(Manusa) behavioral na Responses Struktural jeung Cocaine kronis merlukeun hiji Feedforward Citakan: Loop ngalibetkeun ΔFosB jeung Kalsium / Calmodulin-depéndensi Protéin Kinase II dina inti Accumbens Shell (2013)

Faktor transkrip ΔFosB sareng kalsium anu diperkirakeun otak / protein kalasean tenang -ulinodulin-kinase II (CaMKIIα) ngainduksi dina accumbens inti (NAc) ku paparan kronis ka kokain atanapi ubar psychostimulant tina nyiksa, dimana dua protéin nyapih réspon narkoba sensitif. . Sanaos ΔFosB sareng CaMKIIα duanana ngatur éksprési reséput glutamat AMPA sareng fungsina dina NAc, formasi tulang tonggong dendritik dina neuron spiny NAD sedeng (MSN), sareng sensitipitas lokomotor ka kokain, teu aya hubungan langsung antara molekul ieu dugi ka dijelajah. Di dieu, urang nunjukkeun yén ΔFosB di fosforilasi ku CaMKIIα dina protéin anu stabil Ser27 sareng CaMKII nyaéta diperyogikeun pikeun akumulasi cocaine-mediated of ΔFosB di beurit NAc.

Sabalikna, urang nunjukkeun yén ΔFosB duanana diperyogikeun sareng cekap pikeun induksi kokain tina ekspresi gen CaMKIIα dina vivo, pangaruh anu milih pikeun D₁-Type MSNs dina subregion cangkang NAc.

Salajengna, induksi spines dendritik kana NAc MSNs sareng ningkat responsiveness tingkah laku pikeun kokain sanggeus NAC overexpression of ΔFosB duanana gumantung ka CaMKII.

Anu penting, urang nunjukkeun munggaran induksi tina ΔFosB sareng CaMKII dina NAc na pecandu kokain manusa, nyarankeun target anu mungkin pikeun pipilueun terapi masa depan. Data ieu netepkeun yén ΔFosB sareng CaMKII kalibet dina pakan feedforward positip sél-régional sareng wilayah otak salaku mékanisme konci pikeun ngatur circuitry otak dina réspon kokain kronis.

perkenalan

Ngaronjatkeun bukti ngadukung pandangan yén parobahan éksprési gen nyumbang kana mékanisme kecanduan narkoba (Robison na Nestler, 2011). Salah sahiji panengah parobahan ieu nyaéta isFosB, faktor transkripsi kulawarga Fos (Nestler, 2008). Administrasi kronis ampir ubar naon nyiksa nyababkeun akumulasi anu panjang tina ΔFosB di accumbens inti (NAc), hiji daérah limbik penting pikeun paripolah pahala. Sinduksi uch muncul khusus pikeun kelas NAc medium spiny neuron (MSN) anu nyatakeun reséptor dopamin D1. Overflpression overucpression of ΔFosB dina NAN MSNs jenis D1 nambahan lokomotor sareng réspon ganjaran kokain sareng morfin (Kelz et al., 1999; Zachariou et al., 2006), kalebet naéktansi kokain tambah (Colby et al., 2003). Salajengna, panyekat genetik atanapi virus tina kagiatan transkripsi ΔFosB ngirangan épék-énergi pikeun ubar ieu (Zachariou et al., 2006), nunjukkeun yén induksi ieu ΔFosB mangrupikeun perantara penting pikeun parubahan anu kantos diinduksi dina NAc ku administrasi narkoba kronis.

Kestabilan luar biasa tina ΔFosB (relatif ka sadaya protéin kulawarga Fos anu sanés) mangrupikeun sipat intrinsik molekul, kusabab truncasi domain degron anu aya dina FosB panjang (Carle et al., 2007), sareng prosés diatur. ΔFosB di fosforilasi dina vitro jeung di vivo di Ser27, sareng réaksi ieu langkung stabil deui ΔFosB, ~ 10-melu, dina budaya sél sareng NAc di vivo (Ulery-Reynolds et al., 2009). Sanaos Ser27-ΔFosB parantos ditingalikeun janten substrat pikeun kasein kinase-2 dina vitro (Ulery et al., 2006), mékanisme na di vivo fosforilasi tetep teu dipikanyaho.

Kalsium / protein kaltododulin gumantung kinase II (CaMKII) nyaéta serine / threonine kinase anu α sareng β isoform ngabentuk dodecameric homo- sareng hetero-holoenzymes di vivo, sareng penting pisan pikeun sababaraha bentuk neuroplasticity (Lisman et al., 2002; Colbran sareng Coklat, 2004). CaMKIIα didorong selektif dina cangkang NAc ku amphetamine kronis (Loweth et al., 2010), sareng blokade apotékologis tina kagiatan CaMKII dina cangkang NAc ngurangan sensitipitas perilaku ka amphetamine (Loweth et al., 2008) jeung kokain (Pierce et al., 1998), nalika overexpression viral CaMKIIα dina subregion NAc ieu ningkatkeun sensitipitas lokomotor ka sareng administrasi diri tina amphetamine (Loweth et al., 2010). CaMKIIα bisa mangaruhan paripolah pahala via modulasi subunit reséptor glutamat AMPA (Pierce et al., 1998), sakumaha kagiatan CaMKIIα parantos lami dipatalikeun sareng fungsi reséptor AMPA sareng targeting synaptic dina sababaraha bentuk neuroplasticity (Malinow na Malenka, 2002).

Karya sastra ieu nunjukkeun sababaraha paralel antara ΔFosB sareng CaMKII: duanana diperyogikeun sareng cekap pikeun sababaraha épék paripolah pikeun nyiksa, boh ngawaskeun dendritik dendritik dina sababaraha jinis sél saraf di vivo (Jourdain et al., 2003; Maze et al., 2010), sareng duanana ngahasilkeun sabagian épék paripolah maranéhanana ngaliwatan modulasi reséptor AMPA (Kelz et al., 1999; Malinow na Malenka, 2002; Vialou et al., 2010). Sanaos paralel ieu, teu aya hubungan fungsional antara ΔFosB sareng CaMKII kanyahoan. Di dieu, urang ngadamel pangaturan timbal balik antara ΔFosB sareng CaMKII, sareng nunjukkeun yén dua protéin nyiptakeun gelang feed payun payun D1-spésifik dina cangkang NAc anu dipangaruhan ku kokain sareng ngatur sajumlah réspon kokain. di vivo.

Pindah ka:

Bahan jeung Métode

Eksperimen 1: Analisis Protéin NARAQ NAll Shell sareng Teras Saatos Perawatan Cocaine (Gbr 1A)

Dewasa (8 minggu) beurit jalu dikaluarkeun 20 mg / kg kokain atanapi saline kendaraan IP sakali dina sadinten tujuh dinten. 24 jam saatos suntikan anu terakhir, cangkang NAc sareng inti diangkut (Gbr 1A) sareng lampu kilat beku. nganalisa iTRAQ dilakukeun sakumaha anu dijelaskeun saméméhna (Ross et al., 2004; Davalos dkk., 2010).

Gambar 1

Induksi spésifik dina cangkang CaMKII di NAc ku kokain

Ékspérimén 2: Ngagaduhan Parobihan Protéin dina Tikus NAc Core sareng Shell Saatos Perawatan Cocaine (Gbr 1B – D)

Beurit (8 minggu) beurit jalu dikaluarkeun 10 mg / kg kokain atanapi saline kendaraan IP sakali unggal dinten di tujuh dinten di ruang rékaman lokomotor. Réspon lokomotor kanggo suntikan kokain (5 mg / kg IP) kacatet dina sato-sato éta diobalan sateuacanna ku kokain (disebut "kronis") sareng bagian tina perawatan kalayan asin (katelah "akut"), sareng résponsomotor kana salin. nyalira kacatet dina sésa-sésa anu diawat saline parna (disebut "saline"). Aktivitas kagiatan lokomotor dilaksanakeun sakumaha anu dijelaskeun (Hiroi et al., 1997). Sakeudeung, beurit jalu déwasa disimpen dina 18 "× 24" PAS kotak lapang terbuka medan (San Diego Instruments) pikeun 30 mnt pikeun habituate, dibéré suntikan IP tunggal asin sareng diawaskeun pikeun tambahan 30, sareng dipasihkeun suntikan IP tunggal 5 mg / kg kokain sareng diawaskeun pikeun 30 mnt.

24 saatosna nyuntikkeun ahir ieu, beurit dipotong tanpa anesthesia pikeun ngindarkeun épék bius dina tingkat protéin neuronal sareng phospho-state. Otak serial dihiris dina matrik 1.2 mm (Braintree Scientific) sareng tisu sasarna dihapus dina asin na dibungkus fosfat anu ngandung protease (Roche) sareng sambutan fosfatase (Sigma Aldrich) nganggo pjaring garing 14 pikeun inti NAc sareng punjuran tolak 12 sésana jaringan pikeun cangkang NAc (Tingali Gbr 1A) sareng geura beku dina és garing. Sampel dipina ku sonication cahaya dina buffer RIPA anu diubah: 10 mM Tris pangkalan, 150 mM natrium klorida, 1 mM EDTA, 0.1% natrium dodecyl sulfat, 1% Triton X-100, 1% natrium deoxycholate, pH 7.4, inhibitor pH 4, pH 15 sakumaha di luhur. Saatos tambihan penyangga Laemmli, protéin dipisahkeun dina XNUMX-XNUMX% polyacrylamaide gél gradient (Criterion System, BioRad), sareng blotting Kulon dilaksanakeun nganggo sistem Odyssey (Li-Cor) numutkeun protokol produsén.

Ékspérimén 3: Ngagaduhan Parobihan Protéin dina Tikus NAc Core sareng Shell Saatos Cocaine Withdrawal (Gbr 1E)

Dewasa (8 minggu) beurit jalu dikaluarkeun 10 mg / kg kokain atanapi saline kendaraan IP sakali dina sadinten tujuh dinten. 14 dinten saatos suntikan akhir, sato anu dirawat kalayan saline dirawat suntikan salin anu lain (disebut "saline), sareng sato anu diasuh kokain parantos disuntik salin deui (disebat ditarikna 14 dinten atanapi" 14d WD ") atanapi suntikan kokain ( disebut "14d WD Chal" kanggo tangtangan). Hiji waktos saatos suntikan akhir, sato dipangku sareng blotting Kulon dilaksanakeun sapertos na percobaan 2.

Eksperimen 4: Ngagaduhan Parobihan Protéin dina Tikus NAc Core sareng Shell Sanggeus Cocaine Administrasi (Gbr 2A – C)

Rats dilatih pikeun ngurus diri 0.5 mg / kg / infusi kokain dina séri-jam dina sesi jadwal 1 tetep-salapan dinten. Saatos salapan sesi dasar, beurit dibagi jadi dua kelompok saimbang ku asupan kokain dina dua sesi pamungkas. Hiji grup beurit anu diwenangkeun ngurus kokain (0.5 mg / kg / infus) dina sési-jam (aksés pondok, ShA) sedengkeun kelompok beurit anu dikelola sorangan dina séri genep jam (aksés panjang, LgA ) salila sapuluh dinten tambahan (sésias sési).

Bagian sisikian diolah pikeun immunohistochemistry sapertos dijelaskeun (Perrotti et al., 2004). Otot disampurnakeun 18-24 jam saatos obat ka tukang obat, hasilna degradasi sésana dina protéin FosB panjang sésana sapertos sadaya immunoreactivity sésana ngagambarkeun ΔFosB. Degradasi ieu dikonfirmasi ku blotting Kulon, anu ningalikeun teu aya pewarnaan anu signifikan kalayan antibodi anu diarahkeun ngalawan terminus C tina FosB anu panjang anu henteu ngakuan ΔFosB (data henteu ditingalikeun). Saatos nyababkeun kana bagian 35 µm, jumlah sél immunopositive ΔFosB diitung ku pangamat anu buta dina dua bagian ku unggal beurit, sareng nilai mean unggal médan 40 × teras diitung ku unggal daérah pikeun unggal sato. Unggal sato dianggap minangka pangamatan individu pikeun analisa statistik. Bagean suku minat dikenalkeun nganggo Paxinos sareng Watson (Paxinos na Watson, 2007).

Kuantitas immunoreactivity CaMKIIα dipigawe nganggo sistem Licor sapertos anu dijelaskeun (Covington et al., 2009). Intensitas terpadu tina CaMKII sareng GAPDH ditetepkeun sareng parangkat lunak Odyssey. Hasilna dipidangkeun salaku nilai inténsitas terpadu per mm² jeung ditepikeun hartosna ± sem (n = 4-10 per grup). Nilai pikeun GAPDH digunakeun salaku acuan pikeun normalisasi intensitas CaMKII pikeun ketebalan nyiksikan sareng kaayaan.

Gambar 2

Induksi CaMKII dina cangkang NAc tina beurit pangurus sorangan sareng pecandu kokain manusa

Ékspérimén 5: Ngitung Tingkat Protein dina Manusa Cocaine-Dependent (Gbr 2D)

prosedur

Tisu otak postmortem manusa dicandak ti Quebec Suicide Brain Bank (Institut Universitas Kaséhatan Mental Douglas, Montréal, Quebec, Kanada). Pelestarian jaringan diteruskeun dasarna sakumaha dijelaskeun (Quirion et al., 1987). Sakeudeung, sakali sasari, uteuk disimpen dina és baseuh dina kotak Styrofoam sareng bergegas ka fasilitas Quebec Suicide Brain Bank. Hemispheres langsung dipisahkeun ku potongan motong sagittal di tengah uteuk, batang otak, sareng serebellum. Pembuluh getih, kelenjar pinus, pleoro choroid, satengah cerebellum, sareng satengah batang otak biasana dibedah tina belahan kénca anu teras dipotong sacara coronally kana irisan kandel 1 cm-lami sateuacan katirisan. Satengah cerebellum anu terakhir dipotong sacara telanjang kana irisan-irisan kandel 1cm sateuacan katirisan. Tisu lampu beku dina 2-metilbutane di −40 ° C kanggo ~ 60 sec. Sadaya jaringan beku disimpen dina kantong plastik dina −80 ° C kanggo neundeun jangka panjang. Wewengkon utami khusus dibédakeun tina irisan koronal beku dina piring stainless steel kalayan és garing kanggo ngontrol suhu lingkungan. Blotting Kulon dilakukeun sapertos dijelaskeun dina percobaan 2.

Cohort

Cohort diwangun ku subjek awéwé 37 sareng 3, umurna ageung antara 15-66 taun. Sadaya subjek maot dumadakan tanpa kaayaan agonal anu berkepanjangan atanapi panyawat médis anu proték. Dina unggal kasus, sabab pati dipastikeun ku kantor Coroner Quebec, sareng layar toksikologis dilakukeun kalayan conto jaringan pikeun milari inpormasi ngeunaan obat-obatan sareng panggunaan anu haram dina waktu tilar dunya. Grup hungkul diwangun ti 20 individu anu nyayogikeun kritéria SCID-I pikeun katergantungan kokain. Kelompok kontrol diwangun ku subjék 20 anu henteu aya kasanggupan kakurangan tina kokain sareng teu aya diagnosa jiwa utama. Sadaya subjek maot dumadakan tina sabab anu teu ngagaduhan pangaruh langsung dina jaringan otak. Grup dicocogkeun kanggo umur poko umur, reureuh kulkas, sareng pH. Kanggo sadaya mata pelajaran, autopsies psikologis dilakukeun sapertos anu dijelaskeun saméméhna (Dumais et al., 2005), ngamungkinkeun urang ngagaduhan aksés ka inpormasi kasus detil ngeunaan jiwa sareng médis sajarah, ogé data klinis sareng sosiodemografis sanésna. Sacara ringkes, ngawawancara terlatih ngalaksanakeun na Wawancara klinis Berstruktur pikeun DSM-IV Gangguan Psychiatric (SCID-I) sareng hiji atanapi seueur informan almarhum. Panel ahli klinik ulasan ngan ukur penilaian SCID-I, laporan kasus, catetan koronér, sareng catetan médis pikeun kéngingkeun diagnosa kajiwaan.

Eksperimen 6: Immunoprecipitation Chromatin pikeun Tik NAc (Gbr 3A – C)

Dewasa (8 minggu) beurit jalu dikaluarkeun 10 mg / kg kokain atanapi saline kendaraan IP sakali dina sadinten tujuh dinten. 24 jam saatos suntikan anu terakhir, cangkang NAc sareng inti diangkut. Immunoprecipitation Chromatin (ChIP) parantos ngalaksanakeun jilid na bilateral NAc tina cangkang atanapi inti tina tujuh beurit per kelompok dina total kelompok 14 (sato 98, jumlah kolam renang kokwan 7, kolam renang asin 7). Tissues dihubungkeun, dikumbah, sareng disimpen di −80 ° C dugi ka shearing chromatin ku sonication. Kromatin anu dipasihan dihirup sapeuting sareng antibodi anu pernah kabeungkeut kana manik magnét (Dynabeads M-280, Invitrogen). IgG non-imun tiasa dianggo salaku kadali. Saatos ngabalikeun link-silang sareng purifikasi DNA, qPCR parantos dipaké pikeun ngukur tingkat DNA promosor CaMKIIα. Primer dirarancang pikeun ngagedékeun daérah anu ngandung urutan konsensus AP-1 anu lokasina ~ 450 bp sateuacanna situs transkrip (Teraskeun: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Balikkeun: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Gambar 3

Jenis sél- sareng induksi ΔFosB khusus-wilayah CaMKIIα di vivo

Eksperimen 7: Ngukur Transkrip CaMKII sareng Ekspresi Protein kalayan Cell-Type-Spésifik ΔFosB Overexpression (Gbr 3D)

Beurit bitransgenic jalu diturunkeun tina NSE-tTA (jalur A) × TetOp-ΔfosB (jalur 11) jeung NSE-tTA (jalur B) × TetOp-FLAG-ΔfosB (jalur 11) beurit (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Zachariou et al., 2006) dikandung sareng digedékeun dina 100 µg / ml doxycycline pikeun ngeureunkeun ekspresi ΔFosB nalika pangwangunan. Littermate dibagi dina rédang: satengah tetep dina doxycycline sareng satengahna ditambihkeun ka cai, sareng sato dipaké 8 ka 11 minggu saatos nalika épék transkripsial ΔFosB maksimal (Kelz et al., 1999; McClung na Nestler, 2003). Pikeun analisa transkripsi, beurit gancang dikepung, sareng otak dipiceun teras disimpen dina és. Duka NAc dicandak ku punch jarum 14-gauge jarum sareng gancang beku dina és garing dugi ka RNA diékstrak. Isolasi RNA, qPCR, sareng analisa data dilakukeun sakumaha anu dijelaskeun saméméhna (LaPlant et al., 2009). Sakeudeung, RNA diasingkeun sareng TriZol reagent (Invitrogen), langkung seueur dimurnikeun nganggo kit micro RNAeasy ti Qiagen, sareng pariksa kualitas pikeun Agilent's Bioanalyzer. Transkripsi ngabalikeun dilaksanakeun nganggo ikrip (BioRad). qPCR dilaksanakeun nganggo sistem Biosistem Terapan 7900HT RT PCR kalayan parameter siklus ieu: 10 min at 95 ° C; Daur 40 tina 95 ° C pikeun 1 mnt, 60 ° C kanggo 30 sec, 72 ° C pikeun 30 sec; pemanasan graded ka 95 ° C pikeun ngahasilkeun kurva dissociation pikeun konfirmasi produk PCR tunggal. Analisis imunohistokimia expressionFosB sareng CaMKIIα ekspresi protéin dipidamel salaku dijelaskeun dina percobaan 4.

Ékspérimén 8: Pangaruh Intra-NAc D1 sareng Antagonis D2 Dopamine Antagonis dina Parobihan Proté-Mediated ProteinGbr 3H)

Dewasa (8 minggu) beurit jalu dikaluarkeun 10 mg / kg kokain atanapi saline kendaraan ("kendaraan" kelompok) IP sakali sakali tujuh dinten. 30 min sateuacana pikeun masing-masing suntikan kokain, beurit dikaluarkeun ku IP bohong antagonis D1 antagonis SCH 23390 (0.5 mg / kg, "D1 Ant" kelompok), atanapi grup D2 reseptor antagonis eticlopride (0.5 mg / kg, "D2 Ant" group) , atawa suntikan kontrol uyah ("kokain"). 24 saatos saatos suntikan ahir, sato dipina sareng protéin diitung ku blotting Kulon per per percobaan 2.

Ékspérimén 9: Pangaruh AAV-Mediated Over ΔFosB Overexpression on Protein Expression (Gbr 4 A – C)

Operasi stereotaxic dilakukeun dina beurit lalaki sawawa (minggu 8) pikeun nyuntik AAV-GFP (protéin fluoresensi héjo) atanapi AAV-GFP-ΔFosB (Maze et al., 2010). Jarum pangukur 33 (Hamilton) digunakeun pikeun sadaya pembedahan, dimana 0.5 µl tina virus anu dimurnikeun luhur dituding dibandingkeun dina waktos mnt 5, dituturkeun ku 5 tambahan tina sesa pasca infusion. Sadaya jarak diukur relatif ka Bregma: sudut 10 °, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = −6.7 mm. 14 dinten saatos operasi, sato dibere suntikan IP tunggal tina 10 mg / kg kokain di ruangan pemantauan lokomotor pikeun ngukur épék paripolah overexpression ΔFosB. 24 saatos saatos suntikan ahir ieu, beurit dipotong sakumaha per percobaan 2, sareng jaringan microdissection dilakukeun dina hidayah mikroskopis fluoresénsi pikeun menangkeun jaringan NAc-positip GFP. Blotting Kulon teras dilakukeun sapertos per Ékspérimén 2.

Gambar 4

ΔFosB duanana diperyogikeun sareng cekap pikeun cocaine-mediated D1-gumantung caMKIIα induksi dina NAc cangkang

Eksperimen 10: Pangaruh tina AAV-Mediated Over pressJunD Overexpression on Cocaine-Dependent Protein Expression (Gbr 4 D – F)

Suntikan stértaotaxik tina AAV-GFP atanapi AAV-GFP-ΔJunD dilakukeun unggal per Ékspérimén 8. 14 dinten saatos operasi, sato dikaluarkeun 10 mg / kg kokain atanapi kandaraan asin IP sakali sakali dina tujuh dinten di ruang rekaman lokomotor. Réspon lokomotor pikeun suntikan tunggal kokain (5 mg / kg IP) atanapi saline kacatet. 24 saatosna suntik ahir ieu, beurit dipotong, jaringan dipanén, sareng blot Kulon dilakukeun dina Ékspérimén 9.

Ékspérimén 11: Dina Vitro Protéin Kinase (Gbr 5A – D)

CaMKIIα rekombinan sareng ΔFosB dimurnikeun tina sél serangga (Brickey et al., 1990; Jorissen et al., 2007), sareng asépasi kinase protéin dilakukeun (Colbran, 1993), sakumaha anu dijelaskeun saméméhna. Sakeudeung, CaMKII dikapasangkeun és kalayan 2.5 µM ​​(atanapi ditunjuk konsentrasi) tina ΔFosB, 1 mM Ca²⁺, 40 mM Mg²⁺, 15 µM ​​tenangodulin, sareng 200 mM HEPES pH 7.5. Fosforilasi dimimitian ku tambihan 200 µM ​​ATP sareng atanapi henteu [γ-³²P] ATP sareng diidinan lumangsung pikeun 10 mnt dina suhu kamar (Gbr 5A & B) atanapi 2 mnt dina és (Gbr 5C & D.). Produk direngsekeun ku blotting Kulon (Gbr 5A & B) atanapi ku autoradiogram sareng cacah skintilasi (Gbr B-D).

Gambar 5

ΔFosB mangrupikeun substrat kuat pikeun CaMKIIα

Eksperimen 12: Idéntifikasi Ser27 ΔFosB Fosforilasi (Gbr 5E)

dina vitro assase kinase dilaksanakeun sakumaha per percobaan 11, protéin dipisahkeun ku SDS-PAGE, sareng pita anu pakait sareng ΔFosB dipotong sareng dikalikeun pikeun spéktroskét massa. Tugasan m / z tina serpihan ion anu aya dina sadaya panél dilabélan di luhur puncak ion. Henteu sadayana ion sempalan dilabélan kusabab watesan rohangan. Sacara umum, téks pikeun labél ion fragmen berwarna hideung kecuali nalika langsung mastikeun atanapi nambihan bukti ayana situs fosforilasi anu dipikaresep, upami éta ditandaan warna beureum. Bukti pikeun produk fragmentasi tulang tonggong dipasihan dina sési bacaan fosfoseptida kalayan situs sésa fosforilasi anu dideteksi dina beureum nganggo sebutan serat asam amino tunggal. Katerangan nomer tina ion fragmen anu ditingali ogé ditandaan dina urutan péptida minangka b sareng y. Faktor zum pikeun bagian tina sumbu m / z pikeun nunjukkeun ion sempalan inténsitas handap ditandaan di luhur unggal spéktrum massa sempalan. Ion sempalan anu dipidangkeun dina panel H mastikeun ayana isoform Ser27 fosforil, kumaha ogé, dina campuran isoform fosforilasi sanésna dina situs Ser28, Ser31, Ser34, sareng Thr37. Ayana pa5, pa5-P, pb5, sareng ion pb5-P unik ngonfirmasi fosforilasi sésana Ser27.

Ékspérimén 13: Ukuran fosforilasi Ser27 (Gbr 5F)

Péptida standar dirancang pikeun meniru phospho sareng non-phospho bentuk Ser27 ΔFosB. Saatos sintésis sareng purifikasi, unggal "beurat" péptid idiotypic dibubarkeun dina panyawat cai 50 / 50 / antonitrile sareng dikirim pikeun analisa asam amino pikeun nangtukeun konsentrasi mutlak dina solusi saham péptida sintétis. Masing peptida "beurat" teras langsung diterapkeun kana 4000 QTRAP mass spectrometer (MS) pikeun nangtukeun tabrakan anu pangsaéna pikeun pamecahan MS / MS sareng dua dugi ka opat transisi MRM. Salajengna, péptida anu énggal "énggal" dikerjakeun ka LCMS dina 4000 QTRAP pikeun mastikeun pisah péptida. Alat kasebut dijalankeun dina mode quadrupole triple, kalayan set Q1 dina prékursor m / z nilai khusus (Q1 henteu scanning), sareng Q3 ditetepkeun kana nilai m / z khusus pikeun sempalan péptida khusus. Dina modeu MRM, sababaraha réaksi réaksi tunggal (prékursor / fragment ion transisi dimana énergi tabrakan ditala pikeun ngaoptimalkeun intensitas ion sempalan) diukur sacara berturut-turut, sareng siklus (ilaharna 1-2 sec) dikayunkeun sapanjang sapanjang waktos pamisahan HPLC. Transisi MRM ditangtukeun tina spéktrum MS / MS tina péptida anu tos aya. Dua transisi per péptida, saluyu sareng ion sempalan inténsitas anu luhur, teras dipilih sareng énergi tabrakan dioptimalkeun pikeun maksimalkeun kakuatan sinyal transisi MRM nganggo parangkat lunak automation. Puncak tina péptida standar sareng conto ΔFosB anu kakeunaan CaMKII atanapi kadali teras dibandingkeun pikeun nangtoskeun jumlah mutlak unggal péptida dina réaksi éta. Analisis data kana data LC-MRM dilakukeun nganggo piranti lunak AB Multiquant 1.1.

Eksperimen 14: Induksi tina ofFosB di CaMKII Beuki Overexpressing (Gbr 5G & H)

Tikus transgenik overexpressing T286D CaMKII (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012) sareng jinis littermate liar digedékeun henteuna doxycycline pikeun ngijinkeun ekspres transgene. Tikus sawawa dikaluarkeun 20 mg / kg kokain atanapi masin IP sakali unggal dinten pikeun 14. 24 saatos dina suntikan ahir, sato dipangkalan sareng immunohistokimia sareng etungan ekspresi ΔFosB sapertos na percobaan 4.

Eksperimen 15: Balukar tina HSV-Mediated ΔFosB Overexpression sareng CaMKII Inhibition on NAc Dendritic Spines (Gbr 6A – E)

Tikus jalu déwasa (minggu 8) disuntik dina stéotaxik dina NAc sareng HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB (Olausson et al., 2006), HSV-GFPAC3I, atanapi HSV-GFPAC3I-ΔFosB. Dina konstruksikeun ieu, AC3I, hiji inhibitor dumasar péptida tina kagiatan CaMKII, datar ka C-terminus GFP. GFPAC3I diklon ku PCR nganggo pMM400-vektor anu ngandung GFPAC3I salaku template kalayan primer ieu: GFP-AC3I-F: 5 'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3' GFP-AC3I-R: 5 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3' (clampBspEIstop). Produk PCR anu dihasilkeun diselapkeun kana p1005 + sareng vektor pxNUMX + -Δ FosB ngagunakeun situs NheI sareng BspEI. Pangwangunan ieu disahkeun ku urutan. Koordinat Stereotaxic nyaéta: sudut 1005 °, AP = + 10 mm, Lat = + 1.6 mm, DV = −1.5 mm (Barrot et al., 4.4). Perfusi sareng uteuk dibéréskeun salaku per percobaan 4.

Analisis tulang tonggong dilakukeun sakumaha anu dijelaskeun (Christoffel et al., 2011). Sakeudeung, segmen dendritik 50-150 µm jauh ti soma dipilih sacara acak tina sél anu katépa HSV anu ngungkabkeun GFP. Gambar dikonsumsi dina konfigurasi LSM 710 (Carl Zeiss) pikeun analisa morfologis nganggo NeuronStudio nganggo algoritma rayburst. NeuronStudio ngagolérkeun tulang tonggong salaku ipis, supa, atanapi batang dumasar kana nilai-nilai di handap ieu: (1) rasio, (2) sirah kana rasio beuheung, sareng (3) diameter sirah. Spines sareng beuheung tiasa diklasifikasikeun salaku ipis atanapi supa, sareng anu tanpa beuheung anu signifikan diklasifikasikeun salaku corong. Spines sareng beuheung dilabélan salaku ipis atanapi supa dumasar kana diaméter sirah.

Gambar 6

Blok tina kagiatan CaMKII nyegah épék morfologis sareng perilaku ΔFosB dina NAc

Eksperimen 16: Balukar tina HSV-Mediated osFosB Overexpression sareng CaMKII Inhibition on Cocaine Tubag (Gbr 6F)

Tikus jalu déwasa disuntik sareng virus sapertos per percobaan 15, sareng réspon lokomotor kanggo suntik kokotor 5 mg / kg tunggal diukur sakumaha per Ékspérimén 9. Data lokomotor dikedalkeun salaku total beam putus dina 30 mnt saatos suntikan kokain

Inpormasi Tambahan

Perumahan Sato

Beurit Sprague Dawley jalu (250-275 g; Charles River Laboratories) dipasang duaan. Dalapan budak umur C57BL / 6J Tikus jalu (The Jackson Laboratory) dikelompokkeun kalayan maksimum lima sato per kandang. Sadaya sasatoan dipaénkeun sareng fasilitas sato pikeun ≥1 minggu sateuacan manipulasi ékspérimén sareng dipasang di kamar anu dikuasai iklim (23-25 ° C) dina siklus lampu 12 hr / poék (lampu dina 7: 00 AM) kalayan aksés kana dahareun sareng cai ad libitum. Eksperimen dilakukeun saluyu sareng pedoman ngeunaan Society for Neuroscience jeung panitia perawatan sato sareng panitia (IACUC) di Gunung Sinai.

narkoba

Obat-obatan dikaluarkeun dina IP sareng larut dina asin asin, kalebet kokain (5-20 mg / kg per 10 µl kanggo beurit, per 1 ml kanggo beurit, NIDA) sareng JADI 23390 atanapi eticlopride hydrochloride (0.5 mg / kg per 1 ml, Tocris) . Pikeun bedah stéréotaxic, beurit dirésponasi nganggo "koktel" tina ketamine (100 mg / kg) sareng xylazine (10 mg / kg) (Henry Schein) dina asin asin.

antibodi

CaMKIIα (total): Upstate 05-532, 1: 5,000

CaMKII phospho-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (total): Sinyal Cell 5G4, 1: 250

ΔFosB phospho-Ser27: Phosphosolutions, 1: 500

GluA1 (total): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07-598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

nganalisa statistik

Sadaya analisa statistik dilaksanakeun nganggo pakét perangkat lunak Prism 6 (GraphPad). Tés tés siswa digunakeun pikeun sadayana babandinganana pasangan-bijaksana (dituduhkeun dina Hasilna dimana nilai dirumuskeun), sareng ANOVA one-way digunakeun pikeun sadaya sababaraha perbandingan (dituduhkeun dina bagian hasil dimana nilai F dirumuskeun).

Pindah ka:

Results

Cocaine Coconut Induces CaMKII dina NAc Shell

Seueur pisan kajian anu nunjukkeun yén MSN dina cangkang NAc sareng inti ngagaduhan tanggapan biokimia sareng fisiologis anu béda pikeun paparan kronis pikeun ubar nyiksa (Kourrich sareng Thomas, 2009; Loweth et al., 2010) sareng yén dua subparasi diferensial ngatur paripolah narkoba (Ito et al., 2004). Pikeun nangtoskeun épék bédana kokain dina komponén protéin cangkang NAc vs. inti, urang nganggo Multiplexed Isobaric Tagging (iTRAQ) sareng spéktroskopi massa tandem (MS / MS). Beurit jalu déwasa disuntikkeun IP ku kokain (20 mg / kg) atanapi asin poean kanggo dinten 7; 24 jam saatos suntikan anu terakhir, cangkang NAc sareng inti diangkut (Gbr 1A) sareng lampu kilat beku. Protéin dina conto ieu teras diitung nganggo iTRAQ. Sakabéh opat isoform CaMKII nunjukkeun dina éksprési ageung saatos pangobatan kokain anu khusus pikeun cangkang NAc dibandingkeun inti. Sababaraha fosfatase protéin, kalebet subunit katalitik sareng régulasi PP1, sareng PP2A, anu kantos dipatalikeun sareng rupa-rupa substrat CaMKII dina sistem anu sanés (Colbran, 2004), nuturkeun pola anu sami. Pamanggihan ieu nyayogikeun novel, bukti anu henteu saé yén jalur sinyal CaMKII sacara nyata diatur ku kokain dina NAc dina cara khusus.

Pikeun ngabuktikeun milarian ieu langkung kuantitatif, kami merawat beurit sapertos saluhureun ku kokain (dina dosis anu beda-beda) atanapi saline na diukur résponsomomotor kana kokain (5 mg / kg) atanapi dosis tantangan asin. Ulang-ulang paparan 10 mg / kg kokain nyababkeun pola khas sensitipitas lokomotor (Gbr 1B). Studi salajengna sareng régimen doses ieu diturunkeun, ku cara nganggo blotting Kulon, yén cocaine ulangan mendorong CaMKIIα selektif dina NAc cangkang 24 saatos injeksi ahir kokain (Gbr 1C sareng D; p = 0.0019; F = 7.943; df = 29). Salaku tambahan, fosforilasi substrat kanopi CaMKII Ser831 subunit GluA1 tina reséptor AMPA sacara signifikan ningkat dina cangkang NAc sareng henteu inti (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28), sedengkeun CaMKIIα Thr286 autophosphorylation kuat tapi henteu tren penting pikeun induksi dina cangkang hungkul (Gbr 1D). Sababaraha reséptor glutamat séjén henteu kapangaruhan. Kontras sareng ukuran CaMKII, conto jaringan anu sami nunjukkeun induksi ofFosB dina dua cangkang (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) sareng inti (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) tina NAc (Gbr 1C sareng D), konsisten sareng papanggihan saméméhna (Perrotti et al., 2008).

Kusabab sababaraha kajian sateuacanna ngeunaan aturan kokain tina reséptor AMPA dianalisis sato saatos ~ dinten 14 ditarik tina kokain kronis (tingali Diskusi), urang malikan deui analitik biokimia dina waktos ieu. Kami mendakan yén, 14 dinten saatos suntikan ahir kokain, ΔFosB tetep naék dina NAc (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), sedengkeun henteu caMKII atanapi fosforilasi GluA1 Ser831 tetep ningkat (Gbr 1E). Nanging, 1 hr saatos 10 mg / kg tangtangan dosis kokain, tingkat total CaMKII (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) sareng tina GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; df = 27) fosforilasi duanana dorongan kana gelar anu sami sareng anu kapendak saatos paparan cocaine kronis awal (Gbr 1E). Data ieu nunjukkeun yén neuron cangkang NAc ditujukeun pikeun induksi CaMKII salami période abstinence, panginten ngalaksanakeun langsung tina promoter gén CaMKII (tingali Diskusi). Malih, kanyataan yén induksi ΔFosB langkung pengkuh tibatan induksi CaMKII nunjukkeun ayana mékanisme tambahan, naha didasarkeun kromatin atanapi sabalikna, anu ngalaksanakeun "rem" dina Peraturan CaMKII, sakumaha dibahas dina Diskusi.

Pikeun nguatkeun pangamatan deui ieu, urang ngajalajah modél kokain administrasi diri, anu ngalebetkeun asupan narkoba. Beurit lalaki sawawa dibere aksés pondok atanapi panjang kana kokain; saperti anu diharepkeun (Ahmed na Koob, 1998), ngan ukur aksés kaayaan panjang nyababkeun pangirangan tina ubar diri (Gbr 2A). ΔFosB ngainduksi ka sajauh anu langkung ageung vs. aksés pondok kanggo kokain dina cangkang NAc (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) sareng inti (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17). Kontras, CaMKIIα dipangaruhan dina cangkang NAc ngan ukur kalayan aksés ka kokain (Gbr 2B sareng C; p = 0.0236; F = 4.957; df = 16). Éta pikaresepeun pikeun ngabandingkeun asupan kokain rata-rata rata-rata sasatoan akses pondok (~ 12 mg / kg IV), sato aksés panjang (~ 70 mg / kg IV), sareng sato-anu dikaluarkeun eksperimen (10 mg / kg), sareng naroskeun naha pangna terakhir milih anu induksi anu kuat ti ΔFosB sareng CaMKII padahal jalan pondok henteu. Perbezaan ieu kamungkinan kusabab bédana dina tingkat cocaine puncak (kokain anu dikokolakeun ékspérimén dirumuskeun salaku IP tunggal, sedengkeun kokain anu dikaluarkeun dikirimkeun ku sababaraha dosis IV), atanapi ku bédana panjang panyebaran narkoba (7 dinten pikeun ékspérimén administrasi, dinten 19 pikeun pamaréntahan sorangan).

Sanaos literatur ageung dina ΔFosB sareng CaMKII dina tindakan kokain, teu aya paniluan protéin ieu dina pangguna kokain. Di dieu, urang nampilkeun bukti mimiti yén tingkat duanana ΔFosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) sareng CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32) ningkat dina NAc tina manusa gumantung ka kokain (Gbr 2D, table 1). Data ieu nunjukkeun yén pamariksaan induksi ΔFosB sareng CaMKII ku kokain dina rodent NAc sacara klinis relevan pikeun kecanduan kokain manusa.

table 1

Karakter tina conto panagihan kokain manusa sareng kelompok kontrol anu dicocogkeun

ΔFosB ngatur Transkripsi CaMKII Selektif dina DNNXX-Tipe MSN tina NAc Shell

Pamanggihan yén CaMKII sareng ΔFosB dikedalkeun ku kokain dina rod na NAS ngajurung urang pikeun nangtukeun naha ΔFosB tiasa ngatur transkripsi gén CaMKII. Kami sateuacana ngalaporkeun CaMKIIα salaku kamungkinan anu mungkin pikeun ΔFosB dina analisa microarray anu teu kaunggulan tina NAc (McClung na Nestler, 2003), tapi pamanggihan ieu henteu disahkeun deui dina pangajaran éta. Kami mimiti nganggo ChIP kuantitatif (QChIP-ChIP dituturkeun ku PCR kuantitatif) pikeun nangtukeun naha ΔFosB ngabeungkeut ka promoter gen CaMKIIα di NAc tina beurit lalaki sawawa, sareng kapanggih yén pikasieuneun ieu langkung ningkat, ku administrasi kokain kronis, dina cangkang ( p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), tapi sanés inti, subregion (Gbr 3A). Pikeun langkung ngartos mékanisme anu aya hubunganana sareng bédana spésifik ieu dina ΔFosB ngariung ka promosor CaMKIIα, kami ngagunakeun qChIP pikeun ngarobih kaayaan modpikasi histon di daérah génomik ieu. Panaliti sateuacan nunjukkeun nunjukkeun induksi kokain tina H3 acetylation di promosor CaMKIIα dina total beurit NAc (Wang et al., 2010). Kontras, urang mendakan kokain ngirangan asétilasi H3 di promosor CaMKIIα sacara selektif dina inti NAc (Gbr 3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), kalayan henteu robih katingalina dina cangkang, saluyu sareng robih kromatin khusus subregion-saluareun ΔFosB mengikat. QChIP pikeun tanda anu nindas, dimétilasi H3 lysine 9 (H3K9me2), ngungkabkeun tren turun tina duanana subrei cangkang sareng inti (Gbr 3C).

Pikeun ngabedakeun naha ΔFosB ngatur transkripsi CaMKIIα di vivo, urang ngagunakeun dua garis beurit bitransgenic anu sacara henteu langsung ngabebaskeun ΔFosB khusus dina D1 vs. Jenis MSN D2 dina cara dikawasa ku administrasi doxycycline dina nginum cai (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002). Beurit lalaki déwasa overexpressing ΔFosB ngan ukur dina MSNs jenis D1 ngalaman tingkat nyata tingkat CaMKIIα mRNA dina NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), pangaruh anu henteu katingali dina beurit anu overexpressing ΔFosB umumna dina D2-type MSNsGbr 3D). Ningkatkeun CaMKIIα mRNA, ngainduksi ku ekspresi ΔFosB di MSNs tipe D1, dibarengan ku paningkatan konkomunikasi dina protein CaMKIIα dina duanana cangkang NAc (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) sareng inti (p = 0.0392; t = 2.275; df = 14; Figs 3E sareng F). Data ieu nunjukkeun yén ΔFosB sanggup nyetir ekspresi gen CaMKIIα dina jinis MSN D1 dina dua subkelas, sanaos Gambar 3B nunjukkeun yén parobahan kokométer-édisiasi dina promosor CaMKIIα (contona, dikirangan asétilasi) nyegah ΔFosB tina upregulate CaMKII dina subpersi inti saatos kokain.

Kusabab data beurit transgenik kami nunjukkeun yén induksi ΔFosB éksprési gén CaMKII khusus pikeun DN-tipe DN di NAc, urang teras milarian pikeun nangtoskeun naha régulasi gumantung kokain tina CaMKII meryogikeun aktivasina reséptor D1 dopamin. Beurit jalu sawawa dikaluarkeun kokain kronis atanapi saline sapertos sateuacan, tapi 1 mnt sateuacan unggal suntikan, beurit dina grup kokain dipasihan suntikan IP saline, antagonis D30 SCH 1 (23390 mg / kg), atanapi etikloprida antagonis reséptor D0.5 (2 mg / kg). Sato dianalisis 0.5 jam saatos suntik terakhir kokain. Blotting Kulon ngungkabkeun yén D24, tapi sanés D1, antagonis lengkep ngahambat kanaékan kokain-dimédiasi ΔFosB (p <2; F = 0.0001; df = 18.96), sakumaha dilaporkeun sateuacanna (Nye et al., 1995), ogé dina CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Gbr 3G na H.). Data ieu ngadukung hipotesis anu kokain ngalaksanakeun peningkatan épisitas ΔFosB dina ekspresi gén CaMKII sacara khusus dina cangkang NANXX jenis D1. Ieu bakal penting dina hasil kajian anu badé pikeun nunjukkeun langsung tina pangaruh khusus cocaine ieu dina ekspresi CaMKII dina daérah otak ieu.

ΔFosB Kadua Diperyogikeun sareng Cukup Pikeun Induksi Cocaine of CaMKII dina NAc Shell

Pikeun ngalengkepan panggunaan beurit bitransgenic, urang teras diajarkeun peran ΔFosB dina nyéduksi induksi kokain tina CaMKIIα ku cara nganggo transfer gédisi anu dimédiasi ku beurit. Kami dua kali partikel nyuntik virus adeno-pakait (AAV) kana cangkang NAc tina beurit jalu déwasa (dimana cangkang tiasa disasarkan sacara selektif) pikeun ngindarkeun ΔFosB ditambah GFP atanapi GFP waé. Sato éta teras dibéré suntikan IP tunggal tina 10 mg / kg kokain. Sato overexpressing ΔFosB / GFP nunjukkeun tanggapan lokomotor anu ningkat dibandingkeun sareng sato anu overexpressing GFP waé (Gbr 4A). 24 saatos suntikan kokain tunggal, jaringan NAc positip GFP-éksisi ti sato ieu ku dissection handapeun sumber cahaya neon. Blotting barat dina jaringan ieu (Gbr 4B sareng C) ngungkabkeun overexpression ΔFosB kuat ogé paningkatan anu signifikan dina total protéin CaMKIIα dibandingkeun sato GFP (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), mirip sareng induksi anu katingali ku administrasi kokain kronis. Salaku tambahan, CaMKIIα autophosphorylation at Thr286 (indikasi aktivasi énzim) dironjatkeun ku ΔFosB overexpression (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28), sakumaha fosforilasi substrat CaMKII, Ser831 tina GluA1 (p = 0.0540; t = 2.012; df = 28), sakumaha fosforilasi tina substrat CaMKII, SerXNUMX tina GluAXNUMX (p = XNUMX; XNUMX; df = XNUMX), kitu deui meniru tindakan tina kokain kronis (Gbr 1C sareng D). Taken ngahiji, data ieu nyayogikeun bukti salajengna yén ekspresi ΔFosB dina cangkang NAc cekap pikeun sensitipitas lokomotor ka kokain sareng induksi CaMKII sareng aktivasina dina subperitas ieu.

Kami nganggo cara anu sami pikeun ngabedakeun naha ΔFosB ogé dipikabutuh pikeun induksi kokain-ditengahkeun tina CaMKIIα dina cangkang NAc. AAV dipaké pikeun nyimpang protéin JunD anu terbatas, disebut ΔJunD, anu régulator négatip tina aktivasina transkripsial ΔFosB (Winstanley et al., 2007) tambah GFP atanapi GFP waé. Dua minggu saatosna, nalika ekspresi transgene maksimal, sato dibere kokain (10 mg / kg) atanapi asin poean kanggo dinten 7, sareng dites pikeun résponasi lokomotor kana tangtangan kokain (5 mg / kg) 24 saatos saatos suntikan kronis terakhir (Gbr 4D). ExJunD overexpression nyegah nyegah sensitipitas lokomotor ka kokain, sareng ogé nyegah CaMKIIα induksi sareng aktivasina dina cangkang NAc (Gbr 4E sareng F; p = 0.0437; F = 2.997; total df = 38), nunjukkeun yén kagiatan transkrip ΔFosB dipikabutuh pikeun induksi cocaine-mediated of CaMKIIα dina subregion ieu. Narikna, urang mendakan yén ΔJunD ngirangan tingkat ΔFosB dina kaayaan kaayaan asin sareng cocaine (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), ngirangan kamungkinan novel yén ΔFosB gumantung kana kagiatan AP-1 pikeun tingkat ekspresi sorangan.

CaMKII Phosphorylates ΔFosB di Ser27

maké dina vitro Protéase kinase negeskeun, kami ditangtukeun yén dimurnikeun ΔFosB mangrupikeun substrat anu kuat pikeun CaMKIIα. Inubasiasi-Na₆-ΔFosB kalayan CaMKIIα sareng ATP nyababkeun peralihan ka luhur dina mobilitas éléktroforetik ΔFosB (Gbr 5A); sababaraha pita anu balukarna ngasongkeun sababaraha situs fosforilasi. Sarupa dina vitro kinase nulungan ngagunakeun [γ-³²P] ATP nunjukkeun ngalebetkeun fosfat radiolabeled kana pita ΔFosB anu digeser (Gbr 5B), nunjukkeun langsung fosforilasi protéin. Kami ngahasilkeun antibodi anu spesifik phospho kana Ser27 anu ayeuna dicirikeun ΔFosB (Ulery et al., 2006). Sanajan antibodi ieu henteu ngahasilkeun sinyal ngalawan ékstrak otak anu ngandung Ser27-phosphorylated ΔFosB (data anu henteu ditingali), urang tiasa ngémutan fosforilasi Ser27 dina dina vitro assay kinase nganggo CaMKII (Gbr 5B). Kinetik nganalisa fosforilasi CaMKII tina ΔFosB nunjukkeun yén éta mangrupikeun substrat poténsial pikeun kinase (Gbr 5C), kalayan semu K_M tina 5.7 ± 2.0µM sareng K_CAT tina 2.3 ± 0.3min^-1. Hasil ieu dibandingkeun sareng seueur anu dicirikeun di vivo substrat tina CaMKII (Colbran sareng Coklat, 2004). Salaku tambahan, urang mutuskeun yén CaMKII fosforus ΔFosB kalayan stoichiometry 2.27 ± 0.07 mol / mol (Gbr 5D), nunjukkeun yén sahenteuna tilu situs fosforilasi CaMKII dina His₆-ΔFosB protéin, saluyu sareng Gbr 5A.

Pikeun nalungtik situs fosforilasi individu, urang padamelan MS nganalisa conto ti kami dina vitro assase kinase Gbr 5E nunjukkeun fosforilasi ΔFosB di Ser27 anu saméméhna dicirikeun sareng di sababaraha situs tambahan (data henteu ditingalikeun). Ngabantosan karakterisasi sateuacanna tina Ser27, kami difokuskeun kana situs ieu ku ngahasilkeun péptida sintétis anu dicétak tina phospho- sareng nagara-nagara nonphospho Ser27, teras kuantitas péptida anu dikenal salaku standar di MRM nganalisa ΔFosB sateuacan sareng saatosna. dina vitro fosforilasi ku CaMKII. Saur waktosna (Gbr 5F) mastikeun yén Ser27 mangrupikeun substrat kuat pikeun CaMKII. Hasilna nunjukkeun yén, diantara sababaraha résidu fosforilasi dina ΔFosB, Ser27 mangrupikeun substrat anu efektif pikeun CaMKII.

CaMKII Mediates akumulasi Cocaine tina ΔFosB dina NAll Shell

Kusabab CaMKII tiasa fosforil ΔFosB dina vitro dina situs anu nyirorot ningkatkeun stabilitasna dina vitro jeung di vivo (Ulery et al., 2006; Ulery-Reynolds et al., 2009), kami ditangtukeun naha kagiatan CaMKII ngadalikeun tingkat ΔFosB dina NAc di vivo. Pikeun ngajawab patarosan ieu, urang mimiti ngagunakeun garis beurit anu ngalémbarkeun mutant bebas kalsium CaMKIIα (T286D) dina sababaraha daérah otak kalebet NAc (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012). Kami nyuntik manten lalaki anu cocog sareng umur mutan sareng wildtype littermate kalayan 20 mg / kg kokain atanapi saline sakali unggal dinten pikeun 14, teras dianalisis sato sapoe dina saatos suntikan akhir. Kami mendakan yén tingkat basal ΔFosB ningkat dina sato mutan dina kerang NAc (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), tapi henteu inti (Gbr 5G na H.). Ngéranakeun, induksi kokain tina ΔFosB diblokir dina sato mutan dina cangkang sareng inti, nunjukkeun yén, sanaos CaMKII langsung langsung ngatur stabilitas ΔFosB dina cangkang NAc, éta ogé tiasa janten hulu hulu ΔFosB di jalur-diaktivasi kokain di kadua subérasi NAc .

Aktivitas CaMKII diperyogikeun kanggo Pluktural sareng Paripolah ΔFosB-Mediated Stractural and Behavioural Plastical

Induksi kokain tina dendritik spésies kana NAc MSNs mangrupikeun adaptasi narkoba anu didorong ku ubar paling hadé di daérah otak ieu, sareng induksi tulang tonggong sapertos diarahkeun ku résponasi perilaku anu sensitip kana ubar (Robinson na Kolb, 2004; Russo et al., 2010) sareng dilaporkeun janten selektif pikeun MSNs jenis D1 (Lee et al., 2006). Kami nembé nunjukkeun yén induksi kokain tina dendritik spines di NAc téh gumantung kana ΔFosB sareng program transkrip hilirna (Maze et al., 2010). Padahal aya literatur éksténsif ngeunaan partisipasi CaMKII dina morfologi tulang tonggong dendritik sareng induksi di daérah otak sanés sareng sistem ékspérimén (Jourdain et al., 2003; Penzes et al., 2008; Okamoto et al., 2009), peranna dina formasi tulang tonggong NAc MSN teu acan tiasa diajar. Ku sabab kitu, kami mutuskeun naha kagiatan CaMKII diperyogikeun pikeun induksi ΔFosB-mediated spines MSN dendritik ku ngagunakeun overexpression mediasi HSV-mediator ku peptide AC3I datar ka GFP, hiji konstruksi saméméhna dipidangkeun pikeun ngahambat kagiatan CaMKII di vivo (Zhang et al., 2005; Klug et al., 2012). Éksprési teuing pressFosB dina cangkang beurit NAc beurit sawawa ngainduksi kanaékan signifikan dina kapadetan tulang tonggong dendritik MSN (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Gbr 6A sareng B) sakumaha dilaporkeun saméméhna (Maze et al., 2010), sareng paningkatan ieu didorong utamina ku ipis (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) sareng corong (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59) jinis tulang tonggong (duanana panginten janten tikét).Gbr 6C – E). Teu aya pangaruhna dina tatanggaana dewasa langkung dewasa. Tapi, nalika GFP-AC3I dikedalkeun, induksi ΔFosB ditumpes lengkep (Gbr 6A – E), nunjukkeun yén kagiatan CaMKII diperyogikeun pikeun induksi ΔFosB tina spines dendritik dina cangkang NAc.

Salajengna kami nganggo alat-alat viral anu sami pikeun mastikeun naha kagiatan CaMKII diperyogikeun pikeun épék ΔFosB ngeunaan sensitipitas palaku pikeun kokain. 72 saatos jarum suntikan kana cangkang NAc, sato dibere suntikan tunggal 5 mg / kg kokain sareng kagiatan lokomotorna. Sakumaha anu dipidangkeun ku seueur overexpression AAV langkung panjang ΔFosB (Gbr 4A),, Overexpression mediasi HSV tina ΔFosB ningkat sensitipitas lokomotor kana kokain (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; Gbr 6F). Sapertos induksi spines dendritik, perencatan kagiatan CaMKII ku paksaan tina GFP-AC3I diblokir sacara lengkep dina paningkatan sensitipasi ΔFosB, nunjukkeun yén kagiatan CaMKII diwajibkeun pikeun parobihan ΔFosB-akibat tina kokain paripolah.

Pindah ka:

diskusi

Ulikan anu ayeuna ngajelaskeun mékanisme maju-maju mékanisme kokain mendorong ΔFosB dina NAc, anu upregulates transkrip gén CaMKIIα sacara selektif dina NAc cangkang. CaMKII teras salajengna fosforus sareng stabilisasi ΔFosB ngarah kana akumulasi ΔFosB anu langkung ageung sareng salajengna induksi CaMKIIα (Gbr 6G). Tingkat ko-dua tingkat dua protéin dina nalika paparan kronis kokain teras nyumbang dina cara anu penting pikeun réspon paripolah anu sensitip kana ubar. Ieu hipotesis anu pikaresepeun pisan sabab duanana ΔFosB sareng CaMKII parantos nunjukkeun sadayana sateuacanna diperyogikeun pikeun réaksi tindak tanduk kokain (Pierce et al., 1998; Peakman et al., 2003), sareng urang ngayakeun réaksi ieu pikeun ΔFosB dina cangkang NAc khusus nganggo pendekatan viral (Figs 4 jeung And66).

Sanajan overexpression transgenik ΔFosB dina MSNs jinis D1 tiasa nyetir induksi CaMKII dina cangkang NAc sareng sato kokain-naïve, dina konteks kokain, akumulasi ΔFosB endogen, anu lumangsung dina duanana subregions, mendorong induksi CaMKII sacara khusus dina cangkang NAc. . Béda ieu tiasa aya hubunganana sareng tingkat anu langkung saé pikeun ΔFosB dina model bitransgenic urang, tapi, éta ogé tiasa nunjukkeun kabisa kokain pikeun bédana ngarobihkeun promosor CaMKIIα dina cangkang vs. inti MSN boh pikeun ngamajukeun ΔFosB ngariung dina tilas atanapi ngaluarkeunana dina subgelas anu dimungkinkeun. Kanyataanna, data ChIP kami, anu ngungkabkeun deacetylation diédah cocaine-mediated di promosor gen CaMKIIα dina inti NAc wungkul, ngadukung kamungkinan aya mékanisme kromatin. Kalayan hipotesis ieu, overexpression overFosB dina MSN-jenis D1, tiasa nyetir induksi CaMKIIα dina inti NAc dina henteuna kokain (Gbr 3F), nunjukkeun yén aya modifikasi aktif tina promoter CaMKIIα anu nyegah induksi ieu nalika paparan kokain kronis. Perda bentang kromatin di promosor CaMKII ogé tiasa ngajelaskeun naha CaMKII dipengaruhi ku dosis tantangan cocaine dina cangkang NAc tina beurit cocaine-mundur kronis (Gbr 1E) tapi sanés sato-naifGbr 1D). Ieu tiasa ngagambarkeun épénétik "gén priming" épék ΔFosB (Robison na Nestler, 2011), sareng bakal janten mékanisme molekular tina karubahan kokain (Pickens et al., 2011). Nanging, pikeun ngarobih chromatin ieu sacara kenging ngahubungkeun kana inkubasi tina pangidaman, éta bakal kedah ningkat kana waktosna. Éta bakal pikaresepeun pikeun ngartos naha ieu hal, sareng diajar naha gen séjén nunjukkeun ΔFosB-gumantung, pangaturan khusus ku kokain. Éta ogé penting pikeun dicatet yén feed-forward loop anu kami jelaskeun henteu ngakibatkeun hiji akumulasi anu teu terbatas CaMKII atanapi ΔFosB (Gbr 1E); uncovering molekul "marake" anu tanggung jawab ieu mangrupikeun tujuan anu penting pikeun nalungtik masa depan.

Fungsi anu dipikanyaho ΔFosB sareng CaMKII dina sababaraha sistem ékspérimén sareng daérah otak ngagabung dina sababaraha tingkatan (Gbr 6F). Kadua molekul nuklir nyambung ka tumuwuhna tulang tonggong dendritik: CaMKII berinteraksi sareng sittoskeleton actin (Okamoto et al., 2009), ngatur ukuran sirah tulang tonggong (Matsuzaki dkk., 2004), sareng duanana dipikabutuh sareng cekap pikeun nambahan-ngainduksi tina katurunan dina filopodia sareng sajumlah synaps dina budaya nyiksikan hippocampal (Jourdain et al., 2003), while ΔFosB duanana dipikabutuh sareng cekap pikeun formasi tulang tonggong dendritik anu didorong kokotor di NAc MSN (Maze et al., 2010). Salaku tambahan, duanana molekul parantos aya hubungan sareng peraturan reséptor glutamat AMPA. CaMKII henteu ngatur jumlah tingkat subunit reséptor AMPA, tapi nyababkeun sisipan reséptor AMPA kana sinétron sareng ningkatkeun konduksian saluran AMPA ku cara phosphorylating GluA1 di Ser831 di hippocampal piramida saraf dina budaya sareng di vivo (diulas di (Malinow na Malenka, 2002; Colbran sareng Coklat, 2004)). Perdagangan sapertos ningkat GluA1 sapertos parantos disingket parantos ogé tersirat dina tindakan kokain kronis (ogéBoudreau na lancaran, 2005). Leuwih ti éta, réspon tingkah laku pikeun aktivasina reséptor AMPA di NAc ditingkatkeun ku panyalindungan CaMKIIα ku cara dopamin-dopamin reséptor D1 (Singer et al., 2010). Overexpression jangka panjang khusus D1 tina ΔFosB parantos ditingalikeun pikeun nyurung transkrip GluA2 dina NAc (Kelz et al., 1999), anu nyampurnakeun réspon AMPA anu dimédiasi liwat GluA1, bari urang nunjukkeun di dieu yén overexpression ΔFosB jangka pondok-ogé janten paparan jangka pondok pondok - teu aya pangaruh dina subunit ieu (Gbr 1). Nanging, kami nembe mendakan yén overFosB overexpression jangka pondok sawaktosna ngirangan réspon AMPA dina MSNs jenis D1 di NAc (Grueter et al., 2013). Data ieu nunjukkeun mékanisme anu béda sacara internal anu tiasa janten sérial neuroadaptasi gumantung waktos ka cocaine anu mangaruhan aspék béda tina kamajuan kecanduan anu teu pati kahartos. Dina tingkat perilaku, duanana CaMKII sareng ΔFosB diwajibkeun pikeun sensitipitas lokomotor ka kokain (tingali di luhur), sareng diperyogikeun pikeun pangurus diri kokain dina rodénsia (Colby et al., 2003; Wang et al., 2010), nunjukkeun yén dua protéin penting pikeun adaptasi paripolah jangka pondok sareng jangka panjang pikeun paparan narkoba, bahkan via mékanisme dasar anu rada béda. Mungkin, ΔFosB sareng CaMKII ngatur adaptasi paripolah rumit sapertos ku perobihan dina fungsi synaptic NAc, sanaos seueur usaha anu diperyogikeun langsung pikeun nyambungkeun fenomena sinaptik kana parobahan perilaku.

CajKII ngalirenzyme sakaligus berinteraksi sareng rupa-rupa protéin anu aya pakait sareng synaps (Robison dkk., 2005) anu disangka ngatur target na ka density postynaptic (PSD), fenomena anu disarankeun penting pikeun kamampuan synaptic. Khususna, interaksi CaMKII sareng sublu GluN2B tina reséptor glutamat NMDA, nembé ditingalikeun pikeun ngatur kapinteran sareng sinaptis (learning).Halt dkk., 2012). Nalika péptida AC3I meniru domain autoinhibitory of CaMKII, sahingga nyegah kagiatan katalitik énzim, éta ogé meungpeuk sababaraha interaksi protéin-protéin (Strack et al., 2000; Robison dkk., 2005). Ku sabab kitu, épék paripolah sareng morfologis HSV-GFP-AC3I dilaporkeun ka dieu tiasa kajantenan ngirangan fosforilasi tina target target CaMKII, parobihan targeting CaMKII, atanapi parobihan peran struktural CaMKII anu diusulkeun ku sinapses (Lisman et al., 2002).

Watesan tiang loopFosB-CaMKII anu diusulkeun kana cangkang NAc mangrupikeun catetan khusus, kumargi padamelan panganyarna parantos nunjukkeun sababaraha béda fisiologis antara cangkang NAc sareng inti pikeun ngarobih administrasi kokain, anggapan anu dikonfirmasi ku data iTRAQ (Tabel S1) anu henteu jelas. . MSN dina cangkang NAc nunjukkeun depresi dina kamampuan panyebaran cocaine kronis anu dipikagaduh salami minggu, sedengkeun inti MSN ti sato anu sami nunjukkeun hiji fana (1-3 dinten) kanaékan kamampuan tembakan anu balik ka tingkat basal dina minggu 2 (Kourrich sareng Thomas, 2009). Salaku tambahan, seueur protéin synaptic dibédakeun anu luarna dina cangkang NAc vs. inti sato kakeunaan kokain kronis, kalebet GluA2 (Knackstedt et al., 2010). Salaku amphetamine kronis nyababkeun CaMKIIα sacara khusus dina cangkang NAc (Loweth et al., 2010), henteu heran kami mendakan pangaruh anu sami sareng kokain. Nanging, sakumaha ΔFosB dipengaruhi dina cangkang NAc sareng inti ku kokain kronis (Perrotti et al., 2008), sareng ti saprak urang nunjukkeun yén induksi CaMKIIα dina cangkang ΔFosB, panemuan kami nyayogikeun bukti anyar pikeun mékanisme transkrip anu béda dina promosor CaMKIIα antara dua subparsi ieu, anu tanggung jawab pikeun induksi selektif CaMKIIα dina cangkang.

Sajumlah karya anyar parantos fokus kana delineating béda antara D1- sareng NAX MSNs jenis D2. Sanaos reséptor D1 sareng D2 aub dina épék-épék kokain (Dasar, 2010), karya anyar nunjukkeun yén aktivasi optogenétik tina jinis D1 jenis D2 nambahan réspon tingkah laku ka kokain, sedengkeun aktivasina MSN tipe DXNUMX ngagaduhan pangaruh anu sabalikna (Lobo et al., 2010). Luyu sareng pamanggihan ieu, beurit knockout D1-reséptor kurang dina akuisisi administrasi kokain (Caine et al., 2007), sedengkeun D2 knockouts henteu (Caine et al., 2002). Administrasi agonis D1 langsung kana NAc micu tingkah laku anu milari kokolot dina panyayuhan ulang paradigma (Dasar, 2010). Narikna, pangaruh ieu ngabutuhkeun D1 gumantung pisan-gumantung kana kagiatan CaMKII dina cangkang NAc, tapi henteu inti (Anderson et al., 2008), hasil anu dovetail saé kalayan D1- sareng cangkang khusus ΔFosB-CaMKII diusulkeun di dieu.

Urang saacanna ngalaporkeun yén Ser27 di ΔFosB tiasa diasforilasi ku casein kinase-2 (Ulery et al., 2006), kumaha ogé, urang netepkeun di dieu yén Féforum C CaMKII ΔFosB dina ieu sareng situs sanésna kalayan kinétik sareng stoichiometry jauh langkung ageung sareng tiasa ngayakeun réplika M anu langkung luhur_r watekna pikeun ΔFosB (Gbr 5A) kalayan paparan kokain di vivo (Nestler, 2008). Kami geus terang yén fosforilasi Ser27 nambahan stabilitas ΔFosB sareng kagiatan transkripsi (Ulery et al., 2006; Horeng sareng Nestler, 2007; Ulery-Reynolds et al., 2009). Karya masa depan ayeuna bakal fokus kana idéntifikasi sareng fungsionalitas fungsional ti situs-situs novel ΔFosB fosforilasi anu dituduhkeun ku pangajaran anu ayeuna.

Gelung feed-hareup anu dijelaskeun di dieu nyiptakeun mékanisme énggal anu ku jalan ngatur deui cocaine mendorong kalainan normal dina NAc. Sapertos kitu, jalur biokimia ieu tiasa janten tujuan anu penting pikeun campur tangan terapi masa depan dina gangguan adiktif. Kusabab CaMKII mangrupikeun ubiquitous sareng diperyogikeun pikeun seueur fungsi neuronal basal sareng tingkah laku, pamakean langsung tina sambetan CaMKII parantos diindarkeun salaku perlakuan kecanduan. Data kami nunjukkeun yén langkung seueur target halus tina mékanisme induksi CaMKII, anu khusus pikeun jinis sél individu sareng subregion tina circuitry ganjaran otak, tiasa nyayogikeun target terapeutik anu bakal ngahindarkeun komplikasi tina inhibisi CaMKII sistemik.

Pindah ka:

Acknowledgments

Karya ieu dirojong ku hibah ti National Institute on Drug Abuse (EJN), NIDA-Yale Proteomics Center DA018343 (AJR sareng EJN), sareng Yayasan Hartwell (AJR). Panulis hoyong hatur nuhun ka Gabby Rundenko pikeun hadiah berehan anu dimurnikeun ΔFosB sareng Roger Colbran pikeun hadiah berehan tina dimurnikeun CaMKIIα.

Pindah ka:

Rujukan

1. Ahmed SH, Koob GF. Transisi tina sedeng pikeun asupan ubar kaleuleuwihan: parobahan dina titik set hedonic. Élmu. 1998; 282: 298-300. [PubMed]
2. Anderson SM, KR Terkenal, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Bass CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: jembatan biokimia ngahubungkeun accumbens dopamin sareng sistem glutamat dina milarian kokain. Nat Neurosci. 2008; 11: 344-353. [PubMed]
3. Boudreau AC, Wolf ME. Sensitipitas Paripolah kokain pakait sareng ningkat éksprési permukaan resép AMPA dina inti accumbens. J Neurosci 2005; 25: 9144-9151. [PubMed]
4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. Babasan sareng karakterisasi alfa-subunit Ca2 + / kalédium gumantung protéin kalaseumulin nganggo sistem ekspresi baculovirus. Biochem Biophys Res Komun. 1990; 173: 578-584. [PubMed]
5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Cileungsi L, Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. Peran reséptor dopamin D2-kawas dina kokain administrasi mandiri: nalungtik sareng beuteung mutan reséptor D2 sareng reséptor D2 antagonis. J Neurosci 2002; 22: 2977-2988. [PubMed]
6. Caine SB, Thomsen M, Jibril KI, Berkowitz JS, Emas LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Kurangna pamaréntahan kokain dina dopamine D1 ngawadulkeun beurit. J Neurosci 2007; 27: 13140-13150. [PMC artikel bébas] [PubMed]
7. Carle TL, Ohnishi yn, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. Proteasome-gumantung jeung -independent mékanisme pikeun FosB destabilization: idéntifikasi of FosB domain degron jeung implikasi pikeun stabilitas DeltaFosB. Eur J Neurosci. 2007; 25: 3009-3019. [PubMed]
8. J J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Sasatoan transgenik nganggo ekspresi gen anu disasarkan, dina uteuk. Mol Farmakol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
9. DJ Christoffel, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Russo SJ. IkappaB kinase ngatur kekalahan sosial anu dikonci ku sinaptic sareng paluangan paluangan. J Neurosci 2011; 31: 314-321. [PMC artikel bébas] [PubMed]
10. Colbran RJ. Inactivasi Ca2 + / kalaseum kinase-gumantung kalinulinulin ku autofosforilasi basal. J Biol Kim. 1993; 268: 7163-7170. [PubMed]
11. Colbran RJ. Fosfatase protein sareng kalsium / protéin kalodag-gumantung kakodin plastik kapercayaan synaptic. J Neurosci 2004; 24: 8404-8409. [PubMed]
12. Colbran RJ, Coklat AM. Kalsium / kalapis kakodin-kalina kinase II sareng kamampuan synaptic. Curr Opin Neurobiol. 2004; 14: 318-327. [PubMed]
13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. sél Striatal tipe-spésifik overexpression of DeltaFosB ngaronjatkeun incentive pikeun kokain. J Neurosci. 2003; 23: 2488-2493. [PubMed]
14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler EJ. Laku lampah antidepresan inhibitor histon deacetylase. J Neurosci 2009; 29: 11451-11460. [PMC artikel bébas] [PubMed]
15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhshan B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC. Proteomics kuantitatif protein caveolin-1-diatur: characterization polymerase i sareng transcript release factor / CAVIN-1 IN sél endothelial. Proteomics sél Cell. 2010; 9: 2109-2124. [PMC artikel bébas] [PubMed]
16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Faktor résiko pikeun parantosan bunuh diri dina depresi utama: studi kasus-kontrol prilaku impulsive sareng agrésif dina lalaki. Am J Psychiatry. 2005; 162: 2116-2124. [PubMed]
17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, RC Malenka. DifferentialFosB diferensial nukleus inti ngajukeun fungsi jalur langsung sareng henteu langsung. Proses Natl Acad Sci AS. 2013 dina pencét. [PMC artikel bébas] [PubMed]
18. Halt AR, RF Dallapiazza, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojcik S, Brose N, Silva AJ, Neraka JW. CaMKII mengikat GluN2B kritis nalika konsolidasi mémori. EMBO J. 2012; 31: 1203-1216. [PMC artikel bébas] [PubMed]
19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. Beurit mutan FosB: kaleungitan induksi kokain kronis protéin anu patali sareng Fos sareng sensitipitas anu ningkat kana psikomotor kokain sareng pangaruh anu nguntungkeun. Proc Natl Acad Sci AS A. 1997; 94: 10397-10402. [PMC artikel bébas] [PubMed]
20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. Kontrol bédana tina paripolah anu dikandung ku kokotor ku inti inti accumbens inti sareng cangkang. Nat Neurosci. 2004; 7: 389-397. [PubMed]
21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Dimerization jeung pasipatan DNA-beungkeutan nu DeltaFosB faktor transkripsi. Biokimia. 2007; 46: 8360-8372. [PubMed]
22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. Kalsium / protéin kalapa-gumantung kakodulinulin nyumbang kana pertumbuhan filopodia sareng pembentukan tulang tonggong. J Neurosci 2003; 23: 10645-10649. [PubMed]
23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, JR, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto Bapak, Nestler EJ. Ekspresi tina deltaFosB faktor transkripsi dina uteuk ngawasaan sensitipitas mun kokain. Alam. 1999; 401: 272-276. [PubMed]
24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. Pameran Génétik CaMKII dina Dorsal Striatal Medium Spiny Neurons Ngurangan Synapses Excitatory Functional sareng Ningkatkeun Excitability Intrinsic Intrinsic. Plo Salah. 2012; 7: e45323. [PMC artikel bébas] [PubMed]
25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. Pelatihan kapengker sanggeus pamréntahan kokain mendorong palapis glutamatergic pikeun ngahambat karah cocaine. J Neurosci 2010; 30: 7984-7992. [PMC artikel bébas] [PubMed]
26. Kourrich S, Thomas MJ. Neuron anu sami, adaptasi tibalik: psychostimulant ngalaman diferensiasi alit nambihan sipat dina accumbens inti versus cangkang. J Neurosci 2009; 29: 12275-12283. [PMC artikel bébas] [PubMed]
27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. Pangaruh Pribadi-AMPAR alphaCaMKII Pribadi Ningkatkeun Sensitisasi Cocaine Reward. J Neurosci 2012; 32: 6578-6586. [PMC artikel bébas] [PubMed]
28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ . Peran faktor nappa kappaB nukléér dina hormon-édisiensasi stres hormon-mediated beurit dina beurit awéwé. Biol Psychiatry. 2009; 65: 874-880. [PMC artikel bébas] [PubMed]
29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Cocaine-ngainduksi tulang tonggong dendritik dina D1 sareng reséptor dopamin D2-ngandung neuron spiny sedeng dina accumbens inti. Ngalaksanakeun Natl Acad Sci US A. 2006; 103: 3399-3404. [PMC artikel bébas] [PubMed]
30. Lisman J, Schulman H, Cline H. Dasar molekna CaMKII fungsina dina mémori sinaptis sareng perilaku. Nat Rev Neurosci. 2002; 3: 175-190. [PubMed]
31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. Leungitna spésifik sél sél spésial BDNF meniru kontrol optogenétik tina kokain ganjaran. Élmu. 2010; 330: 385-390. [PMC artikel bébas] [PubMed]
32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. Inhibition of CaMKII dina inti accumbens cangkang ngirangan asupan amphetamine ditingkatkeun dina beurit sensitip. Neurosci Lett. 2008; 444: 157-160. [PMC artikel bébas] [PubMed]
33. Loweth JA, Singer BF, Baker LK, Wilke G, Inamine H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Transient overexpression of alpha-Ca2 + / caleg-gumantung protéin kalangkang II dina inti accumbens cangkang ningkatkeun réspon paripolah pikeun amphetamine. J Neurosci 2010; 30: 939-949. [PMC artikel bébas] [PubMed]
34. Malinow R, Malenka RC. Trafik reséptor AMPA sareng palemahan synaptic. Annu Rev Neurosci. 2002; 25: 103-126. [PubMed]
35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Struktural dasar jangka panjang potentiation dina spines dendritik tunggal. Alam. 2004; 429: 761-766. [PubMed]
36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. Kontrol formasi mémori tina ekspresi CaMKII transgene. Élmu. 1996; 274: 1678-1683. [PubMed]
37. Maze I, Covington anjeunna, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, montir M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ. peran penting tina histone methyltransferase G9a di plasticity kokain-ngainduksi. Élmu. 2010; 327: 213-216. [PMC artikel bébas] [PubMed]
38. McClung CA, Nestler EJ. Pangaturan éksprési gén jeung kokain ganjaran ku CREB na DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-1215. [PubMed]
39. Nestler EJ. Review. mékanisme Transcriptional tina kecanduan: peran DeltaFosB. Philos Trans Sunda Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245-3255. [PMC artikel bébas] [PubMed]
40. Nye anjeunna, asa BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. studi Pharmacological tina pangaturan antigen induksi FOS nu patali kronis ku kokain dina striatum na inti accumbens. J Pharmacol exp Ther. 1995; 275: 1671-1680. [PubMed]
41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. Peranca CaMKII sareng F-actin dina palastik struktural spines dendritik: mangrupakeun identitas molekular tina identip tag? Fisiologi (Bethesda) 2009; 24: 357-366. [PubMed]
42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Mekarwangi JR. DeltaFosB dina accumbens inti ngatur kabiasaan instrumental dahareun-bertulang jeung motivasi. J Neurosci. 2006; 26: 9196-9204. [PubMed]
43. Paxinos G, Watson C. Otak beurit dina koordinat stereotaxic. 6th Edition. Amsterdam; Boston: Akademis Pencét / Elsevier; 2007.
44. Peakman MC, Colby C, Perrotti Li, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen Bapak, Bursa JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Inducible, uteuk ekspresi wilayah-spésifik of a mutant négatip dominan tina c-Jun di mencit transgenik nurun sensitipitas mun kokain. Otak res. 2003; 970: 73-86. [PubMed]
45. Péksi P, Cahill ME, Jones KA, DP Srivastava. Sinyal Convergent CaMK sareng RacGEF ngadalikeun struktur sareng fungsi dendritik. Tren Cell Biol. 2008; 18: 405-413. [PubMed]
46. Perrotti Li, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. Induksi ti deltaFosB dina struktur otak nu patali ganjaran sanggeus stress kronis. J Neurosci. 2004; 24: 10594-10602. [PubMed]
47. Perrotti Li, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. pola béda tina DeltaFosB induksi dina otak ku ubar ti nyiksa. Synapse. 2008; 62: 358-369. [PMC artikel bébas] [PubMed]
48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hope BT, Shaham Y. Neurobiology tina inkubasi tina nginum obat narkoba. Tren Neurosci. 2011; 34: 411-420. [PMC artikel bébas] [PubMed]
49. Pierce RC, EA Gancang, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. Utusan kadua ditengah kalsium ngarobih ekspresi sensitipitas palaku pikeun kokain. J Pharmacol Exp Ther. 1998; 286: 1171-1176. [PubMed]
50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Reséptor otak otak manusa nganggo bagian hemisférs sadayana: metode umum anu ngaminimalkeun artefak jaringan. Synaps. 1987; 1: 446-454. [PubMed]
51. Robinson te, Kolb B. plasticity Struktural pakait sareng paparan ka ubar tina nyiksa. Neuropharmacology. 2004; 47 (Suppl 1): 33-46. [PubMed]
52. Robison AJ, Nestler EJ. Mékanisme transkripsial sareng epigenetik. Nat Rev Neurosci. 2011; 12: 623-637. [PMC artikel bébas] [PubMed]
53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, RBletlet RK, Colbran RJ. Interaksi anu kalangkung kalsium / protein-kakodulin gumantung kana kakase II sareng protéin kapadetan postynaptic NR2B, Dénin-180, sareng alpha-actinin-2. J Biol Kim. 2005; 280: 35329-35336. [PubMed]
54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A. Darso Pappin. Kuantitas protéin tikel dina Saccharomyces cerevisiae ngangge réagen tag isobaric amine-réaktif. Proteomics sél Cell. 2004; 3: 1154-1169. [PubMed]
55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. The addicted synapse: mékanisme of plasticity synaptic jeung struktural dina accumbens inti. Tren Neurosci. 2010; 33: 267-276. [PMC artikel bébas] [PubMed]
56. DW DW. Dina: Panarima Dopamin. Neve KA, editor. New York: Humana Press; 2010. pp. 479-524.
57. Penyanyi BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. Transient overexpression-alpha-kalsium / protein-dependodulin gumantung protein kinase II dina inti accumbens ngabalukarkeun upregulasi fungsina panjang abjad-alpha-amino-3-hydroxyl-5 -methyl-4-isoxazole-propionate reseptor: dopamine type-1 reséptor sareng protein kinase A dependence. Eur J Neurosci. 2010; 31: 1243-1251. [PMC artikel bébas] [PubMed]
58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. Mékanisme sareng pangatur kalsium / protein kaltododulin gumantung kana kinase II nargetkeun kana subunit NR2B tina reseptor N-metil-D-aspartate. J Biol Kim. 2000; 275: 23798-23806. [PubMed]
59. Eujan-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. Fosforilasi DeltaFosB mediasi stabilitasna di vivo. Gerentes. 2009; 158: 369-372. [PMC artikel bébas] [PubMed]
60. Umpan PG, Nestler EJ. Perda kagiatan transkripsi DeltaFosB ku fosforilasi Ser27. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224-230. [PubMed]
61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. Pangaturan stabilitas DeltaFosB ku fosforilasi. J Neurosci. 2006; 26: 5131-5142. [PubMed]
62. Vialou V, dkk. DeltaFosB dina sirkuit pahala otak nyapé daya tahan pikeun tanggapan sareng réspon antidepresan. Nat Neurosci. 2010; 13: 745-752. [PMC artikel bébas] [PubMed]
63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. kronis kokain-diinduksi H3 akétilasi sareng aktivasi transkripal tina CaMKIIalpha dina inti accumbens penting pikeun motivasi pikeun tulangan obat. Neuropsychopharmacology. 2010; 35: 913-928. [PMC artikel bébas] [PubMed]
64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB ngatur kabayang jalan. J Neurosci. 2002; 22: 8133-8138. [PubMed]
65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Héjo TA, Bachtell RK, Perrotti Li, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Self DW, Nestler EJ. DeltaFosB induksi dina cortex orbitofrontal mediates kasabaran ka disfungsi kognitif kokain-ngainduksi. J Neurosci. 2007; 27: 10497-10507. [PubMed]
66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley lj, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Hiji peran penting pisan pikeun DeltaFosB dina intina accumbens dina peta morfin. Nat Neurosci. 2006; 9: 205-211. [PubMed]
67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, Harga EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Lagu LS, Madu EC, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurevich VV, Salama G, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. Sambetan Calmodulin kinase II ngajaga ngalawan panyakit jantung struktural. Nat Med. 2005; 11: 409-417. [PubMed]