Optogenetics, kokain-əmələ gələn davranış həssaslığında (2) dopamin D2014 reseptorlarını ifadə edən yuxarı akustik orta spiny neyronların rolunu göstərir.

Get:

mücərrəd

Nüvə vasitəçiliyi ilə bağlı addım-addım davranışlarına qatqı təmin etmək üçün uzun müddət davam edən, dərmana uyğundur. Burada kokainlə əmələ gələn davranış həssaslığında dopamin D2 reseptorlarını (D2Rs) ifadə edən NAc orta spiny nöronların (MSN) rolunu araşdırmaq üçün bir optogenetik yanaşma istifadə etdik. Kanalodoksin-2 (ChR2) kodlayan Adeno-əlaqəli virus vektorları D2R-Cre transgenik siçanların NAc-ə təslim edilmişdir. Bu, NAc-da D2R-MSN-lərin fotostimulyasiyasına imkan yaratdı. D2R-MSN-ləri yerli inhibitor sxemlər təşkil edirlər, çünki D2R-MSN fotostimulyasiyası qonşu MSN-lərdə inhibitor postsinaptik cərəyanlara (IPSC) uyğundur. NAc D2R-MSN'in fotostimulyasiyası vivo ilə nə də başlanğıc və ya kokainə səbəb olan davranış həssaslığının ifadə edilməsinə təsir göstərmişdir. Bununla birlikdə, dərman çəkilmə dövründə fotostimulyasiya, kokainlə hərəkətli davranış həssaslığının ifadəsini zəriflədi. Bu nəticələr göstərir ki, NAX-nun D2R-MSN-ləri çəkilmə ilə bağlı olan plastisitədə əsas rol oynayır və narkotik maddələrin istifadəsinin dayandırılmasından sonra relapslara kömək edə bilər.

Keywords: optogenetika, orta spiny nöronlar, dopamin D2 reseptorları, kokain, narkotik asılılığı

giriş

Dopamin (DA) sinyalleri mükafat gözləntiləri və məqsədyönlü davranışlarla əlaqəli (Wise, 2004; Goto və Grace, 2005; Berridge, 2007). Dopaminergik xəstəliklərin tanınmış patologiyalarından biri narkotik maddələrdən asılılıqdır (Robinson və Berridge, 1993, 2003). Addictive maddələrə təkrar məruz qaldıqdan sonra, DA mesolimbic yolunda molekulyar və hüceyrəvi səviyyədə adaptiv dəyişikliklər baş verir; bu, ciddi yanlış nəticələrə baxmayaraq kompulsif narkotik maddə axtarma və dərmanlama davranışlarının davam etdiyi kronik, relapsing bir xəstəlik olan narkotik asılılığına gətirib çıxara bilər (Thomas və digərləri, 2008; Baik, 2013). Mezolimbik dopaminerjik sistemdə baş verən dəyişikliklərin xarakterik xüsusiyyətləri narkotik maddə asılılığını anlamaq üçün əsasdır.

Dopamin D1 reseptorları (D1R) və D2 reseptorları (D2R) striatumun orta spiny nöronlarında (MSN) yüksək ifadə olunur. Ventral striatumda, daha yaxşı nüvəli akumbenslər (NAc) kimi tanınan uzunmüddətli dərman vasitələrinə uyğundur, narkotik asılılığı və relaps davranışları ilə yanaşı, asılılığın inkişafına da kömək edir (Lobo və Nestler, 2011; Smith və digərləri, 2013). Ventral tegmental bölgədən olan dopaminergik hüceyrə orqanları əsasən NAc-i innervasiya edir. NAc içərisində hüceyrələrin 95% -nin üzərində dörd əsas beyin regionundan ekskursiya girdisi alan MSNlərdir: prefrontal korteks, hipokampusun ventral subikulumları, basolateral amigdala və talamus (Sesak və Grace, 2010; Lüscher və Malenka, 2011). NAc içərisində olan MSNlər D1Rs ifadə edən birbaşa yollar və doğrudan midbrain DA sahələrinə layihələr və D2Rs və ventral pallidum (Kreitzer və Malenka, 2008; Sesack və Grace, 2010; Lüscher və Malenka, 2011; Smith və digərləri, 2013). MSN, GABAergic olduğundan, MSN neyronlarının aktivasiyası, GABAergic (Chevalier və Deniau, 1990). Buna görə də, D1R-MSN-lərin aktivləşdirilməsi midbrain DA neuronlarını hərəkətə gətirəcək və bundan sonra mükafatla əlaqəli davranışların tənzimlənməsinə kömək edir (Lüscher və Malenka, 2011; Bocklisch et al., 2013).

Genetik olaraq tərtib edilmiş siçanların istifadə etdiyi sonrakı araşdırmalar, Cre recombinase'yi bir hüceyrə tipi şəkildə ifadə edərək, kokain addiction davranışlarında D1R-MSN və D2R-MSN'ler üçün müxtəlif rol oynadılar. Belə siçanlar xüsusi DZNUMXR-MSN və ya D1R-MSN seçici şəkildə manipulyasiya etmək üçün spesifik toksinlər, optogenetik problar və ya DREADD (dizayner reseptorları yalnız dizaynçı dərman tərəfindən aktivləşdirilmiş) genetik hədəflənməsini təmin edir. D2R-MSN-lər üçün D1R-MSN-lərin dərmanla bağlı asılılıq davranışlarının inkişafında heç bir konkret rol (və ya inhibitor rol) olmadığı halda, bu yanaşma, MSN-lərin asılılıq davranışlarında rolu barədə bəzi konsensusa gətirib çıxardı: D2R-MSN (Hikida və digərləri, 2010; Lobo və digərləri, 2010; Ferguson və digərləri, 2011; Bock et al., 2013). Kokainin ifşa edilməsi, həm MSN populyasiyasında həm də sinaptik modifikasiyanı və gen ifadəsində dəyişiklikləri incidir (Lobo və digərləri, 2010; Lobo və Nestler, 2011; Grueter et al., 2013). D1R-MSN və D2R-MSN-lərin kokainlə əlaqəli addictive davranışlarda qarşı rol oynadığı görünsə də, D2R-MSN-lərin dəqiq rolu aydın deyil.

Daha əvvəl D2R knockout (KO) siçanlarının normal kokain vasitəsi ilə davranış həssaslığını və kokain axtaran davranışlarını göstərdiyini, D2R olmamasının səbəb olduğu həssaslığın yalnız bir az azaldığını göstərmişdir (Baik et al. 1995; Chausmer et al., 2002; Sim və digərləri, 2013). Bununla belə, narkotik maddənin çıxarılması zamanı stressə məruz qalma D2R KO siçanlarında kokain ilə əlaqəli davranış həssaslığının, habelə kokain axtarışını və relapsing davranışını ifadə edir (Sim və digərləri, 2013). NAc-da D2R-nin spesifik dağıdılması bazal lokomotor fəaliyyətə təsir göstərmir, kokainə səbəb olan davranış həssaslığını deyil, stressin kokainə səbəb olan davranış həssaslığının ifadəsini maneə törətmək qabiliyyətini təmin edir (Sim və digərləri, 2013). Bu tapıntılar şübhəsiz ki, NAc-da D2R-ın blokadası kokain vasitəsi ilə davranış həssaslığını maneə törədir. Əksinə, NAc-da D2R kokain axtarma və relapsing davranışlarının artmasına səbəb olan çəkilmə zamanı stress tetikleyen sinaptik modifikasiyaların tənzimlənməsində fərqli bir rol oynayır (Sim və digərləri, 2013).

Burada kokainlə əmələ gələn davranış həssaslığında NAc D2R-MSNlərin rolunu qiymətləndirmək üçün optogenetikadan istifadə etdik. Beyin dilimlərini istifadə edərək, D2R-MSN-lərin fotostimulyasiyası qonşu MSN-ləri əhatə edən NAc daxilində yerli inhibitor dövrələri aktivləşdirdiyini görürük. NAc D2R-MSN-lərin fotostimulyasiyası vivo ilə nə kokain səbəbli davranışçı həssaslaşmanın başlanğıcını, nə də ifadəsini təsir edir. Bununla birlikdə, narkotik maddənin çıxarılması dövründə NAc D2R-MSN-lərin təkrarlanan aktivləşdirilməsi kokainə səbəb olan asılılıq davranışını azaldır. Bizim nəticələr göstərir ki, NAX-ların D2R-MSN'ləri çəkilmə ilə bağlı olan plastisitədə əsas rol oynayır və narkotik maddə istifadəsinin dayandırılmasından sonra relapslara kömək edə bilər.

Materiallar və metodlar

Siçan

C2Bl / 57 fonunda D6-Cre BAC transgenik siçan MMRRC (Mutant Mouse Regional Resource Centers, B6.FVB (Cg) -Tg (Drd2-cre) ER44Gsat / Mmucd) əldə edilmişdir. Davranış təcrübələrində, D2-Cre transgeni olmayan littermates D2-Cre siçanlarının nəzarətində istifadə edilmişdir. Siçanlar sabit temperatur və rütubət şəraitində və 12-h işıqda, 12-h qaranlıq cədvəl altında müəyyən bir patogen olmayan maneə obyektində saxlanılıb. Animal qayğı və istifadəsi Koreya Universiteti və KIST Korporasiyasının Heyvan Qulluq və İstifadə Komitələri tərəfindən təsdiq edilmiş standartlara uyğun olaraq həyata keçirilmişdir.

Virus vektor hazırlığı

pAAV-EF1a-DIO-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE səxavətlə Karl Deisseroth (Stanford Univ.) tərəfindən təmin edilmişdir. AAV hazırlamaq üçün, HEK293T hüceyrələri DMEM mediada antibiotiklər və FBS ilə yetişdirilmişdir. Transfeksiyadan bir gün əvvəl, 90-sm yeməklərindən 10% -lik birləşmənin kənarından dörd plitə beş 15-sm yeməklər üzərində yerləşdirilib 18-22 h üçün və ya 60-ə qədər 70% birləşməyə qədər inkubasiya edildi. HEK293T hüceyrələri jetPEI transfeksiyon reagentini (QBiogen) istifadə edərək pAAV-DIO-CHR2-EYFP, pAAV-DJ və pHelper ilə transfekte edilmişdir. DNT / DMEM / PEI kokteyli, vorteksləşdi və 20 dəq üçün otaq temperaturunda inkübe edildi. Kuluçka sonrasında, her bir 15 sm çanaqa transfeksiyon qarışığı əlavə edildi. Transfekte edilmiş hüceyrələr transfeksiyadan sonra 48 h yığılmış və 0.5 h üçün 6750% sodyum deoksikolat (Sigma; D50) və 1014 ədəd / ml benzonaz nükleaz (Sigma; E37) ilə inkubasiya edilmişdir. 1 dəqiqə üçün xNUMXx-da santrifüqləşərək hücum zibilini çıxardıqdan sonra, supernatant bir 3000 mm PVDF (Millipore) filtrindən süzülür. AAV-DJ parçacıklarının təmizlənməsi HiTrap heparin affinity sütunları (GE Healthcare) istifadə edərək həyata keçirildi. AAV konsentrasiyası üçün, 15 molekulyar çəki kəsmə ilə Amicon ultra-0.45 santrifüj filter birimlərindən istifadə edilmişdir. Konsentrasiya edilmiş virus aliquoted və dondurulmuş -15 ° C-də saxlanması üçün. Son viral konsentrasiyalar 100,000 ~ 80 × 3 idi12 hər AAV üçün ml başına virus hissəcikləri.

Stereotaksik enjeksiyon və optik lif yerləşdirmə

Bədən ağırlığına qram başına 1.6 ul Zoletil və 0.05 ul xylazine (Rompun, Bayer) ip enjeksiyonları ilə heyvanlar anesteziya edildi və stereotaksik aparata yerləşdirildi (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). Virusların inyeksiyası üçün, 31 ulluqda (AP +2; ML ± 0; DV −1.7) 1.3 ul virusu NAc-a ikitərəfli şəkildə 4.5 ul / dəq sürətlə vurmaq üçün 0.1 ölçülü şpris iynəsi istifadə edilmişdir. İynə, inyeksiyadan sonra yavaş-yavaş çəkilmədən əvvəl 10 dəqiqə yerində qaldı. İmplantasiya üçün optik-optik kanula bir sirkoniya dəlikdən (diametri 1.25 mm və uzunluğu 4.5 mm) və optik lifin düz ucundan (diametri 200 µm) ibarət idi. D2-MSN-lərin işıqlandırılması üçün fiber-optik kanülün NAc-a implantasiyası virusların vurulmasından dərhal sonra həyata keçirilmişdir. Fiber optik kanülün implantasiyası üçün koordinatlar NAc-ı hədəf almaq üçün 0 ° (AP +1.7; ML ± 1.35; DV −4.2) bir açı idi. Optik elyafın bərkidilməsinə kömək etmək üçün iki vida, fiber optik kanülün implantasiya yerinin arxasına kəllə içərisinə bərkidildi. Fiber optik kanülü kəllədə düzəltmək üçün, kannulanın bazası ətrafında kəllə səthinə C&B Superbond (Sun Medical) tətbiq edilmişdir. C&B Superbond sərtləşdikdən sonra kanula tutucudan sərbəst buraxıldı və kanula və vintlərin ətrafına diş sementi (Poly-F, Dentsply) vuruldu. Kanülasyon sahəsinin ətrafındakı kəsiyi bağlamaq üçün Vetbond toxuma yapışdırıcısı (3 M, 7003449) istifadə edilmişdir. İmplantasiya edildikdən sonra siçanlara ardıcıl 5 gün ərzində antibiotiklər (Enrofloksasin, 12 mq / kq, q 5 saat) və analjeziya (Karprofen, 24 mq / kq, q 3 saat) dərialtı enjeksiyon edildi.

In vivo fotostimulyasiya

Bir 200 μm patch cord, bir qolu istifadə edərək, xronically implantable optik fibrin xarici hissəsinə qoşuldu. Optik liflər mavi lazer diyota (473 nm, MBL-III 473-150 mW) bir FC / PC adapter vasitəsilə əlavə edildi və bir stimulyator vasitəsilə BNC 575 vasitəsilə işıq pulsları yarandı. ChR2-ifadə nöronların fotostimulyasiyası üçün, stimullaşdırma paradiqması 20 Hz tezlik, 5 ms puls müddəti və 2-5 mW işıq qüvvəsi idi. Yamaq kordundan çıxarılan işıq enerjisi S100C işıq sensoru ilə bir güc metr (PM121D) istifadə edərək ölçülür.

Davranış təhlili

2-11 həftəlik elektrofizyoloji analizinə məruz qalan siçan istisna olmaqla, 13-5 həftəsində kişi D6-Cre siçanları ilə davranış təcrübəsi edildi. Yaşa uyğun D2-Cre və Cre negativ nəzarət siçanları virusu enjekte etmiş və fərdi şəkildə yerləşdirilmiş və davranış testinə qədər qəfəsə uyğunlaşmağa icazə verilmişdir. Hər bir manipulyasiya üçün siçanlar təcrübə başlamazdan əvvəl sınaqdan əvvəl 60 dəqiqəyə köçürüldü və həssaslığa imkan verdi və stressi azaltdı (eksperiment otağının parlaqlığı 70 lüks idi). Hər bir eksperimental aparat hər hansı bir potensial koku istəklərini aradan qaldırmaq üçün təcrübələr arasında 70% etanol ilə təmizlənmişdir.

Kokain həssaslaşması

Kokain həssaslaşmasının başlaması üçün siçanlar 3 ardıcıl günlər üçün salin enjeksiyonlarına (ip) alışmışlar və sonra salin və ya kokainlə (15 mg kq-1, ip) 5 ardıcıl gün üçün. Siçanlar bir 0.9 G iynəsi ilə salin (30% NaCl) və ya salin ildə həll edilən kokain hidroklorür (Johnson Mattney, Edinburgh, UK) ilə intraperitoneally (ip) enjekte edilmişdir. Hər bir inyeksiyadan dərhal sonra siçanlar 30 dəqiqə üçün açıq sahə kamerasında üfüqi lokomotor fəaliyyəti üçün test edilmişdir. Fotostimulyasiya effektinin həssaslaşdırmanın başlanması və ifadə edilməsinə təsiri üçün (Şəkil (Şəkilâ € <â € <â € <5), 5) ev sintezində 3 min seans zamanı dörd 30-min dövr üçün NAc üzərinə ikiqat fiber-optik yamaq kordları vasitəsilə ikitərəfli mavi işıqlandırma verildi. Siçan kəlləsindəki fiber optik kanülün patch kordları çıxarıldı və siçanlara ən azı 10 dəqiqə istirahət verildi. Siçanlar sonra kokain və ya şoranla (coc 1d-coc 5d) enjekte edilmişdir. Həssaslaşdırma başladıqdan sonra, kokain 14 gün istənilən şoran salınması olmadan geri çəkildi. Bu çəkiliş dövründə fotostimulyasiya edilməmişdir. Kokainə davranış həssaslığının ifadəsi daha sonra narkotik maddə dozasının (10 mg kq-1, ip) şəklində göstərildiyi kimi NAc fotostimulyasiyasından sonra Şəkil 5A.5A. Kokain çəkilmə dövründə fotostimulyasiya təsirini ölçmək üçün (Şəkil (Şəkil 6), 6), siçanlar yuxarıda təsvir edilən həssaslaşdırma üçün eyni protokuma məruz qalıblar (Şəkil Şəkil 5) 5) fotostimulyasiya istisna olmaqla verildi. Kokain həssaslığının başlamasından sonra 1 günün ümumi çəkilmə müddəti ərzində 14 h üçün hər gün NAc-ə fotostimulyasiya tətbiq edilmişdir. 14 gün çəkildikdən sonra, bütün siçan qrupları kokainin dozaj dozası ilə enjekte edildi (10 mg kg-1).

Şəkil 1 

Nucleus accumbens-də orta spiny nöronların seçmə fotostimulyasiyası. (A) AAV-DIO-CHR2-EYFP viral vektorlarının çatdırılması ilə NAc D2R nöronlarında ChR2-in seçmə ifadəsi. ölçülü çubuklar: fon rəqəmi, 1 mm: insert, 200 μm. (B) Konfokal şəkillər ...
Şəkil 2 

D2RCre-MSN-lərin fotostimulyasiyası yerli inhibitor sxemləri idarə edir. (A) Canlı bir NAc diliminin konfokal görünüşü, ChR2 və ChR2 ifadəsini əks etdirən qonşu hüceyrə (ok başlığı) ifadə edən və fotostimulyasiya edilə bilən bir boya dolu nöronu göstərən. (B) IPSC ...
Şəkil 3 

NAc hüceyrələrinin xüsusiyyətləri. (A) Alexa 594 ilə dolu nöronların iki fotonlu floresans görüntüsü. (A1) isə ChR2 + / AP qrupundan bir nöron göstərir (A3) ChR2- / IPSC qrupundan bir nöron göstərir. (A2) və (A4) yüksək olan böyütmə şəkilləri ...
Şəkil 4 

NAX-də D2-MSN-lərin in vivo optogenetik aktivliyini bazal lokomotor fəaliyyəti üzərində təsiri. (A) AXA-DIO-CHR2-EYFP ilə NAc-ə yoluxan D2 Cre siçanlarının sagittal görünüşü, fiber optik kanülün ikiqat implantasiyası. 473 nm mavi yüngül stimullaşdırılması ...
Şəkil 5 

D2-MSN aktivliyini həssaslaşdırma zamanı kokainə təsirləri. (A) D2-MSN-lərin fotosintezləşdirilməsi üçün eksperimental sxem kokainə həssaslığın başlanması və ifadə edilməsi zamanı. Mavi işıqlandırma (2 ~ 5 mW, 5 ms, 20 Hz) dörd ...
Şəkil 6 

D2-MSN'in geri çəkilmə zamanı təkrar kokainə məruz qalmasına təsirləri. (A) D2-MSN-ə kokain çəkilmə zamanı fotoşəkil stimullaşdırılması üçün eksperimental sxem. Mavi işıqlandırma (2 ~ 5 mW, 5 ms, 20 Hz) səkkiz 3-min dövr üçün çatdırıldı ...

Immunofluoresans və konfokal lazer mikroskopiyası

İmmunofluoresans üçün, siçanlar Zoletil (Virbac, 1.6 μl / g, intraperitoneal) və 0.05 μl / g Rompun (Bayer) ilə anesteziyaya məruz qalıb və 0.1% paraformaldehid / PBS həlli (Sigma) istifadə edərək fiksasiya edilmiş süzülmüş 4 M PBS ilə perfüze edilmişdir. Beyin yuxarı qaldırıldı və yuxarıda göstərildiyi kimi, buzlu buzlanma ilə 4 h üçün təyin edildi. Beyinlər 30 gün ərzində 0.1% sukroz / 2 M PBS-də susuzlaşdırıldı. Braunlar daha sonra dondurulmuşdur və xiyarx-mim-qalın ardıcıl koronal bölmələr bir kriyostat (Leica CM 40, Almaniya) üzərində hazırlanmışdır. 1900% normal keçi serumu və 40% Triton X-1 olan 0.1 M PBS (5 μm) bölmələri (0.2 μm) gecə 100 ° C'de quş poliklonal anti-D2R (1: 500, Millipore, AB5084P) ilə inkubasiya edilmişdir. 4% Triton X-0.2 olan PBS ilə yuyulduktan sonra, nümunələr Alexa Fluor 100 keçi anti-quyon IgG (1: 568; Molekulyar Problar, Eugene, OR, ABŞ) və 1 μl / ml 500 ilə 0.2 h üçün RT-də inkubasiya edilmişdir, 4% normal keçi serumu və 6% Triton X-2 olan PBS-də 1-diamidino-0.2-fenil-indol HCl (DAPI, Sigma, Sent-Luis, MO, ABŞ). Mənfi bir nəzarət olaraq nümunələr yalnız DAPI və ikincil antikorla inkubasiya edilmişdir. Bölmə C100 Planı Apo × 1 / 40 su konfokal lazer tarama sistemi (LSM 1.4, Zeiss, Berlin, Almaniya) üzrə müayinə olundu.

Nucleus accumbens dilimində elektrofizyoloji və fotostimulyasiya

Siçanlar, ChR4-EYFP'nin optimal ifadəsinə nail olmaq üçün, virusun enjeksiyonundan 2 həftə sonra eksperimentlər üçün istifadə edilmişdir. Siçanlar daha sonra ağrılı beyin dilimlərinin hazırlanması üçün anesteziya və dekapitasiya edildi. Beyin dərhal çıxarıldı və dərhal (mM) içində olan buzlu soyu kəsmə həllində yerləşdirildi: 250 Sucrose, 26 NaHCO3, 10 D-Qlükoza, 3 Myo-inositol, 2.5 KCl, 2 Na-piruvat, 1.25 NaH2PO4, 0.5 Askorbik turşusu, 1 Kynurenic turşusu və 7 MgCl2 95% O ilə bubbled olan2/ 5% CO2 (pH = 7.4). NAc olan koronal beyin dilimləri (250 μm qalınlığı) bir vibratome (Leica VT 1200 S) istifadə edərək hazırlanmış və daha sonra (mM-də) olan 11 D-qlükoza, 125 NaCl, 25 NaHCO (mM) içərisində olan qazlı süni serebrospinal maye (ACSF)3, 1.25 NaH2PO4, 2.5 KCl, 1.25 MgCl2 və 2.5 CaCl2 34 ° C-də 1 h-ə qədər qeyd etmədən əvvəl. Dilimlər daha sonra O olan bir submersion qeydiyyat kamerasına köçürülür2doymamış ACSF həlli daim superfused idi. NAc və VTA-da hüceyrələr bir 2X suya batan lens və infraqırmızı DIC optik ilə təchiz olunmuş bir 1000-foton mikroskopu (Olympus FV25 MPE, Tokio, Yaponiya) istifadə edərək görüntülendi. Bütün hüceyrəli yama yastığı qeydləri, çoxcıllamlı 700B gücləndiricisi və Digidata 1440A digitizer (Molecular Devices, LLC) ilə NAc hüceyrələrindən əldə edilmişdir. Data pCLAMP 10.2 proqramı istifadə edərək nümunə alınmış və Clampfit 10.2 proqramı (Molecular Devices, LLC) istifadə edərək təhlil edilmişdir. 3-5 MΩ arasındakı müqavimətli patch elektrodları mM içərisində olan bir daxili həll ilə doldu: 130 K-gluconate, 2 NaCl, 2 MgCl2, 20 HEPES, 4 Na2ATP, 0.4 Na3GTP, 0.5 EGTA və 10 Na2- 7.3 N KOH istifadə edərək pH 1-ə düzəldilmiş fosfokreatin. Təcrübələrin bir hissəsində GABA reseptorlarını bloklamaq üçün bikukullin (10 µM) beyin diliminə hamam tətbiq edilmişdir.

CHR2-EYFP ifadə edən NAc hüceyrələri bir LED işıq mənbəyi (460 ± 27 nm, UHP-Mic-LED-460, Prizmatix) tərəfindən fotostimulyasiya edilmişdir. LED-dən gələn mavi işıq, bir həyəcan süzgəsi (470-495 nm) ilə təchiz edilmiş bir filter kub ilə daha süzülmüş və zəiflədilmişdir; işıq flaşları (10 ms uzunluğu, 0.0366-0.354 mW / mm2) 25-5 Hz frekanslarında 40X obyektiv lens vasitəsilə beynin diliminə təslim edilmişdir. Eksperimentlərin bir alt hissəsində, fotovoloqlar 2 s müddəti işıqlarına cavab olaraq ChR2-ifadə edən hüceyrələrdə ölçüldü.

Statistik təhlili

Məlumatlar vasitələrlə təqdim edilir və iki quyruqlu Tələbə ilə analiz edilir t- Bonefroni tərəfindən izlənilən və ya iki tərəfli variance təhlili ilə test post hoc test. A P-0.05 dəyəri statistik olaraq əhəmiyyətli hesab edildi.

Nəticələr

Nucleus accumbens-də orta spiny nöronların seçmə fotostimulyasiyası

NAc D2R-MSN'lerin kokain aracılı bağımlılık davranışlarında rolünü belirlemek üçün, NAc D2R nöronlarını uyarmak üçün optojenetik bir yaklaşım kullanıldık. NAc-da D2R-MSN-lərin fəaliyyətini selektiv şəkildə nəzarət etmək üçün AAV-DIO-ChR2-EYFP kodlayan virus vektorları D2R-Cre BAC transgenik siçanlarının NAc-na stereotaksial olaraq enjekte edilmişdir. Virusların enjeksiyonundan 4 həftə sonra, NAX-da CHR2-EYFP'nin sağlam ifadəsi müşahidə edildi (Şəkil (Şəkil1A) .1A). D2R-MSN'lərdə ChR2 ifadesinin özgüllüğü immunofluoresans konfokal analizi ile doğrulandı: YFP-tagged ChR2 ifadesi NAc'de D2R ile birlikte lokalize edildi (Şekil (Şəkil 1B), 1B), ChX2-in NAX-də D2R-ifadə nöronlarla ifadə edildiyini göstərir.

Belə bir yanaşma digər tədqiqatlarda istifadə olunsa da (məsələn, Lobo və digərləri, 2010), virus müdaxilə prosedurlarının detalları bir laboratoriyadan digərinə dəyişir, bu, xüsusi eksperimental şərtlər altında optogenetik nəzarəti sənədləşdirmək üçün vacibdir. NAc dilimində MSN-dən bütün hüceyrə yamaq sıxma qeydləri edərək ChR2 funksional ifadəsini qiymətləndirdik. MSNlər tərəfindən müəyyən edilmişdir: (1) nisbətən hiperpolarizasiya edilmiş istirahət zarı potensialı (RMP), tipik olaraq -80 mV-dan daha çox mənfi; (2) tətbiq olunan cərəyan impulslarına cavab verən müntəzəm AP qurğusu; (3) cari nəbz dövründə ilk AP-nin atılmasına uzun gecikmə; (4) bir hiperpolarizasiya ilə aktivləşdirilmiş kation cərəyanının səbəb olduğu hiperpolarizasiya zamanı "sag" bir gərginlik olmaması (Ih); və (5) onların hüceyrə orqanlarının nisbətən kiçik ölçüsü (Chang və Kitai, 1985; O'Donnell və Grace, 1993; Le Moin və Bloch, 1996; Taverna və digərləri, 2008). Mavi işıq (470 nm) bütün görünüş sahəsi üzərində tətbiq edildi (0.78 mm2) MSN-lərin -69 mV tutma potensialına gərginlik bağladıqda. Bəzi MSN-lər CHR2-ni ifadə edirlər, YFP-lərin sümatında flüoresans kimi aydındırlar (Rəqəmlərdə oxlar) 1C1, C3). Belə neyronlar əhəmiyyətli fotoqrafik səthlər nümayiş etdirdi, daha parlaq işıq stimulları isə daha böyük fotoqrafik cərəyanlara səbəb oldu (Şəkil (Şəkil1D) .1D). Pik fotokorus amplitudası və işıq şiddəti arasındakı əlaqə (Şəkil (Şəkil1E) 1E) 0.054 ± 0.0023 mW / mm yarım maksimal işıq həssaslığına malik idi2 və 1.16 ± 0.16 nA (ortalama sem, n = 4).

Cari siqnal şəraitində, ÇS2-ni ifadə edən MSNlər, yüngül zərbələrin qatarlarına (10 ms müddəti, Şəkil Şəkil1F) .1F). Bu şərtlərdə, 0.1 mW / mm-dən çox olan işıq zəiflikləri2 AP-lərin gətirilməsi üçün kifayət idi (Şəkil (Şəkil 1G, 1G, n = 5). AP'ler 20 Hz-ə qədər fotostimulyasiya frekanslarında etibarlı şəkildə uyğundur, 40 Hz-də isə yüngül səbəblərə cavab verən cavablar AP-lərin evakuasiya edilməsində daha az təsirli olan davamlı depolarizasiyaya səbəb oldu 1F, G).

D2R-MSN-lərin fotostimulyasiyası yerli inhibitor sxemləri idarə edir

D2R-MSN-lərin NAc-də yerli sxemlərdə fəaliyyətinin nəticələrini araşdırmaq üçün ChR2-mənfi MSN-lərdə postsinaptik cavabların ölçülməsi zamanı CHR2 ifadəsini ifadə edən msformimed MSN (Şəkil2A) .2A). Şəkil göstərilən nöron Şəkil 2A2A EYFP floresansının olmaması ilə birlikdə göstərildiyi kimi, ChR2 də ifadə edilmir, eləcə də Şəkil göstərildiyi kimi qısa gecikmeli fotoqrafik cərəyanların olmaması Şəkil 1D.1D. Lakin, postsinaptik MSN-69 mV potensialı kimi tutulduqda, 10 ms duration işığı 9.0 ± 0.42 ms gecikməsindən sonra uyarılmış xarici cərəyanları yanıb-söndürür (Şəkil (Şəkil 2B, 2B, n = 15). Bu cavabların təbiətini müəyyən etmək üçün postsinaptik membran potensialı -99 mV -39 mV-ə qədər fərqləndi, işıq flaşları tətbiq edildi (Şəkil (Şəkil2C) .2C). İşığın səbəb olduğu cavablar membran potensialı ilə fərqlənir (Şəkil (Şəkil 2D, 2D, n = 6) və 81 ± 3.4 mV-da qütblərini geri çevirdi. Xlorid ionları üçün bərabərlik potensialı bizim ionik şərtlərimizə uyğun olaraq -80 mV-dir, nəzərə alsaq ki, yüngül işlədilmiş xarici cərəyanlar postynaptic GABAA reseptorları. Bu ehtimalları yoxlamaq üçün GABAA reseptor antagonist bicuculline (10 μM) xarici həllinə əlavə edildi. Bu narkotik tamamilə yüngül səbəblərdən cavablandırdı (Şəkil (Şəkil 2B), 2B) işıq səbəbli cavabların GABAergik inhibitor postsinaptik cərəyanlar (IPSC) olduğunu təsdiqləyib.

Fotostimulyasiyaya olan cavablarına əsasən, qeyd etdiyimiz MSNlər 4 qruplarından birinə təsnif edilə bilər: (1) hüceyrələr yuxarıda təsvir olunan fotostimulyasiya (ChR2 + / AP) cavab vermək üçün AP-ləri yanğın üçün kifayət qədər miqdarda CHR2 ifadə edir; (2) hüceyrələr kiçik bir miqdarı ifadə edən ChR2, işığa cavab olaraq bir alt eşdeğer depolarizasyonunu ortaya qoydu (ChR2 + / No AP); (3) səssiz hüceyrələr ChR2 ifadəsi olmayan, lakin CHR2 (ChR2- / IPSC) ifadə edən presynaptic MSN-lərdən yüngül səbəb olan IPSC'leri qəbul etmişdir; və digər xanımların fotostimulyasiyasına cavab olaraq IPSC-ni nümayiş etdirməyən (4) ChR2-mənfi hüceyrələr (ChR2- / No IPSC). Bu kateqoriyaların hər birində hüceyrələrin nisbi nisbəti Şəkildə göstərilmişdir Şəkil 2E2E (n = 53). Ümumiyyətlə, hüceyrələrin təxminən yarısı (45.3%) CHR2 (qrupların (1) və (2)) cəmini ifadə edir. Biz qeyd etdiyimiz MSN-lərdən heç biri fotostimulyasiyaya cavab olaraq həm fotoqrafik, həm də IPSC-lər nümayiş etdirmişdir; bu, D2R pozitiv MSNlərin NAc daxilində eyni hüceyrə əhalisinin digər üzvlərini innerve etmədiyini göstərir.

İşığa verilən cavabların bu təsnifatı göstərir ki, ChR2 + / No AP hüceyrələrinin (qrup 2) və CHR2- / No IPSC hüceyrələrinin (qrup 4) fotostimulyasiyası dövriyyəyə təsir göstərə biləcək hər hansı bir elektrik siqnalı yarada bilməz. Beləliklə, fotostimulyasiyanı devre funksiyasına təsirlərini müəyyən etmək üçün, biz NAc fotostimulyasiya edildikdə AP yaratmaq üçün ChR2 + / AP MSN-lərin (1 qrupu) xüsusiyyətlərini ətraflı təsvir etmişik və CHR2- / IPSC hüceyrələri (3 qrupu) onlar yüngül səbəbli IPSC qəbul çünki CHR2 + / AP MSNs üçün postsynaptic var. NAc'teki CHR2 + / AP və CHR2- / IPSC hüceyrələri həm spiny neuronlar (Şəkil (Şəkil3A) .3A). Bu iki qrupda neyronların morfoloji və elektrofizioloji xüsusiyyətlərində əhəmiyyətli fərqlər yox idi. Məsələn, bu iki qrupdakı nöronların sümüyü ölçüdə bənzər idi (Şəkil (Şəkil3B) .3B). Bundan əlavə, onların RMPs (-83.0 ± 1.7 vs. 85.0 ± 1.8 mV; n = 10, Şəkil Şəkil 3C) 3C) və giriş müqavimətlərinə (113 ± 15 vs. 133 ± 13 MΩ, n = 6, Şəkil Şəkil 3D) 3D) də fərqlənmədi (p > 0.05 iki quyruqlu Tələbə t-test), onların cari atışlarına cavab olaraq AP-lərin nümunələri (Rəqəmlər 3E, F) də oxşar idi (p > 0.05 iki quyruqlu Tələbə t-test, n = 6). Xülasə, NAX-da D2R-MSN-lərin fotostimulyasiyası D2R-MSN-lərə çox oxşar olan, lakin D2R-ni ifadə etməyən postsinaptik neyronlarla yerli inhibitor sxemləri aktivləşdirir.

NAc D2R-MSN-lərin kokainlə əmələ gələn davranış həssaslığının optogenetik stimullaşdırılması

Daha sonra davranış nəticələrini araşdırdıq vivo ilə NAc D2R-MSN-lərin fotostimulyasiyası. Dorsal striatumda D2R-MSNlərin fotostimulyasiyası lokomotor fəaliyyəti azaldığından (Kravitz et al., 2010), biz Dumbus D2R-MSN aktivasiyasının bazal lokomotor fəaliyyətinə təsirlərini xarakterizə edərək başladık. Bu məqsədlə, D2R-Cre siçanı DIO-AAV-ChR2-EYFP virusu ilə ikitərəfli olaraq NAc (D2-Cre (+) NAc-ChR2) 'ye enjekte edilmişdir. D2R-MSN'ler daha sonra mavi işıq (473 nm, 5 ms pulse müddəti, 20 Hz) ilə optik fiber vasitəsilə NAc-ə təslim edilmiş fotostimulyasiya edilmişdir. Photostimuli, sükunların lokomotor fəaliyyəti qeyd kamerasında saxlandığı zaman 3 min sessiyasında dörd 50 dəqiqlik dövr ərzində tətbiq olundu (Şəkil (Şəkil4A) .4A). Buna paralel olaraq, Cre-dən olmayan Cre WT littermate siçanları eyni şəkildə virusla birləşdi və oxşar mavi işıqlandırma işıqlandırdı. D2-Cre (+) NAc-ChR2 siçanları nəzarət D2R-Cre (-) NAc-ChR2 siçanlarına nisbətən müqayisədə və ya bir qədər yüksəlmiş bazal lokomotor fəaliyyət səviyyəsini nümayiş etdirdi (Şekiller 4B, C). D2R-MSN-də D2R-MSN (+) NAc-ChR2 siçanlarında fotostimulyasiya işıq stimuli dayandırıldıqdan sonra bərpa olunan lokomotor aktivliyin əhəmiyyətli dərəcədə azalmasına gətirib çıxardı (Şəkil (Şəkil4B) .4B). D2R-Cre (-) NAc-ChR2 siçanlarının nəzarətində bu cür təsirlər müşahidə edilməmişdir (Şekiller 4B, C) fotostimulyasiya təsirlərinin beyin toxumasının istiləşməsi kimi qeyri-spesifik təsirlərdən daha çox, ChR2-in aktivasiyası ilə nəticələndiyini bildirir. Buna görə də, məlumatlar NAc-da D2R-MSN-lərin fotostimulyasiya edilməsinin lokomotor fəaliyyətdə azalma olduğunu bildirmişdir.

Bu nəticələr, NAc daxilində D2R-MSN-lərin fəaliyyətini nəzarət etmək bacarığımızı yaratdı vivo ilə. Bundan sonra bu qabiliyyəti D2R-MSN fəaliyyətinin davranış həssaslığına təsirinin kokain təkrar idarə edilməsinə təsirini araşdırmaq üçün istifadə etdik. Davranış həssaslığı, sonrakı dərman pozuntularının lokomotor aktivliyi stimullaşdırmaq üçün qabiliyyətini artırmaq üçün kokain kimi psixostimulyantlara başlanmasına imkan verən prosesə aiddir. Bu proses başlanğıc və ifadə fazalarına ayrılır: başlanğıc davranış həssaslığını (Vanderschuren və Kalivas, 2000; Sim və digərləri, 2013) ifadəsi, narkotik maddənin çəkilməsindən sonra davam edən uzun müddət davam edən davranışçı bir plastisiyadır (Vanderschuren və Kalivas, 2000; Sim və digərləri, 2013). Buna görə də, bu mərhələlərin hər biri zamanı NAX-da D2R-MSNlərin fəaliyyətini nəzarət etmək üçün optogenetika istifadə edərək təkrar intraperitoneal (ip) kokain enjeksiyonu zamanı kokainlə bağlı davranışçı həssaslıqları araşdırdıq.

3 gün ərzində salin enjeksiyasına alışqanlıqdan sonra siçanlar 15 ardıcıl gündə kokainlə (5 mg / kq) enjekte edildi və hər bir enjeksiyondan sonra 30 min üçün lokomotor reaksiyalar qeyd edildi (Şəkil (Şəkil5A) .5A). Photostimuli 30 min sessiya zamanı 3 min dövrlərdə 5 min dövrlərdə işıq söndürüldükdə, XNUMX min dövrləri interspersing əvvəl kokain enjeksiyon əvvəl təslim edildi (Şəkil (Şəkil5A) .5A). NAc-da D2R-MSNlərin fotostimulyasiyası bazal lokomotor fəaliyyəti azaldılıb (Şəkil (Şəkil 4), 4), kokain enjeksiyasına qarşı davranışlara qarşı müdaxilənin qarşısını almaq üçün photostimuli kokain tətbiqindən dərhal təslim edildi.

Hər iki nəzarət D2-Cre (-) NAc-ChR2 siçanı və D2-Cre (+) NAc-ChR2 siçan təkrarlanan kokain inyeksiyalarına cavab olaraq lokomotor fəaliyyətdə əhəmiyyətli bir artım göstərdi (Şəkil (Şəkil 5B), 5B), həssaslığın başlanmasını göstərən. NAX-da D2R-MSN-lərin fotostimulyasiyası D2-Cre (+) NAc-ChR2 siçanlarında və D2-Cre (-) NAc-ChR2 siçanında nəzarətdə olduğu üçün kokainlə əmələ gələn davranış həssaslığının oxşar olduğu üçün davranışçı həssaslığın başlanmasına təsir göstərməmişdir.

15 gün üçün bu cür kokain (5 mg / kg) enjeksiyonunu təkrarlayaraq davranışçı həssaslaşdırma aparıldıqdan sonra dərman 14 gün üçün geri çəkildi və həssaslaşmanın ifadə dərəcəsi siçanları aşağı dozda bir kokain (10 mg /kq). Həssaslaşdırma ifadəsi narkotikdən çəkildikdən sonra davam edən uzun müddət davam edən davranış plastisitəsidir (Steketee və Kalivas, 2011; Sim və digərləri, 2013). D2R-MSN-lərin həssaslığın ifadə edilməsində rolunu araşdırmaq üçün NAc kokain tətbiqindən dərhal fotostimulyasiya olunmuşdu (Şəkil (Şəkil 5A) 5A) və həssaslaşdırma, kokainin enjeksiyasına səbəb olan lokomotor aktivlik miqdarı olaraq ölçüldü.

D2-Cre (+): D2-Cre (-) NAc-ChR2 farelerinde (D2-Cre (-) :: coc-coc) ve D2-Cre (+): : coc-coc) - həssaslaşmanın qeyri-müəyyən ifadəsi meydana gəldi (Şəkil (Şəkil5C) .5C). Kokain stimulyasiya edilmiş lokomosma dəyişikliklərinin gedişatı iki qrup arasında da oxşar idi (Şəkil (Şəkil 5C), 5C), iki qrup arasında əhəmiyyətli bir fərq gözləməmişdir. Birlikdə qəbul edilən bu iki fotostimulyasiya təcrübəsi NAc-da D2R-MSNlərin aktivləşdirilməsinin kokainlə əmələ gələn davranışçı həssaslığın başlanmasına və ya ifadə edilməsinə təsir göstərməyəcəyini göstərir.

Dərman çəkərkən NAc D2R-MSN-lərin fotostimulyasiyası

Yenidən təkrarlanan kokain pozuntusundan sonra dərmanların çəkilmə zamanı xroniki stress Strukturda NAc-da sinaptik plastisitə dəyişiklikləri ilə birlikdə kokain axtarış və nüksedici davranışlardakı stresə səbəb olan artımı nəzarət edən D2R-asılı adaptasiya mexanizminin seçilməsi ilə nəticələnir (Sim və digərləri, 2013). Bu, narkotik maddənin götürülməsi ilə məşğul olan mexanizmlərin narkotik maddə ilə ittiham olunan sensitizasiyadan fərqli olduğunu göstərir. Bundan ötəri, kokain çəkilmə zamanı NAc-da D2R-MSN-lərin fotostimulyasiya edilməsinin kokainlə əmələ gələn davranışçı həssaslığının ifadə olunmasına təsir göstərməyəcəyini araşdırdıq.

2 gün çıxarılma müddəti üçün D2-Cre (-) və D14-Cre (+) siçanları iki qrupa bölünmüşdür: bir qrup gündəlik mavi işıqlandırmaya məruz qalmışdır. 1 h üçün NAc (3 min × 8 dəfə), digər qrup isə (Şəkil (Şəkil6A) .6A). D2R-MSN-lərin kokain çəkilməsində NAc-da təkrarlanan fotostimulyasiyası D2-Cre (-) :: coc-coc siçanlarında sensitizasiya ifadəinə təsir etməmişdir (Şəkil (Şəkil6B) .6B). Əksinə, D2-Cre (+) :: coc-coc siçanlarında, həssaslaşdırma ifadəsi dərman çəkilməsində təkrar fotostimulyasiya ilə zəiflədi (Şəkil (Şəkil 6B), 6B), baxmayaraq ki, lokomozanın kokain-stimulyasiyasının stimullaşdırılmasının vaxtından asılı olmamışdır (Şəkil (Şəkil6C) .6C). Beləliklə, D2R-MSN'lerin narkotik maddənin çıxarılması zamanı NAc-nin fotostimulyasiyası kokain-əmələ gələn davranışçı həssaslaşmanın ifadəsini azaldır (kokain x şəkli stimullaşdırıcı təsir F(1,18) = 11.08, P = 0.0037, Şəkil Şəkil6B) .6B). Bu məlumatlar göstərir ki, D2R-NAc MSN-lərin narkotik maddənin çıxarılması dövründə aktivləşdirilməsi kokain axtarış və relaps davranışlarına təsir göstərir.

Müzakirə

Əhəmiyyətli sübutlar göstərir ki, kokainlə əlaqəli davranış həssaslaşması ventral tegmental bölgəni, prefrontal korteks və nüvəli akumbensləri (NAc) olan mesokortikolimbik sistemdə inkişaf etmiş dopaminergik ötürülmə ilə bağlıdır. Xüsusilə, davranışçı həssaslaşmanın ifadə mərhələsi dərmanın dayandırılmasından sonra adaptiv mexanizmlərin bir təsviri ilə əlaqəli olan (Kalivas və Duffy, 1990; Robinson və Berridge, 1993; Kalivas və digərləri, 1998) kompulsif narkotik intizoruna kömək edə biləcək (Robinson və Berridge, 1993; Kalivas və digərləri, 1998; Steketee və Kalivas, 2011). NAc içərisində molekulyar, hüceyrəli və davranışçı plastisiyədə, MSN-də qəbul edilən DA reseptoru ilə əlaqəli kokainlə bağlı dəyişikliklər dərman vasitəsi ilə əlaqəli addictive davranışları tənzimləyə bilər (Lobo və digərləri, 2010; Schmidt və Pierce, 2010; Ferguson və digərləri, 2011; Pascoli et al., 2011; Bocklisch et al., 2013; Grueter et al., 2013).

Kreynin rekombinasiyasını şərti olaraq ifadə edən genetik cəhətdən süni siçanlardan istifadə edən son tədqiqatlar kokainin asılılıq davranışlarında D1R-MSN və ya D2R-MSNlər üçün rol oynayıb. 1 gün təkrarlanan kokain tətbiqindən sonra NAc-nin D6R-MSN-ların optogenetik aktivasiyası lokomotor fəaliyyəti artırır, D2R-MSN-lərin aktivləşdirilməsi isə heç bir təsiri yoxdur (Lobo et al. 2010). Bu məlumatlar kokainə təkrar məruz qalmasının NAc-nin D1R-MSN-lərinin çıxışını artırdığını göstərir. D1R-nin MSN-lərini tetanoz toxin ilə ifadə etməsi (Hikida et al., 2010) kokain kondensasiya edilmiş yerin üstünlükünü (CPP) azaldır, D2R-MSN'lərdə sinaptik ötürülməni ləğv etdikdən sonra kokain CPP-də heç bir dəyişiklik müşahidə edilməmişdir (Hikida et al., 2010). Dorsal striatumda D1R-MSN-ların optogenetik aktivasiyası davamlı gücləndirməyə gətirib çıxarır, D2 reseptor ifadə edən neyronların stimulyasiya edən müddəti isə müvəqqəti cəzanı yaradır (Kravitz və digərləri, 2012). Son bir araşdırma da, D2R-MSN'lerin bir kimyojenetik yaklaşımla inhibe edilmesinin, kokain elde etme motivasyonunu artırdığı, D2R-MSN'in optogenetik aktivasyonu, kokain özünü idaresini baskılandığını bildirmiştir (Bock ve ark. 2013). Digər tərəfdən, Bocklisch et al. (2013) D1R-MSN'ler VTA'ya NAc layihəsinin, xüsusilə VTA içərisindəki GABAerjik neyronlara, D2R-MSN-lər isə doğrudan VTA-ya layihə vermədiyini bildirdi. Bu dövrdə D1R-MSN-ların optogenetik aktivləşdirməsi DA neyronları kəsir, nəticədə kokainə səbəb olan asılılıq davranışlarını artırır (Bocklisch və digərləri, 2013).

Bu iki MSN-lərin görünən sadə təşkilinə baxmayaraq, MSN-lər birdən çox giriş almış və digər beyin sahələrindən fərqli çıxışlar əldə etmişlər, həmçinin MSN və digər internöronların sinifləri arasında yerli sxemlərin formalaşması nəticəsində D1R- MSN və D2R-MSN-lər kompleks və müxtəlif molekulyar, mobil və davranışlı nəticələr əldə edə bilərlər.

Əvvəllər D2R narkotik dərhal çıxarılması nəticəsində yaranmış sinaptik dəyişikliklərə yardım göstərmiş və bu, ilk dərmanı əldə etmək və ya narkotik maddə axtarışına təsir etmədən kokain axtarışına nüfuzunu gücləndirmişdir (Sim və digərləri, 2013). Bizim indiki məlumatlar göstərir ki, NAX-da D2R-MSNlərin fotostimulyasiyası bazal lokomotor fəaliyyətdə azalma yaradır. Lobo et al. (2010) MSN subtype aktiv olduqda lokomosiyada heç bir dəyişiklik təsbit olunmadıqda, əksinə bazal lokomotor aktivliyin dərhal cavablarını fotostimulyasiyaya yoxlamaqdan yox, ümumi lokomotor fəaliyyəti nəzərdən keçirdilər. Kravitz et al. (2010Dorsal striatumda D2R-MSN-lərin optogenetik aktivləşməsi də lokomotor fəaliyyəti azaldığını aşkar etdi. Beləliklə, bizim məlumatlar NAc-nin D2R-MSNs fotostimulyasiyası ilə bazal lokomotor aktivliyin inhibə olunduğunu və ilk olaraq bu neyronların fotostimulyasiyasında bazal lokomotor fəaliyyətinin vaxtını sistematik olaraq yoxlamaq üçün göstəricidir.

Bu işdə, NAc-da D2R-MSN'lerin optogenetik aktivasyonunun davranışçı həssaslığın başlanmasına və ya ifadə edilməsinə təsir etmədiyini müşahidə etdik. Bununla birlikdə, D2R-MSN'lerin dərman çəkilmə dövründə fotostimulyasiyası, kokainin səbəb olduğu sensitizasyonun ifadə edilməsinə səbəb oldu. Buna görə də, məlumatlarımız D2R-MSN-lərin, gen ifadəsini və ya digər sinyalizasiya formasını dəyişdirmək üçün gedən və bununla da sinaptik plastisitə dəyişikliklərini tetikleyen, kokainlə əmələ gələn davranışçı həssaslaşmaya gətirib çıxaran, geri çəkmə dövründə xüsusi siqnal işə götürdüyünü göstərir. Bu MSNlər, asılılıqla əlaqəli davranışlarda fərqli nəticələr əldə edə biləcək hüceyrə tipli xüsusi uyğunlaşmaların necə istifadə edildiyi bilinmir. Grueter et al. (2013) NAc-da ΔFosB sinaptik xüsusiyyətləri və mükafatla əlaqəli davranışları bir hüceyrə tipi və subregiona uyğun şəkildə modullaşdırır. Son zamanlarda, Chandra et al. (2013) D2R-MSN-lərin təkrarlanan ChR1 aktivləşdirməsi, lakin D2R-MSN-lərin deyil, Tiam1 geninin, kokainin təsirinə bənzər aktin sitoskeletinin yenidən düzəldilməsində iştirak etdiyi bir proteinin aşağı tənzimləməsinə gətirib çıxardı. Buna görə də, dərmana səbəb olan davranışların uzunmüddətli təsirlərini təmin edən mexanizmləri anlamaq üçün bu MSN-lərdə molekulyar hadisələrin hüceyrə seçici induksiyasını təyin etmək vacibdir.

Təkrarlanan dərmana məruz qalması ilə əlaqədar olaraq, çəkilmə əhəmiyyətli bir rol oynamağa təklif edilmişdir, çünki bəzi dəyişikliklər kokainə son təsir göstərdikdən sonra yalnız bir neçə həftədən sonra görünür. Bu, qadağanlığın plastisiyanın inkişafında mühüm vasitədir (Robinson və Berridge, 2003; Boudreau və Wolf, 2005; Boudreau və digərləri, 2007; Kourrich və digərləri, 2007). Bu müşahidələr D2R-bağımlı sinyalizasiya nəzarəti altında olan NAc dəyişikliklər üçün özü çəkilmənin özü ola biləcəyi ehtimalı artırır. D2R-MSN-lərin narkotik maddələrin çıxarılması zamanı NAc-də aktivləşdirilməsinin kokainə səbəb olan davranış həssaslığına təsir göstərdiyini göstərən nəticəm bu fikri məcburi dəstəklə təmin edir.

Daha əvvəl narkotik maddənin çıxarılması zamanı stressə məruz qalması, D2R KO siçanlarında kokain ilə əlaqəli davranış həssaslığının və kokain axtarış və relaps davranışlarının ifadə edilməsini basdırdığını göstərmişdir (Sim və digərləri, 2013). Buna görə maraqlıdır ki, D2R-MSN-lərin narkotiklərin çəkilməsində fotostimulyasiyası da həssaslığın ifadəsini azaldır. Glutamategik sinapslarda stresə səbəb olan sinaptik plastisitə D2R KO siçanlarının NAc-də dəyişir (Sim və digərləri, 2013). D2R-nin fotostimulyasiyası və ya çəkilmə dövründə xroniki stressin sinaptik plastisiyədə oxşar dəyişikliklər yarada biləcəyi hələ bilinməməsinə baxmayaraq, indiki nəticələrimiz, NAX-nun D2R-MSN-lərinin çəkilməyə səbəb olan plastisitədə əsas rol oynadığına və Narkotik istifadəsinin dayandırılmasından sonra relaps. D2R MSN-lərin dərman çəkilməsində iştirak etdiyi və D2R-MSN-lərin fotostimulyasiya və xroniki stressin sinaptik plastisiyaya təsirinin bu xüsusi dövrdə analizi və müqayisəsini aparmaq üçün funksional neyron dövrələrin öyrənilməsi üçün daha çox istintaq tələb olunacaq.

D2R-ifadə edən MSN-lər üçün başqa bir mümkün rol NSX-dən D1R-MSNlərin çıxmasını maneə törətmək olar. Əvvəlki araşdırmalar göstərir ki, MSNlər uzundakı aksonları uzaq hədəflərə proqnozlaşdırırlarsa da, akson təminatları və bitişik parıltılı proyeksiya nöronlarının dendritik ağacları arasında geniş bir örtüşür (Grofová, 1975; Preston və digərləri, 1980; Wilson və Groves, 1980). Bu, NAc daxilində MSN üçün mümkün yerli sinaptik əlaqə göstərə bilər. Süni proyeksiyalı nöronların cütlər içərisində qeydlər siçovul striatumda (Czubayko və Plenz, 2002; Tunstall və digərləri, 2002; Koos və digərləri, 2004; Gustafson et al., 2006). D2R-MSN-lər digər D2R-MSN və D1R-MSN ilə synaptic əlaqələri yaradır, D1R-MSN-lər isə demək olar ki, yalnız digərləri ilə sinaptik əlaqələr yaradırlar. D1R-MSN (Taverna və digərləri, 2008). Yerli təkrarlanan aksonal kollagenlər arasında GABAergik birləşmə də uyğunlaşdırılmış MSNlər arasında da bildirilmişdir (Taverna və digərləri, 2004) hələ D2R-MSN-lərin yerli mikrosirkaların təsadüfi formada olub-olmadığını və ya striatumda olduğu kimi imtiyazlı birləşmə ilə NA-da mikrosirkulyasiyaya kömək etdiyinə hələ də aydın deyildir. Bizim məlumatlar göstərir ki, D2R-MSNs ChrxnumX-i ifadə edən qonşu MSN-lərin sinxronik əlaqələrini D2R ilə ifadə edir və D1R-MSN-lər D2-MSN-lərinə D1R vasitəsi ilə addictive davranışlarını təşviq etmək üçün mane olan əlaqə verirlər.

Sonuç olaraq, NAc D2R-MSN'in optogenetik aktivasyonunun, kokain bağımlılığı esnasında oluşan çekilmeye bağlı plastikleşmenin değiştirdiğini gösterdik. D2R-bağımlı siqnalın geri çəkilmə dövründə fəaliyyət göstərdiyini nəzərə alaraq, kokainlə əlaqəli davranış həssaslığının ifadəsinin əsas tənzimləyicisi kimi görünür, D2R-MSN-lər dərman vasitəsi axtarma və relaps üçün uzunmüddətli uyğunlaşma mühüm vasitəçisidirlər. D2R-bağımlı sinyalizasyonun molekulyar substratlarının identifikasiyası, təkrarlanan narkotik dərinliyi altında istifadə olunan NAc D2R-MSN-lərin xüsusi dövrəsinin müəyyən edilməsi ilə yanaşı, narkotik relapsına müdaxilə üçün yeni hədəflər təqdim etməlidir.

Maraqlılıq mübahisəsi

Müəlliflər bildirirlər ki, tədqiqat potensial münaqişələr kimi başa düşülə bilən hər hansı bir kommersiya və ya maliyyə əlaqəsi olmadıqda həyata keçirilir.

Minnətdarlıq

Bu iş Brain Araşdırma Proqramı (Ja-Hyun Baik, Grant No 2013M3C7A1056101) və Bio və Tibbi Texnologiya tərəfindən Elm Nazirliyi, İKT və Gələcək Planlaşdırma tərəfindən maliyyələşdirilən Koreya Milli Araşdırma Fondu (NRF) tərəfindən dəstəkləndi Elm, İKT və Gələcək Planlaşdırma Nazirliyi tərəfindən maliyyələşdirilən Koreya Milli Araşdırmalar Fondu (JRF) tərəfindən hazırlanan İnkişaf Proqramı (Ja-Hyun Baik, Grant No. 2013M3A9D5072550) və World Class İnstitutu (WCI) proqramı (George J. Augustine , WCI 2009-003), həmçinin Koreya Universitetinin Grant (Ja-Hyun Baik) və Sinqapur Milli Araşdırmalar Fondu (Corc J. Augustine) üçün CRP hədiyyə.

References

  1. Baik JH (2013). Ödülle bağlı davranışlarda dopamin sinyalleri. Cəbhə. Sinir Devreleri 7: 152 10.3389 / fncir.2013.00152 [PMC pulsuz məqalə] [PubMed] [Çaprazlıq]
  2. Baik JH, Picetti R., Saiardi A., Thiriet G., Dierich A., Depaulis A. və digərləri. (1995). Dopamin D2 reseptorları olmayan siçanlarda parkinsoniyalı lokomotor pozğunluq. Təbiət 377, 424-428 10.1038 / 377424a0 [PubMed] [Çaprazlıq]
  3. Berridge KC (2007). Dopaminin mükafatdakı rolu ilə əlaqədar müzakirə: təşviq zəifliyi. Psixofarmakologiya (Berl) 191, 391-431 10.1007 / s00213-006-0578-x [PubMed] [Çaprazlıq]
  4. Bock R., Shin JH, Kaplan AR, Dobi A., Markey E., Kramer PF və digərləri. (2013). Accumbal indirect yolunun gücləndirilməsi kompulsif kokain istifadə üçün möhkəmliyə kömək edir. Nat. Neurosci. 16, 632-638 10.1038 / nn.3369 [PMC pulsuz məqalə] [PubMed] [Çaprazlıq]
  5. Bocklisch C., Pascoli V., Wong JC, House DR, Yvon C., De Roo M. və digərləri. (2013). Kokain, ventral tegmental sahədə GABA ötürülməsinin potensiasiyası ilə dopamin nöronları ayırır. Elm 341, 1521-1525 10.1126 / science.1237059 [PubMed] [Çaprazlıq]
  6. Boudreau AC, Reimers JM, Milovanovic M., Wolf ME (2007). Hücre səthi sıçan nüvəsindəki AMPA reseptorları kokain çıxarılması zamanı artır, lakin mitogen aktivləşdirilmiş protein kinazlarının dəyişmiş aktivasiyası ilə birlikdə kokain problemindən sonra daxiliizasiya edir. J. Neurosci. 27, 10621-10635 10.1523 / jneurosci.2163-07.2007 [PMC pulsuz məqalə] [PubMed] [Çaprazlıq]
  7. Boudreau AC, Wolf ME (2005). Kokainə qarşı davranış həssaslığı, nüvə adacıklarında artan AMPA reseptor səthinin ifası ilə əlaqələndirilir. J. Neurosci. 25, 9144-9151 10.1523 / jneurosci.2252-05.2005 [PubMed] [Çaprazlıq]
  8. Chandra R., Lenz JD, Gancarz AM, Chaudhury D., Schroeder GL, Han MH, et al. (2013). D1R tərkibli nüvəli accumbens neyronlarının optogenetik inhibisyonu Tiam1-nin kokain vasitəsi ilə tənzimlənməsini dəyişir. Cəbhə. Mol. Neurosci. 6: 13 10.3389 / fnmol.2013.00013 [PMC pulsuz məqalə] [PubMed] [Çaprazlıq]
  9. Chang HT, Kitai ST (1985). Nüvənin akumbenslərinin proyeksiya neyronları: hüceyrə içi etiketləmə işi. Brain Res. 347, 112-116 10.1016 / 0006-8993 (85) 90894-7 [PubMed] [Çaprazlıq]
  10. Chausmer AL, Elmer GI, Rubinstein M., Aşağı MJ, Grandy DK, Katz JL (2002). DPamin D2 reseptor mutant siçanlarda kokain səbəb olduğu lokomotor fəaliyyəti və kokain ayrı-seçkiliyi. Psixofarmakologiya (Berl) 163, 54-61 10.1007 / s00213-002-1142-y [PubMed] [Çaprazlıq]
  11. Chevalier G., Deniau JM (1990). Striatal funksiyaların ifadə edilməsində əsas bir proses kimi disinhibisiya. Trends Neurosci. 13, 277-280 10.1016 / 0166-2236 (90) 90109-n [PubMed] [Çaprazlıq]
  12. Czubayko U., Plenz D. (2002). Striatal spiny proyeksiya nöronları arasında sürətli sinaptik ötürülmə. Proc. Natl. Acad. Sci. ABŞ 99, 15764-15769 10.1073 / pnas.242428599 [PMC pulsuz məqalə] [PubMed] [Çaprazlıq]
  13. Ferguson SM, Eskenazi D., Ishikawa M., Wanat MJ, Phillips PE, Dong Y., et al. (2011). Keçirilən nöronal inhibisyon həssaslaşmada dolayı və birbaşa yolların qarşı rol oynadığını göstərir. Nat. Neurosci. 14, 22-24 10.1038 / nn.2703 [PMC pulsuz məqalə] [PubMed] [Çaprazlıq]
  14. Goto Y., Grace AA (2005). Hedefli davranışlarda çekirdek akumbenslerin limbik ve kortikal sürüşünün dopaminerjik modülasyonu. Nat. Neurosci. 8, 805-812 10.1038 / nn1471 [PubMed] [Çaprazlıq]
  15. Grofová I. (1975). Əsas nigraya proqnozlaşdırılan striatal və pallidal nöronların müəyyən edilməsi. Horseradish peroxidase'in retrograd aksonal nəqli vasitəsi ilə eksperimental bir araşdırma. Brain Res. 91, 286-291 10.1016 / 0006-8993 (75) 90550-8 [PubMed] [Çaprazlıq]
  16. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC (2013). ΔFosB, nüvə adapterlərinin birbaşa və indirekt yolak funksiyasını fərqli olaraq modullaşdırır. Proc. Natl. Acad. Sci. ABŞ 110, 1923-1928 10.1073 / pnas.1221742110 [PMC pulsuz məqalə] [PubMed] [Çaprazlıq]
  17. Gustafson N., Gireş-Zarmaraj E., Czubayko U., Blackwell KT, Plenz D. (2006). In vitro striatal mikro dövrədə geribildirim və feedforward synaptic ötürülməsi müqayisəli gərginlik və cari analiz. J. Neurophysiol. 95, 737-752 10.1152 / jn.00802.2005 [PubMed] [Çaprazlıq]
  18. Hikida T., Kimura K., Wada N., Funabiki K., Nakanishi S. (2010). Sinaptik ötürülmənin fərqli rolları doğrudan və dolayı striatal yollarla mükafatlandırmaq və həssas davranışdır. Neuron 66, 896-907 10.1016 / j.neuron.2010.05.011 [PubMed] [Çaprazlıq]
  19. Kalivas PW, Duffy P. (1990). Kəskin və gündəlik kokain müalicəsinin hüceyrə dopaminə nüvəli akumbensə təsiri. Synapse 5, 48-58 10.1002 / syn.890050104 [PubMed] [Çaprazlıq]
  20. Kalivas PW, Pierce RC, Cornish J., Sorg BA (1998). Kokain asılılığının özünü və nəfəsindəki həssaslığın rolu. J. Psychopharmacol. 12, 49-53 10.1177 / 026988119801200107 [PubMed] [Çaprazlıq]
  21. Koos T., Tepper JM, Wilson CJ (2004). Neostriatumda sürünən və sürətlə hərəkət edən nöronlarla uyğundur IPSC'ların müqayisəsi. J. Neurosci. 24, 7916-7922 10.1523 / jneurosci.2163-04.2004 [PubMed] [Çaprazlıq]
  22. Kourrich S., Rothwell PE, Klug JR, Thomas MJ (2007). Kokain təcrübəsi, nüvəli akumbensdə bidireksional sinaptik plastisiyanı nəzarət edir. J. Neurosci. 27, 7921-7928 10.1523 / jneurosci.1859-07.2007 [PubMed] [Çaprazlıq]
  23. Kravitz AV, Freeze BS, Parker PR, Kay K., Thwin MT, Deisseroth K. və digərləri. (2010). Bazel ganglion dövrünün optogenetik nəzarəti ilə parkinsoniyalı motor davranışlarının tənzimlənməsi. Təbiət 466, 622-626 10.1038 / nature09159 [PMC pulsuz məqalə] [PubMed] [Çaprazlıq]
  24. Kravitz AV, Tye LD, Kreitzer AC (2012). Möhkəmləndirilməsində birbaşa və indirekt yolun striatal nöronları üçün fərqli rollar. Nat. Neurosci. 15, 816-818 10.1038 / nn.3100 [PMC pulsuz məqalə] [PubMed] [Çaprazlıq]
  25. Kreitzer AC, Malenka RC (2008). Striatal plastisitasiya və bazal qanqlalı dövr funksiyası. Təbiət 60, 543-554 10.1016 / j.neuron.2008.11.005 [PMC pulsuz məqalə] [PubMed] [Çaprazlıq]
  26. Le Moin C., Bloch B. (1996). D3 dopamin reseptorunun nucleus accumbens peptiderqik nöronlarında ifadəsi: D1 və D2 dopamin reseptorları ilə müqayisədə. Nörobilim 73, 131-143 10.1016 / 0306-4522 (96) 00029-2 [PubMed] [Çaprazlıq]
  27. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D., Friedman AK, Sun H., Damez-Werno D. və digərləri. (2010). BDNF siqnalının hüceyrə tipli xüsusi itkisi kokain mükafatının optogenetik nəzarətini təqlid edir. Elm 330, 385-390 10.1126 / science.1188472 [PMC pulsuz məqalə] [PubMed] [Çaprazlıq]
  28. Lobo MK, Nestler EJ (2011). Narkomaniyaya qarşı striatal balanslaşdırma hərəkətləri: birbaşa və indirekt yolun orta spiny nöronların ayrı-ayrı rolları. Cəbhə. Neuroanat. 5: 41 10.3389 / fnana.2011.00041 [PMC pulsuz məqalə] [PubMed] [Çaprazlıq]
  29. Lüsser C., Malenka RC (2011). Bağımlılıkta narkotik uyuşturucu sinaptik plastiklik: molekulyar dəyişikliklərdən dövrə yenidən qurulmasına qədər. Neuron 69, 650-663 10.1016 / j.neuron.2011.01.017 [PMC pulsuz məqalə] [PubMed] [Çaprazlıq]
  30. O'Donnell P., Grace AA (1993). In vitro qeydə alınmış accumbens nüvəsi və qatı neyronların fizioloji və morfoloji xüsusiyyətləri. Synapse 13, 135-160 10.1002 / syn.890130206 [PubMed] [Çaprazlıq]
  31. Pascoli V., Turiault M., Lüscher C. (2011). Kokain-uyarılmış sinaptik potensiasiyanın ters çevrilməsi uyuşturucuya bağlı adaptiv davranışı sıfırlar. Təbiət 481, 71-75 10.1038 / nature10709 [PubMed] [Çaprazlıq]
  32. Preston RJ, Bishop GA, Kitai ST (1980). Siçovul neostriatumdan orta sünbül neyron proqnozu: intrasellular horseradish peroksidaz tədqiqatı. Brain Res. 183, 253-263 10.1016 / 0006-8993 (80) 90462-x [PubMed] [Çaprazlıq]
  33. Robinson TE, Berridge KC (1993). Dərman intizamının neyro əsasları: asılılığın stimullaşdırıcı sensitizasiya nəzəriyyəsi. Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 247-291 10.1016 / 0165-0173 (93) 90013-p [PubMed] [Çaprazlıq]
  34. Robinson TE, Berridge KC (2003). Asılılıq. Annu. Rev. Psychol. 54, 25-53 10.1146 / annurev.psych.54.101601.145237 [PubMed] [Çaprazlıq]
  35. Schmidt HD, Pierce RC (2010). Glutamat ötürülməsində kokainə səbəb olan neyrokoduntasiyalar: özlem və asılılıq üçün potensial terapevtik hədəflər. Ann. NY Acad. Sci. 1187, 35-75 10.1111 / j.1749-6632.2009.05144.x [PubMed] [Çaprazlıq]
  36. Sesack SR, Grace AA (2010). Cortico-bazal ganglion mükafat şəbəkəsi: microcircuitry. Nöropsikofarmakoloji 35, 27-47 10.1038 / npp.2009.93 [PMC pulsuz məqalə] [PubMed] [Çaprazlıq]
  37. Sim HR, Choi TY, Lee HJ, Kang EY, Yoon S., Han PL və et al. (2013). Dopamin D2 reseptorlarının stressə səbəb olan asılılıq davranışlarının plastisitəsində rolu. Nat. Kommunizm. 4: 1579 10.1038 / ncomms2598 [PubMed] [Çaprazlıq]
  38. Smith RJ, Lobo MK, Spencer S., Kalivas PW (2013). D1 və D2 akkumens proqnoz nöronlarında kokainə səbəb olan adaptasiyalar (bir dichotomy mütləq birbaşa və dolayı yollarla sinonim deyil). Curr. Opin. Neurobiol. 23, 546-552 10.1016 / j.conb.2013.01.026 [PMC pulsuz məqalə] [PubMed] [Çaprazlıq]
  39. Steketee JD, Kalivas PW (2011). İstədiyimiz narkotik: davranış həssaslığını və narkotik axtarış davranışına nüksetmeyi. Pharmacol. Rev. 63, 348-365 10.1124 / pr.109.001933 [PMC pulsuz məqalə] [PubMed] [Çaprazlıq]
  40. Taverna S., Ilijic E., Surmeier DJ (2008). Parkinson xəstəliyi modellərində striatal orta spiny nöronların təkrarlanan kollateral əlaqələri pozulur. J. Neurosci. 28, 5504-5512 10.1523 / JNEUROSCI.5493-07.2008 [PMC pulsuz məqalə] [PubMed] [Çaprazlıq]
  41. Taverna S., Van Dongen YC, Groenewegen HJ, Pennartz CM (2004). Sıçan nüvəsindəki orta ölçülü spiny nöronlar arasında sinaptik əlaqə üçün birbaşa fizioloji sübut in situ. J. Neurophysiol. 91, 1111-1121 10.1152 / jn.00892.2003 [PubMed] [Çaprazlıq]
  42. Thomas MJ, Kalivas PW, Şaham Y. (2008). Mesolimbik dopamin sistemində və kokain asılılığında nöroplastiklik. Br. J. Pharmacol. 154, 327-342 10.1038 / bjp.2008.77 [PMC pulsuz məqalə] [PubMed] [Çaprazlıq]
  43. Tunstall MJ, Oorschot DE, Kean A., Wickens JR (2002). Sıçan striatumunda spiny proyeksiyalı nöronlar arasında inhibitor əlaqə. J. Neurophysiol. 88, 1263-1269 10.1152 / jn.00886.2001 [PubMed] [Çaprazlıq]
  44. Vanderschuren LJ, Kalivas PW (2000). Davamlı həssaslaşmanın indüksiyonu və ifadə edilməsində dopaminerjik və glutamateriq ötürülmələrə dəyişikliklər: preklinik tədqiqatların kritik nəzəriyyəsi. Psikofarmakoloji (Berl) 151, 99-120 10.1007 / s002130000493 [PubMed] [Çaprazlıq]
  45. Wilson CJ, Groves PM (1980). Siçovul neostriatumun ümumi sünbül neyronunun incə strukturu və sinaptik əlaqəsi: horseradish peroksidazın intrasellüler inyeksiyasını istifadə edən bir araşdırma. J. Comp. Neurol. 194, 599-615 10.1002 / cne.901940308 [PubMed] [Çaprazlıq]
  • Wise RA (2004). Dopamin, öyrənmə və motivasiya. Nat. Rev. Neurosci. 5, 483-494 10.1038 / nrn1406 [PubMed] [Çaprazlıq]