು ಟಿಜಿಪಿಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಇಲಿಗಳನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ.
Thr-32 ನಲ್ಲಿನ DARPP-34 ನ ಕೊಕೇನ್-ಪ್ರೇರಿತ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ Tgp35 ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನ ಸೆಳೆಯುತ್ತದೆ. DARPP-32 ನ ಕಾರ್ಯವು ಅನೇಕ ಸೈಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಅದರ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿರುತ್ತದೆ (20). Thr-32 ನಲ್ಲಿ PKA ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಟ್‌ಗಳು DARPP-34, ಆದರೆ Cdk5 ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಟ್‌ಗಳು DARPP-32 Thr-75 ನಲ್ಲಿ. ಹೀಗಾಗಿ, ನಾವು ಕಾಡು-ಮಾದರಿಯ ಮತ್ತು Tgp32 ಇಲಿಗಳಿಂದ ಸ್ಟ್ರೈಟಲ್ ಸಾರಗಳಲ್ಲಿ DARPP-35 ನ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ. Tgp75 ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಫಾಸ್ಫೋ- Thr-32 DARPP-35 ಮಟ್ಟ ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ (ಅಂಜೂರ. 3A; 1.6 wild ಕಾಡು-ಮಾದರಿಯ ಇಲಿಗಳ ಮೌಲ್ಯಕ್ಕಿಂತ 0.2- ಪಟ್ಟು). ಸ್ಟ್ರೈಟಲ್ ಡೋಪಮೈನ್ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿದ ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ನಾವು ಮುಂದಿನದಾಗಿ ನಿರ್ಣಯಿಸಿದ್ದೇವೆ. Thr-5 ನಲ್ಲಿ DARPP-35 ನ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸುವ ಮೂಲಕ ನಾವು Tgp32 ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಕೊಕೇನ್-ಪ್ರೇರಿತ PKA ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಕೊಕೇನ್ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ನಂತರ ಕಾಡು-ಮಾದರಿಯ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ 34 ನಿಮಿಷದಲ್ಲಿ ಫಾಸ್ಫೋ-ಥ್ರ-ಎಕ್ಸ್‌ನ್ಯೂಎಕ್ಸ್ ಡಾರ್ಪ್-ಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲಾಗಿದೆ (ಅಂಜೂರ. 3B; 1.8 ± 0.2- ಪಟ್ಟು ತಳದ ಮಟ್ಟಕ್ಕಿಂತ). ಆದಾಗ್ಯೂ, DARPP-34 ನ Thr-32 ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಮೇಲೆ ಕೊಕೇನ್‌ನ ಪರಿಣಾಮವು Tgp35 ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ (1.2 ± 0.3- ಪಟ್ಟು ತಳದ ಮಟ್ಟಕ್ಕಿಂತಲೂ ಹೆಚ್ಚಿದೆ) ಗಮನ ಸೆಳೆಯಿತು. ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಹೆಚ್ಚಳವು ಕೊಕೇನ್-ಪ್ರೇರಿತ ಪಿಕೆಎ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಬಹುಶಃ ಥಾರ್-ಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ (ಡಿಎಆರ್ಪಿಪಿ-ಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್) ಮೂಲಕ ಗಮನ ಸೆಳೆಯಿತು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.6, 12). ಪ್ರಿಸ್ನಾಪ್ಟಿಕ್ ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಹೆಚ್ಚಳವು ಡೋಪಮೈನ್ ಬಿಡುಗಡೆಯು ಕಡಿಮೆಯಾಗಲು ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಇದು ಕೊಕೇನ್ ನ ಕಡಿಮೆ ಪರಿಣಾಮಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, ಕೊಕೇನ್‌ನ ಒಂದು ಚುಚ್ಚುಮದ್ದು p5 ಮತ್ತು Cdk35 ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಮಟ್ಟ ಮತ್ತು ಕೈನೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಲಿಲ್ಲ (ಅಂಜೂರ. 3 C ಮತ್ತು D). ಇದು ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿದೆ, ಇದರಲ್ಲಿ ಕೊಕೇನ್ಗೆ ದೀರ್ಘಕಾಲದ ಮಾನ್ಯತೆ p35 ಮತ್ತು Cdk5 ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ (6).
Cdk5 ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಅಪ್-ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್ ERK1 / 2 ನ ಕೊಕೇನ್-ಪ್ರೇರಿತ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಗಮನಿಸುತ್ತದೆ. ಸ್ಟ್ರೈಟಂನಲ್ಲಿನ ಡೋಪಮೈನ್ ರಿಸೆಪ್ಟರ್ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯು ಇಆರ್ಕೆ ಮಾರ್ಗ ಸೇರಿದಂತೆ ಇತರ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಕ್ಯಾಸ್ಕೇಡ್‌ಗಳನ್ನು ಸಹ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಇತ್ತೀಚಿನ ಪುರಾವೆಗಳು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ (21, 22), ಇದು ಕೊಕೇನ್ಗೆ ವರ್ತನೆಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ (23). ಆದ್ದರಿಂದ ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯು ಇಆರ್ಕೆ ಮಾರ್ಗದ ಕೊಕೇನ್ ಪ್ರೇರಿತ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಬಹುದೇ ಎಂದು ನಾವು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಕಾಡು-ಮಾದರಿಯ ಇಲಿಗಳಿಂದ ಸ್ಟ್ರೈಟಲ್ ಸಾರಗಳಲ್ಲಿ ಕೊಕೇನ್ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ನಂತರ ಇಆರ್ಕೆ ಮಾರ್ಗದ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದು ಸೆರ್-ಎಕ್ಸ್‌ನ್ಯೂಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಮತ್ತು ಸೆರ್-ಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ (ಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ± ಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್-ಬಾಸಲ್ ಮಟ್ಟಕ್ಕಿಂತಲೂ) ಮತ್ತು ಇಆರ್‌ಕೆಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್‌ಎಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಮೆಕೆಕ್ಸ್‌ನಮ್ಎಕ್ಸ್ / ಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್‌ಎಕ್ಸ್‌ನ ಹೆಚ್ಚಿದ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಮೂಲಕ ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿದೆ. / 5 Thr-1 ಮತ್ತು Tyr-2 ನಲ್ಲಿ (ERK217 ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್: 221 ± 1.5- ತಳದ ಮಟ್ಟಕ್ಕಿಂತ ಪಟ್ಟು) (ಅಂಜೂರ. 4 A ಮತ್ತು B). ಆದಾಗ್ಯೂ, ಕೊಕೇನ್-ಪ್ರೇರಿತ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆ MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-basal level above) ಮತ್ತು ERK1 / 2 (ERK2 phosphorylation: 1.2 ± 0.2- ಪಟ್ಟು ತಳದ ಮಟ್ಟಕ್ಕಿಂತ) Tgp35 ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಅಟೆನ್ಯೂಯೇಟ್ ಆಗಿತ್ತು.ಅಂಜೂರ. 4 A ಮತ್ತು B). ಇದಲ್ಲದೆ, Tgp1 ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ (ಕಾಡು-ಮಾದರಿಯ ಇಲಿಗಳ ಮೌಲ್ಯಕ್ಕಿಂತ 2 ± 35- ಪಟ್ಟು) ಫಾಸ್ಫೋ-ಇಆರ್‌ಕೆಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ / ಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್‌ಎಕ್ಸ್‌ನ ತಳದ ಮಟ್ಟಗಳು ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದ್ದವು, ಆದರೆ ಈ ಪ್ರವೃತ್ತಿ ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯವಾಗಿ ಮಹತ್ವದ್ದಾಗಿರಲಿಲ್ಲ. ಈ ನಂತರದ ಫಲಿತಾಂಶವನ್ನು Thr-0.8 ನಲ್ಲಿ MEK0.2 ನ Cdk5- ಅವಲಂಬಿತ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಕಾರಣವೆಂದು ಹೇಳಬಹುದು, ಇದರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ವೇಗವರ್ಧಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಇಳಿಕೆ ಕಂಡುಬರುತ್ತದೆ (24). ಈ ಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಣಯಿಸಲು, ನಾವು Thr-1 ನಲ್ಲಿ MEK286 ನ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು Tgp286 ಇಲಿಗಳಿಂದ ಸ್ಟ್ರೈಟಲ್ ಸಾರಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟದ ಫಾಸ್ಫೋ- Thr-1 MEK35 ಇರುವುದನ್ನು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಅಂಜೂರ. 4C; 1.3 wild ಕಾಡು-ಮಾದರಿಯ ಇಲಿಗಳ ಮೌಲ್ಯಕ್ಕಿಂತ 0.1- ಪಟ್ಟು). ಇದಲ್ಲದೆ, Thr-1 ನಲ್ಲಿನ MEK286 ನ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಕೊಕೇನ್‌ನ ಒಂದು ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನಿಂದ ಬದಲಾಯಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ, ಇದು Cdk5 ಚಟುವಟಿಕೆಯು ಚಿಕಿತ್ಸೆಯಿಂದ ಪ್ರಭಾವಿತವಾಗುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದು ಕಂಡುಹಿಡಿದಿದೆ (ಅಂಜೂರ. 3D).
ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗೆ ಡೋಪಮೈನ್ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಪ್ರಸರಣವು ಹೆಚ್ಚಿದ ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯಿಂದ ಗಮನ ಸೆಳೆಯುತ್ತದೆ. ಪಿಕೆಎ ಮತ್ತು ಇಆರ್ಕೆ ಒಳಗೊಂಡ ಬಹು ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಕ್ಯಾಸ್ಕೇಡ್‌ಗಳ ಕೊಕೇನ್-ಪ್ರೇರಿತ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯು ಸೆರ್-ಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ () ನಲ್ಲಿ ಅದರ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಮೂಲಕ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಿಆರ್ಇಬಿ ಎಂಬ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಅಂಶವನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲು ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.22, 25). ಪಿಕೆಎ ಮತ್ತು ಇಆರ್ಕೆ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವ ಕ್ಯಾಸ್ಕೇಡ್‌ಗಳ ಮೇಲಿನ ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ ಪರಿಣಾಮಗಳು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ನಲ್ಲಿನ ಸಿಆರ್ಇಬಿ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಮೇಲೆ ಒಮ್ಮುಖವಾಗಬಹುದೇ ಎಂದು ತನಿಖೆ ಮಾಡಲು, ನಾವು ಕಾಡು-ಮಾದರಿಯ ಮತ್ತು ಟಿಜಿಪಿಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಇಲಿಗಳಿಂದ ಸ್ಟ್ರೈಟಲ್ ಸಾರಗಳಲ್ಲಿ ಸೆರ್-ಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್‌ಎಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಿಆರ್‌ಇಬಿಯ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ. Tgp5 ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ (ಕಾಡು-ಮಾದರಿಯ ಇಲಿಗಳ ಮೌಲ್ಯದ 133 ± 35- ಪಟ್ಟು) ಫಾಸ್ಫೋ-ಸಿಆರ್‌ಇಬಿಯ ತಳದ ಮಟ್ಟವು ಕಡಿಮೆಯಾಗಿತ್ತು (ಅಂಜೂರ. 5). ಕೊಕೇನ್ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ, ಕಾಡು-ಮಾದರಿಯ ಇಲಿಗಳ ಸ್ಟ್ರೈಟಟಮ್ನಲ್ಲಿ (1.5 ± 0.1- ಪಟ್ಟು ತಳದ ಮಟ್ಟಕ್ಕಿಂತ) ಫಾಸ್ಫೋ-ಸಿಆರ್ಇಬಿ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲಾಯಿತು, ಆದರೆ ಕೊಕೇನ್ಗೆ ಈ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು Tgp35 ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ (1.2 ± 0.1- ತಳದ ಮಟ್ಟಕ್ಕಿಂತ ಪಟ್ಟು) (ಅಂಜೂರ. 5).
ಸೆರ್-ಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್‌ಎಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಿಆರ್‌ಇಬಿಯ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಸಿ-ಫಾಸ್ ಜೀನ್ ಸೇರಿದಂತೆ ಕೆಲವು ಜೀನ್‌ಗಳ ಪ್ರವರ್ತಕ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ ಸಿಎಎಮ್‌ಪಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಅಂಶದ ಮೂಲಕ ಅದರ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ (26). ಆದ್ದರಿಂದ ಕೊಕೇನ್ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ನಂತರ ಕಾಡು-ಮಾದರಿಯ ಮತ್ತು ಟಿಜಿಪಿಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಇಲಿಗಳ ಸ್ಟ್ರೈಟಂನಲ್ಲಿ ಸಿ-ಫಾಸ್ನ ಪ್ರಚೋದನೆಯನ್ನು ನಾವು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಕಾಡು-ಮಾದರಿಯ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ, ಸಿ-ಫಾಸ್ ಎಮ್ಆರ್ಎನ್ಎ ಮಟ್ಟವು ಗರಿಷ್ಠ ಮೌಲ್ಯಕ್ಕೆ ಏರಿತು (ಕೊಸೇನ್ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ನಂತರ 35 ± 1.8- ಪಟ್ಟು) 0.2 ನಿಮಿಷ, ಮತ್ತು ತರುವಾಯ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ನಂತರ 30 ನಿಮಿಷದಿಂದ ತಳದ ಮಟ್ಟಕ್ಕೆ ಮರಳಿತು (ಅಂಜೂರ. 6 A ಮತ್ತು B). ಆದಾಗ್ಯೂ, ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ನಂತರ 30 ನಿಮಿಷದವರೆಗೆ ಕಾಡು-ಮಾದರಿಯ ಇಲಿಗಳಿಗಿಂತ C-fos mRNA ಯ ಮಟ್ಟಗಳು Tgp35 ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ≈30% ಕಡಿಮೆ ಇತ್ತು (ಅಂಜೂರ. 6 A ಮತ್ತು B). Tgp35 ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಸಿ-ಫಾಸ್ನ ಕಡಿಮೆ ಪ್ರಚೋದನೆಯನ್ನು ಇಮ್ಯುನೊಹಿಸ್ಟೊಕೆಮಿಸ್ಟ್ರಿ ಮತ್ತಷ್ಟು ದೃ bo ಪಡಿಸಿತು (ಅಂಜೂರ. 6 C-F). ಕೊಕೇನ್ ಆಡಳಿತವು ಸಿ-ಫಾಸ್ ಇಮ್ಯುನೊಆರೆಕ್ಟಿವಿಟಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿತು, ಸ್ಟ್ರೈಟಮ್‌ನ ಡಾರ್ಸೋಮೆಡಿಯಲ್-ಡಾರ್ಸೊಸೆಂಟ್ರಲ್ ಭಾಗಗಳಲ್ಲಿ ಮತ್ತು ಪಾರ್ಶ್ವ ಭಾಗಗಳಲ್ಲಿ ದುರ್ಬಲವಾಗಿ, ಕಾಡು-ರೀತಿಯ ಮತ್ತು ಟಿಜಿಪಿಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಸಿ-ಫಾಸ್-ಇಮ್ಯುನೊಪಾಸಿಟಿವ್ ಕೋಶಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿ ಕೊಕೇನ್-ಪ್ರೇರಿತ ಹೆಚ್ಚಳವು ಟಿಜಿಪಿಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಇಲಿಗಳ ಸ್ಟ್ರೈಟಟಮ್ನಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಗಮನ ಸೆಳೆಯಿತು (ಅಂಜೂರ. 6G). ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಸ್‌ಗೆ ಸ್ಟ್ರೈಟಲ್ ಡೋಪಮೈನ್ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್‌ನ ಕೊಕೇನ್-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ವರ್ಧನೆಯು Tgp35 ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಹೆಚ್ಚಿದ ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಫಲಿತಾಂಶವಾಗಿದೆ.
ಚರ್ಚೆ
Cdk5 ಮತ್ತು ಅದರ ಆಕ್ಟಿವೇಟರ್ p35 ಅನ್ನು ಗುರಿ ಜೀನ್‌ಗಳಾಗಿ ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇವುಗಳು ಕೊಕೇನ್ಗೆ ದೀರ್ಘಕಾಲದವರೆಗೆ ಒಡ್ಡಿಕೊಳ್ಳುವುದರಿಂದ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲ್ಪಡುತ್ತವೆ (6). Cdk5 ಅಪ್-ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್‌ಗಿಂತ p35 ಅಪ್-ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್‌ನ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ, ಹೆಚ್ಚಿದ Cdk5 ಚಟುವಟಿಕೆಯು ಸ್ಟ್ರೈಟಲ್ ನ್ಯೂರಾನ್ಗಳಲ್ಲಿ ಕೊಕೇನ್-ಮಧ್ಯಸ್ಥ ಡೋಪಮೈನ್ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್‌ನ ಅಟೆನ್ಯೂಯೇಷನ್‌ಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಎಂಬುದಕ್ಕೆ ನಾವು ಇಲ್ಲಿ ಪುರಾವೆಗಳನ್ನು ವರದಿ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ. ಸ್ಟ್ರೈಟಲ್ ಡೋಪಮೈನ್ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಅಥವಾ ಪಿಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್‌ಎಕ್ಸ್‌ನ ಅಪ್-ನಿಯಂತ್ರಿತ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು, ಎರಡು ಟ್ರಾನ್ಸ್ಜೆನಿಕ್ ಮೌಸ್ ಲೈನ್‌ಗಳಾದ ಟಿಜಿಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಮತ್ತು ಟಿಜಿಪಿಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಇಲಿಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ. Cdk5 ಚಟುವಟಿಕೆಯು p35 ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಹೆಚ್ಚಿದ ಮಟ್ಟಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ ಆದರೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟದ Cdk5 ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನಿಂದ ಅದು ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುವುದಿಲ್ಲ. ನಮ್ಮ ಹಿಂದಿನ ವರದಿಯು TgCdk35 ಮೌಸ್ ಮೆದುಳಿನಲ್ಲಿನ Cdk5 ಚಟುವಟಿಕೆಯು ಕಾಡು-ಮಾದರಿಯ ಮೌಸ್ ಮೆದುಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ.17), p5 ಮಟ್ಟವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸದಿದ್ದರೆ Cdk5 ಅತಿಯಾದ ಒತ್ತಡವು ಮೊನೊಮೆರಿಕ್ Cdk35 ನ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು pxNUMX ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಮಟ್ಟವು Cdk35 ಚಟುವಟಿಕೆಗೆ ದರ-ಸೀಮಿತಗೊಳಿಸುವ ಅಂಶವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಕೊಕೇನ್ ತೀವ್ರ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ನಂತರ ಟಿಜಿಪಿಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಇಲಿಗಳು ಸಿಆರ್ಇಬಿ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಮತ್ತು ಸಿ-ಫಾಸ್ ಎರಡನ್ನೂ ಕಡಿಮೆ ಪ್ರಚೋದನೆಯನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸಿದವು, ಹೆಚ್ಚಿದ ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯಿಂದ ಕೊಕೇನ್ಗೆ ಸ್ಟ್ರೈಟಲ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. Tgp35 ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿನ ಕೊಕೇನ್-ಮಧ್ಯಸ್ಥ ಡೋಪಮೈನ್ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್‌ನ ಅಟೆನ್ಯೂಯೇಷನ್ ಅನ್ನು DdPP-5, PKA, ಮತ್ತು ERK ಒಳಗೊಂಡ ಬಹು ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಕ್ಯಾಸ್ಕೇಡ್‌ಗಳ Cdk35- ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ಪ್ರತಿಬಂಧದ ಮೂಲಕ ಸಾಧಿಸಬಹುದು. ಕೊಕೇನ್ ಆಡಳಿತವು ಕಾಡು-ಮಾದರಿಯ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ Thr-5 ನಲ್ಲಿ DARPP-32 ನ PKA ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಅನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿತು, ಆದರೆ ಈ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು Tgp32 ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿಸಲಾಗಿದೆ. Thr-34 ನಲ್ಲಿನ DARPP-35 ನ PKA ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಫಾಸ್ಫಟೇಸ್ 32 (PP34) ನ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದು CREB ಯ Ser-1 ನ ಡಿಫೊಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ಗೆ ಕಾರಣವಾದ ಕಿಣ್ವ (27). ಆದ್ದರಿಂದ, Tgp1 ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿನ DARPP-32 / PP1 ಮಾರ್ಗದ ಮೂಲಕ PP35 ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ವಿರೋಧಿಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ.
ERK1 / 2 ನ ಕೊಕೇನ್-ಪ್ರೇರಿತ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯು Tgp35 ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿಯೂ ಸಹ ಗಮನ ಸೆಳೆಯಿತು. ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಇಆರ್ಕೆಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ / ಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ನ ಕೊಕೇನ್-ಪ್ರೇರಿತ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ತಡೆಯುವ ಹಲವಾರು ವಿಭಿನ್ನ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳಿವೆ. ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ, Thr-5 ನಲ್ಲಿನ DARPP-1 ನ Cdk2- ಅವಲಂಬಿತ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ PKA ಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ERK5 / 32 ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಗೆ ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಯಾವುದೇ PKA- ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ MEK75 / 1 ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯ ನಂತರದ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. MEK ಕ್ರಿಯಾಶೀಲತೆಯ ಪರೋಕ್ಷ ನಿಯಂತ್ರಣ ಮತ್ತು ಟೈರೋಸಿನ್ ಸ್ಟ್ರೈಟಲ್-ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಫಾಸ್ಫಟೇಸ್ನ ನಿಯಂತ್ರಣವನ್ನು ಒಳಗೊಂಡ ಅನೇಕ ಮಾರ್ಗಗಳ ಮೂಲಕ ERK2 / 1 ನ ಕೊಕೇನ್-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಗೆ Thr-2 ನಲ್ಲಿನ DARPP-32 ನ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಅಗತ್ಯವಿದೆ ಎಂದು ಇತ್ತೀಚಿನ ಅಧ್ಯಯನವು ಕಂಡುಹಿಡಿದಿದೆ. ERK34 / 1 ನಲ್ಲಿ ನೇರವಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುವ ಫಾಸ್ಫಟೇಸ್ (28). ಸೆರ್-ಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಮತ್ತು ಸೆರ್-ಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್‌ಎಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿನ ಮೆಕೆಕ್ಸ್‌ನಮ್ಎಕ್ಸ್ / ಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್‌ಎಕ್ಸ್‌ನ ಕೊಕೇನ್-ಪ್ರೇರಿತ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಅನ್ನು ಟಿಜಿಪಿಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ರದ್ದುಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ಕಂಡುಹಿಡಿಯುವ ಮೂಲಕ ಈ ಸಾಧ್ಯತೆಗೆ ಬೆಂಬಲವನ್ನು ಸೂಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. Thr-1 ನಲ್ಲಿ MEK2 ನ Cdk217- ಅವಲಂಬಿತ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಮೂಲಕ ಮತ್ತೊಂದು ಸಾಧ್ಯತೆಯ ಮಾರ್ಗವಾಗಿದೆ, ಇದು ಅದರ ವೇಗವರ್ಧಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಇಳಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ERK221 / 35 ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಪ್ರತಿಬಂಧಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ (24).
ಸ್ಟ್ರೈಟಂನಲ್ಲಿನ ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್ಎನ್ಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಪ್ರತಿಬಂಧವು ಪ್ರಾಣಿಗಳಲ್ಲಿ ದೀರ್ಘಕಾಲದ ಕೊಕೇನ್ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ವರ್ತನೆಯ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಸಮರ್ಥಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ (6). Cdk5 ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಮೇಲಿನ ನಿಯಂತ್ರಣವು ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಕೊಕೇನ್ ಆಡಳಿತದ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಎದುರಿಸಲು ನರಕೋಶದ ರೂಪಾಂತರಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು ಎಂಬ othes ಹೆಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತದೆ (6). ಪಿಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಅಪ್-ರೆಗ್ಯುಲೇಷನ್‌ನ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿದ ಸಿಡಿಕೆಎಕ್ಸ್‌ಎನ್‌ಯುಎಮ್ಎಕ್ಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯು ಕೊಕೇನ್ಗೆ ದೀರ್ಘಕಾಲದವರೆಗೆ ಒಡ್ಡಿಕೊಂಡ ನಂತರ ಸ್ಟ್ರೈಟಟಮ್ನಲ್ಲಿ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸಬಹುದು ಎಂಬ ಕಲ್ಪನೆಯನ್ನು ನಮ್ಮ ಸಂಶೋಧನೆಗಳು ಬೆಂಬಲಿಸುತ್ತವೆ. ಸಿಆರ್ಇಬಿ ಮತ್ತು ಸಿ-ಫಾಸ್‌ನಂತಹ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಅಂಶಗಳ ಚಟುವಟಿಕೆಗಳಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳ ಮೂಲಕ ಇದು ಸಂಭವಿಸಬಹುದು. ಆದ್ದರಿಂದ, Cdk5 ಆಕ್ಟಿವೇಟರ್ p35, Cdk5 ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಮೇಲೆ ಅದರ ದರ-ಸೀಮಿತಗೊಳಿಸುವ ಪರಿಣಾಮಗಳ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿ, ಕೊಕೇನ್ ಚಟಕ್ಕೆ ಆಧಾರವಾಗಿರುವ ನರಕೋಶದ ಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ದೀರ್ಘಕಾಲೀನ ಬದಲಾವಣೆಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು..
ಮನ್ನಣೆಗಳು
ನಾವು ಡಾ. ಹಸ್ತಪ್ರತಿಯ ವಿಮರ್ಶಾತ್ಮಕ ಓದುವಿಕೆಗಾಗಿ ಮೇರಿ ಜೋ ಡಾಂಟನ್, ಫಿಲಿಪ್ ಗ್ರಾಂಟ್ ಮತ್ತು ಸಶಿ ಕೇಶವಪನಿ. ಈ ಕೆಲಸವನ್ನು ನ್ಯಾಷನಲ್ ಇನ್‌ಸ್ಟಿಟ್ಯೂಟ್ ಆಫ್ ಹೆಲ್ತ್ ಗ್ರಾಂಟ್ Z01DE00664-05 (ಎಬಿಕೆಗೆ), ಯುಎಸ್ ಸಾರ್ವಜನಿಕ ಆರೋಗ್ಯ ಸೇವೆ ಗ್ರಾಂಟ್ DA10044 ಮತ್ತು ಸೈಮನ್ಸ್ ಫೌಂಡೇಶನ್, ಪೀಟರ್ ಜೆ. ಶಾರ್ಪ್ ಫೌಂಡೇಶನ್ ಮತ್ತು ಪಿಕವರ್ ಫೌಂಡೇಶನ್ (ಪಿಜಿಗೆ) ಅನುದಾನದಿಂದ ಬೆಂಬಲಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಟಿಪ್ಪಣಿಗಳು
ಸಂಕ್ಷೇಪಣಗಳು: Cdk5, ಸೈಕ್ಲಿನ್-ಅವಲಂಬಿತ ಕೈನೇಸ್ 5; ಇಆರ್ಕೆ, ಬಾಹ್ಯಕೋಶೀಯ ಸಿಗ್ನಲ್-ನಿಯಂತ್ರಿತ ಕೈನೇಸ್; DARPP-32, ಡೋಪಮೈನ್ ಮತ್ತು CAMP- ನಿಯಂತ್ರಿತ ಫಾಸ್ಫೊಪ್ರೊಟೀನ್, ಆಣ್ವಿಕ ದ್ರವ್ಯರಾಶಿ 32 kDa; ಪಿಕೆಎ, ಸಿಎಎಂಪಿ-ಅವಲಂಬಿತ ಕೈನೇಸ್; ಎಂಇಕೆ, ಇಆರ್ಕೆ ಕೈನೇಸ್; CREB, cAMP- ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಅಂಶ-ಬಂಧಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್.
ಉಲ್ಲೇಖಗಳು
;