PSMC5, 19S Proteasomal ATPase, Faʻatonutonuina Cocaine Action i Nucleus Accumbens (2015)

PLoS se tasi. 2015 Me 11; 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710. eCollection 2015.

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, Nakamura T3, Ohno M4, Kennedy PJ5, Yasuyuki O6, Nishi A7, Neve R8, Tsuzuki T4, Nestler EJ5.

lē faʻatino

ΔFosB o se mautu tusitusi mea na faʻaputuputu i totonu o le tumutumu (NAc), o se vaega taua o le faiʻai taui taui o le faiʻai, i le tali atu i faʻafitauli masani i cocaine poʻo isi vailaʻau o le sauaina. E ui o le ΔFosB e lauiloa i le heterodimerize ma le sui o le aiga o Jun e fausia ai se faʻamaumauga o mea taua, e leʻi oʻo mai i le taimi nei se suʻesuʻega o isi paga e mafai ona fusia mo le ΔFosB i le faiʻai. Lenei, e ala i le faʻaaogaina o fefete lua-hybrid suʻega, matou te iloa ai le PSMC5-e taʻua foi o le SUG1, o le ATPase-o loʻo i ai le vaega laiti o le 19S proteasomal complex-o se tala e faʻafesoʻotaʻi ai porotini ma le osFosB. Matou te faʻamaonia ia fesoʻotaʻiga i le va o ogenFosB ma PSMC5 i le NAc ma faʻaalia ai o polotini uma e lua e fausia ai laʻasaga faigata ma isi polotini faʻatonutonuina o le chromatin e fesoʻotaʻi ma le faʻagaoioia o gafa. Matou te faʻaauau pea ona faʻaalia o le cocaine masani e faʻateleina le faaniukilia, ae le o le cytoplasmic, o le maualuga o le PSMC5 i le NAc ma o le faʻaalia o le PSMC5 i lenei vaega o faiʻai e faʻatupuina ai le tali atu o le cocaine. Faʻatasi, o nei sailiga faʻamatalaina se tala fou auala e fesoasoani i gaioiga a le ΔFosB ma, mo le taimi muamua, afaina PSMC5 i cocaine-faʻaosofia mole mole ma amioga plastity.

Fuaiupu: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O, et al. (2015) PSMC5, o le 19S Proteasomal ATPase, Faʻatonu le Cocaine Action i Nucleus Accumbens. PLOS ONE 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710

Faatonu Faʻatonu: James Edgar McCutcheon, Iunivesite o Leicester, UNITED KINGDOM

Maua: Tesema 10, 2014; Talia: Aperila 7, 2015; Lomia: Ia 11, 2015

Puletaofia: © 2015 Ohnishi et al. O se faʻamatalaga avanoa avanoa lea e tufatufa atu i lalo o aiaiga o le Laisene Creative Commons Attribution, lea e faatagaina ai le le faʻaaogaina o le faʻaaogaina, tufatufaina atu, ma le toe gaosia i soʻo se auala, pe'ā tuʻuina atu le tusitala muamua ma le punaʻoa

Faʻamatalaga o Faamatalaga: O faʻamatalaga talafeagai uma o loʻo i totonu o le pepa.

Faatupeina: O lenei galuega na lagolagoina e fesoasoani mai National Institute of Health, National Institute on Drug Abuse, ma le Foundation Ishibashi ma le Iapani Sosaiete mo le Siʻitia o Saienisi (numera KAKENHI: 24591735, 26290064, 25116010). E leai se sao o le au fai tupe i le faia o suʻesuʻega, o le aoina o faʻamaumauga ma le auʻiliʻiliga, filifiliga e lolomiina, poʻo le saunia o tusitusiga.

Tauvaga malie: Ua faailoa mai e tusitala e leai ni aia tauva.

faʻatomuaga

ΔFosB, o se oloa tuʻufaʻatasia o le FosB gene, e patino i le aiga Fos o mea na tusia, lea e aofia ai foi C-Fos, FosB atoa, Fra-1, ma Fra-2. ΔFosB, e pei o isi FOS proteins, heterodimerizes ma le Family Jun-protein-c-Jun, JunB, poʻo JunD-e fausia ai le AP-1 (activator protein-1) faʻaliliuga faʻaliliuga, lea e faʻaosofia ai pe lafoai ai le faʻamatalaga o genes faʻatulagaina [1,2].

ΔFosB ua faʻaalia e faia se vaega autu i le tagofia o fualaau faasaina [2]. E ese mai i le fos Family proteins, e faʻapupula i le nucleus accumbens (NAc) ma isi isi faiʻai o le faiʻai ona o le faʻaluaina o fualaau faʻataʻitaʻi ona o lona maualuga maualuga o le mautu [3,4], lea e puluvagaina ona o le le lava o le C-terminal degene domains ma le phosphorylation e le tele o proteins kinases [5-7]. O le fausiaina o le ΔFosB i le NAc mediates na faʻalauteleina ai tali o amioga i fualaau faasaina. O le mea lea, o le faʻaaliga manino o le ΔFosB i lenei vaʻa o le vaega o manu matutua, pe faʻaaogaina vekeni vevela poʻo ni mailei feʻau, e faʻaleleia ai le lagona o se meaola i aʻafiaga ma faʻamalosiaga o cocaine ma opiates faʻapea ai ma le manaʻo o se manu e faʻafoe ia te ia lava cocaine [7-11]. I le isi itu, o le faʻaalia o le malosi o le a le faʻaaogaina o le ΔFosB mafua ai le faʻafeagai o uiga faʻapitoa [10-12].

O matou ma isi na faʻamautuina muamua, e ala i le faʻaaogaina o suʻega o le gel, o le JunD ma atonu o nisi o puipuiga a le aiga Jun o paʻaga sili ia o le ΔFosB i le faiʻai i vivo [13-15]. Ae ui i lea, i le taimi nei, e leʻi i ai se iloiloga e le maeʻa, ma le le faʻasalalauina o paʻaga paʻa a le ΔFosB i le faiʻai. O iinei, na matou saili ai e faʻamaonia se paga paga faʻamalosi mo le ΔFosB e ala i le faʻaaogaina o se fefete suʻega lua-hybrid [16,17]. O a matou faʻamaumauga na faʻaalia ai PSMC5, faʻapitoa foi o le SUG1, o se paaga malosi o le ΔFosB i in vitro ma le NAc i vivo, lea e auai ai i le ΔFosB o se vaega o le faʻaaogaina o le transcaine-activation, lea e aofia ai foi le CBP (CREB binding protein ) ma le p300-o le histone acetyltransferases (HATs) -e pei foi o le BRG1 (o le chromatin remodeling protein). Matou te faʻaalia le faʻaalia o taimi masani i cocaine e suia ai le nuʻamea o le PSMC5, o loʻo aofia ai le ATPase o le 19S proteasomal complex, i le NAc ma o le PSMC5 o loʻo faʻatonutonuina tali o amioga i cocaine.

Mea ma Metotia

Yever lua suʻesuʻega

MaV203 levast cells (Invitrogen Life Technologies) na faʻatasi ma le pDBLeu e puʻeina vaega eseese o le protein o le ΔFosB, ma o le faleoloa o le faiva o le mouse na faʻasolosolo i le pPC86 (Invitrogen Life Technologies). O fualaʻau na liua na tupu i luga o le C-medium le lacine, tryptophan, ma le histidine, ma o loʻo iai 10 mM o 3-aminotriazole. O le fusifusia i le va o le FosB fragments ma le paaga sui auai e maua ai genes e tolu tusitala (His3, Ura3, ma LacZ), ma o le induction ua mafai ai e tagata faufautua ona ola i lalo o tulaga faʻaleagaina na faʻaaogaina. O faʻatalologa lelei na faʻaalia i pDBLeu-ΔFosB fragments e ala i le toe faʻafouina o faʻataʻitaʻiga i le televise MaV203.

Laina Cell

Mouse Neuro 2A neuroblastoma cells (ATCC) na tausia i le Eagle's minimum important medium (EMEM) (ATCC), faʻatasi ai ma le 10% fetal bovine serum (FBS) i le 37 ° C ma le 5% CO2. O tene 1A X o se meaalofa mai ia Yusaku Nakabeppu (Fukuoka, Iapani) [18] ma tausia i le DEMM (DMEM) Dulbecco (Life Technologies), faʻatasi ma le 10% FBS i le 37 ° C ma le 5% CO2. O le faʻaaogaina o sela e maua ai le DNA plasmid sa faʻaaogaina e faʻaaogaina ai le Igoa (Qiagen) e tusa ai ma faatonuga a le kamupanī.

PSMC5 ma ΔFosB fausia

E tele fomaʻi ituaiga o PSMC5, o fuālaau taʻitasi e tagotagi i la latou N-terminus, na gaosia mo le faʻaaogaina i le puipuia o le gafa poʻo le faʻataʻitaʻiina o faʻataʻitaʻiga o le gafa. O nei vaega e aofia ai: PSMC5-K196M, PSMC5-Δcoiled-coil domain (PSMC5-ΔCC, leai se amino acids 27-68), PSMC5-NT (aofia ai le vaega N-termina o le protein, mea amino acids 1-151), ma le PSMC5 -CT (e aofia ai le vaega C-o le protein, 172 amino acids) (silasila Fig 1). Na matou faʻaogaina foʻi le mamanu o le vailaʻau o le MYC-ΔFosB ma le ΔFosB ma se fesuiaiga i lona laʻau o le leoga-zipa (mutation o le amino acids 182 i le 205 lea e iloa e faʻaumatia ai le heterodimerization ma aʻafiaga o le aiga o Jun [6].

ata vali
Fig 1. ΔFosB fusu i PSMC5 in vitro.

 

A. Faamatalaga o le ΔFosB, ΔFosB-LZM lea e suia ai le lautusi o le lecinela leucine e faʻamaʻapeʻa ai le ΔFosB heterodimerization ma proteins Jun, ma le Δ2ΔFosB lea e leai ni 78 muamua amino acids o le ΔFosB N-terminus. B. Fuafuaga o le PSMC5, PSMC5-NT lea e aofia ai mea muamua o le 151 amino acids o le PSMC5, PSMC5-CT lea e leai ni 235 muamua acids amino o le PSMC5, ma le PSMC5-ΔCC e leai se laupepa e faʻaaogaina (amino acids 28-68) . O le āiga AAA e fetaui ma se mafuaʻaga, ATUA E fesoʻotai ma gaioiga telefoni feaveaʻi, o loʻo auai i le tele o ATPases. C. 2.4 μg o le pcDNA3.1-ΔFosB (laulili 1-4) poʻo le ΔFosB-LZM (lane 5) na faʻatasi ma le 2.4 μg o le FLAG-tagged PSMC5 poo isi mutanti supption i ni neuro Neuro2a. E lua aso talu ona uma le gasegase, na siakiina ai siama ma maua ai i le puipuiga mai le anti-FLAG antibody ma sosoo ai ma Western-blotted i le anti-ΔFosB poo le anti-FLAG antibody. Manatua o le ΔFosB, ae le o le ΔFosB-LZM, o loʻo fusia malosi i le PSMC5 poʻo le PSMC5-NT, ae le o PSMC5-CT poʻo le PSMC5-ΔCC. O faʻamatalaga o loʻo faʻaalia i le ata na toe faia i le tolu piliona i faʻataʻitaʻiga eseese e tolu.

Pule: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

manu

Iva-11-vaiaso C57BL / 6J male mice (The Jackson Laboratory) sa faʻaaogaina mo faʻataʻitaʻiga uma. O manu na nonofo i luga o se lio o le 12-h i le malamalama-pouliuli ma le avanoa i meaai ma vai ad libitum ma sa masani ona masani i le 1 vaiaso ao lei faia faʻataʻitaʻiga. E lua togafitiga o le cocaine na faʻaaogaina. Ina ia suʻesuʻeina le aafiaga o meaʻai o le cocaine, na tuʻuina atu i manu i 7 aso uma o cocaine (20 mg / kg) poʻo le saline, ma na fasiotia e le 24 hr i le maea ai o le tui mulimuli. O se faʻataʻitaʻiga masani, lea ua faʻaalia e maua mai ai le tele o tali mole mole ma tali i fualaau faasaina [7]. I le suʻesuʻeina o le malosi o le PSMC5 i totonu o le nucleus na faʻapipiʻi i tali o amioga i le cocaine, matou te faʻaaogaina le fua o le vailaʻau (7.5 mg / kg) faʻavae i luga o le manatu e faapea, PSMC5, e pei o le ΔFosB, cocaine [8]. O faʻataʻitaʻiga uma a manu na faʻatagaina e le Komiti o le tausiga ma le faʻaaogaina o manu ile Mauga o Sinai.

Puipuiga ma le puipuiga i sisifo

Neuro 2A suauu na faʻaaogaina i le vao o le PSMC5. E lua aso talu ona uma le gasegase, na fufuluina sela i totonu o le PBS, faʻasaina i le pa puipui RIPA (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 10 mM sodium butyrate, protease inhibitor cocktail) . O le lysates na vaeluaina ma faʻaogaina i le IgG (Sigma) poʻo le anti-FLAG (Sigma) mo le 3 hr i le 4 ° C. Na faʻataunuʻuina le faʻamaonia ma le Protein G beads (Invitrogen) e pei ona faamatalaina [19]. I se faapuupuuga, o lalo o puipuiga a le SDS-PAGE ma le auiliiliina o le puipuia mai le Western Western e faaaoga ai le anti-FosB / ΔFosB antibody (Cell Technology Signaling Technology) e faavae i luga o tulafono ua lolomiina [7]. Mo vailaau faʻamalosi faʻamalama, na matou faʻaaogaina vaega ninii o le nuikilia mai le NAc o miole ina ua maeʻa le togafitiga o le cocaine (20 mg / kg IP i aso taitasi mo aso 7, faatasi ai ma mice na faʻaaogaina le 24 Hr ina ua uma le tui). Na faʻatautaia le faʻaaogaina o vaega ninii o le eletise i le faaaogaina o le Nuclear Complex Co-IP Kit (Active Motif) i faʻamatalaga a le kamupanī. O faʻaoga nei e faʻaaogaina ai: MYC poʻo le ß-actin, Cell Technology Signaling Technology (Danvers, MA), PSMC5 ma histone H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 ma BRG1, Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), ma FLAG M2, Sigma.

Immunohistochemistry

Immunohistochemistry na faia e tusa ai ma taualumaga ua lolomiina [20]. O mice na faʻaaogaina ma faʻaputu faʻatasi ma 4% paraformaldehyde i le PBS. O le Brain na tagi i le 30% sucrose, ona faʻamaʻalo ma teuina i -80 ° C seʻia faʻaaogaina. Vaega o coronal (40 μm) na tipiina i luga o se cryostat ma faʻatautaia mo le immunohistochemistry. O vaega e leai se totogi na faʻapipiʻiina i totonu o se pusa puipui e aofia ai le 0.3% Triton ma le 3% masani masani a le asini. Na maua le ΔFosB i le faʻaaogaina o se siapo polyclonal goat e faʻaleleia i le vaega N-faʻamalosi o le polotini (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology). PSMC5 na maua e ala i le faʻaaogaina o le alofilima o le rabbit polyclonal (1 / 100 Abcam, Cambridge, MA). Na ave ata ma se microscope (60x magnification; Zeiss).

Faʻalauteleina o le Locomotor

O munu uma na mauaina i aso taitasi injections o le saline mo aso 3 e faʻafaigofie ai i latou i le atuatuvale o le injections. O le aso na sosoo ai, na aʻafia ai le mailei o le IP i le saline poʻo le pito i lalo ifo o le cocaine (7.5 mg / kg; silasila i lalo o meaola i luga) ma tuʻuina loa i pusa lalaga. O le gaoioiga faʻavae o mio na faʻamaumauina e faʻaaogaina ai se ata faʻapipiʻiina e pei o faʻamavaega mo le 30 min. O nei togafitiga na faia i aso uma mo aso 3.

Faʻafeiloaʻiina o le kenera faʻataʻitaʻi

Matou te faʻaaoga auala lautele na lomia mo vili-faʻafefeteina le gafa [7,8,11,19]. I le faapuupuuga, o faaupuga plasmids mo le PSMC5 poʻo le tele o ona sui (silasila i le PSMC5 ma le ΔFosB na fausia i luga) na vaevaeina i le bicistronic p1005 (+) HSV plasmid e faailoa ai le GFP i lalo o le pule a le Promoter CMV, ma le PSMC5 poo ona mutants i lalo o le IE4 / 5 faʻalauiloa. I lalo o le ketamine (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg) faʻamaʻiina, sa tuʻuina mice i totonu o se meafaigaluega laiti-manu, ma na faʻaalia le faʻapaʻu. E tolusefulu ma le tolu nila o le syringe na faʻaaogaina e faʻaaoga ai le 0.5 μl o se vete HSV i le NAc i le 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5, DV -4.4) i le fua faatatau o le 0.1 μl / min. O manu na mauaina le inumaga o le HSV na faʻatagaina e toe maua mai mo 2 aso mulimuli ane aʻo taʻalo muamua aʻo leʻi faia le suʻega.

sitatisika

ANOVAs ma tamaiti aʻoga t-suʻega na faʻaaogaina, faʻasaʻoina mo tele faʻatusatusaga, ma le taua faʻatulagaina i p <0.05.

i'uga

PSMC5: paaga o loʻo fusia faʻamaonia le ΔFosB

Na matou faia uluai suʻesuʻega e faailoa ai se vaega talafeagai o le ΔFosB lea na avea ma pusi i se fefete lua-hybrid assay e aunoa ma le faʻaogaina o le tino. Holo-ΔFosB na faʻaosoina le gafa o le tusitala ile lava ia, pei o le N-terminal 1-78 amino acid fragment o le protein. Ae ui i lea, o le N-termina faʻamaonia ΔFosB (Fig 1A), ua faaigoaina o le Δ2ΔFosB, lea e leai se mea muamua o le 78 amino acids o le polotini, e leai sona aafiaga. O le mea lea, matou te faʻaaogaina le Δ2ΔFosB o le pusi paʻu.

Mo le siakiina o paʻaga e mafai ona faʻamaonia, sa matou faʻaaogaina se faletusi o le faila i lalo o le pPC86. Na matou faailoaina sui o le 11 mo paʻaga paga. E ui lava o nei puipuiga e aofia ai paaga masani a le Atemalo, o le C-Jun ma le JunD (Laulau 1), o le sui sili ona taatele o le PSMC5. E ui o le mea e ofo ai, o se sailiga matagofie lea, talu ai na faaalia PSMC5 i se lipoti se tasi i tausaga talu ai e fusifusia i c-Fos in vitro [21]. Ae ui i lea, e leai ni lipoti muamua o le auai a le PSMC5 i le gaioina. E ui i lea, ona o le malosi o le PSMC5 faʻamaoniga i le fefete lua-hybrid assay, matou te agai atu ai e faʻasalalau faʻasalalauga e mafai ona faia ΔFosB-PSMC5 interactions.

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Laulau 1. Faʻaiʻuga o le fefete Faʻamatalaga Lua-Vavalalata ma le Δ2ΔFosB.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

Muamua, ina ia faʻamaonia le fegalegaleaiga faaletino i le va o le ΔFosB ma le PSMC5, matou te faia suʻesuʻega i le vitio co-immunoprecipitation. Na matou mauaina o le FLAG-tagged PSMC5 (Fig 1B), na faʻaaogaina i totonu o lela Neuro 2A, faʻamaʻaʻaina lelei le ΔFosB (Fig 1C). Lona lua, ia iloa le itulagi i le PSMC5 lea e nafa ma lona faʻamaonia i le ΔFosB, matou te gaosia ni mutants PSMC5 tagged pine FLAG-tagged (Fig 1B) ma toe faia le faʻataʻitaʻiga e le faʻamaonia. Na faʻamaʻaʻaina lelei le ΔFOSB i le N-terminal 151 amino acids o le PSMC5 (PSMC5-NT), ae le o le C-terminal 172 amene acid o le protein (PSMC5-CT) (Fig 1C). O le PSMC5 o loʻo le maua lana laupepa vevela (PSMC5-ΔCC) sa le aoga foi i le afaina o le ΔFosB. O nei suʻesuʻega ua fautua mai ai e fusia PSMC5 i le ΔFosB e ala i lona laupepa eleʻele (mea amino acids 27-68). E le gata i lea, o le PSMC5 ole FAG-faʻaaogaina e leʻi faʻafefeina ai se ituaiga mutia o le ΔFosB ma le laupepa leucine zipa (ΔFosB-LZM)Fig 1C), e faʻaalia ai o le ΔFosB e fusia PSMC5 e ala i lenei itu poʻo, atonu e foliga mai, e manaʻomia le heterodimerization ΔFOSB mo le faʻamaumauga a le PSMC5.

PSMC5-ΔFosB faʻamau i le NAc i le maeʻa o le puleaina o cocaine masani

E tusa ai ma nei sailiiliga in vitro, sa matou suʻesuʻe pe o suiga o le PSMC5 i le NAc ua suia i le tali atu i le pulega o cocaine masani. Sa maua i matou i lalo o le vaevaega ma le itu i sisifo o le cocaine e masani ona faateleina le maualuga o le malosi o le vanimonimo o le PSMC5 i lenei vaomalo e aunoa ma se suiga i tulaga o le cytoplasmic (Fig 2A). O lenei aafiaga e le o vaaia i le maea ai o ni pusa o cocaine (faamatalaga e le o faaalia). Na matou suʻesuʻeina mulimuli ane le faʻavasegaina o le PSMC5 ma le ΔFosB i le NAc e le microscopy faʻatoʻateleina o le tino. Na matou suʻesuʻeina ni mice 24 hr ina ua uma le faʻasologa mulimuli o cocaine, o se taimi taimi pe a na o le ΔFosB e mafai ona iloa FosB gene gene (see Nestler 2008). Na matou mauaina le malosi malosi o le PSMC5 i le NAc, e aofia ai se faailoilo malosi faaniukilia. ~ 85% o le ΔFosB + nuclei faʻatasi mo PSMC5 (Fig 2B). E le gata i lea, na matou faia suʻesuʻega faʻamaonia i luga o le NAc ma maua ai, ina ua maeʻa le togafitiga o cocaine masani, na faʻamavaeina lelei ai le ΔFOSB e se anti-PSMC5 antibody (Fig 2C). I le eseesega, faʻavasegaina o le NAC (fuaina o le saline) na faʻaalia ai le leai o se mea e iloagofie ai le ΔFosB faʻailoga (faʻamatalaga e le o faʻaalia). O nei faʻamaumauga e ogatasi ma a tatou sailiga i aganuʻu vavalalata ma faʻamaonia o ΔFosB ma PSMC5 e fegalegaleai i le NAc i vivo.

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Fig 2. PSMC5 tulafono faatonutonu i le kiota NAc.

 

A. Vaega i sisifo o vaega nukila ma cytosolic o NAc o isumu na togafitia i aso uma ma saline poʻo cocaine (20 mg / kg) mo le 7 aso, faʻatasi ai ma manu na suʻesuʻeina 24 itula ina ua maeʻa le tui mulimuli. Faʻateleina e Cocaine niukilia ae le o cytosolic maualuga o le PSMC5. Histone H3 ma ß-actin, ia e leʻi aʻafia i le cocaine, na faʻaaogaina e fai ma avega faʻatonutonu. O faʻamatalaga e uiga ± SEM (n = 8-10 / kulupu, * p <0.05). B. Co-localization o le endogenous PSMC5 (lanumeamata) ma le osFosB (lanumoana) i le NAc o isumu togafiti masani ma le cocaine pei o AC Nuclear lysates o isumu NAc ina ua maeʻa togafitiga o cocaine na faia i le puipuia o le puipuia ma le anti-PSMC5 antibody po o isumu IgG o loʻo faʻatonutonu. , ona faʻamamaina ai lea o Sisifo i le anti-FosB / ΔFosB antibody. O loʻo faʻaalia i le ata le fesoʻotaʻiga PSMC5-FosB i le NAc i vivo. Faʻamatalaga i le B ma le C na toe faʻatinoina i faʻatolu i taʻitasi o tolu tuʻu eseʻese faʻataʻitaʻiga.

Pule: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 faʻaleleia le ΔFosB expression in vitro

Talu ai o le PSMC5 o se sui ua iloa o le complexas complex, na matou tofotofoina pe na te faʻaaogaina le laʻasaga o le ΔFosB e faʻaaoga ai le numera X Ratio 1A. PSMC5 o le leʻofaʻamataʻu na leai sona aafiaga i luga o le maualuga o le ΔFosB, ae na mafua ai le faʻaleleia atili o le ΔFOSB i luga o le faʻamalosia o lela o sē (Fig 3A). O se tasi o foliga talitutusa na vaaia mo le FosB tumau ae o le aafiaga e leʻi ausia ai le taua o fuainumera. I le isi itu, o le taofiofia o le PSMC5 i totonu o le Rat 1A, maua e ala i le faaaogaina o siRNA e taulaʻi PSMC5, e leʻi afaina ai le maualuga o le ΔFosB maualuga ae na matua taofia ai le induction o le ΔFosB e ala i le faʻamalosia o le tino (Fig 3B). O isi faʻafitauli na faʻaalia mo FosB atoa. O nei faʻamaoniga e taʻu mai ai e le faʻaalia e le PSMC5 le faʻaleagaina o le proteasomal o le ΔFosB, e pei ona faʻamoemoeina o se vaega autu o le proteasome, ae e manaʻomia mo le faʻaopoopoga o le FosB gaʻo i totonu o vitro, atonu e ala i le faʻamautuina o aʻafiaga.

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Fig 3. PSMC5 faʻatonutonuina o le FosB / ΔFosB faʻamatalaga i le X Ratio 1A.

 

A. Rat 1A sela na suia i le 4 μg o PSMC5 poʻo le DNA faʻatonutonu. O le soʻona faʻaalia o le PSMC5 e leai se aoga i le basal expression tulaga o le FosB poʻo le ΔFosB protein e pei ona fuafuaina e Western blotting, ae na maua ai se laititi ae taua faʻaopoopoga i le faʻauluina o le osFosB e ala i le faʻaosofia o le serum (F (2,21) = 9.75, p = 0.001). B. Rat 1A sela na fesuiaʻi ma le 5 pmol o se tasi o lua siRNAs poʻo scrambled RNA (control). O siRNA uma na faʻaititia lelei le maualuga o le PSMC5 protein faʻatusatusa i le faʻatonutonuina o tulaga (siRNA # 1, 23 ± 5% o le faʻatonutonu; siRNA # 2, 18 ± 6%; p <0.05; n = 4). PSMC5 knockdown na leai se aoga i basal tulaga o le FosB poʻo le osFosB ae faʻatosinaina le faʻaulufaleina o le FosB ma le ΔFosB i le faʻaosofia o le serum (FosB: F (2,6) = 20.99, p = 0.002; ΔFosB: F (2,6) = 22.83 , p = 0.002).

Pule: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

ΔFosB ma PSMC5 faʻalavelave faʻapitoa i le CBP, p300, ma le BRG1 i le NAc

Ina ia malamalama atili i auala e mafai ai e le PSMC5 ona aʻafia ai le galuega a le ΔFosB, matou te suʻesuʻeina ni paʻaga faʻamalosia faaopoopo mo le lua proteins i le NAc i lalo o le maʻi faʻamaʻi-cocaine. E i ai le lipoti e tasi e fusia PSMC5 i le CBP-a HAT-ma faʻaleleia le histone H3 acetylation i le MHC-II faalauiloa faalauaitele i le lela o le HeLa [22]. E le gata i lea, o mio ua le lava i le CBP ua faʻaitiitia ai le faʻaalia o le amio i le koko ma le faʻaitiitia o le histone acetylation i le FosB tagata faalauiloa [23]. O lea na matou tofotofoina ai pe mafai e PSMC5 ona fusifusia ma le ΔFosB o se vaega o faʻalavelave e aofia ai foi le CBP ma atonu foi o isi tagata e faʻaaogaina tusitusiga.

Na matou faʻamuamua na faʻaalia lelei e le ΔFOSB le CBP ma le p300, o se HAT e fesootaʻi, i potu o Neuro2A (Fig 4A). I le eseesega, o le lemucine zipper mutant forms o le ΔFosB, e pei ona faamoemoeina, e lei faaalia ai lenei gaoioiga. I se tulaga talitutusa, PSMC5 na vavaeina lelei le CBP ma le p300 (Fig 4B). O le mea e malie ai, o lenei aafiaga na maua foi mo le PSMC5-ΔCC, lea na le toso ifo i lalo ΔFosB, e faailoa ai PSMC5 e fegalegaleai ma le CBP ma le p300 e ala i isi vaega o le protein ma tutoatasi mai lona fusifusia i le ΔFosB.

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Fig 4. ΔFosB ma PSMC5 fegalegaleai ma CBP, p300, ma BRG1 in vitro ma in vivo.

 

A. Neuro2A sene na suia i le 2.4 μg o MYC-tagged ΔFosB poʻo le MYC-tagged ΔFosB-LZM. O mea na maua mai i le masini e le mafai ona puipuia i le anti-CBP poʻo le anti-p300, ma faʻasolosolo na soloia i Western ma le antibody poʻo le anti-MYC antibody. O le CBP ma le p300 e fegalegaleai ma le ΔFosB ma na fegalegaleaiga e manaomia ai se laupepa leucine lemu. B. Neuro2A suauu na suia i le 2.4 μg o PSMC5 poo le FLAG-tagged PSMC5-ΔCC. O mea na maua mai i le masini e leʻi puipuia mai i le anti-CBP poʻo le anti-p300, ma o le vaʻaia na fufulu ese i Western ma le antibody poʻo le anti-FLAG antibody. O le CBP ma le p300 e fegalegaleai ma le PSMC5 ma na fegalegaleaiga e le manaomia ai le CC domain. C. O le masini o le kulimi o le kopa NAc ina ua maeʻa le togafitiga o le cocaine masani na tuʻuina i lalo o le puipuiga mai le antip-CBP poʻo le anti-p300. O le afaina o le itu i sisifo o mea na maua mai i le anti-FosB / ΔFosB antibody na faaalia ai fegalegaleaiga vavalalata i le va o le ΔFosB ma le CBP / p300. D. O le laumei o le lysates tutusa o le eletise sa aʻafia i le puipuia mai le anti-BRG1 poʻo le anti-PSMC5, ona sosoo ai lea ma le faʻaaogaina o le Western Western o le faʻafefe i le anti-FosB / ΔFosB poʻo le anti-BRG1 antibody. O faʻamatalaga e faʻaalia ai fegalegaleaiga lelei i le va o le ΔFosB ma le BRG1, ma le BRG1 ma le PSMC5. E. Faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga o le faʻaaogaina o tusitusiga e aofia ai le ΔFosB: JunD heterodimers fegalegaleai ma CBP / p300, BRG1, ma le PSMC5.

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Ina ia faʻamaonia o nei fegalegaleaiga e tutupu foi i le vivo, matou te faʻaaogaina le cocaine e faʻasolosolo ai le ΔFosB ma le PSMC5 sikolasipi, ona maua ai lea o NAc faʻamaonia faʻatasi ma anti-CBP poʻo anti-p300. E ogatasi ma a matou faʻamaumauga o aganuu, faʻamaoniga o le CBP poʻo le p300 na faʻamaʻaʻaina lelei ai le ΔFosB (Fig 4C). Na matou suʻesuʻeina pe o BRG1, o le pito i lalo o le SWI-SNF chromatin, e mafai foi ona fusifusia i le ΔFosB ma le PSMC5, e faavae i luga o le matou sailiiliga muamua o le BRG1 o loʻo faʻaaogaina i nisi o genes target o le ΔFosB faʻatasi ma lo latou faʻamalosia i le NAc i le maeʻa ai o cocaine masani [24]. Na matou iloa o le puipuiga o le BRG1 na toso ifo ai le ΔFosB i le NAc, ma o le puipuiga o le PSMC5 na faapena foi ona kopiina le BRG1 (Fig 4D). Faʻatasi, o nei taunuuga e taʻu mai ai complex complexes ΔFosB-PSMC5 i NAc lea e aofia ai CBP / p300 ma BRG1 (Fig 4E).

PSMC5 overexpression e faʻapupula ai tali i le koko

O le taua o le PSMC5 ma le ΔFosB i le NAc na mafua ai ona matou suʻesuʻeina pe siitia le maualuga o le PSMC5 i lenei fogaeleele e pulea ai amioga i le cocaine. Na matou gaosia se vete Herpes Simplex Virus (HSV) e faʻamalosi ai le PSMC5 poʻo se tasi o ona mutants ma faʻamaonia ai vek i NAc i vivo (Fig 5A). O faʻamatalaga faʻatalanoaina o le PSMC5 e sili ona taua i totonu o le cell cellcleus (Fig 5B). O le televave o le PSMC5 o le vao e leʻi faʻaalia ai ni suiga i tali muamua o cocaine, ae na faʻaalia ai le faʻatupulaia o le locomotor activation i le tali atu i vailaʻau o cocaine faifaipea pe a faatusatusa i le GFP-faʻamalamalamaina o mailei e pulea. I le eseesega, o mice e faʻamalosia ai se ituaiga mutia o le PSMC5 o loʻo leai se laupepa na faʻaaogaina (PSMC5-ΔCC) e leʻi faʻaalia lenei aafiaga (Fig 5B). O le mea e malie ai, o le faʻamalosagaina o le PSMC5-K196M, lea e le maua ai le ATPase o le fualaau o le wildtype, faʻapea foi tali a le locaota e mafai ona maua.

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Fig 5. O le PSMC5 faʻamatalaga i le NAC faʻalautele ai le tali atu i le cocaine.

 

A. Sui HSV-faʻutuaina faʻamatalaga transgene i le medial NAc. AC, faʻamalologa muamua. NAc autu ma atigi vaega ua tusia i luga o le ata. B. Sui maualuga faʻateleina (60x) o tui puipuia o le PSMC5 i le NAc neu ina ua maeʻa tui HSV-PSMC5 faʻaalia ai o le polotini e tele nukila e faʻailogaina e le DAPI pisipisia. Na maua e C. Mice tuʻuga HSV tuʻufaʻatasi i le NAc sosoʻo ai ma le tuiina o le IP i aso uma o tui o cocaine (7.5 mg / kg). Locomotor tali o loʻo faʻaalia i le tali atu i le muamua ma mulimuli o le 3 i aso uma tui o le vailaʻau. O le soona faʻailoa o le PSMC5 poʻo le PSMC5-K196M e faʻateleina ai tali a le locomotor i le toe fai o cocaine, o se aafiaga e le o vaʻaia e PSMC5-ΔCC. E leai se taua aafiaga o le transgenes i locomotor tali atu i le amataga fualaʻau cocaine. ANOVA F (3,125) = 4.163, * p <0.05 e Dunnett's posthoc test.

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Talanoaga

O taunuʻuga o le suʻesuʻega o loʻo i ai nei o loʻo faʻaalia ai se faiga fou lea e faʻapipiʻi ai e le ΔFosB ona aʻafiaga i luga o le mafaufau ma se masini fou e aofia ai le gaioini. I le faʻaaogaina o se auala e le faʻafeʻauina, o se fefete lua-vailaʻau faʻataʻitaʻiga, matou te iloa PSMC5 e avea o se paaga vavalalata tusitusia mo le ΔFosB. Matou te faʻamaonia lenei sailiiliga i totonu o siama masani i vitro ma le NAc i vivo e ala i le faʻaalia o le malosi o PSMC5-ΔFosB. O le mea taua, o le malosi o le malosi o le PSMC5 o loʻo faʻaosoina i le NAc e le pulega o cocaine masani. Na matou faʻaalia atili o le PSMC5-ΔFosB faʻamalosia e galulue faʻatasi ma le tele o isi fesoʻotaʻiga activator transcriptal, e pei o le CBP ma le p300 (lua HAT) ma le BRG1 (o le kulupu autu o SWI-SNF chromatin remodeling complexes). Faʻatasi, oa tatou sailiga e lagolagoina le manatu o le PSMC5 o se vaega o le faʻasologa o le faʻaaogaina o le transcriptional lea e faʻaaogaina i le sili atu ma le mautinoa o genes ΔFosB-induced genes aʻo faagasolo se vasega o le puleaina o cocaine masani (Fig 4E). E ogatasi ma lenei manatu o le sailiiliga faaopoopo lea o le faʻaalia o le PSMC5 i le NAc, e pei o le faʻamalamalamaina o le ΔFosB lava ia, faʻalauteleina tali tali i cocaine. O le a manaia i suʻesuʻega i le lumanaʻi le tulitataoina o nei mea i faʻamatalaga vivo faʻatasi ai ma le faʻamalamalamaina o fegalegaleaiga a PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1 e ala i le faʻaogaina o suʻega o le tusitala o le in vitro.

O le aʻafiaga o le PSMC5 i le cocaine o se mea fou. I le amataga o le avea o se sui o se aiga toatele o ATPE e aofia ai le proteasome, PSMC5 ua faaalia i le tele o tausaga e fegalegaleai ai ma le tele o tusitusiga, e aofia ai le C-Fos, p53, o le eletonika o le hormone, ma le fausaga o le palakalafa basal [25], ae ui i lea, o nai suʻesuʻega faʻatinoina na faia i le aluga o tausaga [26]. O lana faʻatonuga sili ona lelei o le faʻalauteleina lea o le gaoioiga o le MYC tusiga faʻaliliu i totonu o siama faʻalauiloa [27]. O le taua o le PSMC5 i faiga o tusitusiga na fautuaina ai se tulaga e mafai ona fai mo le faatoaga-proteasomal gaoioiga i le faatonutonuina o le tusiga o le gene, ae o le aafia o le PSMC5 i sea tulafono e tumau pea le le taofiofia i le taimi nei [28,29].

E itiiti se mea e iloa e uiga i le PSMC5 galuega i le mafaufau. O se suʻesuʻega muamua na faʻaalia ai le lautele o le PSMC5 mRNA i le va o le faiʻai [30], ae o lona gaioiga galue ua tumau pea ona le toe faʻaaogaina. O a tatou sailiga ua faʻaalia nei suʻesuʻega atili e uiga i lenei peletini lelei ina ia malamalama atili ai i lana matafaioi i le faatonutonuina o tusiga o le kenera ma lona sootaga i le faatoaga-proteasomal functioning in the brain. O le fusia o le PSMC5 i le ΔFosB o loʻo faʻasalalau e le PSMC5 o loʻo faʻapipiʻiina le laupepa. E le gata i lea, o le mafai e le PSMC5 ona faʻaleleia tali a le locomotor i cocaine, ae manaʻomia le faʻaaogaina o le laupepa, e le manaʻomia le gaoioiga ATPase e taua i le polotini. O nei taunuʻuga e mafai ai, atonu o le a sili atu i le tatou polokalame le faʻatautaia o le PSMC5 e ala i lona fusifusia i le ΔFosB ma isi tulafono faatonutonu faʻasalalauga ma e le o lona gaosiga o le proteasomal per se. O isi galuega e manaʻomia e suʻe saʻo ai lenei mea ma isi auala. O le manatu e faapea, o le PSMC5 e faʻaalia ai le tali atu i le cocaine e ala i fegalegaleaiga ma le ΔFosB e mafai ona faʻamalieina, e ui lava i le faʻaaogaina o le togafitiga o le cocaine 3, talu ai ua iloa o le maualuga ole talisapaia o le ΔFosB i le mafaufau i totonu o lenei taimi [3].

O faʻamatalaga i le taimi nei o loʻo faʻamaonia atili ai le aoga o le faʻaaogaina o auala faʻapitoa, faʻamalositino faʻataʻitaʻiina i le suʻesuʻeina o le faavae mole mole tulafono faatonutonu o le faiai. O la matou uluai gaioiga i le PSMC5 na faʻavae i luga o lona faʻamaufaʻailoga iloga i le ΔFosB i se fefete lua-hybrid assay, ae foliga mai o se vaega taua o suiga o le tusiga o loʻo maua i le NAc e ala i le faʻafoʻiina o cocaine. O se malamalamaaga sili atu i le auiliiliga o auala e mafua ai ona maua e le cocaine ia vaega o le eletise PSMC5, ma, i le isi itu, lea e fesoasoani ai le PSMC5 i gaioiga o le faʻaaogaina o le transcaina e faʻaaogaina cocaine, o le tulimataʻi lea o suʻesuʻega nei. I le taimi nei, o la matou fefete o le lua-hybrid assay na faʻaalia ai nisi o tuʻufaʻatasiga tuʻufaʻatasiga faaopoopo o le ΔFosB (Laulau 1) lea o loʻo tuʻuina nei i le taimi nei le suʻega saʻo ile suʻeina. Faʻatasi, o lenei galuega e fesoasoani i le faʻalauteleina o le malamalama e uiga i le faʻaogaina o mea mole mole mole mea e faʻaaogaina ai e cocaine galuega NAc.

tautinoga

O lenei galuega na lagolagoina e fesoasoani a le National Institute on Drug Abuse, ma le Foundation Ishibashi ma le Iapani mo le Promotion of Science (numera KAKENHI: 24591735, 26290064, 25116010).

Tusitala Tusitala

Faʻatinoina ma fuafuaina fuafuaga: YHO YNO EJN. Faia le suʻega: YHO YNO PJK RN. Iloilo faamatalaga: YHO YNO EJN. Mea na tuʻufaʻatasia / meafaigaluega / auiliiliga: TN MO OY AN RN TT. Ave le pepa: YHO EJN.

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