PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Abstract
Guherandinên gene-ê di guhartina jenê de guhertin di morfolojiya neuronal û tevgerê de dibe ku dibe ku kokkotanê binivîse. Me ji bo hîstone 3 lysine 9 (H3K9) dimethylasyon û G9a lysine dimethyltransferase di cocaine-insulateded plasticity and behavioral behavior. Birêvebiriya kocaine di asta nucleus de asta globala H3K9 dimethylasyon kêm kir. TDi kêmkirina wî ya mîtîlasyonê de ji hêla zexta G9a ve di nav vê mizgeftê de hate damezirandin, ku ji hêla faktora veguherîna kocaine-ê ve ΔFosB bû. Dema veguherîna mutagenesis û veguhestina veneal-mediated, me dît ku G9a nehêleya paqijî ya dansîtîk a nucleus nîjonî û tercîhkirina zêdebûna cocaine zêde bû, û bi vî awayî ji bo çalakiyên demkî yên kocaine-a-histone-methylasyonê girîng e.
Pêşkêş
Bişkojka kococaine re tête guhertin li ser guhartinên di jene expressionê de û morafolojiya neuronal di hundurê nucleus de (nifleus), nîqaşeke sereke ya xelata mêjî (1-2). Guhertina Chromatin girîng di guhertinên veguherîkal ên di vê mizgeftê de girîng e ku dibe ku hêla hûrgelên kokolê (3-9). Regulasyona Cocaine di çarçoveya encamên chromatin de di encama NAc de, beşek ji radyoya cocaine-înducedkirî ya makîneya enzymatic a chromatin, ku di rê de di guhertina histone acetylasyon û phosphorylation de (4, 7-9); Lêbelê, rola ji bo enzîmên kontrolkirina hîstoneya histone nehatiye lêkolîn kirin.
Di analîzê de giyayê gumanbar a pirr bi bikaranîna mîkrokraysan (ChIP-Chip) ya ku di nav NAc de dermankirina dermanên kocaine ve hate dagirkirin, nirxandinên histone H3 lysine 9 (H3K9) û 27 (H3K27)6). Ji ber vê yekê em gelek gelek lysine methyltransferases (KMTs) û demethylases (KDMs) ku ji bo H3K9 an H3K27 methylation kontrol dikin (Nig. 1A). Ten du enzîmên, G9a û GLP, biryara rêveberiya berdewamî ya 24 piştî dagirkeriya kocaine ve dubare kir, dema ku herdu genes bi awayekî girîng vekirî bû. Ji ber ku G9a û GLP bi taybetmendiya H3K9 (H3K9me2) kurt dike, ji hêla cocaine ve ji hêla cocaine re asta globala euchromatic H3K9me2 kêm di vê demê de hate dîtin.Nig. 1B). Berevajî, asta cîhanî ya heterochromatic H3K27 methylation bi aloziya kocaine re dubare ne (S1 di warê materyalê de piştgirî bike). Ji ber ku asta bilind ya çalakiya katalîtîk herdu jî li vitro û vivo (10), em ji bo nerazîkirina kocaine-ê di NAcê de piştî girîngiya zordariya G9a lêkolîn kir. Pîvana G9a protein, mîna asta wê ya MRNA, piştî ku rêveberiya kocaine ve dubare dubare qasî 24 kêm bûnS2). Tevî ku G9a MRNA expression di NAN de kêm bû, di NAc de, analîzên immunohistochemîkî kêm kiribû ku 35% kêmkirina kêmkirina proteîneya G15a ya G9a% rêjeya xuyakirinê, bi 21% re ya girêdayî H3K9me2 kêmtir piştî rêveberiya kocaine (Nig. 1B). G9a MRNA îfadeyê jî di vê devera mizgeftê de ji aliyê 20% ve hatibû xwarê ye, piştî xweya xweseriya kocaine (S3).
Ji bo ku bizanibin ka H3K9me2 di guhertoya gene-expression de li gene expression di têkiliya jenê de bi têkiliyê ve girêdayî ye, em analîzên microarray dixebitin ku profîlên îdeolojiya gene-êkêşînek ji hêla doktorê cocaine ve di heywanên pêşîn de ji ber pêşniyarên pêşîn ên kocaine (lêgerîn bibînin) lîsteyên gene Tables S1-S3). Kesên ku cocaine dubare kiribû, dravanek gene nîşan dide xuyakirin ku piştî demjimêrkek 1 piştî kûçek kocaine-ê di berhevkirina heywanên tedawî de (Nig. 1C). Ev xuyabûna jene ya zêdebûna hêla bersivê ya 1 piştî hefteya vekişîna ji kocaine ve hate dayîn. Li gorî raportên berê, bi sedemên piçûk (~ 10%) bersivên bersivên nermalavî yên jêrîn nîşan da (piştî rêveberiya kocaine)Nig. 1C; dîtin S1 Table) (5). Ji bo rasterastiya rola G9a di binpêkirina gene-ê de derxistin, piştî ku kocaine re dubare kirin, mice tête nav-NAc derheqên Herpes a Simplex Virus (HSV) veguhestin GFP an G9a û bi kozînek an jî kocaine dubare kirin ku tête diyarkirin ku ka G9a bêtir danser Ji bo pêşveçûnê ya jenê veguhestina cocaine-êduk dubare berbiçav bû. Ji ji pirtûka 12 veguhastî jenas hilbijêrin asta hişmendiyê nîşan dide ku piştî duyemîn cocaine, me dît ku G9a%S4 Table).
Ji bo ku bizavên G9a veguhestina cocaine-êrişê dubare kirin, ji bo ΔFosB, hilberek paqij a zû ya zû ya zû zû zû zû zû lêkolînek lêkolîn kirin. fosB. ΔFosB li NAcê piştî piştî dubarekirina cocaine, li ku li wê derê ve girêdayî bûye xelata cocaine zêde dike (11). ΔFosB dikare wekî an jî çalakvanek an dorpêçê ve girêdayî ye ku li ser gene target hebûn (3, 5, 6, 12). Using bitransgenic NSE -tTA × tetOP-ΔFosB Çêçik, ku li îlanBê ΔFBB dikare di hilbijartinê de NAc û striatumên dorpêk ên heywanên heywanan (13), em bandora nerazîbûna ΔFBB li ser NAcê li H3K9me2 û KMTs li ser radyoya cocaine lêkolîn. ΔFosB overexpression ji bo asta hemî H3K9me2 kêm bikin (Nig. 1D) û axaftina G9a (Nig. 1E), bi vî awayî bandorên kokolê dubare kir. Li dijî, ΔFosB li ser vê mizgeftê GLP kêm kir, û li ser SVV39H1 û EZH2, bandorên trîmethylating enzyme ji bo H3K9 û H3K27, bi awayekî bandor (S4). Ji bo pergala ΔFBB-ê veguhestina serbixwe ya Bikaranîna serbixwe ya ΔFFB-ê, pişkên jorîn ên wildtype-însîpên nîjer-anî yên hevgirtî yên Adeno-girêdayî virusê (AAV) veguhestin GFP an jî ΔFosB. Di derheqê ΔFosBê ya Viral-Navnîşan de asta G9a di vê mizgeftê de kêm kir (Nig. 1E).
Vê qanûnên taybet û şexsî yên taybet yên G9a ji me re got ku hûn îfadekirina G9a bi taybetî bi nebronên NAcons re bersivên şêlên cocaine re veguherîne dikin. Mûşên WildType derheqên intra-NAc yên HSV vektorên GFP an G9a diyar dikin û ji nû ve hatine analîz kirin an jî cocaine-conditioneded placeed preference paradigm, ku ji bo nirxandina nexagonê nerasterast dide. Viral overexpression of G9a neurons in NAc hate piştrast kirin (Nig. 2A). G9a overexpression pir ji bo cocaine bi compared to heywanên GFP (Nig. 2B), û zêdebûna H3K9me2 di NAc (Nig. 2C). Zûtirîn a ji hevalbendiya mirinê ya G9a (G9aH1093K) (14) pêşniyara cocaine bandor nekir (Nig. 2B) û li ser H3K9me2 li herêmê mizgeftê li ser bandor nîne (Nig. 2C).
Ji bo rola G9a di encamên ciddî yên cocaine de bêtir bixwînin, û bêtir taybetmendî ku zordariya cocaine-êriş ya G9a li NAc, g9fl / fl masî (14) Încîlên Navneteweyî-Nêçîrvanên AAV vektorên wergirtin ku recombinase or GFP wekî kontrola xwe çêbikin. AAV-Cre-aşkere ya G9a li NAc, ku piştrast kir ku ew eksyonistochemîkî (S5), bandorên kocaine zêdebûna ceribandinên kargehên girîng ên zêdebûn zêde kir û di nav NAc de H3K9me2 (Nig. 2D, E). Bazirganiya dermankolojîk ya bazirganî ya G9a û GLP, BIX01294 (15-16), bi kar anîn ka ka kîjan enzyme di heman rengî de bersivên bersiva behsa bandorên cocaine bandor dike. Bêguman, pêşniyariya dermanxaneya G9a û GLP ji bo cocaine girîng bû sedema zêdekirin û H3K9me2 di NAc (Nig. 2F, G).
Rêveberiya domdariya kocaine zêdebûna dravîtên dendritîk li ser Nêçîrkên spî yên navendî yên navîn (17), pêvajoyek bi guhertinên fonksiyonî ve girêdayî ye ku li ser guhartinên glutamatergîk li ser van neurons (18-19) û bersivên hestyarî yên bi dermanan (17, 20). Em di vî awayî de têkoşîn kirin ku çalakiya G9a di NAcê de ji hêla kocaine ve hate derxistin dibe ku dibe ku hêza kocaine medîte bikin ku ji bo nebronên nêçîrkirina dendritic dendritîk dagire. Em antîoprecipitation (CHIP) bi antîloyê dijî ant-G9a tê bikaranîn, me ji nîjneyên G9a hedefên gene yên li NAc, her yek ji berî ku berê berê pasîkaya dendritîk dendritîk hatiye tesbît kirin (Nig. 3A) (20-26). Me dît ku ji rêveberiya kocaine re dubare bi gelemperî G9a kêm kirin, û herweha asta H3K9me2, li ser van gene (Nig. 3B). Bi berevajî, birêvebiriya rêveberiya kocaine bi lezgînî G9a hin ji wan re heman gene gene, ji hêla G9a zêdebûna gotinê ve di dema NAc 1 de piştî dermanek kokolê (S6). Tevî ku G9a bi taybetmendiyên jene yên taybet ên bi guhertinên di nav xwe de tête peywendîdar, ew ne diyar e ku ew bûyerên di navneteweyî de G9a di nav NAc û / an jî di navendên G9a veguhestina jêrîn vs. rêveberiya kocaine vegotin.
Li ser Niştimanî ya G9a li ser Nîscên pirrjimar ên pirrjimar in NAc, em bi rasterast lêpirsîn an naveroka kontrola G9a di herêmê mizgeftê de piştî dermankirina cocaine dubare kir ku ji bo avakirina kocaine-înduced dendritic block bike. Bikaranîna tedawiya cocaine ya berê berê xwe nîşanî xwenîşandanek da ku ji bo NAc (dravîteya spîn)20), em di heywanên spinal density de li ser HSV-GFP an jî HSV-G9a vexwendin. Di peymana paşîn ên berê de, em di NAcê de dermankirina kotokê piştî kocêk dendritic dînîtîtek girîng bû, bandorek ku bi temamî G9a veguhestina asteng hate qedexekirin (Nig. 3C). G9a overexpression tenê tengahî ne ku ji bo nexweşî ya kocaine-dendritîk-dendritîk-density-ê kêm bike. Ji bo daneyên van dane, G9afl / fl Mêgehên intra-NAc peyda bûna HSV-Cre û spine density kurt kirin û bi hêsanî bi heywanên HSV-GFP di nebûna kokolê de ye. Nakêşdanê ya G9a neronên spî yên nîjîkên spî yên li ser Nêçîrvanên spî yên giran zêde bûn (Nig. 3C).
Gelek delîlan da ku şahidiya G9a di encama doktorê dubare daktorî de bi ΔFosB ve dabeş kirin, paşê din lêkolîn ku ka faktoriya veguherînan di heman demê de di rêbazê ya NAc dendritîk. Tevî ku ΔFosB nehatiye ber bi sedemî pîtolojiya dendritîk ve girêdayî ye, çend hedefên xwe yên ku di nav deverên Cdk5 û NFκB de hate diyarkirin (20-23), û nerînên ΔFosB di NAc neuronên bi dermankirina cocaine re dubare dinalîtîk re girêdayî girêdayî dike. (27). Ya yekemîn, em dît ku pêvekirina ΔFosB di bisektoriya bergransgenîk de di nebûna kotonê de, ku G9a û H3K9me2 expression (Nig. 1D, E), G9a ji bo celebên pişesaziyê yên pirrjimar in plankirî kêm kir, gelek ji wan re nîşan kirin ku ji hêla ΔFosB xwe ve (Nig. 3D) (3, 6). Me din nîşanî ku vakslêdana derfetê ya ΔFosB di NAc de di bin mercên basal de, heman rengî rêveberiya kococaine duyemîn dît (Nig. 3E). Di encama NAc ya ΔJunD, a proteînek mutantor a serdestiyek nermalekirî ya ku li dijî çalakiya ΔFosB veguherandine dijberî, nerazîbûna doktorê kocaine asteng kir ku di NAc de zêde bibe (Nig. 3C).
Me çavdêriya me ku ΔFosB di NAcê de G9a veguhastin dike, û ku ΔFosB û G9a hin cûda hedef dikin, rêber kir ku em di navbera ΔFosB û G9a de têkiliyên din de lêkolîn bikin. Piştî kotokê acute, dema ku G9a astê zêde bûn, girêdayî G9a heta fosB Gene zêde bû, dema piştî kocaine re, dema ku G9a expression xistin, G9a binding to fosB gene kêm bû (Nig. 3A). Wek vê yekê G9a piştî ku kocaine dubare bûye bendê kêm bû c-fos, Li benda ku G9a binding ji hêla cocaine ve hate zêdekirin (S7). Ev rastiyek e ku, bêyî fosB, c-fos zehf kirin, nexşandin, bi riya psîkostomulantîk ya kronîk (5). ΔFosB li seranserê di çarçoveya bitransgenîk de pir têr bû ku bi gelemperî G9a bi bendê kêm bike fosb gene (Nig. 3D). Wekî din, G9a bêhtir berbiçav bû ku ji bo rêveberiya Kocaine ve hate zêdekirin.S4 Table). Ev daneyên pêşniyarên otoregulatoryê nîşan dide ku ji ber ku G9a di destpêkê de rêveberiya ΔFosB sînorê rêveberiya kocaine ya acor dike. Lê belê, wekî ΔFosB bi rexnegirtina dermankirinê dubare dike, ew G9a tengahiyê dike û ji ber vê yekê veguhestina xwe ya bêtir pêgirtî dike.
Di encamê de, em nîşan kir ku di henroya lysine methîlasyonê de di NAc de bi rexnegiran re tevlihev e ku di şiroveya kocaineê de zelalek zelalek neuronal ve girêdayî ye. Repression of G9a û H3K9me2 Piştî ku piştî rêveberiya kocaine hate dubare kirin, di çarçoveyê de, çalakiya veguherîna gelek cinsî ya ku celebên pîvanî yên pîtolojîk yên dendritîk tê veguherandin. Ji bo fêmkirina çêtirîna genên ku genes bi rêbazên van rêbazan ve têne çêkirin dê bingeha xwe ya bingeha biyolojiya biyolojîk çêtir bikin ku dibe sedema çêkirina dermankirinê û dibe ku di pêşveçûna dermanên bêhtir tedawî yên bêhtir yên tengahiyê de alîkarî bikin.
Alav û Rêbaz
Animals û derman
Heke din jî got gotin, pehek çar çar pênc perçek perçek li ser kolonyek bi saetek 12 / tarî ya tarî (ronahî ji ji 7: 00 AM heta 7: 00 PM) di germê berdewam (23 ° C) de bi ad libitum gihîştina avê û xwarinê. Protokola heywanan ji aliyê IACUC ve di UT-UT-Southwesterna Navenda Navîn û Çiyayê Sinai ya Dermanê de hat pejirandin.
Ji bo ezmûnên kocaine [mununîstisthehemitry, avêtina rojavayî, PCR (qPCR), mîkrokrayê û çromatin immunoprecipitation (CHIP)], 8- ji mêrê XXUM-B-XXUMBL / 10J-ê meriv bikar anîn. Animals ji hêla derzdeh rojan an 'saline' ('saline dermanên xNUMX', 'acute' cocaine (tedawiya 57 + a tedawiya 6 mg / kg kococê-HCl, ip) an 'kocê dubare' hate kirin (dermanên 7 mg / kg Kocaine-HCl, ip). Mîlyayên li dû dermanê 6 an jî 20 piştî dermankirinê ya paşîn hat dayîn. Ji bo lêkolînên mîkrovrayê, heywanan bi "saline" ('salnameya dermanên xNUMX, dermanên acute', 'dermanên xNUMX salon + 7 dermankirina 20 mg / kg kococaine-HCl, ip),' cocaine-dubare + acute ' Kocaine (1 dermanên 24 mg / kg Kocaine-HCl + 15 dermankirina tedawiyê + 14-ê 1 mg / kg Kocaine-HCl, dermanên 20 dermankirina 7-8 mg / kg kocaine-HCl, ip) ip) û piştî dermankirina dawî ya saet 20 qurban kirin. Di tecrûbeyên raktîk de, peşan bi tenê lêpirsînan piştî postê bûn û bi 7 mg / kg cocaine-HCl, wekî jêrîn hatine jûr kirin. Ji bo şerta dendritîk û mîkrojrayê piştrastkirina peymana HSV-GFP û HSV-G20a-GFP, mice bi 'saline' ('salnameya dermanên 7, an' doktorê Xocê ') hate derman kirin (1 dermanên 20 mg / kg Kocaine-HCl, ip ) di seranserê 1 de, wekî protokolê ev berê berê nîşan dide ku di nîvleya nucleus (NAc) neuronê de di nav dema demjimêra ya Herpes a Simplex virus (HSV) veguherîna transgene (de)S1 ref supplemental). Mice ji bo tedawiya dora dravîtîk tê bikaranîn qurbanên 4 piştî piştî tedawiyê paşîn qurban kirin.
Ji bo hilweşîna herêmî ya herêmî ya G9a ve girêdayî neeronên NAccî ne, em ji mozozê Goznî G9a yê homozygous mûzantor bikar anîn, ku li ser deverek din jî tête navnîşan kirin (S2). Creasyona Creasyona Creasyona 22 ji 25 veguhestina derveyî ya çarçoveyê ya ku ji ber veguherîna mutuxa veguherî ya bêhêzî ye. Me pişkên G9A bikar anîn ku bi temamî vekişandine bi C57BL / 6J-ê. Mice di binê 2 û 7 de GFP û Cre-GFP vegotin. Siyasetmedarên Immunohistochemîk bikar anîn ku ji bo kapasîteya Creasyona Cre-mediated de piştrast bikin (binêre S5). Me ji AAF karanîna heywanên 21 veguhestin piştî postê veguhestin, ji ber recombination di G9a mûşê de xeletî û herî zêde bû, bi raporên belavkirî (S3-S4). G9a û ΔJunD tecrûbeyên bêhtir tecrûbeyên heman rengî hatine bikaranîn bi karanîna veguhestina HSV vexwarên GFP, G9a-GFP, wildtype G9a-GFP, mirinê G1093aHXNUMXK-GFP an jî ΔJunD-GFP (binêre S2 ji bo agahdariyên li ser pêşveçûna G9a avakirina avakirina). Hişyariya HSV-ê-dayikên 3-ê piştî post-surgery-ê bikar tînin ji ber ku bêhtir caran di vê demê-deqê de herî zêde bû, wek immunohistochemistry. Ji ber veguherîna hûrgelê ya HSV, û xwezayî ya AAV ya hêja, bi veguhestina HSV ve di karanîna ceribandinên lez û demkî ya demkî ya teng-tengî de, bi karanîna AAV vekêşan di dema demên dirêj de tête dirêj kirin. Wek vector ve têne pêşîn, di berfireh berfireh berfireh de, ji bo nexweşî yên neuronî di hundirê mizgeftê de bêyî nexweşî, nebronê an nefretê jî.
Ji bo ezmûnên raktîk ên bi karanîna G9a / GLP-êker, BIX01294 (25 ng / μl), mûş bi sterotaxî bi du-du-mînî-mîn-pîmên pêdivî, û herweha du rêberê du hevpeymanê, di NAc. Mini-pumps ji ber pêvajoya berdewamî (12 μl / saet) ji wesayîtê (0.25 hydroxypropyl β-cyclodextrin) an tedawiya rojên 5, di dema ku dema nirxandinên radyo hatine çêkirin de destpêkirina 14 çalak kirin.
Ji bo ΔFosB bi tecrûbeyên bêhtirbestî [avêtina rojavayî, qPCR, û ChIP], bitransgenic male-tTA × tetOP-ΔFosB mêr bi karanîna (10 heft-salî), ji ber ku nebûna nebûna tetracycline doxycycline (8 hefteyên doktoriyê dûr dikeve), heywanên îfosiyonên tundî yên zelal ên qedexe yên ΔFosB (S5). ΔFosB overexpression di van mûşan de bi qPCR ve hatibû pejirandin. Ji bo peydakirina peymanên NNSP-tTA × tetOP-ΔFosB masî, wildtype 8-heft-salî C57BL / 6J-mêr mêr bi sterotaxically-înjected intra-NAc bi AAV vektorên GFP an jî ΔFosB-GFP vekirî didin. Di vê rewşê de, bi vî awayî, ji bo îstifrefa ΔFosB di hefteya 8-ê de-ê de, ku ji bo ku bi awayek yekser a vekirî û îstîxbarata ΔFosB-ê-ê-ê vexwendinê ve dihêlin, biqasî herî bikar bînin. Viral overexpression piştrast kir ku qPCR di nav hefteyên 8 (15-gauge NAc pûçên di binê înfeksiyonê de bêyî dagir kirin) qPCR bikar tînin. AAV-GFP û AAV-ΔFosB-GFP-ê ku ji bo qPCR ji bo nexweşî bi kar anîn (nexşandinên 14-ê, ip) an jî doktorê dubare kirin (14 dermanên 30 mg / kg cocaine-HCl, ip) li destpêka 6 emelî. Rojên 4 piştî tedawiya dawî ya paşîn, mirin bi 4% paraformaldehyde ve girêdayî bûn, li ser vibratome beşek analîzkirin û ji bo analîzek spine dendritîk têne bikaranîn.
Analîzên rojavayê rojavayî
14-gauge NAc punqeyên ji 1 mm ji alozên coron ên ku bi meydana mîzîkê re stenbolê hatine avêtin girtin û di xNUMX-M HEPES Bîsê (1% SDS) de bi pêkanîna proteas û fosphatase inhibitors hene. 1-Numûnên 30 yên hilberîna tevahiya protein li ser 18% SDS gêlên elektrîfkirî bûn. Proteîn ji bo perdeya PVDF veguhestin û bi incubated bûn yan jî antî-H3K9me2 (ة mouse, 1: 500), anti-β-tubulin (ة mouse, 1: 60,000), anti-total histone H3 (polyclonal kevroşk, 1: 5,000), anti-GFP (tê bikaranîn ji bo piştrastkirin ramanê bi zûyî wekhev de testa bi kulman) (polyclonal kevroşk, 1: 1000), anti-H3K27me3 (polyclonal kevroşk, 1: 500) an antîbodîyan antî-actin (ة mouse, 1: 60,000) di şevekê de hate guherandin. 4 ° C (hemî membranan di 5% şîrê an jî 5% albûmê bermîn) hate asteng kirin. Pêguman bi antibodiesên dermanê peroxidase-labeled veguhestin (1: 15,000-1: 60,000 li ser bingeha antibodî tê bikaranîn) û bandên bi karûbarên Super West West Dura ve tê dîtin. Bands bi NIH Image J Software û H3K9me2-bandên bi normal an jî an actin an jî β-tubulin û Histone H3-ê ji bo rakirina wekhevkirina mûzîkê were normal kirin. Kocaine-revandin li ser astengên bandor tune (S8) an hejmara histone 3 (S1) li NAc. Wekî din, HSV-G9a-GFP û HSV-G9aH1093K-GFP ve li tevahiya asta β-tubulin di NAc (ne bandor nîne)S8).
Immunohistochemistry
Mice bi bi dermanê çewal ên chloral hydrate û bi 4% paraformaldehyde re berî analîz kirin ji hêla yekunohistochemîkî yek an du duyemîn ya dîmînerîstanê ve hate binçav kirin wekî berê (S6). Bi kurtasî, mîzên paşdestî li ser avê di şevê de 30% sucrose berî beşdarbûna 35 μm (lêgerînên ku ji bo pêşniyarên dendritîk tê bikaranîn li ser vibratome li beşên 100 μm di nebûna 30% sucrose de) beşdarî beşdar bûn. -Herikîn Free beşên NAC bi 1X PBS, asteng kir (3% Tuan kerê normal, 0.1% tritonX, 1X PBS) şuştin bûn û piştre bi antî-GFP (polyclonal mirîşkan, 1: 8000) incubated û / an jî antî-G9a (polyclonal kevroşk , 1: 500) antibodies di çareseriyê de asteng bikin. Beşên ji bo 1: 200. Piştî şewitandina şevên şevê, piştî beşên 3 bi 10X PBS re, ji hêla tevlihevkirina CyxNUMX û / an antîpên CyxNUMX-ê li 1X PBS çareserkirina astengkirina astengên 2 ve vekişandin. Beşên ji bo xebatên morfolojiyê têne bikaranîn di nav şevê odeya navîn de şevê duyemîn çep kirin. Nûnerê nukleerî ya nukleer bi xnumXX PBS hene ji bo Dîroka 3 ji DAPI (1: 2) pêk hat. Beşan dîsa dîsa şaş kirin, dû dû dehydîteya etanol û bi DPX re çêdike. Hemû beşan bi bikaranîna mîkrokopyaya confocal ve hatin imaged.
RNA û QPCR
Qulikên NAc-ên 14-pîvanî yên li Trizolê homojen bûn û li gorî rêwerzên çêkerê hatin xebitandin. RNA bi stûnên RNAesy Micro hate paqij kirin û spektroskopî piştrast kir ku RNA 260/280 û 260/230 rasyon> 1.8 bûn. Piştre RNA bi karanîna Bio-Rad iScript Kit ve hate veguhestin. cDNA ji hêla qPCR ve SYBR Kesk bikar anîn. Her reaksiyon du caran an du caran hate meşandin û li jêr rêbaza ΔΔCt ya ku berê bi karanîna glyceraldehyde-3-fosfat dehîdrojenaz (GAPDH) wekî kontrola normalîzasyonê hate vegotin hate analîz kirin (S7). Dîtin S5 Table ji bo mRNA primer sequences.
Analyzerên DNA yên microarray
Çar komên (3 serbixwe bi biyolojiya biyolojî) ji bo lêkolîna mîkrojrayê, tevahiya mîkrojenên 12 bikar anîn. Saetek 1 piştî paqijiya kocaine piştî, heywanên zû ve hatin hilweşandin û mirinên veşartî û li ber çiyayê hatin girtin. Neserên NAcê bi karûbarên 15-gauge ve hatin girtin û bi lez ketin RNAyê ku bi lez ve zûtir bû. Bi çarçoveyên 12-ê tevlîhev gavê ji çar heywanan re tevlihev kirin. RNA hevalbend, microarray pêvajoyê, û analîzên daneyên ku berê hatî gotin (S8) Bi kurtahî, RNA hate veqetandin û paqij kirin ku li jor hatî vegotin û ji bo kalîteyê bi karanîna Bioanalyzer-a Agilent hate kontrol kirin. Veguheztin, amplifikasyon, etîketkirin û hibridîzasyona berevajî ya arîkariyên Illumina MouseWG-6 v2.0 bi karanîna rêgezên standard ji hêla navgîniya mîkrojeya UT Southwestern ve hatine çêkirin. Daneyên Raw bi karanîna nermalava Beadstudio paşnav hatin veqetandin û qewirandin. Daneyên normalîzekirî bi karanîna nermalava GeneSpring ve hatin analîz kirin û genelîstan bi karanîna pîvanên girîngiya qutbûna guherîna 1.3 qatî ya bi qutbûna p-nirxa ne-hişk a p <0.05 ve hate çêkirin.
Em di van deman de gelek sedem ji bo sedemên ewlehiyê biparêzin. Yekem, hemû heywanan di heman demê de, di bin heman rewşan de hatine binçavkirin, derman kirin û kuştin. Her weha, di heman demê de hemî RNA û pêvajoya arrayê pêk hat. Ya duyemîn, em girtiyên sêyemîn digirin û gelek heywanan ji bo tehlîlanek pîlan pêk tê, ji ber vê yekê cudahiyê kêmtir ji ber guhertineke takekesî û hêzdariya statîstîk (S9). Sêyemîn, pîvana analîzên daneyên ku ji bo lêkolîna me ve tê bikaranîn, ji aliyê MicroArray Kontrola Kalîteya Control Control ve tê pêşniyar kirin, ji ber ku ev pîvan têne pejirandin ji bo damezirandina veguherîbûnê û inter-intraplatformê (S10-S11).
Avakirina avakirina vîkalên vîral
Ji ber ku ji hêla astengên veguhestinê yên vakslêdanan ve, kêlên coding yên ji bo G9a (G9a) an jî G9a (G9aH1093K) mirinê de p1005 + HSV plasmid di bin kontrola cytomegalovirus promoter (CMV) de zûtirîn govî vexwendin. Mezinahiya navnîşê ~ 9 kb, ku ji bo AAV-3.96 vector ji bo herî mezinbûna mifteyê herî zêde dibe). The IE2 / 4 promoter drives G5a expression. Fragments bi p9 + HSV plasmîd bi rêya ligalên dawî yên Klenowî bi Pmei û EcoRI digotin G1005a (ji pcDNA9) û CIP p3.1 + peyda EcoRI digire. Ji bo hilberîna HSV-ΔJunD-GFP, qonaxa kodê ya ΔJunD ji hêla qedexekirina sînorên EcoRI ve hatî bikaranîna PCR ve hatî bikaranîn, bi oligonucleotîdên ku bi ecoRI-ê ve girêdayî bûn. Pêwîstina PCR ve hatî navnîşana EcoRI ya p1005 + vector. Gotarên herêmî ya Creasyona ku di NAc neuronê de ji hêla jenal-mediated veguhastina bikaranîna AAV vector ve hate dîtin (S12). GFP an mûleya N-termînalê ya GFPyê ya Creasyona bi AAV-2 vector ve girêdayî ye ku bi CMV belavkerê bi hêla sekreterê dîktatorî û pîşesaziya polyadenylasyonê ve hate çêkirin. Vebijêrkên hemî vector ji aliyê dideoxy-sequencing ve hatin pejirandin. Vekal vektor bi karanîna sêyemîn-veguherîn, rêbazek alîkarî ya azad, wekî berê berê tête kirin (S13). Vîrûsê paqijkirî li at -80 ° C were tomarkirin. Kalîteya Viral di bin tehlîlên infeksiyonê de hucreyên HEK293 têne nirxandin. A virus-AΔ-ΔFosB-GFP heman amade bûn. Ji bo HSV-Cre, Çîroka Creasyek hate ragihandin ku ji hêla IRESNUMX / 4-promoter ve hatibû berdan, da ku ji bo xwenîşandana Cre Cre û kêmkirina zextên neurûnî pêşbigirin. S14 ji bo avakirina viral). Di hemî rewşan de, herdu vîralîzmê hemî were pejirandin li vitro û vivo Bi qPCR, û vîrûs hatin pejirandin ku ji bo zelalkirina NAc-sînor nîşan dide.
Muayeneya Stereotaxic
Under ketamine (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg) anesthesia, mûş di hundurê biçûk-a stereotaxic vekirî de bû, û paqijiya kranalî hate dîtin. Pêdiviyên 0.5 μl li virusê bi xNUMX ° angle (AP + 10; ML + 1.6; DV-1.5) bi 4.4 μl / min tête bikaranîna bila sê-sê gauge syringe tê bikaranîn. Animals ku derheqên HSVê digirin, ji bo ceribandinên 0.1 veguhestin, dema ku bi karanîna ceribandina radyoyî ya AAV ve digotin ku rojên 2 berê ji ber ku li korîteya kantonê were vebirin. Ev car caran ji bo veguhestina du vegotanên demokrasiyê yên herî mezintir vîdyal-mediated. Ji bo infeksiyonên BIX20, her du her du pîmên li ser rûyê mûkê di binçavkirinên mîksê de hatine dor kirin. Dezgehên Cannulae ji hêla Nêçeyên du cranial vekirî li ser Nêçîrvanê ve hatin girtin, û ji hêla veşartina ji Bregma (AP + 01294; ML + 1.5; DV-1.0). Mice destûr kir ku ji 5.4 heta 4 ve ji destpêka qonaxa kantona ku wekî jêrîn tê xuyakirin tê de ji bo Xerîbê veguhestin.
Cihê ciyawazkirî
Projeya kargêrkirina cîhê ku wekî berê ve tê de hate kirin, bi guhertina jêrîn (S7) Bi kurtahî, 3 roj piştî înfuzyonên hundur-NAc ên HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP an HSV-GFP, mişk hatin xistin hundurê odeyên kondîsyonê, yên ku ji sê derûdorên cihêreng pêk tê. Mişkên ku tercîha girîng ji bo her du odeyên kondîsyonê nîşan dan ji lêkolînê hatin derxistin (<<10% ji hemî heywanan). Hingê komên şertûmergê hevseng bûn ku ji bo her alîgiriya odeyê ya ku hîn jî heye biguncînin. Di rojên paşîn de, li ser ajalan saline hat avêtin û piştî nîvro 30 hûrdan li yek odeyê hatin ragirtin û dûvre jî kokaîn (10 mg / kg, ip) hate avêtin û êvarê 30 rojan (du saline û du cot kokaîn). Roja ceribandinê, mişk 2 deqîqeyan bêyî dermankirin dîsa li amûrê hatin bicîh kirin û ceribandin ku kîjan alî ew tercîh bikin binirxînin. Bersivên lokomotorî yên ji bo kokaîn bi navbênkariya tîrêjê di odeyên cot-cot de hatine nirxandin da ku bandora dermankirina narkotîkê misoger bibe. Ji bo ceribandinên AAV û BIX20 CPP, protokoleke hinekî guherandin hate xebitandin. Li ser ajalan dîsa saline an kokaîn (01294 mg / kg, ip) hate derzîkirin û ji bo danişînên 10 hûrdemî li odeyên taybetî hatin ragirtin, lê li şûna wan rojê tenê carekê 30 rojan şert hat dayîn, pişt re jî ceribandina roja 4-an (heywan şert bûn êvarî û dermankirinên klîma alternatîf bûn). Ji bo hemî koman, veguhastina bingehîn di bersiva saline de hate nirxandin da ku bicîh bikin ku locomotion ji hêla dermankirina vîrusî an rêgir ve bandor nebûbe.
Rêveberiya xweya kocaine
Zilamek mêrên Lû-Evans mêr, xwarinê 230-250 g di destpêkê de ezmûn, wergirtiye. Ew di nav hûrgelan de bûne û hawirdora kontrola germê li ser xeyalek 12-ê / çarî (bi xNUMX-9-ê re şewitandin) ad libitum gihîştina xwarin û avê. Rats destûr bûn ku di hawîrdewletê nû de bigirin û hefteya destpêkê ya 1 ji bo destpêka ceribandinê. Hemû pêvajoyê di bin Enstîtuya Tendurustiya Tenduristiyê de ji bo Lênêrîna Lênêrîna Xweser û Bikaranîna Niştimanî ya Niştimanî û ji aliyê Komîteya Lênêrînê û Lênêrîna Bikaranîna Xweseriya Çiyayê Sinai ve hate qebûl kirin Amûrên rêveberiya xweseriyê bi bi laşên infrared bi tevliheviya lokomotorê tedawî bû. Rêveberiya xweseriya ku berê berê behsa pêk hat (S15-S16) bi katêterên ku di bin anesteziya isoflurane de (2.4–2.7%) di nav rehê jûjûla rast de hatî çandin. Kateter bi 0.1 ml çareseriyek şor a ku tê de 10 U heparîn û ampicîlîn (50 mg / kg) şûştin. Piştî hefteyek başbûna ji emeliyatê, perwerdehiya xwerêveberiyê di gava tarî ya çerxa tarî / tarî de dest pê kir. Di bin bernameyek xurtkirinê ya rêjeya sabit-3 (FR0.75) de, ku 1 çapemeniya leverê çalak encam da yek înfuzyonek tiryakê, ji ajalan re 1-saet destûr hate dayîn ku her roj bi kokaîn (1 mg / kg / usionnfuzyon) were girtin. Rats piştî 6 rojan xwarina kokaînê stabîl kirin (<15% li pey hev guhertina% 3 guhertin, bi kêmî ve 75% li ser leverê bihêzkirî bersiv dan). 24 demjimêran piştî rûniştina xwerêveberiyê ya paşîn, mişk zû zû ji hev hatin birrîn, mêjî bi lez derxistin û ji bo tecrîdkirina RNA û qPCR pêvajo kirin.
Chromîtîkê immunoprecipitation (ChIP)
Nûçeyên nû yên nûçeyên fermdehyde hatin têkildar bûn û ji bo ChIP wekî berê ve hatine amade kirin amade kirin (S17-S18) bi guhertinên biçûk. Bi lezgînî, 4 14-gauge perçeyên NAc punches (Xalûnên 5-ê bi tevlîhevkirinê vekirî) hatin girtin, bi xNUMX% formaldehyde û bi XXUM-M glycine-ber-xNUMX ° C. roj 1 berî ku razîmendiya sonication, pez antî-kevroşk / mişk (li gor laş barînê) miherkan magnetic IgG destê nixamtinê miherkan magnetic guncaw bi yan jî antî-G2a (kevroşk polyclonal pola chip) amade kirin an jî antî-H80K1me9 (mouse pola ة chip) Antibodies bi şevê li 3 ° C di bin çepa bêdeng de li çareseriya astengiyê. Tissue sonication and chromatin shearing like previously described (S17). Piştre sonication, hevpeymanên wekhev ên chromatin wek veguherên nû yên nû veguherandin û ~ 5% hilberên dawîn yên ku kontrola 'kontrola' kontrol dikin. Piştî ku paqijkirin û resuspensionê ya mîkrobatên bacanê / antibody de, tevliheviya hûrgelên antibody / bead (~ 7.5 μg antibody / modelê) were çêkirin û ji bo ku her tîmên kromîtîk ve girêdayî bûne û saetan ji 16 ° C di xNUMX ° C. Nimûneyên bêtir şaş kirin û li ser 4 ° C bi şevê berî DNA paqijkirina kitêba paqijkirina PCR bikar tînin. Piştî paqijkirina DNA, nimûne bi qPCR re bûn û normal bûn ku kontrola 'amûra kontrola' ya ku berê berê hatine gotinS17). Mîkroksiyonên ermenî yên IgG-ê bikar tînin ku mîkroclonal-antibody-ê-ê-ê-ê-ê-ê IP-ê hatin kirin ku ji bo dewlemendiya nimûne ya sembolê nîşan bide. Adenine fosphoribosyltransferase (APRT) ji bo kotok û ΔFosB bêhtir tecrûbeyên berbiçav yên nermalek bikar anîn. Dîtin S5 Pêdivî ye ji bo promoter primer sequences.
Analîzek dendritic spine
Ji bo rêbaziya G9a di rêbazkirina morafolojiya neuronal de li vivo bixwînin, me berê berê rêbazên ku bi guhertinên jêrîn re behsa gotinê (S1). Sê roj piştî derziyê ji HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (hemû vîrûs li wildtype mice C57Bl / 6J hatin bikaranîn), an HSV-CRE-GFP (tê bikaranîn li G9afl / fl masî), dema ku hişyariya vîral herî zêde bû, pejna berbiçav bûn, mirinên kronoprotkirî û paşê li 100 μm li vibratomê beşdarî rûniştin. Beşên ku ew li jorîn (jibo Immunohistochemistry) bibînin, li dijî GEF-ê antîbî bikar tînin. Bo nirxandina bandora overexpression G9a û knockout li ser hejmara herçî, her weha bandora overexpression ΔJunD, em bi pîvana hejmara spines li nêzîkî neurites 1-2 per Neuron digihêje qet nebe 299 μm ji dendrites navîn ji medium NAC GFP-derbirîn neuronên spiny (MSN). Bawer kirin ku MSN-ê di niştecîhên neurûnî yên ji nûçeyên din ên neuronî cuda hene, herweha raporên berê yên nîşanî nîşan dide ku HSV bi taybetî li DARPP-32 nexweşî li herêmê mizgefta DARPP-XNUMX diyar dike (S19), em bawer dikin ku MSN di nav van xebatên yekser de lêkolîn kirin. Ji bo her heywanan, em nirxandin ~ nebronên 6-8 di perê 3-4 heywanên heywanan de (komên 7), piştî ku nirxa navîn ji bo her heywanê ji bo analîzkirina statîstîk standiye. Xweserên ku ji bo bandorên ΔFBB-ê de bêhtirkirin de lêpirsînan li ser NAc spine density bi heman rengî hatine jimartin têne kirin, bi bila ji bila AAV vektor bikar tînin ku ji bo demên GFP an jî ΔFosB-GFP vekirî tête kirin (8 heftan). Hemû wêneyên HSV bi bikaranîna microskopî bi armancên xNUMXX-êvanîya neftê (Wêneyên AAV bi armanca petrolê ya 100X ve hatin girtin) hatin girtin. Wêneyên ku di xetera 63 devera xwerû û 1 × 1024 vebata çarçoveyê de çêkiribûn. Daveya dendritîk bi karanîna pelê NIH Image J bi kar tîne, û hejmarên spine ji hêla ezmûnê sereke yê kor bû kor bû. Numreya navîn a 1024 μm ya dendrîtê hate hesab kirin.
analîza statîkî
Yek û du awayên ANOVA ji bo pêşniyarkirina cîhê cîhanî û pêşniyarên dendritîk ên ku ji du komên mezintirîn mezintirîn diyar dikin. Tested testê ji bo qPCR, qirêjiya rojavayî, analîzên dendritîk bi hevberdana HSV-GFP ve HSV-Cre bi G9a yên din ên bikar tînin.fl / fl mişk, analîzên mîkrok (li jor binihêrin) û ceribandinên immunoprecipitation kromatîn. T-testên xwendekarê plansazkirî li dû analîzkirina ANOVA ya du-alî ya tîrêjiya dendika stûyê piştî zêde îfadekirina ΔFosB bi piştrastkirina bandorên sereke yên girîng ên dermankirina derman û vîrusê hatin bikar anîn. Hemî nirxên ku di efsaneyên jimar de tê de wateya mean SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001) nîşan dikin. Analîzên hûrgulî yên statîstîkî ji bo Figs. 1-3 Di nivîsa sereke de têne dayîn: Di navîgasyonê de Di navîgasyonên Dîtuyan de.
Footnotes
Min şahidî dikim ku naveroka naveroka hundurê hundurê manuscript Essential Role of the Histone Methyltransferase G9a in Cocaine-Induced Plasticity hatine weşandin yan jî li ser cîhek din bin, li ser înternetê.
Hemî karûbarên ku bi karanîna heywanan tê bikaranîn di gor rêbazên sazûmaniyê û rêveberên IACUC de hate damezirandin û di navenda Zanîngeha Tendurîstanê ya Southwestern û Şîneya Sinai ya Medicine.
References and Notes