DeltaFosB faʻaauau le faʻatonutonuina o le gaoioiga faalauiloa a Cck (2010)

Fai'ai Re. 2010 Me 6; 1329: 10–20.

Fa'asalalau i luga ole laiga 2010 Mati 11. doi:  10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

Ioane F. Enwright, III,1 Megan Wald,1 Madison Paddock,1 Elisapeta Hoffman,1 Rachel Arey,2 Scott Edwards,2 Sade Spencer,2 Eric J. Nestler,3 ma Colleen A. McClung2, *

Faamatalaga tusitala ► Faamatalaga o le Puletaofia ma Laisene ►

O le lomiga mulimuli a le tagata faʻasalalau lomiga o lenei tusiga o loʻo avanoa i Brain Res

Vaai i isi tala i le PMC faʻailoa le lomiga lolomi.

Alu i le:

lē faʻatino

O nisi o suiga taua o meaola, fausaga, ma amioga e mafua ona o le masani ona aafia i fualaau faasaina o le sauaina e foliga mai o loʻo faʻatalanoaina e le faʻamautu mautu o le ΔFosB. O galuega muamua na faʻaalia ai o le ΔFosB overexpression i isumu mo 2 vaiaso e oʻo atu ai i le faʻateleina o le faʻaalia o le tele o genes i le striatum, o le tele o ia mea e mulimuli ane faʻalaloina pe a maeʻa vaiaso 8 o le faʻaaliga ΔFosB. O le mea e mataʻina ai, o le tele o nei kenera na faʻatulafonoina foi i isumu o loʻo faʻaalia le numera o le CREB. E le o manino mai i lenei suʻesuʻega, peitaʻi, pe faʻatulafonoina e le ΔFosB taimi pupuu nei kenera e ala i le CREB. O iinei tatou te iloa ai o le 2 vaiaso o le ΔFosB overexpression faʻateleina le faʻaaliga CREB i le striatum, o se aʻafiaga e faʻaumatia e 8 vaiaso.. O le amataga o le induction e fesoʻotaʻi ma le faʻateleina o le CREB o loʻo faʻapipiʻiina i nisi o faʻasalalauga faʻatupuina o loʻo i totonu o lenei itulagi faiʻai. O le mea e ofo ai, o le tasi gene na masalomia le CREB e faʻatatau i lipoti muamua, cholecystokinin (Cck), e leʻi pulea e le CREB i striatum. Ia su'esu'e atili le tulafono faatonutonu a Kiki mulimuli i le ΔFosB overexpression, matou faʻamaonia o le faʻaupuga o le ΔFosB mo taimi pupuu e faʻateleina uma ai Kiki gaoioiga fa'aola ma fa'amatalaga kenera. E fa'atuputeleina ai fo'i gaioiga fa'amau i se nofoaga fa'amaufa'ailoga CREB (CRE) i totonu o le Kiki fa'alauiloa. Ae ui i lea, a'o mana'omia le nofoaga CRE mo fa'amatalaga masani masani o Kiki, e le manaʻomia mo le ΔFosB induction o Kiki. Ile tu'ufa'atasia, o nei fa'ai'uga e ta'u mai ai e ui ina fa'atupuina le fa'aupuga o le ΔFosB mo taimi pupuu ma fa'atuputeleina le fa'aaliga CREB i nisi o fa'atupu fa'atupuina, e le na'o le pau lea o le faiga e fa'atulafonoina ai kenera i lalo o nei tulaga.

uputatala: nucleus accumbens, transcription, vaisu

Alu i le:

FAATOMUAGA

O le a'afia faifaipea i vaila'au o le fa'aleagaina e mafua ai suiga fa'aletino ma le fa'atulagaina i le tele o itulagi fai'ai. O nei suiga e manatu e a'afia ai suiga i fa'amatalaga fa'amatalaga o kenera i le faiga mesolimbic. O lenei faiga e aofia ai le dopaminergic neurons e fa'asolo mai le vaega o le ventral tegmental area (VTA) i le ogatotonu i le vaeluaga o neurons i totonu o le nucleus accumbens (NAc) (ventral striatum) faʻapea foʻi ma le tele o isi vaega faiʻai. Suiga i le gaioiga o mea e lua o tusitusiga, o le cAMP response element binding protein (CREB) ma le ΔFosB (se Fos family protein), ua faʻatulagaina e faʻatalanoaina le tele o suiga o meaola, faʻavae, ma amioga e vaʻaia i taimi masani e faʻaalia ai fualaau faasaina ( toe iloilo e Nestler, 2005).

O le CREB ose fa'amatalaga fa'aliliuga fa'aalia i soo se mea o se sui ole aiga CREB/ATF. CREB homodimers fusifusia i fesuiaiga o se CRE sequence (consensus: TGACGTCA) maua i le faalauiloaina o le tele o genes. Phosphorylation o le CREB (tele i le serine 133, e ui lava o isi nofoaga ua faailoaina) e mafai ona faaosofia e le tele o faʻailoga faʻailoga e aofia ai i lalo ifo o le dopamine receptors (Cole et al., 1995). I luga o le phosphorylation i le serine 133, e faʻaaogaina e le CREB le co-activator CREB binding protein (CBP) poʻo proteins e fesoʻotai i ai e taʻitaʻia ai le faʻateleina o faʻamatalaga o le kenera (toe iloilo e Johannessen et al., 2004). O le faʻaalia faifaipea i vailaʻau opiate poʻo psychostimulant o le faʻaleagaina e faʻaosofia ai le faʻatupulaia le tumau o le CREB gaioiga i totonu o le nucleus accumbens. (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), ose fetuutuunaiga e manatu e fa'aitiitia ai le tauia o nei vaila'au ma saofagā i lagona le lelei o le to'esea o fualaau (Nestler, 2005).

LO fetuutuunaiga tumau i fualaau o le sauaina e manatu e faʻatalanoaina i se vaega e le ΔFosB, o se fesuiaiga sili ona mautu o le FosB. (Nestler et al., 1999; McClung et al., 2004; Nestler, 2008). O tagata o le aiga o Fos e fa'atasi ma tagata o le aiga o Jun e fa'atupu ai se activator protein 1 (AP-1) lavelave. AP-1 transcription complexes e fusifusia i fesuiaiga o le AP-1 tali elemene (consensus: TGACTCA) e faʻatonutonu ai tusitusiga (toe iloilo e Chinenov ma Kerppola, 2001). E ui o le faʻaalia tele o vailaʻau o le faʻaleagaina e taʻitaʻia ai le faʻatupuina puupuu (itula) o tagata Fos-aiga (faʻapea foʻi ma le faʻateleina o le CREB), o le faʻaalia pea o fualaau faʻasaina e taʻitaʻia ai le faʻaputuina o le ΔFosB mautu (Faamoemoe ma al., 1994; Perrotti et al., 2008), o le fa'aaliga e fa'aauau pea mo vaiaso.

Bi-transgenic isumu e faʻaalia le ΔFosB poʻo le CREB i le matua striatum faʻaalia le tele o meaola faʻapitoa ma amioga faʻaalia i manu e faʻaalia pea i psychostimulants poʻo isi vailaʻau o le faʻaleagaina. Afaʻataʻitaʻiga o suiga o le faʻaaliga o kenera i nei manu transgenic na faʻaalia ai le tele o kenera e faʻatonutonuina e ala i taimi puʻupuʻu (2 vaiaso) le faʻaalia o le ΔFosB, suiga e fesoʻotaʻi ma le faʻaitiitia o le faʻaitiitia o le taui o fualaau. O suiga i le faʻaaliga o le kenera ma le tali atu i amioga faʻatasi ma le ΔFosB taimi pupuu e matua tutusa lava ma mea na vaʻaia i manu o loʻo faʻaalia le CREB mo 2 poʻo 8 vaiaso (McClung ma Nestler, 2003). I se eseesega mataʻina, o le overexpression umi umi (8 vaiaso) o le ΔFosB faʻaitiitia le faʻaalia o le tele o nei lava genes ma taʻitaʻia ai le faʻateleina o le taui o fualaau faasaina (Kelz et al., 1999; McClung ma Nestler, 2003).

E tasi le kenera na iloa i nei su'esu'ega o le cholecystokinin (Kiki), o se neuropeptide e gaosia i le tele o vaega o faiʻai, e aofia ai le striatum (Hokfelt et al., 1980). E mafai e le CCK ona faʻaogaina le dopaminergic transmission (Vaccarino, 1992), o loʻo aʻafia i le taui o fualaau faasaina ma le faʻamalosia (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton, et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002), ma fa'aosoina i le striatum e cocaine tumau (Ding ma Mocchetti, 1992). E le gata i lea o le Kiki ua faʻaalia le faʻalauiloaina o le tali atu i faʻalavelave uma CREB ma AP-1 (Haun ma Dixon, 1990; Deavall, et al., 2000; Hansen, 2001). Talu ai o le tele o kenera (e aofia ai Kiki) lea na faʻaalia ai le faʻateleina o faʻamatalaga e mulimuli i le CREB ma le faʻaaliga ΔFosB mo taimi pupuu na iloa pe masalomia le CREB faʻatatau i kenera (McClung ma Nestler, 2003), matou te manaʻo e fuafua pe faʻaalia le ΔFosB taimi pupuu e taʻitaʻia ai tulafono faatonutonu o nei kenera (faʻatasi ai ma le taulaʻi Kiki) e ala i tulafono faatonutonu a le CREB poʻo auala sili atu ona lavelave o le faʻatonutonuina o kenera.

Alu i le:

TULAFONO

ΔFosB overexpression e fa'atuputeleina le maualuga o le CREB

Na matou faʻaogaina le paʻu i Sisifo e suʻesuʻe ai pe faʻateleina e le ΔFosB le maualuga o le protein CREB i le striatum o isumu. Mo lenei suʻesuʻega, matou te faʻaaogaina isumu bi-transgenic (laina 11A) o loʻo tauaveina uma le NSE-tTA transgene ma le TetOp-ΔFosB transgene. I le leai o se doxycycline, o nei isumu o loʻo faʻaalia le malosi o le faʻaalia o le ΔFosB i le dynorphin positive neurons i striatum (Kelz et al., 1999). O lenei metotia o le faʻaalia o le ΔFosB ua maeʻa faʻamaumauga ma faʻatagaina mo le faʻaalia o le itulagi, lea e tutusa ma le ΔFosB induction o loʻo vaaia i manu e faʻaalia i cocaine masani (Faamoemoe ma al., 1994; Kelz et al., 1999). Na matou iloa i le 11A mice o loʻo faʻaalia le ΔFosB, CREB protein maualuga na matua faʻaleleia pe a maeʻa le 2 vaiaso o faʻamatalaga ma o nei laʻasaga na toe foʻi i le laina faʻavae pe a uma le 8 vaiaso o faʻamatalaga (Ata 1A, n=8). Ina ia iloa pe o suiga i le CREB maualuga ma taimi pupuu ΔFosB overexpression e mafai ona toe faia i se isi faiga, matou te faʻaalia le ΔFosB i le PC12 sela ma maua ai le maualuga o le maualuga o le CREB (p<0.05) pe a faʻatusatusa i pulega (Ata 1B, n=4). O nei faʻaiʻuga e faʻaalia ai o le faʻaaliga ΔFosB mo taimi pupuu e faʻateleina ai le maualuga o le protein CREB.

Ata 1

Ata 1

Ole maualuga ole CREB e faʻateleina ile faʻamatalaga ΔFosB. Western blot analysis of lysates from (A) isumu striata mai isumu 11A ese dox mo le 2 pe 8 vaiaso pe (B) O sela PC12 o loʻo faʻaalia le ΔFosB. Fa'amatalaga i totonu A o lo'o fa'aalia o le pasene o suiga ile off dox fa'atusatusa ...

O le ΔFosB ma le CREB e fusifusia i le faʻalauiloaina o kenera faʻapitoa i totonu o le striatum pe a maeʻa le faʻaalia o le ΔFosB mo taimi pupuu.

Na matou faʻaogaina le ChIP (chromatin immunoprecipitation) suʻesuʻega o mea faʻapipiʻi e iloa ai pe o le ΔFosB poʻo le CREB faʻapipiʻi na tupu i nisi o faʻalapotopotoga faʻalauiloa ma pe a faʻateleina lenei fusia pe a maeʻa le faʻaalia o le ΔFosB mo taimi pupuu. Sa matou iloiloina le fusia i le BDNF ma Kiki faʻalauiloa, talu ai o genes uma e lua e faʻamalo maualuga pe a maeʻa le faʻaalia o le ΔFosB mo taimi pupuu, le faʻaalia o le CREB, poʻo le togafitiga o cocaine masani (McClung ma Nestler, 2003). Sa matou iloiloina foi le fusia i le CDK5 faʻalauiloa, talu ai o se faʻamatalaga tuusaʻo lauiloa a le ΔFosB (Chen et al., 2000; Bibb et al., 2001; Kumar et al., 2005). Mulimuli ane, sa matou fuaina le fusifusia i le prodynorphin faʻalauiloa, talu ai o suʻesuʻega talu ai na maua e mafai ona noatia e le ΔFosB ma le CREB i lalo o tulaga eseese (Andersson et al., 2001; Zachariou et al., 2006).

O le suʻesuʻega o le ChIP na faia i luga o le striata mai le 11A mice o loʻo faʻaalia le ΔFosB mo 2 vaiaso e faʻaaoga ai faʻamaʻi e iloa ai le CREB poʻo le ΔFosB. I lalo o tulaga masani, na matou iloa ai o le ΔFosB e fusifusia i le CDK5 ma prodynorphin fa'alauiloa, a'o leai se fa'amauina e iloagofie i le BDNF or Kiki tagata fa'alauiloa (Laulau 1). E le gata i lea, o le ΔFosB overexpression na faʻateleina le fusifusia o le ΔFosB i le CDK5 faalauiloa, ae le o le prodynorphin fa'alauiloa. Na matou fuaina le CREB o loʻo fusifusia i nei faʻasalalauga ma maua ai o le CREB e fusifusia i le CDK5, BDNF ma prodynorphin fa'alauiloa, ae le o le Kiki faʻalauiloa, i le striatum masani, ma o le ΔFosB overexpression mo 2 vaiaso faʻateleina le CREB fusia i le BDNF ma prodynorphin fa'alauiloa, ae le o le CDK5 fa'alauiloa. Faʻatasi, o nei faʻaiʻuga e faʻaalia ai o le ΔFosB ma le CREB e mafai uma ona fusifusia i nisi o faʻalapotopotoga faʻalauiloa e pei ole prodynorphin ma CDK5, ae ui i lea, CREB fusifusia e patino i isi faʻalauiloa e pei o BDNF. E le gata i lea, o le ΔFosB overexpression e oʻo atu ai i le faʻateleina o le ΔFosB faʻapipiʻi i nisi o faʻasalalauga, e pei ona faʻamoemoeina, ae faʻapea foʻi i le CREB faʻapipiʻi i faʻasalalauga faʻapitoa, e ogatasi ma le ΔFosB-mediated CREB induction na matauina i lenei taimi.

Laulau 1

Laulau 1

Faʻamauina o polotini faʻatulafonoina i le tele o faʻasalalauga i isumu o loʻo faʻaalia le ΔFosB mo le lua vaiaso.

O galuega talu ai ua faʻaalia ai o suiga i le faʻaalia o le kenera e mafua mai i le umi o le ΔFosB overexpression e fesoʻotaʻi ma suiga o le chromatin, aemaise lava, acetylation o histone H3, i faʻasalalauga faʻapitoa faʻapitoa (Kumar et al., 2005). Ina ia iloa pe mafai e lenei mea ona faʻaalia suiga i le faʻamatalaga o le kenera i luga o le faʻamatalaga puupuu o le ΔFosB, matou te fuaina le fusifusia o le acetylated histone H3 (o se faʻasologa faʻasologa e fesoʻotaʻi ma le chromatin galue), poʻo se methylated histone H3 (Lys9, o se suiga faʻasologa e fesoʻotaʻi ma transcriptionally). chromatin e le o galue). Na matou iloa o le faʻaalia o le ΔFosB mo le 2 vaiaso na mafua ai ona leai se suiga i le fusifusia o le H3 acetylated i soʻo se faʻalapotopotoga faʻalauiloa na suʻesuʻeina (Laulau 1). Na matou mauaina se faʻaititia tele i le fusifusia o le methylated histone H3 i le prodynorphin promoter, ae leai se noatia i le Kiki promoter ma leai se suiga i le noatia i le CDK5 ma BDNF faʻalauiloa, faʻapea e le o se faiga lautele lea e faʻatonutonu ai e le ΔFosB, i se taimi pupuu, le faʻaalia o gene. Na matou ofo ma fiafia i le mea moni e leʻi maua se eseesega i a matou suʻega ChIP e mafai ona faʻatatau mo le faʻatupulaia o Kiki faʻamatalaga mRNA i le 11A mice ina ua maeʻa le 2 vaiaso o le faʻaaliga ΔFosB ma filifili ai e suʻesuʻe atili lenei masini.

Faʻateleina le ΔFosB taimi pupuu Kiki fa'aaliga i le tele o faiga

Faʻamatalaga Microarray o isumu bi-transgenic 11A o loʻo faʻaalia le ΔFosB i le striatum na maua ai. Kiki faʻateleina tulaga faʻaalia pe a maeʻa le 2 vaiaso o le faʻaalia atili ona faʻasolosolo malie lea ona faʻaitiitia i taimi uumi o le ΔFosB expression (Ata 2A, n=3). Matou te faʻamaonia lenei aafiaga mo Kiki fa'aaoga PCR taimi moni i luga o se vaega eseese o manu i le 2 ma le 8 vaiaso ma maua ai i'uga i taimi e lua e tutusa ma le su'esu'ega microarray (fa'amatalaga e le o fa'aalia).

Ata 2

Ata 2

Faʻateleina le faʻamatalaga puupuu o le ΔFosB faʻateleina Kiki fa'aaliga o kenera. (A) Kiki faʻamatalaga mRNA i striatum pe a maeʻa le faʻaalia o le ΔFosB i le 11A mice mo le 1, 2, 4, poʻo le 8 vaiaso. O suʻesuʻega Microarray na faia i luga o faʻataʻitaʻiga striatal ma Kiki maualuga ...

Ina ia suʻesuʻe atili le gafatia o le ΔFosB e faʻatonutonu Kiki faʻamatalaga, matou te faʻaogaina sela PC12 faʻafeiloaʻi faʻatasi ma a Kiki-luciferase reporter plasmid ma pe o se ΔFosB expression plasmid poʻo se aofaiga tutusa o le pCDNA. O aso e lua (n=5-9) ma le tolu (n=11-13) aso o le overexpression o le ΔFosB na mafua ai le faateleina o le Kiki- fa'aaliga luciferase. E le gata i lea, o aso e tolu o le ΔFosB overexpression na mafua ai le sili atu Kiki-luciferase induction pe a faʻatusatusa i aso e lua o le faʻaalia (Ata 2B). O le faʻaalia o le ΔFosB e leʻi faʻaalia ai le faʻaalia o se luciferase le faʻalauiloaina (faʻamatalaga e le o faʻaalia). I lalo o le leai o ni togafitiga na faʻaitiitia ai i Kiki-Luciferase gaoioiga manino. O nei faʻaiʻuga o loʻo faʻaalia ai o faʻamatalaga ΔFosB mo taimi pupuu e faʻateleina ai le gaioiga o le Kiki promoter, ma tuua le taliina o le masini lea e taofia ai le overexpression umi o le ΔFosB Kiki faʻamatalaga.

ΔFosB overexpression faʻateleina le fusifusia i se nofoaga faʻapipiʻi CREB i totonu o le Kiki tagata faʻaola

O a matou iloiloga na maua ai lena mea Kiki faʻamatalaga faʻateleina pe a maeʻa le faʻaaliga ΔFosB mo taimi pupuu, ae ui i lea, o matou ChIP suʻesuʻega na maua ai e leai se CREB poʻo le ΔFosB e fusifusia i le Kiki fa'alauiloa. Ia iloa pe iai ni suiga i le polotini o lo'o fusifusia i le Kiki fa'auluuluga ina ua mae'a le fa'aalia o le ΔFosB, sa matou fa'aogaina su'esu'ega o su'esu'ega eletise eletise (EMSA) fa'atasi ai ma se su'esu'ega o lo'o i ai le nofoaga e pei o le CRE o lo'o i totonu o le. Kiki fa'alauiloa. I le faʻaaogaina o faʻamatalaga faaniukilia mai le striata o le 11A mice o loʻo faʻaalia le ΔFosB mo 2 vaiaso, na matou maua ai le faʻaopoopoga o le fusifusia i le nofoaga CRE putative i le Kiki tagata faalauiloa (Ata 3 A,C, n=4). O le mea e malie ai, 11A isumu o loʻo faʻaalia le ΔFosB mo le 8 vaiaso, lea e faʻaalia ai le faʻaitiitia o Kiki fa'aaliga, na fa'aalia ai fo'i le fa'ateleina o le fusifusia i lenei 'upega tafa'ilagi (Ata 3B, C, n=4). I le avea ai o se faʻatusatusaga, na matou suʻesuʻeina le fusia i se nofoaga CRE maliega i isumu o loʻo faʻaalia le ΔFosB mo 2 vaiaso ma maua ai le CRE malosi o loʻo fusifusia i vaega faʻasolosolo, ae leai se faʻaopoopoga i le fusia pe a uma le ΔFosB induction (Ata 3F, n=4). O le mea lea, e ui lava i le faʻateleina o le ΔFosB i le aofaʻi o le CREB o loʻo vaʻaia i le taimi nei, o nei taunuuga e ogatusa ma a matou suʻega ChIP lea e iloa ai o le faateleina o le CREB o loʻo fusifusia i tagata faʻalauiloa pe a maeʻa le faʻaalia o le ΔFosB e patino i naʻo ni kenera ma e le o se faʻalavelave faʻavaomalo. . Ina ia iloa pe o noatia le CREB i le Kiki fa'alauiloa i la matou su'esu'ega EMSA, sa matou faia su'esu'ega maualuga ma se antibody fa'apitoa a le CREB. I le maliliega ma a matou su'esu'ega ChIP, matou te le'i mauaina se fa'amauina o le CREB i se Kiki su'esu'e o lo'o i ai le nofoaga CRE i su'esu'ega a le EMSA, a'o le CREB na matua fa'amauina ma fa'atupuina le fa'atonuga o le CRE site (Ata 3D,E, n=4). O le gaioiina o le DNA i le Kiki faʻalauiloa e leʻi aʻafia foi i se antibody i le ΔFosB (faʻamatalaga e le o faʻaalia), i lalo o tulaga o loʻo faʻaalia i le tele o suʻesuʻega muamua e poloka ai le ΔFosB e fusifusia i nofoaga faʻamaoni AP-1 (Faamoemoe et al., 1994a, 1994b; Chen et al., 1995, Hiroi et al., 1998). Na matou faia foʻi suʻesuʻega ChIP i luga o striata o manu 11A ina ua maeʻa le 8 vaiaso o le faʻaaliga ΔFosB ma e leai lava se fusi o le CREB poʻo le ΔFosB i le Kiki fa'alauiloa (fa'amatalaga e le o fa'aalia). O le mea lea, o le faʻaaliga ΔFosB e taʻitaʻia ai le faʻateleina o le porotini o loʻo fusifusia i le Kiki fa'alauiloa pe a uma le 2 ma le 8 vaiaso o fa'aaliga; ae ui i lea, o le mea e iloagofie ai nei mea e le o iloa.

Ata 3

Ata 3

Polotini fusifusia i le Kiki fa'alauiloa. (A, B) Su'esu'ega o suiga ole gaioioiga eletise e fa'aaoga ai le Kiki CRE-pei o le 'upega tafaʻilagi faʻatasi ai ma aano o manu mai manu o loʻo faʻaalia le ΔFosB mo 2 vaiaso (A) poʻo 8 vaiaso (B). I le (A), tauvaga ma le tele o tagata tauva e le'i fa'ailogaina ...

O le nofoaga fa'apea CRE i totonu o le Kiki e le nafa le tagata fa'alauiloa mo le fa'ateleina o gaioiga fa'alauiloa

Talu ai na matou maua se faʻaopoopoga o le fusifusia o porotini e faʻaaoga ai se vaega o le Kiki promoter, lea o loʻo i ai le upega tafaʻilagi a le CRE, mulimuli i le ΔFosB overexpression, matou te manaʻo e fuafua pe talafeagai lenei nofoaga mo le faʻateleina Kiki faʻamatalaga mulimuli i le ΔFosB overexpression. Ina ia faʻataʻitaʻiina lenei avanoa, matou te faʻafeiloaʻi sela PC12 ma se Kiki-luciferase plasmid o loʻo i ai lona CRE-pei o le nofoaga poʻo se tasi o loʻo i ai se suiga i le saite e faʻaumatia ai soʻo se fegalegaleaiga ma CREB. O le mea e malie ai, o suiga o le CRE-pei o le nofoaga na faʻaitiitia ai le basal Kiki fa'alauiloa gaioiga e 32% (Ata 4A, n=9), ae le'i aafia ai le Kiki faʻauluina o le faʻalauiloaina e le ΔFosB overexpression (Ata 4B, n=11-13). E ta'u mai ai e, e ui lava o le Kiki e manaʻomia e le tagata faʻalauiloa se nofoaga e pei o le CRE mo le gaioiga atoa, o le faʻateleina o le faʻalauiloaina o gaioiga faʻaosoina e le ΔFosB overexpression e le manaʻomia ai le CRE-pei o le faasologa.

Ata 4

Ata 4

le Kiki-e pei o le nofoaga CRE e le manaʻomia mo Kiki fa'aosoina e le ΔFosB. (A) Kiki-luciferase gaoioiga na fuaina 2 aso ina ua mavae le transfection ma le masani Kiki-luciferase poʻo se tasi lea na suia ai le nofoaga e pei o le CRE. * p<0.05 (B) Kiki-luciferase ...

cFos e fusifusia i le Kiki tagata faʻaola

O suʻesuʻega muamua na maua ai lena mea cFos faʻateleina le mRNA i faʻamatalaga puʻupuʻu ΔFosB, peitaʻi, a maeʻa le faʻaumiumi o le faʻaaliga ΔFosB, o le malosi o le cocaine togafitiga e faʻaosofia ai le cFos i striatum ua faʻaitiitia (McClung ma Nestler, 2003; Renthal et al., 2008). O le mea lea, atonu e mafai ona saofagā le cFos i le faʻateleina o Kiki fa'amatalaga e mulimuli i fa'amatalaga ΔFosB pu'upu'u. Na matou faia suʻega ChIP ma se antibody faʻapitoa mo cFos ma fua cFos fusia i le Kiki fa'alauiloa fa'atasi ma le leai o se fa'aaliga ΔFosB pu'upu'u. A o matou iloa o cFos e fusifusia i le Kiki faʻalauiloa, o lenei fusifusia e leʻi faʻatupulaia tele ina ua maeʻa le faʻaalia o le ΔFosB (Ata 5, n=5). E ta'u mai ai talu ai o le cFos e fusifusia le Kiki promoter, e mafai ona saofagā i le tulafono faatonutonu lautele o Kiki fa'amatalaga, ae e foliga mai e le o aofia ai i le fa'atonutonuina o le Kiki faalauiloa e le ΔFosB.

Ata 5

Ata 5

cFos e fusifusia i le Kiki fa'alauiloa. Chromatin immunoprecipitation assays na faia ma se antibody faapitoa mo cFos faʻaaogaina striatal tissue mai le ΔFosB overexpressing isumu pe i luga o le dox, poʻo le maeʻa o le 2 vaiaso o le aveeseina o le dox. Ole taimi moni ole su'esu'ega ole PCR ...

Alu i le:

TALANOAGA

O lenei suʻesuʻega e faʻamaonia ma faʻalauteleina i luga o suʻesuʻega talu ai o loʻo faʻaalia ai o le ΔFosB e faʻatonutonuina le faʻaaliga o gene i le striatum ma matou iloa ai e faia e ala i le tele o auala pe a uma le faʻamatalaga puupuu. Matou te faʻaalia, pe a maeʻa le 2 vaiaso o le faʻaalia, o le ΔFosB e fusia saʻo i le au faʻalauiloa i nisi o kenera e taʻitaʻia ai suiga i faʻamatalaga (ie. CDK5). E le gata i lea, e faʻateleina ai le maualuga o le protein CREB, o se aʻafiaga o loʻo matauina i sela faʻaleaganuʻu faʻapea foʻi ma le striatum, e oʻo atu ai i le faʻateleina o le CREB o loʻo fusifusia i isi gene faʻalauiloa (ie. dynorphin ma BDNF). I se suʻesuʻega talu ai, na matou iloa ai o le faʻamatalaga puupuu o le ΔFosB i le striatum e taʻitaʻia ai le tele o suiga tutusa o faʻaaliga e maua pe a ova le CREB, ma oʻo atu ai i tali tutusa i uiga o le cocaine fiafia (McClung ma Nestler, 2003). O le mea lea, o le suʻesuʻega o loʻo i ai nei o le ΔFosB e taʻitaʻia ai le CREB, faʻapea foʻi ma le fusia o le CREB i nisi o faʻalapotopotoga faʻalauiloa, e fesoasoani e faʻamatalaina pe aisea na faʻasoa ai le tele o suiga o faʻamatalaga e nei mea e lua.

O le faʻauluina o le CREB e le ΔFosB e manaia, talu ai ua faʻaalia o vailaʻau faʻaleagaina e aʻafia ai suiga i le serine 133-phosphorylated CREB maualuga (Mattson et al., 2005) ma fa'ateleina le fa'asalalauga fa'asalalau CRE (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), e aunoa ma le suia o le maualuga o le CREB. E ono mafai ona le tumau suiga ile maualuga ole CREB, ma o lea e faigofie ai ona misi i isi su'esu'ega. I o matou lima, ua matou vaʻaia le faʻateleina o le cocaine i le CREB mRNA i faʻataʻitaʻiga faʻapitoa, ae ui i lea, o lenei aafiaga e matua fesuisuiaʻi (mataʻituina e leʻi faʻasalalau). Talu ai ona o le 11A transgenic mice ma PC-12 sela o loʻo faʻaalia le CREB induction pe a uma le faʻaalia o le ΔFosB mo taimi pupuu, o loʻo taʻu mai ai o le CREB e moni lava faʻaosoina e le ΔFosB (poʻo se taulaiga o le ΔFosB), ma tuʻuina atu se isi auala e faʻamatalaina ai suiga o fualaau faʻasaina i le gene. fa'aaliga.

O le mea e ofo ai, na matou iloa e leai se CREB poʻo ΔFosB e fusifusia i le Kiki fa'alauiloa e ui lava Kiki fa'aaliga manino fa'atulafonoina pe a mae'a fa'amatalaga ΔFosB pu'upu'u. Cck o se neuropeptide tele o loʻo faʻaalia i le VTA ma le NAc (Hokfelt et al., 1980) ma e foliga mai o loʻo aʻafia i tali o amioga i vailaʻau o le faʻaleagaina (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton, et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002). I su'esu'ega aganu'u sela, o le Kiki fa'alauiloa ua fa'ailoa tele ma fa'aalia e tali atu i tagata o le aiga CREB ma AP-1 (toe iloilo e Hansen, 2001). Haun ma Dixon (1990) faʻaalia e mafai e AP-1 complexes ona fusifusia i le Kiki nofoaga e pei o le CRE i vitro, ma na faʻaalia mulimuli ane, i le faʻaaogaina o sela neuroblastoma SK-N-MC, o le fesuiaiga o le CRE-pei o le saite na faʻaitiitia ai le tali atu a le faʻalauiloaina i le faʻaalia o cFos / cJun (Rourke et al., 1999). Ioe, ua tatou maua foi le faateleina Kiki gaoioiga fa'alauiloa (Ata 2) ma fusifusia i poʻo faataamilo i le elemene pei o le CRE (Ata 3) i luga o le faʻaalia o le ΔFosB, o le isi sui o le aiga AP-1, ae matou te le maua le tuʻufaʻatasia tuusaʻo o le ΔFosB i le Kiki tagata faʻaola i vivo or i vitro, e oo lava i lona soona faailoaina.

Tele galuega ua fa'aalia ai se sao mo le CREB i le fa'atonutonuina o Kiki gaoioiga fa'alauiloa. O le Kiki O le nofoaga e pei o le CRE o lo'o fa'asaoina i luga o vetetalata (Hansen, 2001) ma, i nisi o suʻesuʻega aganuʻu, o CREB ma AP-1 faʻalavelave e fusifusia i lenei nofoaga ma e manaʻomia mo Kiki gaoioiga fa'alauiloa (Haun ma Dixon, 1990; Deavall, et al., 2000; Hansen, 2001). E le gata i lea, o nisi activators lauiloa o Kiki fa'aaliga (e aofia ai le bFGF, PACAP, peptones, ma le depolarization) ua fa'aalia e galue e ala i le CREB (Hansen, et al., 1999; Deavall, et al, 2000; Bernard, et al., 2001; Gevrey, et al., 2002; Hansen, et al., 2004). O tatou Kiki-luciferase reporter gene data lagolago se matafaioi taua mo le CRE-pei o nofoaga i tulafono faatonutonu o Kiki fa'alauiloa gaioiga, talu ai o suiga o lenei saite e fa'aitiitia ai le basal Kiki gaoioiga fa'alauiloa ma Kiki-luciferase faʻamatalaga faʻaosoina e le VP16-CREB, o se faiga faʻavae malosi o le CREB, e leiloa pe a suia lenei 'upega tafaʻilagi (mataʻituina e leʻi faʻasalalau). O lea, na matou ofo i le mauaina o le CREB e foliga mai e le fusia i le Kiki fa'aoso i fa'aupuga fa'asolosolo pe i luga ole laina fa'avae po'o luga ole fa'aupuga ΔFosB pu'upu'u pe a si'itia le maualuga ole CREB. O loʻo finau mai o tulaga o le CREB taʻitasi e le na o le pau lea o le mea e fuafua ai le aofaʻi o faʻamaumauga i lenei 'upega tafaʻilagi, ma o loʻo lagolagoina e le galuega a isi (Cha-Molstad, et al., 2004). Talu mai le fa'alauiloaina o isi, ua fa'ailoaina muamua kenera taula'iga CREB, pei ole BDNF ma prodynorphin, na fusifusia le CREB, matou te mautinoa i la matou sailiga o le CREB e le o noatia i le Kiki fa'aola i vaega faaniukilia striatal. E le gata i lea, o le induction o Kiki-luciferase gaioiga e le ΔFosB e leʻi faʻalagolago i luga ole CRE-pei o le saite, faʻapea e le faʻatonutonuina e le ΔFosB Kiki fa'amatalaga e ala i le fa'atonutonuina o le fusia sa'o o le CREB i le Kiki fa'alauiloa.

O lo matou le mafai ona iloa CREB fegalegaleai ma le Kiki fa'alauiloa e lagolagoina e Renthal et al. (2009), o le na faʻaaogaina le ChIP-chip approach e vaʻavaʻai ai i suiga o le lalolagi i le phosphorylated CREB (pCREB) ma le ΔFosB faʻapipiʻi i le striatum pe a uma le faʻaalia o le cocaine masani. I nei suʻesuʻega, DNA-protein complexes sa immunoprecipitated with ΔFosB poʻo pCREB antibodies ma le DNA precipitated, ina ua uma ona faʻailoga, na faʻapipiʻiina i se microarray promoter. E ui o le tele o kenera taula'i CREB na fa'ailoa muamua na fa'ailoaina i lenei faiga (fa'ata'ita'iga, BDNF, prodynorphin), Kiki e lei faailoaina. E le gata i lea, ua faʻaalia o le fusia o le CREB i se nofoaga CRE maliliega e matua eseese lava i le va o laina telefoni feaveaʻi (Cha-Molstad, et al., 2004). O suʻesuʻega muamua uma na maua ai fegalegaleaiga CREB ma le Kiki fa'alauiloa na fa'atinoina ile aganu'u (e le o le fai'ai lea na maua mai ai a tatou fa'ata'ita'iga EMSA ma ChIP) ma fa'aaoga su'ega su'ega gel e su'esu'e ai fegalegaleaiga porotini-DNA. E ui e mafai e le EMSA ona suʻesuʻeina le gafatia o se mea e fusifusia ai i se faasologa DNA, o suʻega a le ChIP e maua ai se vaaiga fou i nei fegalegaleaiga. i vivo. E le gata i lea, o le tele o faʻamatalaga o loʻo faʻaalia ai le induction o Kiki gaoioiga fa'alauiloa po'o le CREB fa'amauina i le Kiki fa'alauiloa na maua mai sela na fa'aosofia e mea e pei o peptones (Bernard et al., 2001), depolarization (Hansen, et al., 2004), poʻo le tele o faʻagaioiga o faʻailoga faʻailoga intracellular e aofia ai le cAMP ma le ERK (Hansen et al., 1999). I a matou suʻesuʻega, na o le pau lava le "stimulus" na faʻaaogaina o le faʻaalia o le ΔFosB, lea e lava e faʻaosofia ai. Kiki fa'aaliga. Ile tu'ufa'atasia, o lo'o ta'u mai ai e mafai e le CREB ona fusifusia (ma ono fa'atonutonu) le Kiki fa'alauiloa e fa'alagolago tele i le ituaiga sela ma le fa'agaoioia o ala fa'ailoga fa'apitoa. E le gata i lea, o le Kiki CRE-pei o le faʻalauiloaina elemene (a itiiti mai i sela PC12 e leʻi faʻaogaina ma i le kiore striatum) e le o se faʻamoemoe saʻo a le CREB poʻo le ΔFosB. O le mea e malie ai, o le tulafono faatonutonu a FosB fa'amatalaga a le CREB e fa'apitoa fo'i ile ituaiga sela ma le ituaiga fa'aosofia. O se suʻesuʻega a Anderson 'ua al. na maua ai o le tui o le CREB antisense oligonucleotides i totonu o le isumu striatum o se vaega e taofia ai le induction o FosB mulimuli i le faʻaaogaina o cocaine (Andersson et al., 2001). Ae ui i lea, na latou iloa foi o le gafatia o le L-Dopa e faʻaosofia FosB faʻamatalaga i le 6-OHDA-lesioned striatum e leʻi aʻafia i le i ai o CREB antisense oligonucleotides.

Talu ai o le CREB ma le ΔFosB e foliga mai o loʻo faʻatonuina le Kiki faʻalauiloa, ma suiga i le fausaga o le chromatin ua faʻamauina i le tali atu i le tele o faʻaosofiaga e faʻaosofia ai le ΔFosB (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2008), na matou manatu e mafai e le ΔFosB ona faʻaogaina le gaioiga faʻalauiloa e ala i le suia o le fausaga o le chromatin. Ae ui i lea, i isumu o loʻo faʻaalia le ΔFosB mo le 2 vaiaso, e leai se suiga i le histone H3 acetylation i le Kiki tagata faalauiloa (Laulau 1). O lo'o lagolagoina e fa'amaumauga a le ChIP-chip o Renthal et al. (2009), lea na lipotia e leai se suiga i le acetylated H3 fusifusia i le Kiki fa'aoso i isumu fa'aalia i cocaine tumau. Talu mai le Kiki o lo'o fa'agaoioi le fa'aolaola i le striatum, e leai se fa'amauina o le methylated histone H3 na fa'amoemoe pe matauina. O le mea e malie ai, matou te leʻi vaʻaia foi se suiga ona o le ΔFosB overexpression i le acetylated H3 fusifusia i le BDNF fa'alauiloa (lea na fa'aalia ai le fa'ateleina o le fusifusia o le CREB) po'o le CDK5 ma prodynorphin faʻalauiloa (lea na faʻaalia ai le faʻateleina o le fusifusia ΔFosB). Talu ai o loʻo i ai le tele o suiga faʻasolopito e fesoʻotaʻi ma suiga i le faʻalauiloaina o gaioiga (toe iloilo e Rando ma Chang, 2009), atonu e iai isi suiga ole chromatin e feso'ota'i ma le fa'aosoina o nei kenera. So'o se suiga e tasi o le chromatin, e ui lava e masani ona va'ai i le maualuga o le gaioiga fa'alauiloa, atonu e le suia i le taimi o le fa'agaoioia o se kenera patino. I galuega i le lumanaʻi, o le a manaia le vaʻai i isi suiga e ono tupu i le fausaga o le chromatin i le Kiki fa'alauiloa mulimuli ane ΔFosB overexpression. O le mea e malie ai, o cocaine tumau (e foliga mai e ala i ΔFosB induction) ua faʻaalia e faʻaalia ai le faʻaalia o le sirtuin 1 ma le 2, vasega III histone deacetylases lea e foliga mai e suia ai le physiology o le neuronal, faʻailoga ERK, ma tali atu i le cocaine (Renthal et al., 2009). O le faʻaaogaina o le histone deacetylase o le a iai le malosi e faʻatonutonu ai le faʻaalia o le tele o genes. e ala i suiga o le lalolagi i le fausaga o chromatin.

O se tasi o sui tauva e ono aafia i Kiki tulafono faatonutonu mulimuli ane ΔFosB overexpression o le AP-1 tagata o le aiga cFos. Fa'aaliga o cFos o lo'o fa'atulafonoina e le CREB (Sheng et al., 1990; Impey et al., 2004), ma le cFos overexpression (o gatasi ma le soona faʻaalia o lana paaga fusia cJun) faʻateleina Kiki gaoioiga fa'alauiloa (Rourke et al., 1999). O le mea lea, o le faateleina o le maualuga o le CREB ona o le taimi pupuu ΔFosB overexpression e mafai ona faʻateleina le maualuga o le cFos ma iʻu ai i le faʻateleina o le fusifusia i le Kiki nofoaga e pei o le CRE. au mRNA e faʻaosoina i isumu pe a maeʻa le lua vaiaso o le faʻaalia o le ΔFosB (McClung ma Nestler, 2003) ma faʻaitiitia i isumu e faʻaalia i le cocaine tumau poʻo le faʻaalia o le ΔFosB umi (Renthal et al., 2008). O iinei tatou te iloa ai o cFos e fusia saʻo i le Kiki faʻalauiloa i totonu o le striatal tissue, peitaʻi, ΔFosB overexpression e le faʻatuputeleina le fusia. E ta'u mai ai e ui e mafai ona aofia ai cFos le fa'atonutonuina Kiki faʻamatalaga lautele, o se suiga i le fusifusia o cFos naʻo ia e le o le masini lea e faʻatonutonu ai e le ΔFosB. Kiki fa'aaliga. Ae ui i lea, e mafai, e mafai e le ΔFosB ona faʻaosoina, suiga pe a maeʻa faʻaliliuga i le cFos (faʻataʻitaʻiga suiga o le phosphorylation) poʻo le faʻaalia o le faʻaaliga o se paaga faʻapipiʻi (e pei o le cJun) poʻo le porotini co-activator. Ae ui i lea, talu ai o le CRE-pei o le saite (lea na faʻaalia muamua o se nofoaga faʻapipiʻi mo AP-1 faʻalavelave, vaʻai Haun ma Dixon, 1990) e le manaʻomia mo le faʻateleina Kiki gaioiga faʻalauiloa vaaia i le ΔFosB overexpression (e pei ona iloiloina i le matou tusitala faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga), e faʻapea o isi mea e faʻaaogaina e faʻatulafonoina foi e le ΔFosB.

le Kiki vaega fa'alauiloa o lo'o fa'aaogaina i la matou su'esu'ega fa'ata'ita'iga o le luciferase reporter gene o lo'o i ai se nofoaga fa'asao fa'asao Sp1 ma se E-pusa (toe iloilo e Hansen, 2002). Aemaise lava, o faʻasologa o E-pusa ua faʻaalia e fusifusia ai le tele o faʻamaumauga (toe iloilo e Forrest ma McNamara, 2004). I le faʻaaogaina o sela PC12, ua matou vaʻaia le faʻaitiitia o suiga o le E-pusa Kiki faʻalauiloa gaioiga, ae le suia le tali a le faʻalauiloa ile ΔFosB (faʻamatalaga e le o faʻaalia). O le mea e malie ai, a Kiki-luciferase tusitala o loʻo i ai suiga i le CRE site ma le E-pusa e leai se gaioiga masani ma e le tali atu i le ΔFosB overexpression (mataʻituina e leʻi faʻasalalau). O le isi faufautua gafatia o le ΔFosB gaioiga i luga o le Kiki fa'alauiloa o ATFs, o nisi ituaiga o ia mea e iloa e fa'aosoina i le striatum e ala i le fa'aalia masani o le psychostimulant (Green et al., 2008). Ae ui i lea, matou te leʻi mauaina se faʻamaoniga mo le faʻaogaina o le ΔFosB o nei ATF (faʻamatalaga e le o faʻaalia), ma o ATF o le a le faʻamoemoeina e fusifusia i le suiga CRE-pei o le saite i luga o le Kiki fa'alauiloa.

O se tasi o faʻamatalaga o lenei suʻesuʻega o loʻo matou faʻaogaina le bi-transgenic system e faʻaalia ai le ΔFosB ma o lea e tatau ai ona faʻasao le tasi i le faʻatusaina o mea tutusa i le va o lenei faʻataʻitaʻiga ma le puleaina o cocaine masani. Ae ui i lea, o le 11A transgenic mice e maua ai le avanoa tulaga ese e vaʻavaʻai ai i aʻafiaga faʻapitoa o le ΔFosB i le striatum, talu ai o le overexpression e faʻatapulaʻaina i lenei vaega faiʻai (Chen et al., 1998), ae o le faʻaaogaina o cocaine e faʻaosofia ai suiga i le tele o isi vaega faiʻai e ono aʻafia ai le striatum. E le gata i lea, o le tele o suʻesuʻega na faʻamauina ai uiga tutusa ma le molecular phenotypes i le 11A mice pe a faʻatusatusa i manu e le-transgenic e togafitia i le cocaine masani (Kelz et al., 1999; McClung ma Nestler, 2003; Renthal et al., 2009). E le gata i lea, Bibb et al. (2001) lipotia tutusa tulaga o striatal Cdk5 mRNA ma le protein induction i lenei lava 11A strain pe a faʻatusatusa i cocaine-togafitia, e le-transgenic littermates, faʻapea foʻi ma suiga tutusa i sini CDK5, p35 ma DARPP-32.

I le faaiuga, matou te iloa o le faʻamatalaga ΔFosB puupuu e taʻitaʻia ai le faʻaosoina o kenera i le striatum e ala i le tele o masini. O nei mea e aofia ai le faʻapipiʻiina saʻo o le faʻalauiloaina, faʻaofiina o le porotini CREB ma le gaioiga, suiga o le chromatin, faʻaopoopo i auala e leʻi fuafuaina.

Alu i le:

FUAFUAGA FAATINO

manu

Male bi-transgenic 11A manu (NSE-tTA x TetOP-ΔFosB) na faʻaaogaina i lenei suʻesuʻega ma o loʻo faʻaalia i totonu. Kelz et al., 1999. Ina ia faʻaalia le ΔFosB, na aveese mai isumu mai le doxycycline i le va o le 3 ma le 6 vaiaso o le matua, aʻo faʻatumauina isumu ile doxycycline. O isumu uma na fa'anofo i vaega ma tausia i le 12:12 malamalama/pouliuli, moli i le 7 i le taeao ma moli i le 7 i le afiafi, ma ad lib avanoa i meaai ma vai. O fa'ata'ita'iga uma o isumu na mulimulita'i ma fa'atonuga na fa'amaonia e le komiti o le tausiga o manu ma le fa'aoga a le Iunivesite o Texas Southwestern Medical Center i Dallas.

Tusitala ma fa'amatalaga plasmids

Le ituaiga vao (WT) Kiki promoter-luciferase reporter na saunia e ala i le faʻaofiina o se vaega 200 bp PCR i totonu o le pGL3-luc vector (Promega). O lenei fasi vaega na maua mai le DNA genomic isumu (primers: 5' TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' luga, ma le 5' TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3' lalo) ma muamua faaofi i totonu o le pGEM-T Easy vector (Promega, #A1360). O le vaega faʻalauiloa na faʻapipiʻiina i totonu ole Kpn1/Xho1 faʻatapulaʻaina nofoaga enzyme ole pGL3-luc.

Le fatuina o le suiga o le CRE point i le Kiki fa'alauiloa, o se mutagenic primer fa'asaga i se nofoaga na lipotia muamua e pei o le CRE (sense primer: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3', antisense primer: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCGCTGAGTCCAGGACACG 3') na faʻaaogaina i le tuʻufaʻatasia ma le Stratagene Quik Change II faʻatonuga (Mutagenesis) . Ole mea lea e fa'aliliuina ai le saite pei ole CRE (ACTGCGTCAGC) ile ACTGAGCTCC. O plasmids tusitala uma na faʻamaonia e le DNA sequencing. O le ΔFosB expression plasmid o loʻo i ai se faʻasologa atoa ΔFosB faʻaofiina i totonu o le tele o nofoaga faʻapipiʻi o le pCDNA 3.1 ma sa faʻamatalaina muamua (Ulery ma Nestler, 2007).

Aganu'u sela ma suiga DNA

Ile pheochromocytoma (PC12) sela na tausia i Dulbecco's modified Eagle's medium F-12, faʻaopoopo i le 10% serum solofanua, 5% fetal bovine serum, ma le 1% penicillin/streptomycin i le 37°C ma le 5% CO.2. O sela na faʻafeiloaʻi e ala i le electroporation e faʻaaoga ai le BTX 360 electroporator (350V, 0 ohms, ma le 850 μF) i le 800 μL Dulbecco's phosphate buffered saline i le 4 mm gap cuvettes ma le 10 μg o le tusitala ma le 5 μg o le faʻaaliga fausia. Empty vector plasmid (pCDNA) na fa'aogaina e fa'amautu le aofa'i o DNA. Ina ua mae'a fe'avea'i, na fa'atupula'ia sela i luga o ipu 35 mm ua ufiufi collagen mo le taimi fa'ailoa.

Lusifelo su'esu'e

Lua pe tolu aso talu ona uma le felauaiga, na fufuluina sela fa'atolu i le Dulbecco's phosphate buffered saline, lysed (fa'aaoga 3 mM glycylglycine, 25 mM MgSO.4, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT), aoina, ma kilia e ala i le centrifugation. 30 μL o le lysate na tuʻufaʻatasia ma le 140 μL luciferase assay buffer (25 mM glycylglycine, 15 mM MgSO .4, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM potassium phosphate, 1 mM coenzyme A, pH 7.8). Na fuaina le gaioiga o le Luminescence i le faʻaaogaina o le FLx-800 microplate fluorescence reader pe a uma le tui faʻaautomatika o le 40 μL 1 mM luciferin i le vaieli. O le gaioiga a Luciferase na faʻatulagaina i le aofaʻi atoa o le protein e pei ona fuafuaina e le BioRad protein assay.

Su'esu'ega o suiga ole gaioioiga eletise

Fa'ato'aga fa'aniukilia mai fasi fa'ato'a lua o striatum mai isumu bi-transgenic 11A (lea e fa'atumauina i luga pe tape le doxycycline mo le 2 pe 8 vaiaso) (McClung ma Nestler, 2003) na saunia e tusa ai ma Huang ma Walters (1996). 32O su'esu'ega oligonucleotide fa'ailoga-P-lua na saunia e fa'aaoga ai le Promega Gel Shift Assay system protocol (#E3300) ma fa'amama su'esu'ega e fa'aaoga ai Roche Quick Spin Columns. O fa'asologa o su'esu'ega a le CRE ma le AP-1 e mai Promega (#E328A ma le E320B, fa'asologa) ma le Kiki CRE fa'asologa sa (Cck-CRE lagona: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; Cck-CRE antisense: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

O tali fa'amau ma le electrophoresis na fa'atinoina i le fa'aogaina o suiga ole Promega Gel Shift Assay system procedure (#E3300). 50,000 CPM ole su'esu'ega fa'ailoga sa tu'ufa'atasia ma le 10 μg striatal nuclear extract. Na fa'aopoopo i ai le DNA po'o antibodies ole tauva malūlū a'o le'i fa'aofiina le su'esu'ega ua fa'ailogaina. Mo suʻesuʻega supershift, 2 μg o le CREB antibody (Upstate Biotechnology #06-083) na faʻaaogaina. O tali na fa'afefeteina i luga ole 4% polyacrylamide gels, fa'agogo, ma fa'aalia ile ata (fa'aoga fa'amalosi mata mo le 1 itula i le 2 aso).

Immunoblotting

Mo sela PC12, 35 mm papatusi o sela na fufuluina i le aisa malulu Dulbecco's phosphate-buffered saline ma lysates na saunia i le aisa malulu RIPA lysis buffer (50 mM Tris pH 7.4, 5 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% deoxycholate, 1. % Triton X-100, 0.1% sodium dodecyl sulfate) o loʻo i ai le iniseti protease. Ina ua uma le sonication, kilia, ma Bradford protein assay, lysates na atoatoa denatured ma 50 μg o faataitaiga taitasi sa electrophoresed i 10% SDS polyacrylamide gels. O polotini na faʻafeiloaʻi i le PVDF membrane, poloka mo le 1 itula i le 3% susu mamago e le o gaʻo i le Tris-buffered saline o loʻo iai le 0.1% Tween-20 (TBS-T susu), ma suʻesuʻe i le po i le 4 ° C ma faʻamaʻi muamua (CREB-). Upstate Biotechnology #06-083, fa'aaoga ile 1:1,000; GAPDH- Sigma #G8795, fa'aoga ile 1:80,000) fa'asusu ile susu TBS-T. A mae'a le tele o fufulu i le TBS-T, sa su'esu'e poloka mo le itula e tasi i le vevela o le potu e fa'aaoga ai le alkaline phosphatase-conjugated antibodies lua (Sigma) fa'afefiloi 1:5,000 i le susu TBS-T. A maeʻa le tele o fufulu ile Tris-buffered saline, na faia le tali lanu e tusa ai ma le BioRad (#170-6432) faʻatonuga. Membranes na mago i le po, suʻesuʻe i luga o se masini mafolafola ma faʻataʻitaʻi faʻataʻitaʻiga e faʻaaoga ai le ImageJ (silasila i lalo).

Mo striatal extracts, Western blot assays sa faia e pei ona lomia muamua (Faamoemoe ma al., 1994). Na ave'ese le 'ie mai isumu ua pa'u'u, tu'u i luga o le aisa ma vaevae i luga o le fai'ai matrix i le mafiafia o le 1 mm. Ona ave lea o tu'i i'aisa ma fa'aisa i le -80°C se'ia fa'aaoga. Tissue sa sonicated i luga o le aisa i totonu o se patepa faʻavae faʻamama suia o loʻo i ai uma phosphatase ma protease inhibitors (Roche, Sigma). Ina ua uma le sonication, sa denatured samples i le vai inu ma centrifuged i 15,000xg mo 15 minute; na fa'aputuina ma fa'agaioiina; Ole aofa'i ole fa'atosina ole polotini na fa'atatauina ile su'esu'ega a Bradford (Bio-Rad). O faʻataʻitaʻiga na faʻataʻitaʻiina i luga o le 10% acrylamide / bisacrylamide gel, faʻafeiloaʻi i se PVDF membrane, poloka i le 5% susu ma faʻapipiʻiina i antibodies muamua (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). Na mulimuli ane va'aia poloka e fa'aaoga ai le chemiluminescence system (Pierce). O faʻataʻitaʻiga uma na faʻamaonia i le GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA). Na fa'ata'ita'iina pupuni masani ina ia mautinoa o lo'o tatou i ai i le laina laina ole su'ega.

Su'esu'ega Densitometry

Mo PC12 immunoblots, su'esu'ega densitometry na fa'aaogaina e fa'aaoga ai le ImageJ fa'atasi ai ma le fa'avasegaina o le rodbard. O fa'ailoga fa'asologa masani na toesea mai fua ta'itasi ma le fua faatatau o le CREB i le GAPDH fa'ailoga na fa'atatau mo fa'ata'ita'iga ta'itasi. Mo striatal immunoblots ma suʻesuʻega EMSA, Scion Image 1.62c na faʻaaogaina ma le toesea o tua.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP)

ChIP su'ega sa faia e tusa ai ma metotia o Tsankova et al. (2004) ma Kumar et al. (2005). I se faapuupuuga, o faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga mai le 11A mice o loʻo tausia i luga poʻo fafo o le doxycycline na faʻafesoʻotaʻi ma le 1% formaldehyde ma le faʻafesoʻotaʻi na tineia i le glycine (faʻaiʻuga o le 0.125 M). O nei faʻataʻitaʻiga sa mai fasi faiʻai atoa na ave i le maualuga o le nucleus accumbens ma aveese le cortex. Chromatin sa sele e tusa ma le 0.2 i le 1 kb fasipepa e ala i sonication, kilia i polotini G (Thermo Scientific #22852), ma faʻataʻitaʻiga faʻaaisa i le -80°C. I le va o le 60 ma le 100 μg o le chromatin na faʻaaogaina mo timuga taʻitasi. 5-10 μg o antibody muamua taʻitasi na faʻaaogaina (CREB: Upstate Biotechnology #06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology #SC-48x, acetylated H3: Upstate Biotechnology #06-599, methylated H3 (LYS9): Cell Signaling Technology, cFos: Santa Cruz Biotechnology #SC-7202x). Antibody-chromatin lavelave na immunoprecipitated i le Polotini G faʻatasi ai ma pulu e tusa ai ma faʻatonuga a le gaosiga (Thermo Scientific #22852). I le mae'a ai o feso'ota'iga fa'afeagai o fa'aulu ma fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'i, o fa'ata'ita'iga ta'itasi sa fa'atatau ile PCR (qPCR). O le faʻaogaina o nei faʻamaʻi uma mo le ChIP ua faʻamaonia tele (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2009).

Ole maualuga ole polotini o lo'o fusifusia i fa'atupu fa'atupu fa'atupu ta'itasi na fa'amoemoeina ile fuaina ole aofa'i ole DNA e feso'ota'i ile qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA). O le faʻaogaina poʻo le DNA atoa (nonimmunoprecipitated) ma le DNA immunoprecipitated na faʻateleina i faʻatolu i luma o le SYBR Green (Applied Biosystems, CA). O tau Ct mai fa'ata'ita'iga ta'itasi na maua mai ile fa'aogaina ole Sequence Detector 1.1 software. O le faʻatusatusaga o faʻataʻitaʻiga DNA na faia i le faʻaaogaina o le ΔΔCt metotia (Tsankova et al., 2004). Primers faʻaaogaina: BDNF faʻalauiloaina 4: CTTCTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5 fa'alauiloa: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck faalauiloaina: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Prodynorphin faalauiloaina: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCCTGTTTGTCACTTTCAA.

Suʻega faʻamaumauga

O fa'amaumauga uma o lo'o tu'uina atu e pei o ± fa'asologa masani o le uiga. O le eseesega o fuainumera na fa'amauina i le su'ega-t-tailed lua a Tamaiti aoga (p<0.05). Ina ua faia le tele o faʻatusatusaga, na faʻafetaui p-taua e faʻaaoga ai le faasaʻoga a Bonferroni.

Alu i le:

Faʻafetai

Matou te fia faafetai atu ia Will Renthal ma Arvind Kumar mo talanoaga aoga. Matou te fia fa'afetai fo'i ia NIDA mo le fa'atupeina o nei su'ega.

Alu i le:

Faamatalaga Faʻamatalaga

Le Faʻalauiloa a le Lomitusi: O le PDF lenei o se tusitusiga e leʻi faʻaaogaina lea na taliaina mo le lolomiina. I le avea ai ma se tautua mo o tatou tagata faʻatau, o loʻo tatou saunia lenei uluai kopi o tusitusiga. O le tusitusiga o le a faʻaaogaina le kopiina, faʻavasegaina, ma le toe iloiloga o le faʻamaoniga ao leʻi faʻasalalauina i lona tulaga mulimuli. Faamolemole ia matau i le faagasologa o le gaosiga e mafai ona maua ai mea sese e mafai ona aafia ai le anotusi, ma o tulafono uma e le faatagaina e faatatau i le tusi o talaaga.

Tulaga fa'avasega:

Vaega: #1 Cellular and Molecular Biology of Nervous system

Alu i le:

mau faasino

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