DeltaFosB, Cck promoter fəaliyyətini dolayı şəkildə tənzimləyir (2010)

Brain Res. 2010 May 6; 1329: 10-20.

2010 Mart 11 onlayn nəşr olundu. doi: 10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,¹ Megan Wald,¹ Madison Paddock,¹ Elizabeth Hoffman,¹ Rachel Arey,² Scott Edwards,² Sade Spencer,² Eric J. Nestler,³ və Colleen A. McClung^{2, *}

Yazar məlumat ► Müəlliflik hüququ və lisenziya məlumatları ►

Bu məqalənin nəşrin son redaktə olunmuş versiyasını əldə edə bilərsiniz Brain Res

PMC-də digər məqalələrə baxın quote dərc edilmiş məqalə.

mücərrəd

İstifadəsi olan narkotik maddələrə xroniki məruz qalması səbəbindən yaranan əhəmiyyətli biyokimyəvi, struktur və davranış dəyişikliklərindən bəziləri olduqca sabit transkripsiyon faktoru olan ΔFosB tərəfindən vasitəçilik edir. Əvvəlki işlər 2 həftələrində siçanlardakı ΔFosB overspresyonunun striatumdakı çox sayda genin ifadəsinin artmasına gətirib çıxardığını göstərir, əksəriyyəti sonra 8 həftəsi ΔFosB ifadəsinin ardından aşağı tənzimlənir. Maraqlıdır ki, bu genlərin çoxu transkripsiyanın əmələ gətirdiyi CREB-dən çox olan siçanlarda düzəldilmişdir. Lakin bu işdən qısa müddətli ΔFosB bu genləri CREB vasitəsilə tənzimləməyəcəyi aydın deyildir. Burada ΔFosB eksperxpresiyasının 2 həftəsinin striatumda CREB ifadəsini artırdığı, 8 həftələrində yayılan təsirin. Erkən induksiya bu beyin bölgəsində müəyyən hədəf gen stimulatorlarına artan CREB ilə bağlıdır. Təəccüblü bir əvvəlki hesabatlara əsaslanan bir CREB hədəfi olan bir gen, xolesistokinin (Cck), Striatumda CREB tərəfindən nəzarət edilmədi. Tənzimləməni daha da araşdıracaq Cck ΔFosB overspresyonu sonrasında, biz qısa müddətli ΔFosB ov ekspresyonu Cck promoter fəaliyyəti və gen ifadəsi. Bu, həmçinin, CREATE bağlanmış bir CREB məcburi saytında (CRE) məcburi fəaliyyəti artırır Cck təşəbbüskar. Lakin, CRE site normal bazal ifadəsi üçün vacibdir Cck, ΔFosB induksiyası üçün tələb olunmur Cck. Birlikdə götürülən bu nəticələr göstərir ki, qısamüddətli ΔFosB induksiyası müəyyən gen stimulatorlarında CREB ifadəsini və fəaliyyətini artırır, bu, bu şərtlərdə genlərin yenidən düzəldilməsi mexanizmi deyil.

Keywords: nüvə accumbens, transkripsiyası, bağımlılığı

GİRİŞ

İstifadəsi olan preparatlara xroniki məruz qalma bir sıra beyin bölgələrində biyokimyəvi və struktur dəyişikliklərinə səbəb olur. Bu dəyişikliklər, mezolimbik sistemdə gen ifadəsi profillərində dəyişikliklər ehtiva edir. Bu sistem, ventral tegmental bölgədən (VTA) nüvəli akumbens (midilli) (ventral striatum) orta beyin neuronlarına qədər, həmçinin bir sıra digər beyin bölgələrindən olan dopaminergik neyronlardan ibarətdir. İki transkripsiya faktoru, cAMP reaksiya elementli bağlayıcı protein (CREB) və ΔFosB (bir Fos ailə proteini) fəaliyyətində dəyişikliklər, sui-istifadələrə xroniki məruz qalma ilə görülən çoxlu biyokimyəvi, struktur və davranış dəyişikliklərinə vasitəçilik etmək təklif edilmişdir tərəfindən nəzərdən keçirilir Nestler, 2005).

CREB, CREB / ATF ailəsinin üzvü olan bir yerdə ifadə olunan transkripsiyaya səbəb olur. CREB homodimerləri bir çox genin təşviqçiliyində tapılmış bir CRE sekansının (konsensus: TGACGTCA) varyasyonlarına bənzəyir. CREB fosforillənməsi (əsasən serin 133-da, digər sahələr təsbit edilmiş olsa da) dopamin qəbuledicilərinin aşağı axınları daxil olmaqla, bir neçə sinyalizasiya zonası ilə stimullaşdırıla bilərCole və ark., 1995). Serin 133-da fosforilasyondan sonra, CREB ko-aktivator CREB bağlayıcı protein (CBP) və ya artan gen ifadəsinə gətirib çıxaran əlaqəli proteinləri ( Johannessen et al., 2004). İstifadənin opiate və ya psevdo-stimullaşdırıcı maddələrinə xroniki məruz qalma, nüvə akumbensində CREB aktivliyində müvəqqəti artıma səbəb olur (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman və digərləri, 2002, 2003), bir uyğunlaşma, bu dərmanların mükafatlandırıcı xüsusiyyətlərini azaltmaq və narkotik çıxarılmasının mənfi emosional vəziyyətinə qatqı verməyi düşünür (Nestler, 2005).

LFövqəladə maddələrin istifadəsinə qarşı davamlı adaptasiyanın qismən FosB tərəfindən yüksək səviyyədə saxlanılan, FosB (Nestler və digərləri, 1999; McClung et al., 2004; Nestler, 2008). Fos ailə üzvləri Jun ailəsinin üzvləri ilə aktivator protein 1 (AP-1) kompleksi yaratmaq üçün dimerizasiya edirlər. AP-1 transkripsiya kompleksləri transkripsiyanı tənzimləmək üçün AP-1 cavab elementinin (konsensus: TGACTCA) dəyişikliklərinə bənzərdir Chinenov və Kerppola, 2001). İstifadəsi olan dərmanlara kəskin şəkildə məruz qalmaq Fos-ailə üzvlərinin qısa müddətli induksiyasına (hr) gətirib çıxarır (həm də artan CREB fəaliyyətinə), təkrarlanan dərmana məruz qalma yüksək dərəcədə sabit ΔFosB (Hope və digərləri, 1994; Perrotti və digərləri, 2008), ifadəsi həftələr boyu davam edir.

Yetkin striatumda ΔFosB ya CREB-yə təsir göstərən bi-transgenik siçanlar heyvanlarda görülən biyokimyəvi və davranışlı fenotiplərin əksəriyyətini psixostimulyatorlara və ya digər sui-istifadə qaydalarına birbaşa məruz qoyur. Abu transgenik heyvanlarda gen ifadəsinin dəyişməsinin təhlili qısa müddətli (2 həftələr) ΔFosB ekspresyonu ilə düzəldilmiş çoxsaylı genləri təyin etdi, dərman mükafatının bir ardıcıl azalması ilə bağlı dəyişikliklər. Qısa müddətli ΔFosB ilə gen ifadə və davranış reaksiyalarındaki dəyişikliklər, CREN'yi 2 və ya 8 həftələrində ovsunxpressedən heyvanlarda olduqca oxşar idiMcClung və Nestler, 2003). Ziddiyyətli kontrastda ΔFosB'nin uzun müddətli aşırı ekspresyonu (8 həftə) eyni eyni genlərin çoxunun ifadəsini azaldır və dərman mükafatının artmasına gətirib çıxarır (Kelz və digərləri, 1999; McClung və Nestler, 2003).

Bu tədqiqatlarda müəyyən olunan bir gen var xolesistokinin (Cck), bir neçə beyin bölgəsində istehsal edilən bir nöropeptid, striatum (Hokfelt və digərləri, 1980). CCK dopaminergik ötürülməniVaccarino, 1992), dərman mükafatına və gücləndirilməsinə cəlb olunur (Josselyn və digərləri, 1996; Josselyn və digərləri, 1997; Hamilton, və digərləri, 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger və ark., 2002) və striatumda kronik kokain (Ding və Mocchetti, 1992). Əlavə olaraq Cck promoterin həm CREB, həm də AP-1 komplekslərinəHaun və Dixon, 1990; Deavall və digərləri, 2000; Hansen, 2001). Genlərin bir çoxundan (o cümlədən Cckhəm CREB və qısa müddətli ΔFosB ifadəsindən sonra artan ifadə göstərildi, ya da CREB hədəf genləriMcClung və Nestler, 2003), biz qısa müddətli ΔFosB ifadəsinin bu genlərin tənzimlənməsinə gətirib çıxaracağını müəyyənləşdirmək istəmişdik CckCREB-nin tənzimlənməsi və ya gen tənzimlənməsinin daha mürəkkəb mexanizmləri vasitəsilə.

NƏTİCƏLƏR

ΔFosB oversexpression keçici olaraq CREB səviyyələrini artırır

Biz ΔFosB aşırı təzyiqi siçovulların striatumunda CREB protein səviyyələrini artırdığını araşdırmaq üçün Western blotting istifadə etdik. Bu çalışmada hem NSE-tTA transgenini hem de TetOp-ΔFosB transgenini taşıyan bi-transgenik siçanlardan istifadə edilmişdir (xNUMXA xətti). Doksisiklin olmadığı zaman, bu siçanlar striatumdakı dynorphin pozitiv nöronlarda ΔFosB ifadəində sağlam artım göstərir (Kelz və digərləri, 1999). ΔFosB'yi aşırı eksprese eden bu metot, yaygın bir şekilde belgelenmiş ve kronik kokaine maruz kalan hayvanlarda görülen ΔFosB indüksiyonuna paralel bölgeye özgü ekspresyonaHope və digərləri, 1994; Kelz və digərləri, 1999). 11A siçanlarında ΔFosB'yi aşındırırken, CREB protein səviyyələri 2 həftə ifadə edildikdən sonra əhəmiyyətli dərəcədə upregulated idi və bu səviyyələr 8 həftə ifadəindən sonra (Şəkil 1A, n = 8). Qısamüddətli ΔFosB həddindən artıq ekspresiyası ilə CREB səviyyəsindəki dəyişikliklərin başqa bir sistemdə təkrarlana biləcəyini təyin etmək üçün PC12 hüceyrələrində ΔFosB-ni keçici olaraq həddindən artıq ifadə etdik və CREB səviyyələrinin nəzarətlə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə artdığını (p <0.05) aşkar etdik (Şəkil 1B, n = 4). Bu nəticələr göstərir ki, qısa müddətli ΔFosB ifadəsi CREB protein səviyyələrini artırır.

CREB səviyyələri ΔFosB oversexpression ilə artır. Lysatların Western blot analizi (A) 11 və ya 2 həftə və ya üçün dox off 8A siçan siçan striata (B) PC12 hüceyrələri ΔFosB'yi aşındırır. Məlumatlar A müqayisədə off dox-da yüzdə dəyişiklik kimi göstərilir ...

Hər ikisi ΔFosB və CREB qısamüddətli ΔFosB overexpression sonra striatum xüsusi hədəf genlərin promoters bağlayır

Biz ΔFosB və ya CREB bağlanmasının müəyyən hədəf gen təşviqatçlarında meydana gəldiyini və bu bağlamanın qısa müddətli ΔFosB aşırı ekspresyonu sonrasında artdığını müəyyən etmək üçün striatal toxuma testi (chromatin immunoprecipitation) istifadə etdik. Biz məcburi olaraq təhlil etdik BDNF və Cck hər iki genin qısamüddətli ΔFosB ov ekspresyonu, CREB overexpressioni və ya kronik kokain müalicəsi (McClung və Nestler, 2003). Biz də məcburi olaraq təhlil etdik CDK5 təşviq edən, çünki ΔFosB (Chen et al., 2000; Bibb və digərləri, 2001; Kumar və al., 2005). Nəhayət, biz məcburi ölçülmüşük prodynorphin əvvəlki tədqiqatlar fərqli şərtlər altında həm ΔFosB, həm də CREB ilə bağlı ola biləcəyini təsbit etdiyindənAndersson və digərləri, 2001; Zachariou et al., 2006).

CHP analizi, CREN və ya ΔFosB'yi tanıyan antikorları istifadə edərək, 11 həftələrində ΔFosB'yi aşırı 2A siçanlarından striata ilə həyata keçirildi. Normal şəraitdə, ΔFosB'nin buna bağlı olduğunu təsbit etdik CDK5 və prodynorphin təşəbbüskarlar, heç bir təsbit edilə bilməyəcəyi bağlayıcıdır BDNF or Cck təşəbbüskarlar (Cədvəl 1). Bundan başqa, ΔFosB overspresyonu ΔFosB-nin bağlanmasını artırdı CDK5 təşviq edən, lakin deyil prodynorphin təşəbbüskar. Bundan sonra CREB bu təşəbbüskarlarında bağlanırdı və CREB ilə əlaqəyə keçdi CDK5, BDNF və prodynorphin təşəbbüsçülər, lakin deyil Cck promoter, normal striatumda və 2 həftə ərzində ΔFosB aşırtma xarakteristikası, CREB bağlamasını artırır BDNF və prodynorphin təşviq edənlər, lakin deyil CDK5 təşəbbüskar. Birlikdə götürüldükdə, bu nəticələr ΔFosB və CREB həm də müəyyən gen təşviqçiləri kimi bağlaya biləcəyini göstərir prodynorphin və CDK5Lakin, CREB məcburi kimi digər promoters üçün xüsusi BDNF. Bundan başqa, ΔFosB aşırı ekspresyonu, gözlənilən kimi, bəzi promoterlərdə ΔFosB-də artımın artmasına gətirib çıxarır, həm də bu zaman nöqtəsində müşahidə olunan ΔFosB vasitəsi ilə CREB induksiyasına uyğun olaraq xüsusi promoterlərə CREB-ə bağlanmağa gətirib çıxarır.

İki həftə boyunca ΔFosB'yi aşırı sarsıntıyla siçanlardaki müxtəlif təşviqatçılara potensial tənzimləyici zülalların bağlanması.

Əvvəlki işlər uzun müddətli ΔFosB aşırı ekspresyonunun səbəb olduğu gen ifadəsinin dəyişməsinin kromatin modifikasiyası, xüsusilə histon H3'in asetilasyonu, xüsusi gen promoterlər (Kumar və al., 2005). Bu, qısamüddətli ΔFosB aşırı ekspresyonu ilə gen ekspresyonunda meydana gelen dəyişikliklər üçün hesabat verə biləcəyini müəyyən etmək üçün, asetillenmiş histon H3 (transkripsiyalı aktiv kromatin ilə əlaqəli bir histon modifikasiyası) və ya methylated histone H3 (Lys9, transkripsiyalı şəkildə əlaqəli bir histon modifikasiyası inaktiv kromatin). 2 həftəsi üçün ΔFosB'nin ov ekspresyonunun tədqiq edilən gen təşviqçilərinin heç birində acetilatlı H3-in bağlanmasında heç bir dəyişiklik olmadığı aşkar edilmişdir (Cədvəl 1). Methylated histone H3-in bağlanmasında əhəmiyyətli bir azalma tapdıq prodynorphin təşviq edən, lakin heç bir məcburi deyil Cck təşəbbüskar və bağlamada dəyişiklik yoxdur CDK5 və BDNF bu, qısa müddətdə ΔFosB'nin gen ifadəsini tənzimləyən ümumi bir mexanizm olmadığını irəli sürür. Biz təəccüb etdilər və artımımızı hesablaya biləcək ÇIP testlərimizdə heç bir fərq tapmadığımızdan maraqlıyıq Cck 11 həftəsindəki ΔFosB ifadəsindən sonra 2A siçanlarında mRNA ifadəsi və bu mexanizmi daha da tədqiq etməyə qərar verdi.

Qısamüddətli DFB böyüyür Cck birdən çox sistemdə ifadə

Bi-transgenik 11A siçanlarının mikroarray xarakteristikası, striatumda ΔFosB'yi aşırtmaqla Cck ifadə səviyyələri 2 həftə overspressiya sonra artmaq və daha sonra ΔFosB ifadə daha uzun müddət ilə azalma (Şəkil 2A, n = 3). Bu təsiri təsdiqləyirik Cck 2 və 8 həftələrində heyvanların ayrı bir qrupunda real vaxtlı PCR istifadə edərək, iki dəfə xallarda mikroarray analizinə (məlumatlar göstərilməyib) oxşar olan nəticələr tapıldı.

ΔFosB-nin qısamüddətli overspresiyası artır Cck gen ifadəsi. (A) Cck 11, 1, 2 və ya 4 həftələrində 8A siçanlarında ΔFosB overexpresyonundan sonra striatumda mRNA ifadəsi. Mikroarray analizləri striatal nümunələrdə və s Cck səviyyəsi ...

ΔFosB-nin tənzimlənməsini qabaqcadan araşdırmaq Cck ifadə edərək, PC12 hüceyrələrini keçid dövründə a Cckya da bir ΔFosB ifadə plazmidi və ya bərabər miqdarda pCDNA əmələ gətirir. ΔFosB aşırı ekspresyonunun iki (n = 5-9) ve üç (n = 11-13) günleri, Cck-suliferaz ifadəsi. Əlavə olaraq, ΔFosB ov ekspresyonunun üç günü əhəmiyyətli dərəcədə daha çox nəticələndi Cckiki gün overexpressiya ilə müqayisədə,Şəkil 2B). ΔFosB'nin ekspressioni promotersiz lusiferaza konstruksiyasini (ma'lumotlar ko'rsatilmagan) ifodasız etməmişdir. Heç bir müalicə şərtində bir azalma olmadı Cck-suliferaz fəaliyyəti aydın görünür. Bu nəticələr göstərir ki, qısamüddətli ΔFosB ifadəsi aktivliyini artırır Cck uzun müddətli ΔFosB ov ekspresyonunun basdırılması mexanizmi cavabsız qaldı Cck ifadəsi.

ΔFosB overspresyonu, proqnozlaşdırılan CREB bağlanma sahəsindəki bağlanma dərəcəsini artırır Cck təşəbbüskar

Analizlərimiz bunları tapdı Cck ifadəsi qısa müddətli ΔFosB ifadəsindən sonra artmışdır, lakin bizim CHIP testlərimizdə CREB və ΔFosB Cck təşəbbüskar. Protein bağlamasında dəyişikliklərin olub olmadığını müəyyən etmək Cck ΔFosB aşırı ekspresyonu sonrasında destekleyici olaraq, elektroforetik hareketlilik kayma testleri (EMSA), bir prodüktörlü CRE-benzeri siteyi Cck təşəbbüskar. 11 həftələrində ΔFosB'yi aşaraq 2A siçanlarının striata dənindən nüvə ekstraktları istifadə edərək, CREATE saytında yerləşdirici CRE saytına Cck promouter (Şəkil 3 A, C, n = 4). Maraqlıdır ki, 11A siçanları 8 həftələrində ΔFosB'yi aşağı salır, Cck ifadəsi də bu saytda daha çox məcburi göstərdi (Şəkil 3B, C, n = 4). Bir müqayisədə, 2 həftələrində ΔFosB-dən çox olan siçanlarda konsensus CRE saytına birləşmə müayinə etdik və striatal ekstraktlarda möhkəm CRE bağlamasını tapdınız, lakin ΔFosB induksiyasını (Şəkil 3F, n = 4). Beləliklə, bu zaman nöqtəsində görülən ümumi CREB səviyyələrində bir ΔFosB-in artımına baxmayaraq, bu nəticələr ΔFosB aşırı ekspresyonundan sonra promoterlərdə artan CREB bağlanmasının yalnız müəyyən genlərə xüsusi olduğunu və qlobal bir fenomen olmadığını göstərən ÇIP testlərimizə uyğun gəlir . CREB-in bağlılığını müəyyən etmək Cck EMSA analizimizdə təşəbbüskar, bir CREB xüsusi antikoru ilə üst-üstəlik sınaqları həyata keçirmişik. Bizim CHIP testlərimizlə razılaşdığımızda, CREB-nin heç birinə bağlanmamışıq Cck EMSA testlərində ehtimal CRE saytını ehtiva edən proqnoz, CREB əhəmiyyətli bir şəkildə razılaşdı və bir razılıq CRE saytınıŞəkil 3D, E, n = 4). DNT-də bağlanma fəaliyyəti Cck promoter, ΔFosB-ə inanılmaz bir AP-1 saytına bağlanmaq üçün bir neçə əvvəlki tədqiqatlarda göstərilən şərtlər altında (FOB) göstərilən bir antikordan təsirlənməmişdir (Hope və digərləri, 1994a, 1994b; Chen et al., 1995, Hiroi et al., 1998). 11 həftələrində ΔFosB ifadəsindən sonra 8A heyvanlarının striata üzrə CHIP testlərini həyata keçirmişik və hələ də CREB və ya ΔFosB Cck promoter (məlumatlar göstərilməyib). Beləliklə, ΔFosB ifadəsi, zülal bağlama artımına gətirib çıxarır Cck 2 və 8 həftə ifadələrindən sonra promouter; Ancaq bu faktorların kimliyi hələ də məlum deyil.

Proteində bağlama Cck təşəbbüskar. (A, B) İstifadə edərək elektroforetik hərəkətlilik şifrəsi təhlili Cck 2 həftə (A) və ya 8 həftə (B) üçün ΔFosB'yi aşınan heyvanlardan striatal toxuma ilə CRE-kimi site. (A), çox rakipsiz rəqiblə rəqabət ...

Yararlı CRE saytında Cck Promoter artan promoser fəaliyyəti üçün məsuliyyət daşımır

Zərərin bir parçasını istifadə edərək protein bağlamasını tapdığımız üçün Cck ΔFosB ov ekspresyonu sonrasında, bu sitenin artması üçün lazım olub olmadığını belirlemek istedik, CRE siteyi ehtiva edən promotör, Cck ΔFosB overexpression aşağıdakı ifadə. Bu imkanları test etmək üçün biz PC12 hüceyrələrini bir ilə transfekte etdik CckCRE-benzeri site və ya CREB ilə hər hansı bir qarşılıqlı təsirini aradan qaldıracaq bir yerdə bir mutasiya olan birini ehtiva edən -suliferaz plazmidi. Maraqlıdır ki, CRE-lik saytın mutasiya bazal azaldı Cck 32% tərəfindən təşviqat fəaliyyəti (Şəkil 4A, n = 9), lakin təsir etməmişdi Cck er'sFosB həddindən artıq ifadə ilə təşviqçinin induksiyası (Şəkil 4B, n = 11-13). Bu da göstərir ki, baxmayaraq ki Cck təşəbbüskar tam bazal fəaliyyət üçün qorunmayan CRE-kimi bir sahə tələb edir, ΔFosB overexpression tərəfindən səbəb olan artan promoter fəaliyyəti CRE-benzeri bir sıra tələb etmir.

The CckCRE site üçün lazımlı deyil Cck ΔFosB tərəfindən induksiya. (A) Cck-suliferaz aktivliyi ya normal olaraq transfeksiyadan sonra 2 gün ölçüldü Cck-luciferase və ya CRE-yə bənzər saytın mutasiya olunduğu biri. * p <0.05 (B) Cck-siferaz ...

cFos buna bağlıdır Cck təşəbbüskar

Əvvəlki işlər bunu tapdı cFos mRNA qısamüddətli ΔFosB ifadə ilə artır, lakin uzun ΔFosB ifadəsindən sonra kokain müalicəsinin striatumda cFos-nun gətirməsinə imkanları azaldılır (McClung və Nestler, 2003; Renthal və digərləri, 2008). Buna görə cFos'un artımına qatqı təmin edilə bilər Cck qısamüddətli ΔFosB ifadəsinin ardından ifadə. CFOS üçün spesifik bir antikor ilə CHIP testləri həyata keçirildik və cFos cədvəlində ölçülür Cck qısamüddətli ΔFosB ifadəsi olan və olmadan təşviqatçı. CFOS-nun bağlandığını gördük Cck promoter, bu bağlama aşağıdakı ΔFosB oversexpress (Şəkil 5, n = 5). Bu, cFosun buna bağlı olduğundan gəlir Cck təşviqatçı, ümumi tənzimləməsinə qatqı təmin edə bilər Cck ifadə, lakin ehtimal ki, tənzimləmə ilə məşğul deyil Cck ΔFosB tərəfindən təşəbbüskar.

cFos buna bağlıdır Cck təşəbbüskar. Kromatin immunoprecipitasiya təhlilləri cFos üçün xüsusi bir antikorla, ΔFosB aşırı ekspress siçanlarından dox üzərində ya da 2 həftə dox çıxarıldıqdan sonra striatal toxuma istifadə edilmişdir. Gerçek zamanlı PCR analizi oldu ...

MÜZAKİRƏ

Bu tədqiqat ΔFosB'nin striatumdakı gen ifadəsini tənzimləməsini göstərdiyini və qısa müddətli ifadədən sonra bir çox mexanizm vasitəsilə bunu tapdığını göstərən əvvəlki tapıntılar üzərində təsdiqlənir və genişləndirir. 2 həftədən çox vaxt keçirildikdən sonra, ΔFosB birbaşa ifadə olunan dəyişikliklərə gətirib çıxaran müəyyən genlərdə təşviqatçının birləşdiyini göstərir (yəni, CDK5). Bundan başqa, CREB zülal səviyyələrini artırır, digər hüceyrə promoterlərindəki artan CREB bağlanmasına gətirib çıxararaq, kültürlü hüceyrələrdə və striatumda müşahidə edilən bir təsir dynorphin və BDNF). Əvvəlki bir araşdırmada, ΔFosB'nin striatumdakı qısa müddətli aşırı ekspresyonunun CREB aşırı eksprese edildiğinde ortaya çıxan bir çox gen ekspresyonu değişikliğine yol açtığını ve kokain tercihlerindeki benzer davranışsal yanıtlara yol açtığını (McClung və Nestler, 2003). Beləliklə, ΔFosB'nin CREB induksiyasına gətirib çıxarması və CREB-nin müəyyən gen təşviqçiliyinə bağlanması, bu iki transkripsiya faktoru ilə niyə çox gen ifadəsinin dəyişmələrinin paylaşıldığını izah etməyə kömək edir.

ΔFosB tərəfindən CREB induksiyası maraqlıdır, çünki istifadənin dərmanları serin 133-fosforilatlı CREB səviyyələrində dəyişikliklərə səbəb olurMattson və digərləri, 2005) və CRE-vasitə ilə verilmiş transkripsiyanı (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman və digərləri, 2002, 2003), CREB ümumi səviyyələrini dəyişdirmədən. CREB səviyyələrində dəyişikliklər müvəqqəti ola bilər və buna görə də digər tədqiqatlarda asanlıqla buraxılmış ola bilər. Bizim əlimizdə CREB mRNA'sında kokain səbəbli artımlar, xüsusilə də, təcrübələrimizdə gördük, lakin bu təsir çox dəyişkəndir (yayımlanmamış müşahidə). Hem 11A transgenik siçanlar həm də PC-12 hüceyrələrində qısamüddətli ΔFosB aşırı ekspresyonu sonrasında CREB induksiyasını göstərdikləri üçün CREB həqiqətən genin dərmana bağlı dəyişikliklərini açıqlamaq üçün başqa bir mexanizm təmin edən ΔFosB (ya da ΔFosB hədəfi) tərəfindən indükləndiyini göstərir ifadəsi.

Şaşırtıcı bir şekilde, CREB ya da ΔFosB'nin bağlandığını gördük Cck hətta təşviq edən Cck ifadəsi qısa müddətli ΔFosB ifadəindən sonra aydınlaşdırılır. Cck hər iki VTA və NAc-də ifadə olunan bol nöropeptiddir (Hokfelt və digərləri, 1980) və ehtimal ki, sui-istifadəyə qarşı olan davranışlara cavab verə bilər (Josselyn və digərləri, 1996; Josselyn və digərləri, 1997; Hamilton, və digərləri, 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger və ark., 2002). Hüceyrə mədəniyyət testlərində, Cck təşəbbüskar geniş şəkildə xarakterizə edilmiş və CREB və AP-1 ailə üzvlərinə cavab verilmişdir (nəzərdən keçirilmişdir). Hansen, 2001). Haun və Dixon (1990) AP-1 komplekslərinin bağlaya biləcəyini göstərdi Cck CRE-kimi sayt vitroSK-N-MC nöroblastoma hüceyrələri istifadə edərək, CRE-kimi saytın mutasiyalarının cFos / cJun (cFos / cJunRourke və digərləri, 1999). Həqiqətən, biz də artar Cck təşviqat fəaliyyəti (Şəkil 2) və CRE-kimi elementdə və ya ətrafında bağlanma (Şəkil 3) başqa bir AP-1 ailə üzvü olan ΔFosB-nin aşırı ifadəsi ilə, lakin biz ΔFosB-nin birbaşa bağlanmasını tapmırıq. Cck təşəbbüskar vivo ilə or vitrohətta onun aşırı ifadəsi ilə.

Çox işlər CREB-nin tənzimlənməsində bir rol oynamışdır Cck təşviqat fəaliyyəti. Məqalələr Cck CRE-kimi site onurğalılar arasında qorunur (Hansen, 2001) və bəzi hüceyrə mədəniyyət testlərində CREB və AP-1 kompleksləri bu sayta bənzəyir və Cck təşviqat fəaliyyəti (Haun və Dixon, 1990; Deavall və digərləri, 2000; Hansen, 2001). Bundan əlavə, bir çox tanınmış aktivatorları Cck ifadəsi (bFGF, PACAP, peptones və depolarizasiya daxil olmaqla) CREB (Hansen və digərləri, 1999; Deavall və digərləri, 2000; Bernard, və digərləri, 2001; Gevrey və s., 2002; Hansen və digərləri, 2004). Bizim Cck-siferase məruzəçi gen məlumatları, tənzimlənməsində CRE-kimi sayt üçün mühüm rol oynayır Cck promoter fəaliyyəti, çünki bu saytın mutasiya bazal azaldır Cck promouter fəaliyyəti və CckCREP-nin konstruktiv aktiv forması olan VP16-CREB tərəfindən səbəb olan -suliferaz ifadəsi bu sayt mutasiya edildikdə (yayımlanmamış müşahidə) itirilir. Beləliklə, biz CREB-nin əlaqəli görünməyəcəyini tapmaq üçün təəccübləndik Cck CREB səviyyələri artdıqda ya bazalda və ya qısamüddətli ΔFosB overexpresiyası zamanı striatal ekstraktlarda stimulator. Bu CREB səviyyələrini müdafiə edir per se bu saytda məcburi məbləğin müəyyən edilməsində yeganə amildir və bu, digərlərinin işi ilə dəstəklənir (Cha-Molstad və digərləri, 2004). Digərləri təşəbbüskar olduğundan, əvvəlcədən CREB hədəf genləri kimi təyin etdi BDNF və prodynorphinCREB'i bağlamışdıq, CREB'nin bağlamağa bağlı olmadığını tapmaqda əminik Cck striatal nüvə ekstraktlarında təşəbbüskar. Bundan əlavə, CckΔFosB tərəfindən hazırlanan -suliferaz fəaliyyəti, ΔFosB-nin tənzimlənməməsini nəzərdə tutan qeyri-pozitiv CRE-kimi saytdan asılı deyildir Cck CREB-nin birbaşa bağlanmasını tənzimləyərək ifadə Cck təşəbbüskar.

CREB ilə qarşılıqlı əlaqəni təsbit edə bilməməmiz Cck promouter tərəfindən dəstəklənir Renthal et al. (2009)kronik kokain ifrazından sonra striatumda fosforlanmış CREB (pCREB) və ΔFosB bağlamasında qlobal dəyişikliklərə baxmaq üçün bir ÇIP-çip yanaşmasını istifadə etmişdi. Bu təcrübələrdə DNT-protein kompleksləri ΔFosB və ya pCREB antikorları ilə immunopresipitasiya edilmiş və etiketləndikdən sonra çökmüş DNT bir promoter mikrosərənə hibridləşdirilmişdir. Daha əvvəl xarakterizə edilmiş bir çox CREB hədəf genləri bu yanaşma ilə müəyyən edilmiş olsa da (məsələn, BDNF, prodinorfin), Cck müəyyənləşdirilməyib. Bundan əlavə, CREB konsensus CRE saytına bağlanmasının kültürlü hüceyrələr arasında çox fərqləndiyini göstərmişdir (Cha-Molstad və digərləri, 2004). CREB ilə qarşılıqlı əlaqələri olan əvvəlki bütün işlər Cck promoter hüceyrə mədəniyyətində həyata keçirilmişdir (EMSA və CHIP nümunələrinin əldə olunduğu beyn deyil) və protein-DNT qarşılıqlı təsirlərini tədqiq etmək məqsədilə jel dəyişdirmə təcrübələrindən istifadə edilmişdir. Bir EMSA bir DNT ardıcıllığına bağlanmaq üçün bir amil potensialını qiymətləndirərkən, CHIP testləri bu qarşılıqlı əlaqələrə yeni bir baxış verir vivo ilə. Bundan əlavə, məlumatların əksəriyyəti indüksiyaya aiddir Cck promoter fəaliyyəti və ya CREB ilə əlaqələndirir Cck promoter pepton kimi amillər tərəfindən stimullaşdırılan hüceyrələrdən əldə edilmişdir (Bernard və ark., 2001), depolarizasiya (Hansen və digərləri, 2004) və ya cAMP və ERK (daxil olmaqla) daxilində intrasellular siqnalizasiya kassadlarının müxtəlif aktivatorlarıHansen və ark., 1999). Bizim təcrübələrimizdə istifadə edilən yeganə "stimulus" ΔFosB'nin overexpresiyası idi və bu, Cck ifadəsi. Birlikdə götürülən bu, CREB-nin (və potensial olaraq tənzimlənməsinə) qoşulma qabiliyyətini göstərir Cck promoter hüceyrə tipinə və xüsusi siqnal yollarının aktivliyinə çox asılıdır. Bundan əlavə Cck CRE-kimi promoter elementi (ən azı işlənməmiş PC12 hüceyrələrində və siçan striatumda) CREB və ya ΔFosB'nin birbaşa hədəfi deyil. Maraqlıdır ki, tənzimləmə FosB CREB tərəfindən ifadəsi də hüceyrə növü və stimullaşdırma növü ilə bağlıdır. Andersson tərəfindən edilən bir araşdırma et al. CREB antisens oligonükleotidlərinin siçan striatumuna enjeksiyonunun qismən induksiyasını inhibe etdi. FosB kokain tətbiqindən sonraAndersson və digərləri, 2001). Ancaq onlar da L-Dopanın inandırmaq qabiliyyətini tapdılar FosB 6-OHDA-lesioned striatumdakı ifadədə CREB antisens oligonükleotidlərinin olması təsirlənməmişdir.

CREB və ΔFosB dolayı yolla tənzimlənən göründüyü üçün Cck promoter və xromatin strukturunda dəyişikliklər ΔFosB (Tsankova et al., 2004; Kumar və al., 2005; Renthal və digərləri, 2008), biz ΔFosB'nin kromatin strukturunu dəyişdirərək dolğun olaraq təşviqçi fəaliyyətə modul ola biləcəyini əsaslandırdıq. Lakin, 2 həftələrində ΔFosB-dən çox siçanlarda sümüklərdə histon H3 asetilində dəyişiklik olmadı. Cck promouter (Cədvəl 1). Bu, ÇIP-çip məlumatları tərəfindən dəstəklənir Renthal et al. (2009)olan, asetilatlı H3 bağlamasında heç bir dəyişiklik bildirməmişdi Cck kronik kokainə məruz qalan siçanlarda təşviqatçısıdır. Çünki Cck promoter striatumda aktivdir, heç bir repressiv methylated histone H3 bağlanması gözlənilir və ya müşahidə olundu. Maraqlıdır ki, ΔFosB aşırı ekspresyonu səbəbiylə asetilen H3 bağlamasında heç bir dəyişiklik görmədik. BDNF promoter (artan CREB məcburiyyətini göstərən) və ya CDK5 və prodynorphin təşviq edənlər (ΔFosB məcburi artım göstərdi). Promoter fəaliyyətində dəyişikliklərlə əlaqəli bir sıra histon dəyişiklikləri olduğundan (bax Rando və Chang, 2009), ehtimal ki, bu genlərin induksiyası ilə əlaqəli digər kromatin dəyişiklikləri mövcuddur. Hər hansı bir xromatin modifikasiyası, müəyyən bir genin aktivasiyası zamanı tez-tez təşəbbüskarlıq səviyyəsinin proqnozlaşdırılması olsa da dəyişə bilməz. Gələcək işlərdə, ətrafında olan kromatin strukturunda digər potensial dəyişikliklərə baxmaq maraqlı olardı Cck ΔFosB overexpresyonundan sonra təşəbbüskar. Maraqlıdır ki, kronik kokain (ehtimal vasitəsilə ΔFosB induksiyası) nötral fiziologiyanı, ERK siqnalını və kokainə davranış reaksiyalarını dəyişən görünən sirtuin 1 və 2, sinfi III histon deasetilazlarının ifadəsini indükləyəcək göstərilmişdirRenthal və digərləri, 2009). Bir histon deasetilazın induksiyası eyni zamanda çox sayda genin ifadəsini tənzimləməyə imkan verəcəkdir vasitəsilə xromatin strukturunda qlobal dəyişikliklər.

Mümkün bir namizədi Cck Aşağıdakı tənzimləmə ΔFosB ov ekspresyonu AP-1 ailə üzvü cFos idi. CFos ifadəsi CREB tərəfindən tənzimlənir (Sheng et al., 1990; Impey et al., 2004) və cFos overspression (onun cəlb tərəfdaş cJun aşırtma ilə uyğunlaşır) artırır Cck təşviqat fəaliyyəti (Rourke və digərləri, 1999). Buna görə də, qısamüddətli ΔFosB oversexpress səbəbindən artan CREB səviyyəsi cFos səviyyəsini artıra bilər və Cck CRE-kimi sayt. cfos mRNA iki həftədən sonra ΔFosB overexpressiya (McClung və Nestler, 2003) və kronik kokainə məruz qalan və ya uzun müddətli ΔFosB ekspresyonu (Renthal və digərləri, 2008). Burada cFos'un birbaşa əlaqəli olduğunu görürük Cck striatal toxumada təşviq edən, lakin ΔFosB overspresyonu əhəmiyyətli dərəcədə birləşməni artırmaz. Bu, cFosun tənzimlənməsinə cəlb oluna bilər Cck ümumiyyətlə, cFos-un birləşməsindəki dəyişiklik ΔFosB tənzimləyən mexanizm deyildir Cck ifadəsi. Lakin, ΔFosB ya cFos-da post-translational dəyişiklikləri (məsələn, dəyişdirilmiş fosforilyasiya) və ya bir cədvəl ortağının (cJun kimi) və ya ko-aktivator proteinin ifadəsini gətirə bilər. Lakin, əvvəlcədən yaradılmış CRE-kimi sayt (əvvəllər AP-1 kompleksləri üçün bağlayıcı bir site olduğu göstərilir, Haun və Dixon, 1990) artırılması tələb olunmur Cck ΔFosB ov ekspresyonu (bizim reportyor gen eksperimentlərimizdə qiymətləndirildiyi kimi) ilə müşahidə olunan təşviqat fəaliyyəti, digər trans-təsir edən amillərin də ΔFosB tərəfindən tənzimləndiyini əsaslandırır.

The Cck luciferase reporter gen testlərimizdə istifadə olunan promotor parçası konservləşdirilmiş bir Sp1 bağlanma sahəsi və E-qutunu (Hansen, 2002 tərəfindən nəzərdən keçirilmişdir) ehtiva edir. Xüsusilə, E-qutu dizilişləri çox sayda transkripsiyanın faktorlarına bənzəyir Forrest və McNamara, 2004). PC12 hüceyrələrini istifadə edərək, E-qutunun mutasyonunun azaldığını gördük Cck təşviqçi fəaliyyəti, lakin təşəbbüskarın ΔFosB (məlumat göstərilməmişdir) cavabını dəyişdirmir. Maraqlıdır ki, a CckCRE site və E-qutusunda mutasiyalar olan mutasiyalı reporter heç bir təsbit edilə bilən bazal fəaliyyətə malik deyil və ΔFosB overexpressiya (yayınlanmamış müşahidə) üçün cavab vermir. ΔFosB əməliyyatının potensial mediatoru Cck promouter ATF'dir, bəzi formaları kronik psychostimulant məruz qalma ilə striatumda məlum olduğu bilinir (Yaşıl et al., 2008). Lakin, bu ATF'lerin ΔFosB induksiyası üçün heç bir sübut tapmırıq (məlumat göstərilmir) və ATF-lərin mutasiya edilmiş CRE-benzeri saytına bağlanması gözlənilmir. Cck təşəbbüskar.

Bu tədqiqatın bir xəbərdarlığı, biz ΔFosB'yi aşırtmaq üçün bi-transgenik bir sistem istifadə etdiyimizdən, bu paradiqma və kronik kokain tətbiqi arasındakı paralellikləri nəzərə alaraq mühafizəkar olmalıdır. Ancaq 11A transgenik siçanları ΔFosB'nin striatumdakı spesifik təsirlərinə baxmaq üçün qeyri-adi fürsətə malikdirlər, çünki overspression bu beyin bölgəsi ilə məhdudlaşır (Chen et al., 1998), kokainin idarəsi isə digər beyin bölgələrində müxtəlif dəyişikliklər yaradır, sonra isə striatumu dolayı təsir edə bilər. Bundan başqa, bir neçə tədqiqat 11A siçanlarında oxşar davranış və molekulyar fenotipləri xroniki kokainlə müalicə edildiyi transgen olmayan heyvanlaraKelz və digərləri, 1999; McClung və Nestler, 2003; Renthal və digərləri, 2009). Əlavə olaraq, Bibb et al. (2001) Striatalın oxşar səviyyələrini bildirdi Cdk5 kokainlə müalicə olunan, transjenik olmayan littermates ilə müqayisədə, eyni zamanda, CDX11 hədəfləri, p5 və DARPP-35 kimi oxşar dəyişikliklərlə müqayisədə eyni 32A sintezində mRNA və protein induksiyası.

Nəticədə, qısa müddətli ΔFosB ifadəsi çox mexanizmlər vasitəsilə striatumdakı genlərin induksiyasına gətirib çıxarır. Bunlar birbaşa promoterin bağlanması, CREB proteininin və aktivliyinin indüksiyasını, xromatin modifikasiyasını, müəyyənləşdiriləcək yollara əlavə olaraq ehtiva edir.

Təcrübəli prosedurlar

Heyvanlar

Bu işdə kişi bi-transgenik 11A heyvanları (NSE-tTA x TetOP-ΔFosB) istifadə edilmişdir və Kelz və digərləri, 1999. ΔFosB'yi ovsunxpress etmək üçün, siçanlar xNUMX və 3 həftə arasında doksisiklindən çıxarıldı, nəzarət siçanları doksisiklin üzərində saxlanıldı. Bütün siçanlar 6-da 12: 12 işıqlı / qaranlıq dövrü, 7-da işıqlar və 7 pm-də işıqlar, ad lib qida və suya çıxış. Bütün siçan təcrübələri Dallas Texas Southwestern Medical Center Universitetinin heyvan qayğı və istifadəsi komitəsi tərəfindən təsdiqlənmiş protokollara uyğun idi.

Müəllif və ifadə plazmidləri

Wildtype (WT) Cck promoter-luciferase məruzəçi təxminən 200 bp PCR fragmanını pGL3-luc vektoruna (Promega) yerləşdirməklə hazırlanmışdır. Bu fraqment sümük genomik DNA'dan (primerlər: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' upstream və 5 'TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3' aşağı axından) əldə edilmiş və əvvəlcə pGEM-T Easy vektoruna (Promega, #A1360) daxil edilmişdir. Promoter parçası daha sonra pGL1-luc'ün Kpn1 / Xho3 məhdudlaşdırma enzim sitelerine klonlandı.

CRE nöqtəsi mutasyonunu yaratmaq üçün Cck promoter, əvvəllər bildirilən CRE-kimi bir sahəyə qarşı yönəlmiş bir mutagenik astar (məna astar: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3 ', antisense astar: 5'CTGTTCACCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG 3') ilə dəyişikliyin kombinasiyasında təlimatla birlikdə istifadə edilmişdir . Bu, bildirilən CRE-ə oxşar saytı (ACTGCGTCAGC) ACTGAGCTCC-yə çevirir. Bütün müxbir plazmidlər DNT sıralaması ilə təsdiqləndi. ΔFosB ifadəsi plazmid, pCDNA 3.1-in çoxsaylı klonlama yerinə daxil edilmiş və əvvəllər təsvir olunmuş tam uzunluqlu ΔFosB ardıcıllığını ehtiva edir (Ulery və Nestler, 2007).

Hüceyrə mədəniyyəti və DNT infeksiyaları

Siçovul feokromositoma (PC12) hüceyrələri Dulbecco'nun dəyişdirilmiş Kartalın orta F-12-də saxlanıldı,% 10 at serumu,% 5 fetal iribuynuzlu serum və% 1 penisilin / streptomisin ilə 37 ° C və% 5 CO₂. Hüceyrələr BTX 360 elektroporatoru (350V, 0 ohm və 850 μF) istifadə edərək elektroporasiya yolu ilə 800 μL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinatında 4 mm boşluqlu küvetlərdə müxbirin 10 μg və ifadə konstruksiyasından 5 μg istifadə edildi. Ümumi DNT miqdarını normallaşdırmaq üçün boş vektor plazmidindən (pCDNA) istifadə edilmişdir. Transfeksiyadan sonra hüceyrələr göstərilən müddət ərzində 35 mm kollagen örtüklü qablarda böyüdülmüşdür.

Luciferase testləri

Transfeksiyadan iki və ya üç gün sonra hüceyrələr 3 dəfə Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinində yuyulur, yuyulur (25 mM glisilglisin, 15 mM MgSO istifadə olunur)₄, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT) toplanmış və santrifüqasiya yolu ilə təmizlənmişdir. 30 μL lizat 140 μL lusiferaz test tamponu (25 mM glisilglisin, 15 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM potasyum fosfat, 1 mM koenzim A, pH 7.8). Luminescence fəaliyyəti bir 800 μL 40 mM luciferin avtomatlaşdırılmış bir injection sonra bir FLX-1 microplate fluorescence oxucu istifadə edərək ölçüldü. Luciferase fəaliyyəti, BioRad protein testi ilə təyin olunan ümumi protein məzmununa normalləşdirildi.

Elektroforetik hərəkətlilik dəyişməsi təhlili

Bi-transgenik 11A siçanlarından ikitərəfli dilimlərdən nüvə ekstraktları (2 və ya 8 həftələrdəki doksisiklində saxlanılan və ya kəsilmədiyi yerdə)McClung və Nestler, 2003) uyğun olaraq hazırlanmışdır Huang və Walters (1996). ³²P-etiketli iki qatlı oligonükleotid probları Promega Gel Shift Testi sistemi protokolu (#E3300) istifadə edərək hazırlanmış və problar Roche Quick Spin Sütunları ilə təmizlənmişdir. Konsensus CRE və AP-1 prob seqmentləri Promega (müvafiq olaraq #E328A və E320B) və Cck CRE ardıcıllığı (Cck-CRE mənası: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; Cck-CRE antisens: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT) idi.

Bağlayıcı reaksiyalar və elektroforez Promega Gel Shift Test sistemi prosedurunun (#E3300) dəyişikliklərindən istifadə edilmişdir. 50,000 CPM etiketli prob 10 μg striatal nüvə ekstraktı ilə birləşdi. Radiolabeled probları tətbiq etməzdən əvvəl soyuq rəqib DNT və ya antikorlar əlavə edildi. Yuxarıdakı təcrübələr üçün CREN antikorunun (Upstate Biotechnology # 2-06) 083 μg istifadə edilmişdir. Reaksiya 4% poliakrilamid jelləri üzərində elektroforez edilmiş, qurudulmuş və filmə məruz qalmışdır (1 gün üçün 2 günə intensiv ekranlar istifadə edilmişdir).

İmmünoblotinq

PC12 hüceyrələri üçün transfekte edilmiş hüceyrələrin 35 mm lövhələri buzlu soyuqda yuyulur və Duzbekdəki fosfat tamponlu salin və lizatlar buz kimi RIPA liziz tamponunda hazırlanır (50 mM Tris pH 7.4, 5 mM NaCl, 5 mM EDTA,% 1 deoksixolat, 1 Proteaz inhibitorları olan% Triton X-100,% 0.1 sodyum dodesil sulfat). Sonikasiya, klirinq və Bradford zülal analizindən sonra lizatlar tamamilə denatüre edildi və hər bir nümunədən 50 μg% 10 SDS poliakrilamid jelləri üzərində elektroforez edildi. Zülallar PVDF membranına köçürüldü,% 1 Tween-3 (TBS-T südü) olan Tris tamponlu salin içərisində% 0.1 yağsız quru süd içərisində 20 saat bloklandı və birincil antikorlarla (CREB-) 4 ° C-də gecə sınaqdan keçirildi. Upstate Biotechnology # 06-083, 1: 1,000; GAPDH- Sigma # G8795, used 1: 80,000) TBS-T südündə seyreltilir. TBS-T-də çox dəfə yuyulduqdan sonra ləkələr otaq temperaturunda bir saat ərzində TBS-T südündə 1: 5,000 qədər seyreltilmiş qələvi fosfatazla birləşdirilmiş ikincil antikorlardan (Sigma) istifadə edildi. Tris tamponlu şoran içərisində çox dəfə yuyulduqdan sonra rəng reaksiyası BioRad (# 170-6432) təlimatlarına uyğun olaraq həyata keçirildi. Membranlar bir gecədə quruduldu, düz skanerdə skan edildi və ImageJ istifadə edərək densitometriya edildi (aşağıya bax).

Striatal çıxarışlar üçün Western blot testləri daha əvvəl nəşr olunduHope və digərləri, 1994). Doku kəsilməmiş siçanlardan çıxarılmış, buz üzərində yerləşdirilmiş və 1 mm qalınlığında bir beyin matrisi ilə bölünmüşdür. Daha sonra toxuma zərbələri alındı və istifadə olunana qədər -80 ° C-də donduruldu. Doku həm fosfataz, həm də proteaz inhibitorlarını (Roche, Sigma) ehtiva edən modifikasiya edilmiş bir deterjan əsaslı tamponda buz üzərində sonicated edilmişdir. Sonikasyondan sonra, nümunələr qaynar suda denatüre edildi və 15,000xg-da 15 dəqiqə üçün santrifüj edildi; sonradan toplanmış və işlənmiş süpernatant; Protein konsentrasiyası məbləğləri sonra Bradford testi (Bio-Rad) istifadə etməklə müəyyənləşdirilmişdir. Nümunələr bir 10% akrilamid / bisakrilamid jelində işlənmiş, PVDF membranına köçürülmüş, 5% sütdə bloklanmış və əsas antikorlar (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY) ilə inkubasiya edilmişdir. Blots sonradan bir chemiluminesence sistemi (Pierce) istifadə edərək görüntülenmiştir. Bütün nümunələr GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA) üçün normallaşdırıldı. Standart tirajlar testin xətti aralığına sahib olduğumuz üçün təmin edildi.

Densitometriya təhlili

PC12 immunoblotları üçün densitometriya təhlili rodbard kalibrləmə ilə ImageJ istifadə edilmişdir. Orta ölçülü siqnal hər ölçüdən çıxarılıb və hər bir nümunə üçün CREB-nin GAPDH siqnalına nisbəti hesablanıb. Striatal immünoblots və EMSA təhlili üçün, Fion Image 1.62c fon toplama işlemi ilə istifadə edilmişdir.

Kromatin immunoprecipitation (ChIP)

ÇIP əmsalları üsullarına uyğun olaraq həyata keçirildi Tsankova et al. (2004) və Qumar et al. (2005). Qısaca doksisiklin üzərində və ya ondan kənarda saxlanılan 11A siçanlarından alınmış ikitərəfli striatal nümunələr% 1 formaldehidlə çarpaz bağlandı və çarpaz bağlama glisinlə söndürüldü (son konsentrasiyası 0.125 M). Bu nümunələr korteks çıxarılaraq nüvə akumbens səviyyəsində alınan bütün beyin dilimlərindən idi. Kromatin, sonikasiya yolu ilə təxminən 0.2 - 1 kb fraqmentlərə qədər kəsilmiş, Protein G boncukları (Thermo Scientific # 22852) ilə təmizlənmiş və giriş nümunələri -80 ° C-də dondurulmuşdur. Hər yağış üçün 60 ilə 100 μg arasında kromatin istifadə edilmişdir. Hər bir əsas antikorun 5-10 μg-si istifadə edilmişdir (CREB: Upstate Biotechnology # 06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, asetylated H3: Upstate Biotechnology # 06-599, methylated H3 (LYS9): Cell Signaling Technology, cFos: Santa Cruz Biotechnology # SC-7202x). Antikor-xromatin kompleksləri istehsalın təlimatına uyğun olaraq Protein G plus boncuklarla immunopresipitasiya edilmişdir (Thermo Scientific # 22852). Giriş və çökmüş nümunələrin əks çarpaz bağlanmasından sonra hər bir nümunə kəmiyyət PCR (qPCR) məruz qaldı. Bütün bu antikorların ChIP üçün istifadəsi geniş şəkildə təsdiq edilmişdir (Tsankova et al., 2004; Kumar və al., 2005; Renthal və digərləri, 2009).

Faizin hər bir gen promoterində zülal bağlama səviyyəsi qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA) ilə əlaqəli DNT məbləğinin ölçülməsi ilə müəyyən edilmişdir. Giriş və ya ümumi DNT (qeyri-immünopresipitasiya edilməmiş) və immunopresipitasiya edilmiş DNT SYBR Green (Applied Biosystems, CA) iştirakı ilə üçqatda gücləndirilmişdir. Hər bir nümunədən Ct dəyərləri Sequence Detector 1.1 proqramı ilə əldə edilmişdir. Şablon DNT-nin nisbi miqdarı ΔΔCt üsulu (Tsankova et al., 2004). Əvvəllər istifadə olunmuşdur: BDNF promoteri 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5 promouter: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck promoteri: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Prodinorphin promoteri: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

Statistik təhlil

Bütün məlumatlar ortalama ± standart səhv kimi təqdim olunur. Statistik fərq Tələbənin iki quyruqlu t-testi ilə təyin olundu (p <0.05). Çoxlu müqayisə edildikdə, p-dəyərlər Bonferroni düzəlişindən istifadə edərək düzəldildi.

Təşəkkürlər

Biz Will Renthal və Arvind Kumar'a faydalı müzakirələr üçün təşəkkür edirik. NİDA-ya bu təcrübələri maliyyələşdirmək üçün də təşəkkür edirik.

Dəyişikliklər

Yayımcının Rədd cavabı: Bu dərc üçün qəbul edilmiş edilmiş edilməmiş əlyazmanın bir PDF faylıdır. Müştərilərimizə xidmət olaraq, bu əlyazmanın bu erkən versiyasını təqdim edirik. Əlyazma, surətini çıxarmaq, tərtib etmək və son sübut şəklində dərc edildikdən sonra ortaya çıxan sübutların nəzərdən keçirilməsini təmin edəcəkdir. Xatırlayın ki, istehsal prosesi zamanı məzmuna təsir göstərə biləcək səhvlər aşkar edilə bilər və jurnala aid olan bütün hüquqi rəddlər aiddir.

Təsnifat şərtləri:

Bölmə: #1 Sinir sistemlərinin hüceyrəli və molekulyar biologiyası

References

Andersson M, Konradi C, Cenci MA. cAMP reaksiyası element-bağlayıcı protein dopaminə bağlı gen ifadəsinin sağlam, lakin dopamin-denervat striatum üçün tələb olunur. J Neurosci. 2001; 21: 9930-43. [PubMed]
Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. Nucleus accumbens shell-da CREB aktivliyi emosional stimullara davranış reaksiyalarının qapısını nəzarət edir. Proc Natl Acad Sci ABŞ A. 2002; 99: 11435-40. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC. Kokain müalicəsi, uyanık, sərbəst hərəkət edən siçovulların nüvəsindəki akumbens qabığında hüceyrə xolesistorisinin (CCK) artırılması, kokainə davranışla həssas olan sıçanlarda gücləndirilmiş bir təsirdir. J Neurochem. 2002; 81: 1021-7. [PubMed]
Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptones, siklik adenosin monofosfat reaksiyası elementi-bağlayıcı faktorlarla intestinal xolesistokinin gen transkripsiyasını stimullaşdırır. Endokrinoloji. 2001; 142: 721-9. [PubMed]
Bibb JA, Chen J, Teylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Kronik kronik maruziyetin təsiri nöronal protein Cdk5 tərəfindən tənzimlənir. Təbiət. 2001; 410: 376-80. [PubMed]
Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. Transformasiya faktoru CREB-in cAMP cavab elementinə hüceyrə tipinə xüsusi birləşməsi. Proc Natl Acad Sci ABŞ A. 2004; 101: 13572-7. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ. Elektrokonvulsif nöbet ve kokain tedavileri ile delta FosB ve FosB benzeri proteinlerin düzenlenmesi. Mol Pharmacol. 1995; 48: 880-9. [PubMed]
Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Beyində induksiyalı, hədəf gen ifadəsi olan transgenik heyvanlar. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang ES, Zeng L, Nestler EJ. Hipokampusa kliniki elektrokonvulsif nöbetler ile siklin bağımlı kinaz 5'un indüksiyonu: ΔFosB'nin rolu. J Neurosci. 2000; 20: 8965-71. [PubMed]
Çinenov Y, Kerppola TK. Transkripsiyanın tənzimləyici spesifikliyinə vasitəçilik edən Fos-Jun qarşılıqlı əlaqələri. Onkogen. 2001; 20: 2438-52. [PubMed]
Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Amfetamin və dopaminə neyronal adaptasiya: rat striatumda prodinorfin geninin tənzimlənməsinin molekulyar mexanizmləri. Neuron. 1995; 14: 813-23. [PubMed]
Deavall DG, Raychowdhury R, Dockray GJ, Dimaline R. STC-1 hüceyrələrində PACAP tərəfindən CCK gen transkripsiyası nəzarət. Am J Physiol Gastrointest Karaciğer Fiziol. 2000; 279: G605-12. [PubMed]
Ding XZ, Mocchetti I. Sümük striatumda xolesistokinin mRNA tərkibinin dopaminergik tənzimlənməsi. Brain Res Mol Brain Res. 1992; 12: 77-83. [PubMed]
Forrest S, McNamara C. Id transkripsiyası amilləri və damar lezyon formasyonu ailəsi. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004; 24: 2014-20. [PubMed]
Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Protein hidrolizi ilə xolesistokinin geninin transkripsiya aktivləşdirilməsi üçün sikli AMP- və kalsium-əsaslı protein kinazlarının birgə tələbi. J Biol Chem. 2002; 277: 22407-13. [PubMed]
Green TA, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. Nucleus accumbensdə ATF2, ATF3 və ATF4 aktivləşdirən transkripsiyanın (ATF) aktivləşdirilməsi və emosional davranışın tənzimlənməsi. J Neurosci. 2008; 28: 2025-32. [PubMed]
Hamilton ME, Redondo JL, Freeman A.Ş. Dropamin və xolesistokininin siçovul nüvəsinin akumbensində daşqın edilməsi, dərman preparatının verilməsinə cavab olaraq. Sinapse. 2000; 38: 238-42. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. Mitogenlə aktivləşdirilmiş protein kinaz və protein kinaz A siqnal yolları, siklik adenozin 3 ′, 5′-monofosfat cavab elementini bağlayan zülalın aktivləşdirilməsi ilə xolesistokinin transkripsiyasını stimullaşdırır. Mol endokrinol. 1999; 13: 466-75. [PubMed]
Hansen TV, Nielsen FC. Nöronal xolesistokinin gen transkripsiyasının tənzimlənməsi. Scand J Clin Lab Invest İnş. 2001; 234: 61-7. [PubMed]
Hansen TV. Xolecistokinin gen transkripsiyası: promotor elementləri, transkripsiya amilləri və sinyal yolları. Peptidlər. 2001; 22: 1201-11. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. KCl və forkolin CREB koordinasiya aktivasiyası və kooperativ CBP vasitəsilə kolesistokinin gen ifadəsini sinerjistik şəkildə tənzimləyir. J Neurochem. 2004; 89: 15-23. [PubMed]
Haun RS, Dixon JE. Sıçan xolecystokinin geninin ifası üçün vacib olan transkripsiya gücləndirici insan c-fos geninin -296 elementinə bərabər bir sıra ehtiva edir. J Biol Chem. 1990; 265: 15455-63. [PubMed]
Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. Xroniki elektrokonvulsif nöbetlərin molekulyar, hüceyrəli və davranış hərəkətlərində fosB geninin əsas rolu. J Neurosci 1998. 1998; 18: 6952-62. [PubMed]
Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Mezo-limbik nöronlarda dopamin və CCK birlikdə yaşamaq üçün sübutlar. Təbiət. 1980; 285: 476-8. [PubMed]
Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. Xroniki elektrokonvulsif nöbet (ECS) tedavisi değişen kompozisyon ve özelliklere sahip beyinde uzun süreli bir AP-1 kompleksinin ifadesini vermektedir. J Neurosci. 1994; 14: 4318-28. [PubMed]
Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Xroniki kokain və digər xroniki müalicələrlə beyindəki dəyişmiş Fos kimi zülallardan ibarət uzunmüddətli AP-1 kompleksinin indeksasiyası. Neuron. 1994; 13: 1235-44. [PubMed]
Huang KX, Walters JR. Sıçan striatumda AP-1 transkripsiyası faktorunun DNT bağlanma fəaliyyətinin dopaminergik tənzimlənməsi. Neuroscience. 1996; 75: 757-75. [PubMed]
Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. CREB tənzimlənməsini müəyyənləşdirin: transkripsiyanın faktiki tənzimləyici bölgələrinin genomun geniş analizi. Cell. 2004; 119: 1041-54. [PubMed]
Johannessen M, Delghandi MP, Moens U. Nə CREB çevrilir? Cell Siqnal. 2004; 16: 1211-27. [PubMed]
Josselyn SA, Vaccarino FJ. CCK (A) və CCK (B) antagonistlərinin siçovulların kondisyonlu fəaliyyətinin inkişafına təsirləri. Behav Pharmacol. 1996; 7: 505-512. [PubMed]
Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Sıçanlarda kokain tərəfindən istehsal olunan şərti aktivliyin alınmasına CCK (A) reseptorunun cəlb edilməsi üçün sübutlar. Brain Res. 1997; 763: 93-102. [PubMed]
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr., Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR , Nestler EJ. Beşte deltaFosB transkripsiyon faktorunun ifadəsi kokain həssaslığını nəzarət edir. Təbiət. 1999; 401: 272-6. [PubMed]
Qumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Self DW, Nestler EJ. Kromatin remodeling, striatumda kokainə səbəb olan plastisitənin əsas mexanizmidir. Neuron. 2005; 48: 303-14. [PubMed]
Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Hope BT. Kokain-sensitləşdirilmiş siçovulların nüvəli akumbenslərindəki kokainə səbəb olan CREB fosforilasiyası hüceyrə siqnal ilə əlaqəli kinazın aktivləşdirilməsi ilə təmin edilir, amma protein kinaz A. J Neurochem deyil. 2005; 95: 1481-94. [PubMed]
McClung CA, Nestler EJ. CREB və DeltaFosB tərəfindən gen ifadə və kokain mükafatının tənzimlənməsi. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-15. [PubMed]
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: beyində uzun müddətli adaptasiya üçün molekulyar bir keçid. Brain Res Mol Brain Res. 2004; 132: 146-54. [PubMed]
Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. ΔFosB: uzunmüddətli sinir və davranış plastisitəsinin molekulyar vasitəçisi. Brain Res. 1999; 835: 10-17. [PubMed]
Nestler EJ. Bağımlılıq üçün ortaq bir molekulyar yol varmı? Nat Neurosci. 2005; 8: 1445-9. [PubMed]
Nestler EJ. Bağımlılığın transkripsiyon mexanizmləri: DeltaFosB rolu. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245-55. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. DeltaFosB-nun istifadəsi ilə narkotik maddələri ilə beynin induksiyası. Sinapse. 2008; 62: 358-69. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
Rando OJ, Chang HY. Kromatin quruluşunun genom geniş görünüşləri. Annu Rev Biochem. 2009; 78: 245-71. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
Renthal W, Carle TL, Maze I, Covington HE, 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. Delta FosB, kronik amfetamin pozuntusundan sonra c-fos geninin epigenetik desensitizasiyasına vasitəçilik edir. J Neurosci. 2008; 28: 7344-9. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
Xanu G, Wilkinson M, Covington HE, 3rd, Maze I, Sikder D, Robison AJ, LaPlant Q, Dietz DM, Russo SJ, Vialou V, Chakravarty S, Kodadek TJ, Stack A, Kabbaj M, Nestler EJ. Kokain tərəfindən kromatinin tənzimlənməsinin genomun geniş analizi sirtuinlər üçün bir rol oynayır. Neuron. 2009; 62: 335-48. [PMC pulsuz məqalə] [PubMed]
Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. Mesolimbik dopamin funksiyasının xolesistokinin modulasiyası: motivasiya davranışının tənzimlənməsi. Pharmacol Toksikol. 2002; 91: 404-13. [PubMed]
Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC. Xolecystokinin gen promoterində yanmış E-qutu və cAMP / TPA reaksiyalı elementlər arasında mənfi əməkdaşlıq. FEBS Lett. 1999; 448: 15-8. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, Duman RS, Storm D, Nestler EJ. Naltrekson-çöküntülü morfin çıxarılması zamanı CRE-mediatlı transkripsiyonun regional və mobil xəritələr. J Neurosci. 2002; 22: 3663-3672. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Storm D, Nestler EJ. Amfetamin ilə siçan beynində CRE-mediatlı transkripsiyanın tənzimlənməsi. Sinapse. 2003; 48: 10-7. [PubMed]
Sheng M, McFadden G, Greenberg ME. Membran depolarizasiyası və kalsiyum transkripsiyanın əmələ gəlməsinin əmələ gəlməsi ilə c-fos transkripsiyasına səbəb olur. Neuron. 1990; 4: 571-82. [PubMed]
Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ. Akut və kronik elektrokonvulsif nöbet sonrası sıçan hipokampusunda gen stimulator bölgələrində histone modifikasiyası. J Neurosci. 2004; 24: 5603-10. [PubMed]
Ulery PG, Nestler EJ. SerxNUMX fosforilasiyası ilə DeltaFosB transkripsiyalı fəaliyyətinin tənzimlənməsi. Eur J Neurosci. 27; 2007: 25-224. [PubMed]
Vaccarino FJ. Psikostimulant mükafat və əlaqəli davranışlarda nucleus accumbens dopamin-CCK qarşılıqlı təsirlər. Neurosci Biobehav Rev. 1992; 18: 207-14. [PubMed]
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ. ΔFosB: morfin hərəkətində nüvəli akumbensdə ΔFosB üçün mühüm rol. Nature Neurosci. 2006; 9: 205-11. [PubMed]