Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 Receptor û Enstîtuya Downstream Signaling (2013)

Şîrove: Wusa dixuye ku Cdk5 rêgezkirina receptorên dopamine D2 kêm dike. Ecêb e, faktora wergerê deltafosb hilberîna Cdk5 dike.

Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) PLoS YEK 8 (12): e84482. doi:10.1371/journal.pone.0084482

Abstract

Receptorê dopamine D2 (DRD2) receptorek sereke ye ku navbeynkariya fonksiyonên mêjî yên bi dopamîn-girêdayî yên wekî mood, xelat, û hestyarî dike. Kînaza 5-a girêdayî Cyclin-ê (Cdk5) serine/threonine kinase-ya ku bi proline-derhêneriya wê ye ku fonksiyona wê di çerxa xelata mêjî de têkildar e. Di vê lêkolînê de, me eşkere kir ku bermayiya serine 321 (S321) di lûleya sêyemîn a hundurîn a DRD2 (D2i3) de cîhek rêziknameya nû ya Cdk5 e. Fosforîlasyona S5-girêdayî Cdk321 di D2i3 de hate dîtin li vitro û pergalên çanda hucreyê.

Wekî din, me dît ku fosforîlasyona S321 guheztina rûbera agonîst-teşwîqkirî ya DRD2 xera kir û pevgirêdana proteîna G bi DRD2 re kêm kir. Digel vê yekê, rêça cAMP-ê ya jêrîn di pergala heterolog û di çandên neuronal ên seretayî de ji embrîyoyên knockout p35 ve dibe ku ji ber kêmbûna çalakiya astengdar a DRD2 bandor bû. Van encaman destnîşan dikin ku fosforîlasyona bi navbeynkariya Cdk5-ê ya S321 fonksiyona DRD2 asteng dike, mekanîzmayek rêziknameyê ya nû ji bo nîşankirina dopamine peyda dike.

kesayetiyên

Gazîname: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 Receptorê Dopamine D2 Fosforîlate dike û Nîşana Downstream kêm dike. PLoS YEK 8 (12): e84482. doi:10.1371/journal.pone.0084482

Weşan: James Porter, Zanîngeha North Dakota, Dewletên Yekbûyî yên Amerîkayê

Wergirtiye: Gulan 20, 2013; Qebûl kirin: Mijdar 14, 2013; Published: December 31, 2013

Copyright: © 2013 Jeong et al. Ev gotarek vekirî-gihîştî ye ku di bin şertên ku tê belav kirin Creative Commons Attribution License, ku bi karanîna belavker, belavkirin û veguhestinê de destûr dide destnîşankirin, ji hêla nivîskar û çavkaniya rastîn ve tê deyn kirin.

Fona Ev xebat ji hêla alîkariyên (NRF-2012R1A2A2A01012923 û NRF-2012R1A4A1028200) ji hukûmeta Koreyê (MSIP) ve hate piştgirî kirin û di heman demê de di çarçoveya bernameya hevkariya navneteweyî ya ku ji hêla NRF ya Koreyê (2012K2A1A2033117) û Enstîtuya Lêkolînê ya Koreya (Korea) ve hatî rêve kirin (2031K415A2004A2006) ve hatî piştgirî kirin. Bernameya Lêkolîna Bingehîn a MSIP (XNUMX-XNUMX). SKP XNUMX û XNUMX Hevbendiya Niştimanî ya Lêkolînê ya li ser Şizofreniya û Depresyonê (NARSAD) Xelatên Lêkolînerên Ciwan wergirt. Di sêwirana lêkolînê, berhevkirina daneyan û analîzê de, biryara weşandinê, an amadekirina destnivîsê de fonan ti rola wan tune.

Berjewendiyên pêşbaziyê Nivîskaran diyar kir ku tu neyeketiya pêşbaziyê tune.

Pêşkêş

Nîşana Dopamine di nav fonksiyonên mêjî yên cihêreng de, di nav de hevrêziya motor, kontrolkirina moodê û mekanîzmayên xelatê de têkildar e [1]. Parçeyek sereke ya îşaretkirina dopamînê ya di vertebrîstan de ji hêla neuronên spî yên navîn (MSNs) ve tê xebitandin ku bi bijartî komek wergirên dopamînê vedibêjin û têketina dopamînerjîk bi giranî ji qada tegmental a ventral (VTA) û substantia nigra (SN) distînin.) [2]. Receptorên dopamine receptorên bi proteîn-G (GPCR) bi heft domên transmembrane ne û ji du binkûre pêk tên, Receptorên mîna D1 û D2-mîna, ku di îşaretkirina dopamînê de navbeynkariyê dikin [1]. Mînakî, receptorên mîna D1-dopamîn (D1, D5) adenylyl cyclase bi G-ê çalak dikin.αs û asta hundurîn a cAMP zêde bike, lê receptorên mîna dopamîn D2 (D2, D3, D4) adenylyl cyclase bi G asteng dikin.αi û asta hundurîn a cAMP kêm bike [1], [3].

Di nav receptorên dopamine de, receptorê D2 (DRD2) di patofîzyolojiya gelek nexweşiyên derûnî yên mezin de, tevî şîzofreniya û narkotîkê, têkildar e. [4], bi vî rengî ku gelek dermanên antîpsîkotîkî bi kêmî ve Qismî DRD2 dikin hedef. Her weha tê zanîn ku çalakiya DRD2 bi encamên behreyî yên narkotîkên destdirêjiyê di modelên heywanan de baş têkildar e. [5]. Antîdepresant û bandorkeriya stabîlîzkerê moodê jî bi guhertinên di derbirîna rûbera hucreyê ya DRD2 an nîşana hundurîn a jêrîn a ku ji hêla PKA, ERK û GSK3 ve hatî navber kirin ve girêdayî ye. [1], [4], [6]. Tevî van rolên krîtîk ên ji bo DRD2 di mêjî de, mekanîzmayên birêkûpêk ên hûrgulî yên ku heterojenî û tevliheviyê dide taybetmendiyên DRD2 bi tevahî nayê fêm kirin.

Rêzên delîlên lihevhatî destnîşan dikin ku gelek guheztinên postwergerandinê di başkirina çalakiya DRD2 de têkildar in. Glîkozilasyona berfireh a DRD2 di lêkolînên destpêkê yên nîşankirina wêne-girêdayî de hate eşkere kirin [7], û avakirina girêdana dîsulfîdê di hundurê DRD2 de jî wekî guhertoyek girîng ji bo girêdana lîgandê hate nas kirin. [8]. Wekî din, malperên fosforîlasyonê yên DRD2 di destpêkê de ji hêla ve hatin nas kirin li vitro îmtîhana bi radyoîzotopên, peydakirina rêyên ji bo rêyên rêgezên cihêreng ên ku ji hêla kînasên cihêreng ve têne navber kirin [9]. Bi rastî, proteîna kinase C (PKC) seferberiya bi navbeynkariya DRD2 ya kalsiyûmê hundurîn rêve dike û têkiliya DRD2 bi proteînên sîtoskeletal re modul dike. [10]. Fosforîlasyona ji hêla GPCR kinase 2 (GRK2) ve rêgezên resensitîzasyona DRD2-ê ku ji hêla agonîst ve hatî çêkirin rêve dike. [11].

Kînaza-girêdayî Cyclin 5 (Cdk5) serine/threonine kinase-ya ku bi proline ve hatî rêve kirin e ku ji ber vegotina mêjî-taybetî ya aktîvatorên wê yên bingehîn xwedan çalakiya tercîhî ye. p35 û p39 [12]. Cdk5 di pêvajoyên cûrbecûr yên neuronal de, tevî koçberiya neuronal û rêberiya axon, tevlê dibe, û mişkên null ên Cdk5 û p35 di qatkirina kortikal de kêmasiyan nîşan didin. [13]. Di van demên dawî de, hate destnîşan kirin ku fosforîlasyona WAVE1 û ephexin ji hêla Cdk5 ve morphogenesis spine dendritîk rêve dike. [14]. Digel vê yekê, Cdk5 di heman demê de astên îfadeya rûkalê ya receptorê NMDA, NR2B, û NR2A-navbeynkariya herikên NMDA-yê jî rê dide. [15], [16]. Hêjayî balkişandinê ye ku gelek delîl têkiliyek samîmî di navbera Cdk5 û pergala dopamine de destnîşan dikin. Cdk5 tyrosine hydroxylase (TH) fosforîlate dike, aramiya wê birêkûpêk dike, û bi vî rengî homeostasis dopaminergîk diparêze. [17]. Di neuronên postsynaptîk de, dema ku bermayiya T75 ya dopamine û fosfoproteîn-32kD (DARPP-32) bi rêkûpêk a cyclic-AMP (DARPP-5) ji hêla Cdk1 ve tê fosforîlekirin, ew dikare çalakiya PKA asteng bike û bi vî rengî nîşana PKA-ya bi navbeynkariya dopamine DRDXNUMX dijber bike. [18]. Balkêş e, dema ku kokaîn, agonîstek neyekser a receptorên dopamînê, bi rengek kronîk di mişkan de tê rêve kirin, asta mRNA û proteîna Cdk5 di neuronên spîndî yên navîn de zêde dibe. [19]. Bi hev re, Cdk5 xuya dike ku di adaptasyonên synaptîk ên narkotîkê de beşdar dibe. Di vê lêkolînê de, em têkiliyek fonksiyonel a DRD2 û Cdk5 destnîşan dikin ku rola Cdk5 di nîşankirina dopamine de bêtir dirêj dike.

Alav û Rêbaz

Antibodies

Serumên dijî-kêvroşk li dijî peptîdên ku fosfo-serîn 321 (pS321) ya sêyem lûleya hundurîn a DRD2 (D2i3) vedihewîne, hatin rakirin. Fosfo-peptîd, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), ji bo çêkirina stûnek peptîd-hevgirtî ji bo paqijkirina pêwendiyê hate bikar anîn (20401, PIERCE). Antî-pS321 li gorî rêwerzên çêker ji hêla pergalek paqijkirina girêdanê ve hate dewlemend kirin. Fosfo-antîpoşa paqijkirî di PBS de bi 0.1% sodyûm azide û 0.1% gelatin ve hate hilanîn. Dij-mişk antî-Cdk5 (sc-249) û antî-p35 antî-kêvroşk (sc-820) ji bo blotting Western û immunocytochemistry ya Cdk5/p35 hatin bikar anîn. Dij-mişk antî-GFP (sc-9996) ji bo immunoprecipitation û Western blotting DRD2-GFP hate bikar anîn. Antîpoşa dijî-FLAG-ê ya dijî-kêr (sc-807), antî-HA-yê dijî-kêr (sc-805), antî-GST-ê li dijî mişk (sc-138), û antî-GAPDH li dijî mişk (sc- 32293) ji Santa Cruz Biotechnologies hatin kirîn.

Animals

Mişkê knockout p35 diyariyek dilovan bû ji Dr. Komên destpêkê yên ji bo genotyping 5'- GGTCTCCTCTTCTTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC û 5'- TCCATCT GCACGAGACTAGT bûn wek ku berê hate diyarkirin. [20]. Mişkên ICR û mişkên Sprague Dawley ji bo amadekirina lîzatê mejî hatin bikar anîn. Hemî prosedurên heywanan ji hêla Komîteya Lênihêrîn û Bikaranîna Heywanan a Sazîkî ya Zanîngeha Zanist û Teknolojiyê ya Pohang ve hatî pejirandin.

Avakirina Plasmîdê

Îzoforma dirêj a DRD2 ya mirovî di vektorek plasmîdê ya EGFP-N1 de û sêyem lûleya hundurîn a DRD2 (212-373 bermahiyên asîda amînî di nav de 29 bermahiyên asîda amînî yên din ên ku ji îzoforma dirêj a DRD2-ê re yekta ne) di vektorek plasmîd a pFLAG-CMV-2 de hatine bikar anîn. Cdk5 ya mirovî di vektorek plasmîd a pCMV-HA de û p35 a mirovî di vektorek plasmîd a pcDNA 3.1 de hate danîn. Cdk5-a mirovî di binê promotorek cytomegalovirus (CMV) de digel p35-a mirovî di vektorek pcDNA 3.1 de hate danîn da ku ji bo immunocytochemistry, ceribandina hundurînkirina receptorê avahiyek vegotinek dualî (Cdk5/p35) çêbike, [35S]-GTPγAssaya girêdana S, ceribandina girêdana radioligand û immunoassay enzîma cAMP.

Li Vitro Kinase Assay

IP-girêdayî li vitro testa kinase wekî jêrîn hate kirin. Tevahiya mejiyê mişkê di 3 mL tampona lîzayê ya erythrocytes (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) bi 20 lêdana homojenîzatorek Dounce hate lîz kirin da ku mejiyê homojenkirî werbigire. . Lîz 30 hûrdem li ser qeşayê hatin înkubakirin, sonik kirin, û di 16,000 × de hatin santrîfuj kirin. g ji bo 10 min. Spernatant bi antî-p35-a dijî-rabbit re immunoprecipitated bûn da ku kompleksek Cdk5/p35 çalak bistînin. Cdk5/p35 kompleks û proteîna fusion GST ya paqijkirî bi adenosine 5'-triposphate, [γ-32P] (NEG-502H, PerkinElmer) û di tampon kinase (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl2, 0.2 mM DTT) ji bo 1 h li germahiya odeyê [18], [21]. Kompleksa paqijkirî Cdk5/p25 (14-516, Millipore) jî ji bo li vitro testa kinase wekî ku li jor hatî destnîşan kirin. Tampon barkirina nimûneyê 2x li tevlêra reaksiyonê hat zêdekirin û di 100°C de hat kelandin. Dûv re nimûne ji SDS-PAGE re hatin şandin û gêlê hişkkirî ji hêla otoradiografiyê ve hate nirxandin.

Kromatografiya Liquid (LC) - Mass Spectrometry (MS) / MS Analysis

Proteîna GST-D2i3 ya rekombînant ji hêla LC-MS/MS ve li dû IP-girêdayî hate analîz kirin. li vitro kinase assay. Me bi karanîna X!!Tandem (guhertoya Dec-01-2008) nasnameya peptîdê ya daneyên LC-MS/MS pêk anî. Her pelê daneya RAW yekem car bi karanîna lûleya trans-proteomîk (TPP; guhertoya 4.3) veguherî mzXML. Îskanên MS/MS-ê yên di mzXML-yên guhertî de dûv re li dijî databasa rêza proteîna mişkê ya UniProt (serbestberdana 2010_07) di nav de rêza GST-D2i3 bi karanîna X!!Tandem ve hatin lêgerîn. Tolerans ji bo îyonên pêşîn 3 Da û ji bo îyonên perçeyî 2 Da hate danîn. Taybetmendiya enzîmê ji bo trîpsînê hate bikar anîn. Vebijarkên guheztinê yên guhêrbar ji bo karbamîdometîlasyona cysteine ​​(57.021 Da), oksîsyona methionine (15.995 Da), hîdrolîza asparagine (0.987 Da) û fosforîlasyona serine (79.966 Da) hatine bikar anîn.

Bêmoxkirin

Immunoprecipitation li ser lîzên hucreyê di tampon lysis ELB de hate kirin. Antî-GFP li lîzatan hat zêdekirin û 3 saetan li 4°C înkuba kirin. Immunocomplekss bi karanîna proteîn-A agarose hatin paqij kirin. Avêtin bi tampon barkirina nimûneya SDS-ê 30 hûrdem li 37°C hatin înkubakirin, û ketin ber SDS-PAGE û blotên Western.

GST Pull-down Assay

10 μg GST û GST-D2i3 a paqijkirî bi lîzata mejiyê mişkê 1.5 saetan li 4°C de hate înkubakirin. 30 µL gulên Sepharose 4B yên bi glutathione (GSH)-konjugated (17-0756-01, GE Healthcare) bi tampon lîzê re hevsengkirî hate zêdekirin û ji bo 1 demjimêrên din hate înkubakirin. Beads bi santrîfugê li 2,000 × hatin komkiring û 4 caran bi tampon lîzê tê şûştin [22], [23]. Barîn ji hêla Western blotting ve bi karanîna antî-Cdk5 û antî-p35 ve hatî analîz kirin.

Immunocytochemistry

Hucreyên HEK 293 yên veguhestî û noyronên striatal ên ku li ser pêçan hatine çandin, carekê bi salona tampon a fosfatê (PBS) hatin şûştin û ji bo 4 hûrdeman di nav sar de 30% paraformaldehyde / PBS ve hatin rijandin. Antîpoşa seretayî di çareseriya astengkirinê de (2% seruma hespê û 1% Triton X-100 di PBS de) hate rijandin. Antîbody antî-mişk a Alexafluor-647-conjugated (A20990, Invitrogen) û Alexafluor-568-antî-kêvroşk (A11011, Invitrogen) wekî antîbodên duyemîn hatin bikar anîn. Hoechst ji bo nîgarkirina navokê hatine bikar anîn. Wêneyên bi mîkroskopiya konfokal (Olympus, FluoView-1000) hatin wergirtin.

Reseptor Internalization Assay

24 demjimêran piştî veguheztinê, hucre bi 1 μM quinpirole (Q102, Sigma) ji bo 30 hûrdem û 90 hûrdeman li 37 °C hatin derman kirin. Hucre di 2 mL PBS sar de ji nû ve hatin sekinandin û ji bo her reaksiyonê 200 µL aliqut hatin bikar anîn. Tedawiyên narkotîkê di germahiya odeyê de ji bo 3 saetan li ser hûrgelên jêrîn hatin kirin; 3 nM [3H]-spiperone (NET-565, PerkinElmer), 3 μM sulpiride (895, TOCRIS), 10 μM haloperidol (H1512, Sigma). Hîdrofobîk [3H]-spiperone ji bo nîşankirina receptorên bi tevahî diyarkirî hate bikar anîn û sulpiride hîdrofîlîk hate bikar anîn da ku li şûna receptorên membranous girêdayî [3sînyalên H]-spiperone. Nîşaneyên receptorê yên girêdayî membranê bi kêmkirina nirxên receptorên hundurîn ên ji tevahî nirxên receptorê diyarkirî têne hesibandin. Xane li ser parzûnek GF/B (Millipore) hatin fîltrekirin û 3 caran bi tampon şuştinê (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl) hatin şûştin. Parzûn hatin zuwa kirin û radyoaktîvîteya mayî bi karanîna jimarvanek şilkirina şil hate pîvandin [24].

Amadekirina Perdeya Hucreyê

Hucreyên lihevhatî yên di firaxên çandê yên 100 mm piştî veguheztinê bi PBS-a qeşa-sar hatin şûştin û di 1 mL tampon HME (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl hatin berhev kirin.2, 1 mM EDTA). Lîzên homojenkirî bi 500 × g ji bo 15 hûrdeman hatin santrîfuj kirin û dûv re 36,000 × g ji bo 30 hûrdeman santrîfuj kirin. Pelên ku di tampon HME de ji nû ve hatine sekinandin ji bo ceribandinan hatine bikar anîn.

[35S]-GTPγS Binding Assay

Parçeyên parzûna şaneyê bi 1 μM quinpirole (Q102, Sigma) di tamponê testê de (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl, berê hatin inkubasyon kirin.2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA û 0.01 mM GDP) ji bo 10 min. [35S]-GTPγS (NET-030H, PerkinElmer) di 3 μL de li 30 nM ya dawîn hate zêdekirin û ji bo 90 hûrdeman hate înkubakirin. 170 µL tampona qeşa-sar (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, û 0.1 mM GTP) hate zêdekirin ku reaksiyonê rawestîne. Membran li ser parzûna GF/B (Millipore) hatin şûştin û 3 caran bi tampon şuştinê (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl) hatin şûştin. Parzûn hatin zuwa kirin û radyoaktîvîtî bi kargêra sîntilasyonê hate pîvandin [25], [26].

Assay Binding Radioligand

Parzûnên xaneyên amadekirî bi 0.01 nM [3H]-spiperone (NET-565, PerkinElmer) û zêdekirina giraniya quinpirole (Q102, Sigma) ji bo 30 hûrdeman di tamponê de (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Membran li ser parzûna GF/B (Millipore) hatin şûştin û 3 caran bi tampon şuştinê (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl) hatin şûştin. Reaksîyon bi parzûna bilez a di nav parzûnên GF/C de bi dawî bû. Radyoaktîvîteya bermayî bi karûbarek sîntilasyona şil hate pîvandin [27]-[29].

CAMP Enzyme Immunoassay

Hucreyên HEK 293 yên veguhestî 10 saetan bi 6520 μM rolipram (R1, Sigma) pêşî hatin derman kirin, û dûv re bi 0.1 μM forskolin (F6886, Sigma) û zêdebûna giraniya quinpirole (Q102, Sigma) ji bo 30 hûrdeman hatin derman kirin. Neronên striatal ên çandî yên seretayî 10 demjimêran bi 1 μM rolipram, û dûv re jî 1h 1 μM dopamine hatin derman kirin. [22]. Lîzên hucreyê bi 0.1 M HCl hatin amadekirin û astên cAMP ji hêla kîta îmmunoassay enzîma cAMP (Sapphire Bioscience) ve li dû talîmatên çêker hatin tespît kirin.

Neurona Striatal Çandî ya Seretayî

Qada striatal ji mêjiyê embryonîk ê mişkê (E15) hate veqetandin. Tîsa veqetandî di navgîniya bingehîn a hindiktirîn (MEM) de (11095, Invitrogen) ku tê de 0.25% trîpsîn (T4549-100, Sigma) û 0.1% DNase I heye ji bo 6 hûrdeman li 37 °C hate veqetandin. Hucreyên di navgîniya platingê de ji nû ve hatin sekinandin (MEM bi 0.01 M HEPES (pH 7.4) û 10% (vol / vol) seruma hespê (16050-122, GIBCO)). Neuron 7 rojan hatin çandin li vitro (DIV 7) di MEM-ê de bi pêveka B27 (17504-044, Invitrogen) berî ku li ser immunoassayên enzîma cAMP were sepandin.

results

Cdk5 Serine 321 Fosforîlate dike Di Xala Sêyemîn a Navhucreyî ya DRD2 de li vitro

Ji bo naskirina substratên nû yên Cdk5, me lêgerînek birêkûpêk bi karanîna (S/T)PX(K/H/R) wekî rêzikên lihevhatina naskirina Cdk5 pêk anî. [30] û DRD2 wekî substratek berendam destnîşan kir. Rêzeya lihevhatinê, tevî serine 321, di sêyem lûleya hundurîn a DRD2 (D2i3) de ye ku li wir mekanîzmayên rêkûpêk ên cihêreng hatine bicîh kirin. [3], [10], [11]. Rêz ji hêla pêşveçûnê ve di DRD2-ê de di vertebrayan de tê parastin, ku tê wateya girîngiya fonksiyonê ya bermayî (Nig. 1A).

thumbnail

Figure 1. Cdk5 serine 321 fosforîlate dike di çerxa sêyem a hundirînxaneyê ya DRD2 de vitro.

(A) Rêzkirina rêza amînoasîdê ku deverên parastî yên DRD2 ji cûrbecûr cûrbecûr nîşan dide (şiwandî). Cihê fosforîlasyona potansiyel a Cdk5 bi stêrkek tê destnîşan kirin. (B) IP-girêdayî li vitro testa kînazê bi proteînên mutant GST-D2i3 û GST-D2i3 rekombinant. Kompleksa Cdk5/p35 ku ji ekstrakta mêjiyê mişkê ji hêla immunoprecipitation dijî-p35 ve hatî dewlemend kirin ji bo reaksiyonên kinase hate bikar anîn. Autoradiographek proteînên fosforîlekirî digel Coomassie şînahiya şîn a heman gêlê tê xuyang kirin. Arrowhead nîşana radyoaktîf a ku bi GST-D2i3s re têkildar destnîşan dike û serê tîra vekirî îşaretên radyoaktîf ji p35 nîşan dide. (C) Spectruma MS/MS ya perçeya peptîda fosforîlated a D2i3. Nimûneyên perçebûnê yên teorîk li binê spektrumê têne xuyang kirin. Di nav hemû îyonên perçeyî de, y- û b-îyonên hatine tespîtkirin di spektrumê de têne destnîşan kirin. The y6 û y7 îyon bi xurtî fosforîlasyona serine 321 nîşan dide. (D) Li vitro ceribandina kînazê bi kompleksa Cdk5/GST-p25 a paqijkirî bi karanîna proteînên mutant GST-D2i3 û GST-D2i3. Proteînên fosforîlated di otoradiografekê de, ligel rengkirina şîn a şîn a Coomassie, hatin xuyang kirin. Arrowhead nîşana radyoaktîf a GST-D2i3 nîşan dide û tîra vekirî îşaretên radyoaktîf ji GST-p25 nîşan dide.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Ji bo nirxandina kapasîteya Cdk5 ji bo fosforîlkirina D2i3, me IP-girêdayî pêk anî li vitro analîzên kînazê bi karanîna kompleksek Cdk5/p35 ya çalak a ku ji lîzata mêjiyê mişkê bi immunoprecipitation p35 bi proteînên GST-D2i3 (bermayiyên asîda amînî 212-373) safîkirî yên paqijkirî wekî substrate dewlemendkirî ye. Me di proteînên paqijkirî yên GST-D2i3 û GST-D2i3 S297A de nîşaneyên fosforîlasyonê dît, lê bi karanîna GST-D2i3 S321A nîşanek girîng kêm bû (Nig. 1B). Ji bo verastkirina fosforîlasyona serine 321 di GST-D2i3 de, me analîza LC-MS/MS ya nimûneyên ji IP-girêdayî pêk anî. li vitro asasên kinase bi karanîna spektrometriya girseyî ya LTQ XL. Bi domdarî, fosfo-peptîdên ku bi girseya fosfo-serîn 321 peptîd ve girêdayî ne (Nig. 1C). Bifikirin ku wergirtina girêdayî daneyê di dema analîza LC-MS/MS de meyl dike ku di nimûneyê de proteînên pir zêde kifş bike. [31], ev dane destnîşan dike ku bermayiya serine 321 cîhê fosforîlasyona serdest a Cdk5 li herêma D2i3 ye. Ji bo îsbatkirina fosforîlasyona rasterast a serine 321 di GST-D2i3 de ji hêla Cdk5 ve, li vitro ceribandina kînazê bi karanîna kompleksa Cdk5/GST-p25 a paqijkirî ya bi proteînên GST-D2i3 yên rekombînant ên paqijkirî hate kirin. Me di GST-D2i3 de nîşanek fosforîlasyonê ya girîng a ku di GST-D2i3 S321A de tunebû nas kir (Nig. 1D). Bi hev re, ev encam destnîşan dikin ku bermayiya D2i3 S321 ji bo fosforîlasyona bi navbeynkariya Cdk5 armancek bijartî ye.

Cdk5 Serine 321 Fosforîlate dike Di Kêla Sêyemîn a Navhucreyî ya DRD2 de di Hucreyan de

Ji bo naskirina fosforîlasyona serine 321, me antîpotek taybetî ji bo fospho-serine 321 (pS321) bilind kir. Nimûneyên ji IP-girêdayî li vitro ceribandina kinase bi karanîna antî-pS321 antî-pS2 ji hêla Western blotting ve hate analîz kirin. Blots di reaksiyona kinase de ku bi GST-D3iXNUMX ve girêdayî bû bandek cûda nîşan da (Nig. 2A). Ji bo verastkirina fosforîlasyona potansiyel a serine 321 di DRD2 de ji hêla Cdk5 ve di hucreyan de, immunoprecipitates antî-GFP ji hucreyên HEK 293 ku DRD2-GFP û DRD2 S321A-GFP bi an bê HA-Cdk5 û p35 ve diyar dikin, ji hêla Western blotting ve hatî analîz kirin û bi karanîna antî-GFP ve hate analîz kirin. antî-pS321 antîbodî. Nîşaneyên bandê yên taybetmend ên ji hêla antî-GFP-ê ve têne zanîn ku ji ber glycosylasyona zêde ya DRD2-ê têne zanîn tenê di hebûna DRD2-GFP de têne dîtin, û antî-pS321 antî-pS2 sînyalên DRD5-ê yên wekhev tenê bi îfadeya Cdk35/pXNUMX ve têne dîtin.Nig. 2B) [7]. Ji bo bêtir verastkirina fosforîlasyona serine 321 ji hêla Cdk5 ve, D2i3 (FLAG-D2i3) û forma mutant a D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) hatin afirandin. FLAG-D2i3 û FLAG-D2i3 S321A ku bi an bê HA-Cdk5 û p35 di hucreyên HEK 293 de têne diyar kirin ji hêla ceribandinek guheztina tevgerê ya SDS-gel ve hatî analîz kirin. Ji bo FLAG-D5i2 veguheztinek girîng a girêdayî Cdk3 hate dîtin, lê ne ji bo FLAG-D2i3 S321A (Nig. 2C). Me di heman demê de asta fosforîlasyona DRD2 li Ser321 li ser stimulasyona agonîst jî nirxand. Hucreyên HEK 293 ku DRD2-GFP û kompleksa Cdk5/p35 îfade dikin ji hêla quinpirole ve hatin teşwîq kirin, û immunoprecipitates antî-GFP ji lîzên hucreyê bi blota Western bi karanîna antî-GFP û antî-pS321 ve hatî analîz kirin. Me dît ku fosforîlasyona bi navbeynkariya Cdk5-ê ya DRD2 li Ser321 ji hêla stimulasyona agonîst ve nehatiye bandor kirin, ku ji fosforîlasyonên navbeynkariya GRK- û PKC-yê cûda xuya dike (Nig. 2D) [32], [33]. Bi hev re, van encaman destnîşan dikin ku Cdk5 dikare bermayiya serine 321 ya DRD2 di hawîrdora hucreyî de fosforîl bike.

thumbnail

Wêne 2. Cdk5 serine 321 fosforîlate dike di sêyem lûleya hundurîn a DRD2 ya di hucreyan de.

Fosforîlasyona bi navbeynkariya Cdk5 ya serine 321 bi karanîna antî-pS321 ve hate analîz kirin. (A) Nimûneyên ji IP-girêdayî li vitro ceribandina kînazê bi karanîna proteînên GST-D2i3 bi blottinga Western (WB) bi antîbodên destnîşankirî ve hate analîz kirin. Serikên tîran GST-D2i3s destnîşan dikin. (B) DRD2-GFP û DRD2 S321A-GFP bi an bêyî HA-Cdk5 û p35 di hucreyên HEK 293 de hate diyar kirin. Immunoprecipitates antî-GFP bi karanîna antî-GFP û antî-pS321 bi karanîna blotting Western ve hate analîz kirin. Kevir îşaretên DRD2 destnîşan dike û serê tîra vekirî îşaretên netaybetî ji immunoprecipitates antî-GFP destnîşan dike. '% input' ji bo reaksiyonek IP-ê % volume ya lîzatê ya tevahî ye. Nîşaneyên Cdk5 ên endogen ên qels bi stêrkan hatine destnîşan kirin. (C) Vekolîna guheztina tevgera gel. Hucreyên HEK 293 yên ku wekî ku tê destnîşan kirin hatine veguheztin ji hêla Western blotting ve hatine analîz kirin. (D) Hucreyên HEK 293 yên veguhestî bi quinpirole ve hatin derman kirin û immunoprecipitates antî-GFP bi blota rojavayî bi antî-GFP û antî-pS321 ve hatî analîz kirin. Serê tîra vekirî îşaretên netaybet ên ji immunoprecipitates antî-GFP destnîşan dike.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Kompleksa Cdk5/p35 û DRD2 bi Fîzîkî ve girêdayî ne

Me pêwendiya laşî ya potansiyel a di navbera kompleksa Cdk5/p35 û DRD2 de lêkolîn kir ji ber ku gelek substratên Cdk5 têne zanîn ku bi fîzîkî bi kompleksa Cdk5/p35 ve girêdayî ne. [23], [34], [35]. Pêşîn, ceribandina vekişîna GST-ê hate kirin. Proteîna GST-D2i3 ya rekombînant a paqijkirî bi lîzata mejiyê mişkê re hate înkubakirin û bermayên vekêşana GST ji bo blota rojavayî hatin analîz kirin. Wekî ku tê nîşandan Nig. 3A, Cdk5 û p35 endojen di nav barên dakêşanê de hatin nas kirin, ku têkiliyek laşî ya di navbera DRD2 û kompleksa Cdk5/p35 de destnîşan dike (Nig. 3A). Digel vê yekê, HA-Cdk5 û p35 di immunoprecipitates antî-GFP de ji lîzên hucreyên HEK 293 ku DRD2-GFP û Cdk5/p35 diyar dikin (Nig. 3B). Wekî din, me analîzên immunocytokîmyayî pêk anî û dît ku DRD2-GFP, HA-Cdk5 û p35 li qada membranozî ya hucreyên HEK 293 îşaretên hev-herêmî yên girîng nîşan didin (Nig. 3C, panelên jorîn). Me di çarçoveya neuronal de hev-herêmîkirina DRD2 û Cdk5 / p35 jî lêkolîn kir. Bi domdarî, DRD2-GFP di heman demê de bi Cdk5 û p35 endogenous re di neuronên striatal ên çandî (DIV7) de hev-herêmî girîng nîşan da, ku bêtir piştgirî dide girêdanên fonksiyonel di navbera DRD2 û Cdk5/p35 (Nig. 3C, panelên jêrîn). Encam destnîşan dikin ku DRD2 û Cdk5/p35 dikarin tevliheviyek çêbikin û bi vî rengî, piştgirî didin têgîna ku DRD2 substratek fîzyolojîk a Cdk5 e.

thumbnail

Wêne 3. Cdk5/p35 dikare bi DRD2 re kompleksek çêbike.

(A) Vekolîna vekêşana GST-ê bi karanîna proteîna GST-D2i3 ya rekombînant a paqijkirî ya bi jêgirtina mêjiyê mişkê re tê bikar anîn. Bersivên dakêşana GST-ê ketin ber analîzên blota rojavayî. 'Bead' barîna dakêşanê ya bêyî proteînên GST destnîşan dike. (B) Immunoprecipitation kompleksa DRD2 û Cdk5/p35. Anti-GFP IP ya ji lîzên ji hucreyên veguheztin bi analîzên blota rojavayî ve hat kirin. Kevir îşaretên DRD2 destnîşan dike û serê tîra vekirî îşaretên netaybetî ji immunoprecipitates antî-GFP destnîşan dike. Ji bo têketinan blotek zêde vekirî jî di rastê de tê xuyang kirin. (C) Analîzên immunocytochemical yên DRD2 û Cdk5/p35. Hucreyên HEK 293 ku DRD2-GFP û Cdk5/p35 îfade dikin bi antî-Cdk5 û antî-p35 (panelên jorîn) hatin reng kirin. DRD2-GFP tenê di noyronên striatal ên çandî de hate xuyang kirin û bi antî-Cdk5 û antî-p35 (panelên jêrîn) hate reng kirin. Hoechst ji bo nîgarkirina navokê hatine bikar anîn. Barê pîvanê 5 μm ye. Hemî wêne bi karanîna mîkroskopa konfokal (Olympus, FluoView-1000) hatine wergirtin.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Fosforîlasyona DRD5 bi navbeynkariya Cdk2 Çalakiya Receptorê kêm dike

Hat ragihandin ku fosforîlasyon taybetmendiyên krîtîk ên GPCR-ê yên wekî hevgirtina proteîna G, hundurînkirina receptor, herêmîbûna hundurîn, û têkiliya bi proteînên modulator re modul dike. [9], [11], [24]. YEKNavxweyîkirina receptorê ku ji hêla gonîst ve hatî çêkirin pêvajoyek birêkûpêk a krîtîk a veguheztina sînyalê ye. Me modulasyona navbeynkariya Cdk5 ya hundurînkirina DRD2 lêkolîn kir. Hucreyên HEK 293 ku DRD2-GFP û DRD2 S321A-GFP bi Cdk5/p35 an bêyî wê îfade dikin, bi 1 μM quinpirole ve hatin inkubasyon kirin da ku hundurê DRD2-ya teşwîqkirî ya agonîst bike.Nig. 4A). [3Nîşaneyên H]-spiperone yên hucreyên diyarker ên DRD2-GFP di 30 hûrdeman dermankirina quinpirole de bi girîngî kêm bûn û di 90 hûrdemî de hatin xilas kirin. Balkêş e, [3Nîşaneyên H]-spiperone yên hucreyên diyarker DRD2-GFP û Cdk5/p35 jî di 30 hûrdeman dermankirina quinpirole de kêm bûn lê di 90 hûrdeman de nehat xilas kirin (Nig. 4A, beşa duyemîn). Ji alîyek dî, [3Nîşaneyên H]-spiperone yên hucreyên diyarker ên DRD2 S321A-GFP di 30 hûrdemî de kêm bûn û di 90 hûrdem de hatin vegerandin, bêyî ku bi Cdk5 / p35 re hevpeyivîna xwe nîşan bide. Lêkolînên berê destnîşan kirin ku DRD2-ya navxweyî li ser teşwîqkirina agonîst a dirêj ve vedigere parzûna plazmayê. [11]. Twusa dixuye ku fosforîlasyona Cdk5-ya navbeynkar a DRD2 di pêvajoyên resensitîzasyonê yên li dû hundurê hundurînkirina DRD2-a ku ji hêla agonîst ve hatî çêkirin de beşdar dibe.

thumbnail

Figure 4. Fosforîlasyona bi navbeynkariya Cdk5 vebêja rûbera DRD2 û îşaretkirina jêrîn kêm dike.

(A) îfadeya rûbera DRD2 bi [3H]-spiperone binding assay. Hucreyên HEK293 yên veguheztin bi 1 μM quinpirole ji bo dema hatî destnîşan kirin hatin şixulandin û hatin berhev kirin, li dûv 3 nM [3Dermankirina H]-spiperone ji bo 3 h. Radyoaktîvîtî hat pîvandin û sînyalên rûvî hatin hesabkirin. Barên çewtiyê navgîniya ± SE nîşan didin (n = 8; *p<0.05, **p<0.01; ANOVA yek-alî bi testa Dunnett post hoc re: hemî stûnan beramberî stûna kontrolê bidin ber hev). (B) [35S]-GTPγS binding assay. Parzûnên şaneyê ji şaneyên ku li gorî diyarkirî hatine veguheztin hatine amadekirin. Amadekariyên membranê bi 1 μM quinpirole û dûv re 3 nM [35S]-GTPγS ji bo 90 min. Barên çewtiyê navînî ± SE nîşan didin (n = 8; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; ANOVA yek-alî bi testa post-hoc ya Bonferroni: hemî cotên stûnan bidin ber hev). (C) Pêşbaziya Quinpirole [3H]-spiperone binding assay. Amadekariyên membranê yên ji şaneyên veguhastî bi 0.01 nM [3H]-spiperone û zêdekirina giraniya quinpirole ji bo 30 min. Ji hêla GraphPad ve paşveçûnek ne-linear hate wergirtin. Barên çewtiyê navînî ± SE (n = 3) nîşan dide. (D) Di hucreyên HEK 293 yên transfekkirî de immunoassayên enzîma cAMP. Hucreyên veguhestî 10 saetan bi 1 μM rolipram ve hatin dermankirin, û dûv re bi 0.1 μM forskolin û zêdekirina giraniya quinpirole ji bo 30 hûrdeman hatin derman kirin. Ji hêla GraphPad ve paşveçûnek ne-linear hate wergirtin. Barên çewtiyê navînî ± SE nîşan didin (n = 4; ** p<0.01; du dûvik t-test). (E) Neronên striatal ên çandî yên ji celebê çolê û embrîyoyên p35 knockout (DIV 7) bi 10 μM rolipram ji bo 1 demjimêran li dûv 1 μM dopamine ji bo 1 demjimêran hatin derman kirin. Barên çewtiyê navînî ± SE nîşan didin (n = 4; **p<0.01; du dûvik t-test).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Me guheztinek potansiyel a pevgirêdana proteîna G-ya agonîst-stimulkirî ya bi DRD2-ê re ku bi fosforîlasyona Cdk5-ê ve girêdayî ye bi karanîna [35S]-GTPγS binding assay [25], [26]. DRD2-GFP û DRD2 S321A-GFP bi an bêyî Cdk5 / p35 di hucreyên HEK 293 de hatin diyar kirin. Membran bi 1 μM quinpirole hatin amade kirin û teşwîq kirin û bêtir destûr kirin [35S]-GTPγS incorporation. DRD2-GFP û Cdk5/p35 membrana hucreyê diyar dike ku bi girîngî xirab bûye [35S]-GTPγGirêdana S li gorî hemî membranên hucreyên din (Nig. 4B). Van encaman destnîşan dikin ku fosforîlasyona bi navbeynkariya Cdk5 girêdana proteîna G-ya agonîst-stimulkirî ya li DRD2-ê kêm-rêkûpêk dike.

Wekî din, pêşbaziya quinpirole [3Vekolînên girêdana H]-spiperone hatin kirin ku ji hêla fosforîlasyona bi navbeynkariya Cdk2 ve li her guhertinek potansiyel a di hevrêziya agonîst de li DRD5 vekolîn. Girêdana pêşbazî ya [3H]-spiperone li ser dermankirina zêdebûna giraniya quinpirole ji bo amadekirina membranê ya ji veguheztin hate pîvandin. Girêdana hevrikî ya quinpirole û [3H]-spiperone li DRD2-GFP û DRD2 S321A-GFP têketinek wekhev çêkiri nirxan (-9.789 ji bo DRD2-GFP; -9.691 ji bo DRD2 S321A-GFP), destnîşan dike ku têkiliya lîgandê bi DRD2 re bi girîngî ji fosforîlasyona Cdk5-navbeynkar li DRD2 nayê bandor kirin (Nig. 4C).

Fosforîlasyona bi navbeynkariya Cdk5 Rêya îşaretê ya DRD2-cAMP daxist-rêkûpêk dike

Dûv re, me lêkolîn kir ka guheztina DRD2 ji hêla Cdk5 ve bandorê li rêyên nîşankirina jêrîn dike. Me astengkirina bi navbeynkariya DRD2 ya hilberîna cAMP-ê ya ji hêla adenylyl cyclase ve di nav hucreyên ku DRD2-GFP û DRD2 S321A-GFP de bi karanîna immunoassay enzîma cAMP-ê vedibêje, çavdêrî kir. Hucreyên ku DRD2-îfade dikin di bersiva quinpirole de bi rengek bi doz ve girêdayî asta cAMP-ê kêm bûne. Balkêş e, hevberdana Cdk5 / p35 bi girîngî astengkirina herî zêde ya avakirina cAMP kêm kir (Wêne 4D, panela çepê). Ji hêla din ve, di hucreyên diyarker ên DRD2 S321A-GFP de, avabûnên cAMP-ê di bersivdayîna dermankirina quinpirole de bêyî ku bilêvkirina Cdk5 / p35 bi bandor were asteng kirin (4D, panela rastê). Van encaman destnîşan dikin ku fosforîlasyona Cdk5-a navbeynkar a DRD2 çalakiya astengker a DRD2 li ser riya nîşana cAMP-ê ya jêrîn kêm dike. Ji bo piştrastkirina diyardeyan di cîhek ji hêla fîzyolojîkî ve têkildartir de, me neuronên çandî yên seretayî yên ji embrîyoyên knockout ên ku di p35 de kêmas in, çalakkerek bingehîn a Cdk5 bikar anîn. Neronên striatal ên çandî yên seretayî bi 1 μM dopamine hatin derman kirin û ji hêla immunoassay enzîma cAMP ve hatin analîz kirin. Dema ku bi dopamînê ve were teşwîqkirin, neuronên ji mişkên p35 yên knockout asta cAMP-ê li gorî noyronên celeb ên çolê kêm nîşan didin (Nig. 4E). TBi hev re, me encam da ku fosforîlasyona Cdk5-a navbeynkar a DRD2 dibe sedema kêmbûna tone astengker li ser riya cAMP-ê ya ku ji hêla DRD2 ve tê xebitandin.

Nîqaş

Me DRD2 wekî substratek nû ya Cdk5 nas kir. Wusa dixuye ku fosforîlasyon bi bandorkirina çarenûsa DRD2-ê li dû hundurê receptorê bi bandorkirina çarenûsa DRD2-ê kêm dike û bi vî rengî DRD2 G kêm dike.i-hevkirin û rêça cAMP-ê ya jêrîn. Ji ber ku bermayiya fosforîlasyonê S321 hem di îzoformên DRD2 yên dirêj û hem jî yên kurt de heye, mekanîzmaya ku di vê lêkolînê de tê pêşniyar kirin dibe ku di îşaretkirina bi navbeynkariya DRD2 de rêgezek rêziknameya gelemperî be..

DRD2 di noyronên zirav ên navîn de ne tenê wekî binkûrek sereke ya wergirên dopamînê hate hesibandin, lê di heman demê de ji ber hestiyariya wê ya ji guhertinên hebûna di bersivê de li ser stimulasyonên hawîrdorê jî hate nas kirin. Nehesaskirin û resensitîzasyona DRD2-a ku ji hêla agonîst ve hatî çêkirin bi berfirehî hatî lêkolîn kirin [11], [24]. Bi taybetî, hejmarek lêkolînan destnîşan kirin ku bandorên rûbirûbûna psîkostimulant a kronîk, wek kokaîn û amfetamîn, ku asta derveyî hucreyî ya dopamînê di synapse striatal de bilind dike, bi guhertinên dînamîkî yên DRD2-ya postsynaptîk re têne hev kirin. [36]. Bi rastî, bikarhênerên kokainê yên kronîk têne zanîn ku asta DRD2 li devera striatal kêm kirine, û hebûna DRD2 di navokê de (NAcc) têkiliyek neyînî bi lêgerîna narkotîkê û tevgerên bihêzkirina mişk û prîmatan re nîşan dide. [37]-[39]. Van vedîtinan destnîşan dikin ku fonksiyona DRD2 di bersivê de ji stimulasyonên cihêreng, di nav de rûdana dermanê kronîk, ji rêziknameya adaptasyon an berdêl pir hesas e. Encamên me destnîşan dikin ku bermayiya S321 di sêyem lûleya hundurîn a DRD2 de dikare ji hêla Cdk5 ve were fosforîl kirin, ku di encamê de kêmbûna bandora astengker a DRD2 li ser riya cAMP-ê vedigire. Ev têkilî mekanîzmayek rêziknameyê ya nû ya ku bi Cdk5-ê re di neuronên dopaminoceptive de têkildar pêşniyar dike ku dibe ku bi xwezaya dînamîkî ya hebûna rûbera DRD2 ve girêdayî be.

Pêdivî ye ku were zanîn ku Cdk5 di navbeynkariya guhertinên adaptî yên hawîrdora neuronal de wekî hêmanek bingehîn tê zanîn. Mînakî, guheztinên strukturî û fonksiyonel ên stûnên dendrîtîk ên di noyronên çerxa lîmbîk de yek ji encamên dubarekirina psîkostimulant e. [40]. Van guhertinan bi guheztinên molekularî yên cihêreng re, di nav de ketina proteîna girêdana element-girêdanê ya cAMP (CREB) û ΔFosB, faktorên veguheztinê yên ku di bersiva rêveberiya kronîk a kokaînê de rêgezek domdar nîşan didin. [41], [42]. Ya girîng, Cdk5 hedefek ΔFosB ye [19], û gelek hêmanên krîtîk ên ku di dînamîkên stûyê dendrîtîk de têkildar in, wekî PSD-95, kinase-aktîfkirî ya p21 (PAK), β-catenin, û spinophilin, wekî substratên Cdk5 hatine ragihandin. [43]-[46]. Bi domdarî, manîpulasyonên genetîkî an dermankolojîk ên çalakiya Cdk5 guheztinên morfolojiya stûna dendrîtîk û bersivên behrê yên li ser kokainê derdixe holê, ku ji bo Cdk5 di guhertinên molekulî û morfolojîk ên çerxên dopamîn ên mesolimbic de rola krîtîk destnîşan dike. [47], [48]. Encamên me destnîşan dikin ku DRD2 armancek nû ya Cdk5 ye ku di bersivê de bertekên kronîk ên narkotîkê de li ser guhartinên adaptasyona pergala dopamînê nihêrînek zêde peyda dike ji ber ku paşîn-rêkûpêkkirina Cdk5 bi navbeynkariya ΔFosB dibe ku bibe sedema zêdebûnek tonik di fosforîlasyona DRD2 de. . Wekî din, tê zanîn ku DRD2 bandorê li gelek pêvajoyên hucreyî dike, di nav de rêgezên cAMP û MAP kinase û bûyerên veguheztina jêrîn. [42], [49]. Ji ber vê yekê, dîtinên di vê lêkolînê de ne tenê dibe ku rêziknameyek rasterast a DRD2 ji hêla Cdk5 ve diyar bike lê di heman demê de di heman demê de di bersivên adaptasyona pergala dopamînê de ji rûdana dermanê kronîk re têgihiştinek nû jî peyda dike.

Alîkarên Nivîskar

Ceribandin û sêwirandin: JJ YUP DH SKP. Ezmûnan pêk anîn: JJ YUP DKK YK. Daneyên analîz kirin: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Reagents / materyal / amûrên analîzê yên beşdar: YHS. Kaxez nivîsand: JJ SKP.

Çavkanî

  1. 1. Missale C, Nash SR, Robinson SW, Jaber M, Caron MG (1998) Receptorên Dopamine: ji avahî heya fonksiyonê. Physiol Rev 78: 189–225.
  2. 2. Wise RA (2002) Rêbaza xelata mêjî: nerînên ji teşwîqên nediyar. Neuron 36: 229-240. doi: 10.1016/s0896-6273(02)00965-0
  3. Gotara Benda
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Gotara Benda
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Gotara Benda
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Gotara Benda
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Gotara Benda
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Gotara Benda
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Gotara Benda
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Gotara Benda
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Gotara Benda
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Gotara Benda
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Gotara Benda
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Gotara Benda
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Gotara Benda
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Gotara Benda
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Gotara Benda
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Gotara Benda
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Gotara Benda
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Gotara Benda
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Gotara Benda
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Gotara Benda
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Gotara Benda
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Gotara Benda
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Gotara Benda
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Gotara Benda
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Gotara Benda
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Gotara Benda
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Gotara Benda
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Gotara Benda
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Gotara Benda
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. Gotara Benda
  91. PubMed / NCBI
  92. Google Scholar
  93. Gotara Benda
  94. PubMed / NCBI
  95. Google Scholar
  96. Gotara Benda
  97. PubMed / NCBI
  98. Google Scholar
  99. Gotara Benda
  100. PubMed / NCBI
  101. Google Scholar
  102. Gotara Benda
  103. PubMed / NCBI
  104. Google Scholar
  105. Gotara Benda
  106. PubMed / NCBI
  107. Google Scholar
  108. Gotara Benda
  109. PubMed / NCBI
  110. Google Scholar
  111. Gotara Benda
  112. PubMed / NCBI
  113. Google Scholar
  114. Gotara Benda
  115. PubMed / NCBI
  116. Google Scholar
  117. Gotara Benda
  118. PubMed / NCBI
  119. Google Scholar
  120. Gotara Benda
  121. PubMed / NCBI
  122. Google Scholar
  123. Gotara Benda
  124. PubMed / NCBI
  125. Google Scholar
  126. Gotara Benda
  127. PubMed / NCBI
  128. Google Scholar
  129. Gotara Benda
  130. PubMed / NCBI
  131. Google Scholar
  132. Gotara Benda
  133. PubMed / NCBI
  134. Google Scholar
  135. Gotara Benda
  136. PubMed / NCBI
  137. Google Scholar
  138. Gotara Benda
  139. PubMed / NCBI
  140. Google Scholar
  141. Gotara Benda
  142. PubMed / NCBI
  143. Google Scholar
  144. 3. Neve KA, Seamans JK, Trantham-Davidson H (2004) Nîşana receptorê Dopamine. J Recept Signal Transduct Res 24: 165-205. doi: 10.1081/lrst-200029981
  145. 4. Amar S, Shaltiel G, Mann L, Shamir A, Dean B, et al. (2008) Tevlêbûna gengaz a hêmanên nîşana receptorê D2-ya post-dopamîn di pathofîzolojiya şîzofreniyê de. Int J Neuropsychopharmacol 11: 197-205. doi: 10.1017/s1461145707007948
  146. 5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, et al. (2002) Rola receptorên mîna D2-dopamine di xwe-rêveberiya kokainê de: lêkolînên bi mişkên mutantê receptorê D2 û dijberên receptorên D2 yên nû. J Neurosci 22: 2977-2988.
  147. 6. Lee S, Jeong J, Park YU, Kwak Y, Lee SA, et al. (2012) Valproate îşaretkirina dopamine bi girêdana bi induction îfadeya proteîna Par-4 re diguhezîne. PLoS One 7: e45618. doi: 10.1371/journal.pone.0045618
  148. 7. Fishburn CS, Elazar Z, Fuchs S (1995) Glîkozîlasyona cûda û bazirganiya hundurîn ji bo isoformên dirêj û kurt ên wergirên dopamînê D2. J Biol Chem 270: 29819–29824. doi: 10.1074/jbc.270.50.29819
  149. 8. Reader TA, Molina-Holgado E, Lima L, Boulianne S, Dewar KM (1992) Taybetî [3H]raclopride bi receptorên neostriatal dopamine D2 ve girêdayî ye: rola komên disulfide û sulfhydryl. Neurochem Res 17: 749-759. doi: 10.1007/bf00969008
  150. 9. Ng GY, O'Dowd BF, Caron M, Dennis M, Brann MR, et al. (1994) Fosforîlasyon û palmîtoylkirina receptora dopamîn a D2L ya mirovî di hucreyên Sf9 de. J Neurochem 63: 1589-1595. doi: 10.1046/j.1471-4159.1994.63051589.x
  151. 10. Li M, Bermak JC, Wang ZW, Zhou QY (2000) Modulasyona îşaretkirina receptorê dopamîn D(2) ji hêla proteîna girêdana aktîn (ABP-280). Mol Pharmacol 57: 446-452.
  152. 11. Cho D, Zheng M, Min C, Ma L, Kurose H, et al. (2010) Endocytosis û fosforîlasyona receptorê ya ku ji hêla agonîst ve hatî çêkirin navbeynkariya receptorên dopamine D (2) dike. Mol Endocrinol 24: 574-586. doi: 10.1210/me.2009-0369
  153. 12. Tsai LH, Delalle I, Caviness VS Jr, Chae T, Harlow E (1994) p35 yekîneyek rêkûpêk-taybetî ya neuralî ya kinase-girêdayî cyclin e 5. Xweza 371: 419-423. doi: 10.1038/371419a0
  154. 13. Dhavan R, Tsai LH (2001) Deh salên CDK5. Nat Rev Mol Cell Biol 2: 749-759. doi: 10.1038/35096019
  155. 14. Fu AK, Ip NY (2007) Kînaza 5-a girêdayî Cyclin-ê di dema pêşkeftina stûna dendrîtîk de nîşanên derveyî hucreyî bi sîtoskeletonê aktînê ve girêdide. Cell Adh Migr 1: 110–112. doi: 10.4161/cam.1.2.4617
  156. 15. Wang J, Liu S, Fu Y, Wang JH, Lu Y (2003) Çalakkirina Cdk5 mirina hucreya CA1 ya hîpokampal bi rasterast fosforîlkirina receptorên NMDA vedike. Nat Neurosci 6: 1039–1047. doi: 10.1038/nn1119
  157. 16. Zhang S, Edelmann L, Liu J, Crandall JE, Morabito MA (2008) Cdk5 fosforîlasyona tyrosine 1472 NR2B û vegotina rûkalê receptorên NMDA bi rê ve dibe. J Neurosci 28: 415-424. doi: 10.1523/jneurosci.1900-07.2008
  158. 17. Moy LY, Tsai LH (2004) Kînaza 5-a girêdayî Cyclin-a girêdayî serine 31 ya tyrosine hydroxylase fosforîlate dike û aramiya wê rê dide. J Biol Chem 279: 54487–54493. doi: 10.1074/jbc.m406636200
  159. 18. Bibb JA, Snyder GL, Nishi A, Yan Z, Meijer L, et al. (1999) Fosforîlasyona DARPP-32 ji hêla Cdk5 ve nîşana dopamînê di neuronan de modul dike. Xweza 402: 669–671.
  160. 19. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, et al. (2001) Bandorên rûbirûbûna kronîk a kokaînê ji hêla proteîna neuronal Cdk5 ve têne rêve kirin. Xweza 410: 376–380.
  161. 20. Ohshima T, Ogawa M, Veeranna, Hirasawa M, Longenecker G, et al. (2001) Beşdariyên sînerjîk ên kînaza 5/p35 û Reelin/Dab1 ya girêdayî cyclin-ê ji bo cîhgirtina neuronên kortîkal ên di mêjiyê mişkê yê pêşkeftî de. Proc Natl Acad Sci USA 98: 2764–2769. doi: 10.1073/pnas.051628498
  162. 21. Morabito MA, Sheng M, Tsai LH (2004) Kînaza 5-a girêdayî Cyclin-ê fosforîlyeya N-termînalê ya proteîna dakêşana postsynaptîk PSD-95 di neuronan de dike. J Neurosci 24: 865-876. doi: 10.1523/jneurosci.4582-03.2004
  163. 22. Park SK, Nguyen MD, Fischer A, Lûqa MP, Affar el B, et al. (2005) Par-4 nîşana dopamine û depresyonê girêdide. Hucre 122: 275-287. doi: 10.1016/j.cell.2005.05.031
  164. 23. Niethammer M, Smith DS, Ayala R, Peng J, Ko J, et al. (2000) NUDEL substratek nû ya Cdk5 e ku bi LIS1 û dyneînên sîtoplazmî ve girêdayî ye. Neuron 28: 697-711. doi: 10.1016/s0896-6273(00)00147-1
  165. 24. Kim KM, Valenzano KJ, Robinson SR, Yao WD, Barak LS, et al. (2001) Rêzkirina ciyawazî ya receptorên dopamine D2 û D3 ji hêla receptor kinases û beta-arrestînên bi proteîn-G ve girêdayî ye. J Biol Chem 276: 37409–37414. doi: 10.1074/jbc.m106728200
  166. 25. Waldhoer M. Mol Pharmacol 1998: 1-2.
  167. 26. Bofill-Cardona E, Kudlacek O, Yang Q, Ahorn H, Freissmuth M, et al. (2000) Girêdana kalmodulin bi receptorê D2-dopamine re bi girtina guheztina çalakkirina proteîna G nîşana receptorê kêm dike. J Biol Chem 275: 32672–32680. doi: 10.1074/jbc.m002780200
  168. 27. Lîsteya SJ, Seeman P (1981) Çareserkirina hêmanên wergirên dopamîn û serotonin ên [3H]spiperone ku bi herêmên mejîyê mişk ve girêdide. Proc Natl Acad Sci USA 78: 2620–2624. doi: 10.1073/pnas.78.4.2620
  169. 28. Gardner B, Strange PG (1998) Çalakiya agonîst li ser receptorên dopamînê yên D2 (dirêj): girêdana lîgandê û ceribandinên fonksiyonel. Br J Pharmacol 124: 978-984. doi: 10.1038/sj.bjp.0701926
  170. 29. Seeman P, Tallerico T, Ko F (2003) Dopamine [3H]domperidone ji cîhên pêwendiya bilind ên receptora dopamine D2 vediguhezîne, lê ne [3H]raclopride an [3H]spiperone di navgîniya îzotonîk de: Encamên ji bo belavkirina pozîtronê mirovî tomography. Synapse 49: 209-215. doi: 10.1002/syn.10232
  171. 30. Obenauer JC, Cantley LC, Yaffe MB (2003) Scansite 2.0: Pêşbîniya proteome-berfireh ya danûstendinên nîşankirina hucreyê bi karanîna motîfên rêzikên kurt. Asîdên Nukleîk Res 31: 3635-3641. doi: 10.1093/nar/gkg584
  172. 31. Liu H, Sadygov RG, Yates JR 3rd (2004) Modelek ji bo nimûneyên rasthatî û texmînkirina pirbûna proteîna têkildar di proteomîkên gulebaranê de. Anal Chem 76: 4193-4201. doi: 10.1021/ac0498563
  173. 32. Ito K, Haga T, Lameh J, Sadee W (1999) Veqetandina receptorên dopamine D2 bi hevderxistina kînazên receptorên G-proteîn-hev ve girêdayî ye 2 an 5. Eur J Biochem 260: 112-119. doi: 10.1046/j.1432-1327.1999.00125.x
  174. 33. Namkung Y, Sibley DR (2004) Protein kinase C navbeynkariya fosforîlasyon, desensitîzasyon û bazirganiya receptora D2 dopamine dike. J Biol Chem 279: 49533–49541. doi: 10.1074/jbc.m408319200
  175. 34. Wong AS, Lee RH, Cheung AY, Yeung PK, Chung SK, et al. (2011) Fosforîlasyona Cdk5-navbeynkar a endophilin B1 ji bo otofagiya veguheztin di modelên nexweşiya Parkinson de hewce ye. Nat Cell Biol 13: 568–579. doi: 10.1038/ncb2217
  176. 35. Kesavapany S, Lau KF, McLoughlin DM, Brownlees J, Ackerley S, et al. (2001) p35/cdk5 beta-catenin girêdide û fosforîlate dike û pêwendiya beta-catenin/presenilin-1 saz dike. Eur J Neurosci 13: 241-247. doi: 10.1046/j.1460-9568.2001.01376.x
  177. 36. Kuhar MJ, Ritz MC, Boja JW (1991) Hîpoteza dopamînê ya taybetmendiyên bihêzkirina kokaînê. Trends Neurosci 14: 299-302. doi: 10.1016/0166-2236(91)90141-g
  178. 37. Volkow ND, Fowler JS, Wolf AP, Schlyer D, Shiue CY, et al. (1990) Bandorên destdirêjiya kronîk a kokaînê li ser receptorên dopamînê yên postsynaptîk. Am J Psychiatry 147: 719–724.
  179. 38. Dalley JW, Fryer TD, Brichard L, Robinson ES, Theobald DE, et al. (2007) Receptorên D2/3 yên Nucleus accumbens pêşbîniya taybetmendiyê û xurtkirina kokaînê dikin. Zanist 315: 1267–1270. doi: 10.1126/zanist.1137073
  180. 39. Nader MA, Morgan D, Gage HD, Nader SH, Calhoun TL, et al. (2006) Wêneya PET ya receptorên dopamine D2 di dema xwe-rêveberiya kronîk a kokaînê de di meymûnan de. Nat Neurosci 9: 1050–1056. doi: 10.1038/nn1737
  181. 40. Robinson TE, Kolb B (1997) Guherandinên strukturel ên domdar ên di navokê de û neronên korteksa pêşfrontal de ku ji hêla ezmûna berê ya bi amfetamînê ve hatî hilberandin. J Neurosci 17: 8491–8497.
  182. 41. Robinson TE, Kolb B (1999) Guhertinên di morfolojiya dendrit û dendikên dendikê de di nucleus accumbens û korteksa pêşîn de piştî dermankirina dubare ya bi amfetamîn an kokaîn. Eur J Neurosci 11: 1598–1604. doi: 10.1046/j.1460-9568.1999.00576.x
  183. 42. McClung CA, Nestler EJ (2003) Rêzkirina vegotina genê û xelata kokaînê ji hêla CREB û DeltaFosB ve. Nat Neurosci 6: 1208–1215. doi: 10.1038/nn1143
  184. 43. Feng J, Yan Z, Ferreira A, Tomizawa K, Liauw JA, et al. (2000) Spinophilin avabûn û fonksiyona stûnên dendrîtîk bi rê ve dibe. Proc Natl Acad Sci USA 97: 9287–9292. doi: 10.1073/pnas.97.16.9287
  185. 44. Prange O, Murphy TH (2001) Veguheztina modular a komikên dendika postsynaptîk-95 û têkiliya bi pêşgirên stûyê domdar di dema pêşkeftina zû ya neuronên kortikal de. J Neurosci 21: 9325–9333.
  186. 45. Murase S, Mosser E, Schuman EM (2002) Depolarîzasyon beta-Catenin dixe nav stûnên neuronal û guhertinên di avahî û fonksiyona synaptîk de pêşve dike. Neuron 35: 91-105. doi: 10.1016/s0896-6273(02)00764-x
  187. 46. ​​Hayashi ML, Choi SY, Rao BS, Jung HY, Lee HK, et al. (2004) Morfolojiya synaptîk a kortîkal a guheztin û hevgirtina bîranînê ya xerakirî di mişkên transgenîkî yên PAKê yên serdest-neyînî yên taybetî yên mêjî de. Neuron 42: 773-787. doi: 10.1016/j.neuron.2004.05.003
  188. 47. Benavides DR, Quinn JJ, Zhong P, Hawasli AH, DiLeone RJ, et al. (2007) Cdk5 xelata kokainê, motîvasyon, û hestiyariya neuronê striatal modul dike. J Neurosci 27: 12967–12976. doi: 10.1523/jneurosci.4061-07.2007
  189. 48. Meyer DA, Richer E, Benkovic SA, Hayashi K, Kansy JW, et al. (2008) Bêserûberkirina striatal a Cdk5 bersivên lokomotor li ser kokaîn, fêrbûna motor, û morfolojiya dendritîk diguhezîne. Proc Natl Acad Sci USA 105: 18561–18566. doi: 10.1073/pnas.0806078105
  190. 49. Impey S, Obrietan K, Storm DR (1999) Çêkirina girêdanên nû: rola nîşankirina ERK / MAP kinase di plastîkbûna neuronal de. Neuron 23: 11-14. doi: 10.1016/s0896-6273(00)80747-3