PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
mücərrəd
Gen ifadəsində kokainə bağlı dəyişikliklər, kokain bağımlılığına bağlı ola biləcək nöronal morfoloji və davranışlarda dəyişikliklərə səbəb olur. Biz histonun 3 lizin 9 (H3K9) dimetilasyonu və kokainə səbəb olan struktur və davranışçı plastisiyədə lizin dimetiltransferaza G9a üçün mühüm rol oynadıq. Təkrarlanan kokain tətbiqi, nucleus accumbens'teki H3K9 dimetilasyonunun qlobal səviyyəsini azaldıb. Thistonun metilliliyindəki azalması bu beyin bölgəsində G9a repressiyası vasitəsilə vasitəçiliyin təmin olunduğu, kokainlə əlaqəli transkripsiya faktoru ΔFosB tərəfindən tənzimlənir. Kondensasiya mutagenezindən və virusdan irəli gələn gen köçürməsindən istifadə edərək, biz G9a aşağı tənzimlənməsi nüvə accumbens neyronların dendritik spin plastisiyasını artırdığını və kokain üçün daha yaxşı seçim etdiyini, beləliklə kokanın uzun müddətli hərəkətlərində histon metilinin mühüm rol oynadığını gördük.
giriş
Təkrarlanan kokainin ifşa edilməsi, genin ifrazatında davamlı dəyişikliklər və beynin mükafat dövrünün əsas komponenti olan nucleus accumbens (NAc) daxilində nöronal morfologiyanı dəyişdirərək xarakterizə olunur1-2). Kokain asılılığının əsasını təşkil edən bu beyin bölgəsində qüsursuz transkripsiyalı dəyişikliklər zamanı xromatin remodeling vacibdir (3-9). NAc nəticələrində kromatin quruluşunun kokain tənzimlənməsi, qismən kromatin enzimatik maşınlarının birbaşa kokainlə bağlı dəyişikliklərindən, histon asetiliyində və fosforiliyədə dəyişikliklərə səbəb olur (4, 7-9); lakin histonun metilləşdirilməsinə nəzarət edən fermentlər üçün rollar hələ araşdırılmamışdır.
Mikroarraysa (ChIP-Chip) qoşulmuş kromatin immunoprecipitasiyası istifadə edən son genom genişləndiricisi analizi təkrar kokain müalicəsi sonrasında NAc-də xüsusi gen stimulatorlarında repressiv histon H3 lizin 9 (H3K9) və 27 (H3K27) methylationinin6). Buna görə H3K9 ya da H3K27 methylation (nəzarət) olaraq bilinən çox sayda lizin metiltransferazları (KMTs) və demetilazlar (KDMs)Şəkil 1A). Yalnız iki fermentlər, G9a və GLP, təkrarlanan kokain tətbiqindən sonra 24 müddətində davamlı transkripsiya tənzimlənməsini nümayiş etdirdi, hər iki genin ifadəsi əhəmiyyətli dərəcədə azaldı. G9a və GLP xüsusilə H3K9 (H3K9me2) dimethylationini kataliz etdiyindən, onların kokain tərəfindən aşağı tənzimlənməsi bu zaman nöqtəsində müşahidə edilən ehromromatik H3K9me2 səviyyəsinin azalması ilə uyğundurŞəkil 1B). Əksinə, heterokromatik H3K27 metilinin qlobal səviyyələri təkrar kokain məruz qalması ilə dəyişməmişdir (S1 onlayn materialları dəstəkləyən şəkillər). Həm yüksək səviyyədə katalitik fəaliyyətə görə vitro və vivo ilə (10), NAc-da təkrar kokain məruz qaldıqdan sonra G9a repressiyasının funksional əhəmiyyətini daha da araşdıracağıq. G9a proteininin səviyyələri, mRNA səviyyələri kimi, təkrarlanan kokain tətbiqindən 24 saat sonra əhəmiyyətli dərəcədə azaldıŞəkil S2). NAX-da G9a mRNA ifadəsi 35% ilə azaldılıb, immunohistokimyəvi analiz təkrarlanan kokain tətbiqindən sonra H15K9me21-da müşahidə edilən 3% azalma ilə müqayisədə G9a protein səviyyəsində daha mütənasib 2%Şəkil 1B). G9a mRNA ifadəsi də bu beyin bölgəsində 20% -lə təkrarlanan kokain təkrar self-administrasiyasındanŞəkil S3).
Eoksromatik H3K9me2-də dəyişikliklərin NSc-də gen ifadəsində genom geniş dəyişiklikləri ilə əlaqəli olub-olmadığını müəyyən etmək üçün əvvəlcədən kokain məruz qalma tarixinə malik olan və ya olmayan bir heyvanın kokain dozası dozasının səbəb olduğu gen ifadəsi profillərini yoxlamaq üçün mikroarraylı analizlər tətbiq etmişik (bax. gen siyahıları S1-S3 masaları). Təkrarlanan kokain almış heyvanlar kəskin müalicə olunan heyvanlara nisbətən kokain problemindən sonra 1 saatlıq dramatik artan gen ifadəsini nümayiş etdirmişlər (Şəkil 1C). Bu artan gen ifadəsi yenə təkrarlanan kokaindən çıxarılmanın 1 həftəindən sonra verilmiş bir kokain probleminə cavab olaraq baş vermişdir. Əvvəlki hesabatlarla uyğun olaraq, genlərin kiçik bir hissəsi (~ 10%) təkrarlanan kokain tətbiqindən sonra desensitləşdirilmiş transkripsiyona cavabları göstərmişdir (Şəkil 1C; görmək Cədvəl S1) (5). Təkrarlanan kokaindən sonra müşahidə olunan güclü gen ifadəsində G9a downregulusunun rolunu birbaşa araşdırmaq üçün siçanlar GFP və ya G9a'yı ifadə edən Herpes simplex virusu (HSV) vektorlarının intra-NAc enjeksiyonlarını qəbul etdi və G9a overexpression olub-olmadığını müəyyən etmək üçün salin və ya təkrar kokainlə müalicə edildi təkrarlanan kokain səbəbli gen ifadəsinin genişləndirilməsini maneə törətmək üçün kifayət idi. Təkrarlanan kokaindən sonra ifadələrin yüksək səviyyəli göstəricilərini əks etdirən 12 təsadüfi seçilmiş genlər qrupundan biz G9a bu genlərin 50%Cədvəl S4).
G9a ifadəsinin təkrarlanan kokainlə bağlı təzyiqinə vasitəçilik edən transkripsiyanın yuxarı səviyyəli hadisələrini müəyyən etmək üçün dərhal erkən genin yüksək dərəcədə sabit tərkibli məhsulu olan ΔFosB üçün mümkün bir rolu araşdırdıq fosB. ΔFosB təkrar kokainə məruz qaldıqdan sonra NAc-da toplanır, bu da kokain mükafatının artırılması ilə əlaqədardır11). ΔFosB ya hədəf geninə asılı olaraq transkripsiyası aktivator və ya repressor kimi çıxış edə bilər (3, 5, 6, 12). Bitransgenik NSE-tTA × tetOP-ΔFosB burada ΔFosB ifadəsi böyüklər heyvanlarının NAc və dorsal striatumunda selektiv şəkildə tətbiq oluna bilər13), biz ΔFosB ifadəsinin NAX-də H3K9me2 və KMTslərin kokain tənzimlənməsinə təsirini araşdırdıq. ΔFosB overexpressiya həm H3K9me2 (Şəkil 1D) və G9a ifadəsi (Şəkil 1E), bununla da təkrar kokain təsirlərini təqlid edir. Əksinə, ΔFosB bu beyin bölgəsində GLP ifadəsini azaltmadı və SUV39HNNMXX və EZH1, H2K3 və H9K3 üçün əsas trimetilləşdirici fermentlər (Şəkil S4). Bu məlumatları müstəqil ΔFosB overexpress sistemi ilə təsdiq etmək üçün wildtype adult siçanlar GFP və ya ΔFosB ifadə edən Adeno ilə əlaqəli virus (AAV) vektorlarının ikitərəfli NAc inyeksiyalarını qəbul etmişdir. Virus vasitəsi ilə ΔFosB bu beyin bölgəsində G9a ifadə səviyyəsini aşağı saldıŞəkil 1E).
G9a-nın bu cür müəyyən və xüsusi tənzimlənməsi bizi NAc neuronlarında G9a ifadəinin dəyişdirilməsinin kokain davranışlarına cavab verdiyini araşdırmağa yönəldirdi. Wildtype siçanlar GFP və ya G9a ifadə edən HSV vektorlarının intra-NAc inyeksiya qəbul etdi və sonra dərman mükafatının dolayı bir ölçüsünü təmin edən qərəzsiz kokain şərtli yer seçimi paradiqmasını istifadə edərək təhlil edildi. NAc neyronlarındakı G9a virus anonsuzluqları davranış testindən sonra təsdiq edildi (Şəkil 2A). G9a overexpressiya GFP-ni aşan heyvanlarla müqayisədə kokainə üstünlük vermişdir (Şəkil 2B) və NAc-da H3K9me2 səviyyəsini artırdıŞəkil 2C). G9a (G9aH1093K) katalitik cəhətdən ölü bir mutantın aşkara çıxarılması (14) kokain seçimini təsir etmədi (Şəkil 2B) və bu beyin bölgəsində H3K9me2 səviyyəsinə təsir etməmişdir (Şəkil 2C).
G9a 'nın kokain davranış təsirlərində rolunu daha da öyrənmək və daha dəqiq olaraq, NAc-da G9a ifadəsinin təkrarlanan kokainə səbəb olan repressiyasını təqlid etmək üçün, yetkin G9afl / fl siçan (14), Cre recombinase və ya GFP'yi bir nəzarət kimi ifadə edən AAV vektorlarının intra-NAc enjeksiyonlarını qəbul etmişdir. NAX-da G9a-nın AAV-Cre knockdown, immunohistochemically təsdiq edilmişdir (Şəkil S5), kokainin yerdəki kondisioner sınaqlarında təsirlərini əhəmiyyətli dərəcədə artırdı və NAc-da H3K9me2 səviyyəsini azaldıŞəkil 2D, E). G9a və GLP, BIX01294 (15-16), fermentin inhibisyonunun kokain davranışlarına qarşı təsirlərinin olub-olmadığını müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir. Həqiqətən, G9a və GLP-in farmakoloji inhibisyonu kokainə üstünlük verir və NAc-da H3K9me2-ni azaldırŞəkil 2F, G).
Kokanın təkrar idarə edilməsi, NAc orta spiny nöronlarda dendritik spinlərin sıxlığını artırır (17), bu nöronlara eksitatör glutamateriqik sinapslarda funksional dəyişikliklərlə əlaqəli bir proses18-19) və dərmanlara həssas davranış reaksiyaları (17, 20). Beləliklə, biz təkrar kokain tərəfindən NAc-da G9a fəaliyyətinin aşağı tənzimlənməsinin kokainin NAc nöronlarının dendritik bel yoğunluğunu tənzimləmək qabiliyyətinə vasitəçilik edə biləcəyini fərz etdik. Anti-G9a antikoru olan kromatin immunopresipitasiyası (CHIP) istifadə edərək, hər birinin daha əvvəl kokainə səbəb olan dendritik plastisiyaya (əvvəlcədən təyin edilmiş) olan NAc-də bir neçə proqnozlaşdırıcı G9a gen hədəfini təyin etdik (Şəkil 3A) (20-26). Təkrarlanan kokain administrasiyasının G9a bağlamasını, həmçinin bu gen stimulatorlarında (H3K9me2 səviyyələrini)Şəkil 3B). Əksinə, kəskin kokain idarəsi sürətlə G9a-nı bu eyni gen stimulatorlarından bəzilərinə cəlb edir, kəskin doza kokaindən sonra NAc 9 saatında müşahidə edilən G1a artımına uyğun gəlirŞəkil S6). Xüsusi gen promoterlərindəki G9a məcburi ifadəsində dəyişikliklərlə əlaqəli olmasına baxmayaraq, bu cür hadisələrin NAc-da dəyişmiş qlobal səviyyədə və / və ya akut sonrası G9a-də fərqi ilə dəyişikliyi ilə bağlı olub-olmadığı aydın deyil vs Təkrarlanan kokain idarəsi.
NAc-da çoxsaylı plastikləşmə ilə əlaqəli genlərin G9a tənzimləməsinə əsasən biz təkrarlanan kokain müalicəsi sonrasında bu beyin bölgəsində G9a ifadəsinin saxlanmasının kokainlə əlaqəli dendritik omurum formasiyasının qarşısını almaq üçün kifayət qədər olub olmadığını araşdırdıq. Əvvəllər NAc-də dendritik bel induksiyasını təşviq etmək üçün nümayiş etdirilən bir kokain müalicə protokolundan20), ya HSV-GFP ya da HSV-G9a ilə enjekte edilən heyvanlarda bel yoğunluğunu inceledik. Əvvəlki tapıntılarla razılaşdıqda, kokain müalicəsi sonrasında NAc-də dendritik bel yoğunluğunda əhəmiyyətli bir artım gözlədik, G9a overexpression (Şəkil 3C). Yalnızca G9a aşırı ekspresyonu kokain olmaması halında NAc dendritik bel yoğunluğunu azaltmaq üçün kifayət etmədi. Bu məlumatları tamamlamaq üçün G9afl / fl HSV-Cre'in intra-NAc inyeksiya və sümük yoğunluğunun alındığı siçanlar miqdarını təyin etdi və kokain olmadığı halda HSV-GFP qəbul edən heyvanlarla müqayisə edildi. G9a ifadəsinin knockdownu, NAc orta spiny nöronlarda bel ağacının sıxlığını əhəmiyyətli dərəcədə artırdı (Şəkil 3C).
Təkrarlanan kokaindən sonra NAc-da G9a aşağı tənzimlənməsinin ΔFosB tərəfindən vasitəçiliyinə dair sübutlar nəzərə alındıqdan sonra, bu transkripsiya faktoru NAc dendritik spinlərin tənzimlənməsində iştirak edirmi?. ΔFosB əvvəlcədən belə bir dendritik plastisitə ilə əlaqələndirilməməsinə baxmayaraq, Cdk5 və NFKB alt birləşmələri də daxil olmaqla bir çox hədəfləri belə təsirlənmişdir (20-23), NAc neyronlarında ΔFosB-nin davamlı ifadəsi təkrar kokain müalicəsindən sonra dendritik bel yoğunluğunun artması ilə əlaqələndirilir (27). Birincisi, biz aşkar etdik ki, ΔFosB nin bitkəsiz siçanlarda kokain olmaması halında, G9a və H3K9me2 ifadəsiniŞəkil 1D, E), G9a-nın çoxlu plastisiyaya aid genlərə bağlanması, onların bir çoxunun ΔFosB özünün birbaşa hədəfləri olduğu göstərilmişdir (Şəkil 3D) (3, 6). Bundan əlavə, NAc-da ΔFosB'ün virusun aşırı ekspresyonunun bazal şəraitdə dendritik bel yoğunluğunu əhəmiyyətli dərəcədə artırdığını göstərdik, təkrarlanan kokain tətbiqindən sonra müşahidə edilənŞəkil 3E). Əksinə, ΔFosB transkripsiyası fəaliyyətini antagonize edən dominant bir mənfi mutant protein olan ΔJunD NAc-də aşırı ekspresiya, təkrar kokainin NAc-də dendritik omurumun formalaşması qabiliyyətini blok etdi (Şəkil 3C).
ΔFosB NAX-da G9a ifadəsini tənzimləyir və ΔFosB və G9a eyni hədəf genlərin bir hissəsini təşkil etdiyimiz müşahidələrimiz bizə ΔFosB və G9a arasında digər qarşılıqlı əlaqələri araşdırmağa gətirib çıxardı. G9a səviyyələri artdıqda, kəskin kokaindən sonra G9a-nın bağlanmasına fosB G9a ifadəsi ləğv edildikdə təkrar kokaindən sonra, G9a fosB gen azaldıŞəkil 3A). Təkrarlanan kokain sonrası belə bir azalma G9a bağlanması müşahidə edilmədi c-fos, G9a bağlama təkrar kokain (Şəkil S7). Bu, fərqli olduğu ilə uyğun gəlir fosB, c-fos xroniki psixostimulyar təsirlərlə pozulmuş, buna yol verilməmişdir (5). Bitransgen siçanlarda ΔFosB aşırı ekspresyonu, G9a-nın bağlanmasına fosb gen (Şəkil 3D). Bundan başqa, G9a overexpressiya təkrarlanan kokain tətbiqindən sonra artmış ΔFosB ifadəsini azaltmaq üçün kifayət idi (Cədvəl S4). Bu məlumatlar bir autoregulatory loop göstərir ki, G9a ilk növbədə ΔFosB'nin aktiv kokain tətbiqi ilə indüksiyasını məhdudlaşdırır. Lakin, ΔFosB təkrarlanan dərman pozuntuları ilə birikirsə, G9a'yı təzələyir və bununla da özünün daha da induksiyasını gücləndirir.
Nəticədə, biz NAc-da histonun lizin metilinin kokainə cavab olaraq neyronal gen ifadəsini tənzimləməsində iştirak etdiyini nümayiş etdirdik. Təkrarlanan kokain tətbiqindən sonra G9a və H3K9me2-nun təzyiqləri, qismən, dendritik plastisitenin aberrant formalarını tənzimləyən çoxsaylı genlərin transkripsiya aktivləşdirməsi vasitəsilə kokain seçimini təşviq edir. Bu mexanizmlər vasitəsilə tənzimlənən genlərin daha yaxşı başa düşülməsinə nail olmaq, narkotik asılılığının kompleks bioloji əsasları haqqında biliklərimizi artıracaq və asılılıq pozuntularının daha təsirli müalicələrinin inkişafına kömək edə bilər.
Material və metodlar
Heyvanlar və müalicələr
Müəyyən edilməmiş halda, siçanlar 12 saat işıqlı / qaranlıq dövrü (7: 00 AM-dan 7: 00 PM-a qədər olan) ilə sabit bir temperaturda (23 ° C) olan bir kolonda dörd-beş qəpikdə yerləşdirilib ad libitum Suya və qidaya çıxma. Bütün heyvan protokolları UT Cənub-Şərqi Tibb Mərkəzində və Sinay Tibb Tədqiqat Məktəbində IACUC tərəfindən təsdiq edilmişdir.
Kokain təcrübələrinə görə [immunohistochemitry, qərb blotinqi, kəmiyyət PKR (qPCR), mikrovrays analizi və xromatin immunoprecipitasiyası (ChIP)), 8-10-həftəlik kişi C57BL / 6J siçanlarına istifadə edilmişdir. Heyvanlar 'salin' (7 müalicəsi salinası, ip), 'kəskin' kokain (6 müalicəsi salinası + bir müalicə 20 / kq kokain-HCl, ip) və ya 'təkrarlanan' kokain (7 müalicəsi 20 mg / kq) kokain-HCl, ip). Siçanlar son müalicədən sonra 1 saatda və ya 24 saatda qurban verildi. Mikroarray tədqiqatları üçün heyvanlar gündə 'salin' (15 müalicəsi salinası, ip), 'kəskin' kokain (14 müalicəsi salin + 1 müalicəsi 20 / kq-koksin HCl, ip), təkrarlanan + kəskin 'kokain 7 müalicələri salin + 8 müalicəsi 20 mg / kg kokain-HCl, ip) və ya 'təkrar çəkilmə + kəskin' kokain (7 müalicəsi 20 mg / kq kokain-HCl + 7 müalicələri salin + 1 müalicə 20 mg / kg kokain HCl, ip) və son müalicədən sonra 1 saat qurban verildi. Davranış təcrübələrində, siçanlar tək başına post-cərrahiyə edildi və aşağıda təsvir edilən 10 mg / kq kokain-HCl, iplə müalicə edildi. HSV-GFP və HSV-G9a-GFP infeksiyasından sonra dendritik omuz analizi və mikroarray validasiya üçün siçanlar "salin" (5 müalicəsi salin, ip) və ya 'təkrar kokain' (5 müalicəsi 20 / kg kokain-HCl, ip ), bu enjeksiyon protokolunun, Herpes simplex virusu (HSV) transgen ekspresyonu süresince çekirdek accumbens (NAc) nöronları üzerinde omurga sıxlığının artması üçün gösterildiği kimi, 3 gün boyuncaƏlavə ref S1). Dendritik spinal analiz üçün istifadə olunan siçanlar sonuncu müalicədən sonra 4 saat fəda edildi.
NAc neyronları ilə məhdudlaşdırılmış G9a transkriptinin lokal silinməsinə səbəb olmaq üçün başqa yerlərdə ətraflı təsvir edilmiş bir floxed G9a allele üçün mutasiya siçanlarını homozigot istifadə etdik (S2). Kre ilə yaranan rekombinasiya exon 22-nun 25-ə qoşulmasından asılıdır, mutasiya edilmiş transkriptin əsassız vasitəçiliyinə gətirib çıxarır. C9BL / 57J siçanlarına tamamilə geri dönmüş olan G6a floxed siçanlardan istifadə etdik. Siçanlar 2 və 7 həftə yaşları arasında GFP və ya Cre-GFP ifadə edən Adeno ilə əlaqəli virus (AAV) vektorları (serotip 10) ilə NAc-ə sterotaksial olaraq enjekte edilmişdir. İmmünohistokimyəvi analiz, Cre-vasitə ilə birləşən rekombinasiyanın effektivliyini yoxlamaq üçün istifadə edilmişdir (bax Əlavə Şəkil S5). 21 gündən sonra cərrahiyyə əməliyyatı etdikdən sonra, G9a-da floxed siçanlarda rekombinasiya bu zaman nöqtəsində sabit və maksimal idi, nəşr olunmuş hesabatlaraS3-S4). G9a və ΔJunD overexpression təcrübələri ya GFP, wildtype G9a-GFP, katalitik olaraq ölü G9aH1093K-GFP və ya ÄJunD-GFP (ifadə S2 G9a konstruksiyalarının inkişafı ilə bağlı ətraflı məlumat üçün). İmmunohistokimya vasitəsilə müşahidə olunduğu kimi, HSV siçanların həddindən artıq ekspress səthləri 3 gündən sonra əməliyyatdan istifadə edilmişdir. HSV ekspresyonunun geçici niteliğine ve AAV ekspresyonunun daha istikrarlı doğasına bağlı olarak, hızlı, kısa süreli transgen ekspresyonu gerektiren deneylerde HSV vektörler kullanıldı, AAV vektörler ise uzun süreli transgene ekspresyon gerektiren deneylerde kullanıldı. Hər iki vektor, əvvəlcədən geniş tədqiqatlarda, affenent və efferent nöronların heç bir infeksiyasına yol açmadan, enjekte edilmiş beyin sahəsində yalnız nöronal hüceyrə orqanlarına yoluxdurmaq üçün göstərilmişdir.
Farmakolojik G9a / GLP inhibitörü, BIX01294 (25 ng / μl) istifadə edən davranışçı təcrübələr üçün, siçanlar NAc daxil iki deri altı mini pompalarla yanaşı ikitərəfli guide cannula ilə sterotaksial olaraq implantasiya edilmişdir. Mini-pompalar, 12 gün üçün hər hansı bir vasitənin (0.25 hidroksipropil β-siklodekstrin) və ya dərmanının davamlı çatdırılması (5 μl / saat) başlatdıqdan implantasiyadan 14 saat əvvəl aktivləşdirilib, zamanı zamanı davranış qiymətləndirmələri aparıldı.
ΔFosB aşırı ekspress sınaqları üçün [western blotting, qPCR və ChIP], kişi bitransgenik NSE-tTA × tetOP-ΔFosB siçan istifadə edildi (10 həftəlik), tetrasiklin törəməsi doksisiklin (8 həftədə doxycycline) olmadığı təqdirdə heyvanlar sağlam striatal məhdudlaşdıran ΔFosB (S5). Bu siçanlarda ΔFosB overspression qPCR vasitəsilə təsdiq edilmişdir. NSE-tTA × tetOP-ΔFosB siçanlar, wildtype 8-həftəlik C57BL / 6J kişi siçanları GFP və ya ΔFosB-GFP ifadə edən AAV vektorları ilə sterotaksial olaraq inteqrasiya olunmuş NAc idi. Bu vəziyyətdə AAV vektorları 8-də postoperativdən sonra maksimal ΔFosB ekspresyonunu təmin etmək üçün istifadə edilmişdir, bu da viral yoluxmuş və bitransgenik ΔFosB aşırı ekspress siçanlar arasında birbaşa müqayisə etməyə imkan verir. 8 həftəsində cərrahiyyə sonrası qPCR istifadə edilərək viral overexpressiya təsdiqləndi (15-gauge NAc püskürtmələri enjeksiyon sahəsindəki diseksiyonlar nəticəsində). QPCR üçün istifadə olunmayan AAV-GFP və AAV-ΔFosB-GFP siçanları 14 həftəsində başlayan salin (14 müalicəsi salin, ip) və ya təkrar kokain (30 müalicə 6 mg / kq kokain-HCl, ip) Əməliyyat. Son müalicədən sonra 4 gün, beyinlər bir vibratome bölünmüş və dendritik omba analiz üçün istifadə 4% paraformaldehid ilə sabit edilmişdir.
Western blot təhlili
14-gauge NAc zərbələri paslanmayan polad siçan beyin matrisi istifadə edərək əldə edilən 1 mm koronal bölmələrdən alınmışdır və proteaz və fosfataz inhibitorlarını ehtiva edən 1 M HEPES lizis tamponu (1% SDS) ilə sonikləşdirilmişdir. 10-30% -i SDS jelində ümumi protein xNUMX μg nümunələri elektroforez edilmişdir. Proteinlər PVDF membranlarına köçürüldü və anti-H18K3me9 (siçan monoklonal, 2: 1), anti-β-tubulin (siçan monoklonal, 500: 1), anti-total histon H60,000 (quyon poliklonal, 3: 1), anti-GFP (punched toxuma bərabər viral ifadə yoxlanılması üçün istifadə olunur) (quyon poliklonal, 5,000: 1), anti-H1000K3me27 (quyon poliklonal, 3: 1) və ya anti-aktin antikorları (siçan monoklonal, 500: 1) 60,000 ° C (bütün membranlar 4% sütdə və ya 5% bovin serum albumində bloklandıldı). Membranlar daha sonra peroksidaz etiketli ikincil antikorlarla inkubasiya edilmişdir (5: 1-1: istifadə olunan əsas antikordan asılı olaraq 60,000) və bantlar SuperSignal West Dura substratı ilə görüntülendi. Bantlar NIH Image J Software ilə ölçülmüş və H3K9me2 bantları aktin və ya β-tubulin və bərabər yükləmə üçün nəzarət etmək üçün total histon H3 normallaşdırılmışdır. Təkrarlanan kokainin aktin səviyyəsinə təsir etməməsi (Şəkil S8) və ya ümumi histon 3 (Şəkil S1) NAc. Bundan əlavə, HSV-G9a-GFP və HSV-G9aH1093K-GFP infeksiyası NAc-da ümumi β-tubulin səviyyəsinə təsir göstərməmişdirŞəkil S8).
İmmünohistokimya
Siçanlar xloral hidratın öldürücü dozası ilə sedatlaşdırılmış və 4% paraformaldehid ilə əvvəllər təsvir edilən tək və ya ikiqat immunohistokimya ilə analiz edilmədən əvvəl perfüze edilmişdirS6). Qısacası, post-sabit beyinlər 30 μm-də bölünməzdən əvvəl 35% sukrozunda gecə otaq temperaturunda inkubasiya olunmuşdu (dendritik omba analizi üçün istifadə olunan beyinlər 100% sukroz olmaması halında 30 μm bölmələrdə vibratome üzrə bölünmüşdür). Pulsuz süzülmüş NAc bölmələri 1X PBS ilə yuyulur, bloklanır (3% normal eşşəkarı serum, 0.1% tritonX, 1X PBS) və sonra anti-GFP (toyuq poliklonal, 1: 8000) və / və ya anti-G9a (quyon poliklonal , 1: 500) antikorları məhdudlaşdıran həll edir. Dendritik spinlər üçün analiz edilən bölmələr 1-da 200-da bir dovşan poliklonal anti-GFP antikoru ilə kuluçkalanmışdı. Gecə inkübasyonundan sonra, NAc bölmələri 3 PBS ilə 10 dəqiqə üçün 1 dəfə yuyulurdu, sonra 2X-də 3X PBS bloklama həllində Cy1 və / və ya Cy2 floresan coupled ikincili antikorlarla inkubasiya edildi. Morfologiya tədqiqatları üçün istifadə olunan bölmələr orta dərəcəli antikorda gecə otaq temperatüründə inkubasiya edilmişdir. Nüvə partlayış, 1X dəqiqə üçün DAPI (1: 50,000) olan 10X PBS bölmələrində inkübe edilməklə əldə edilmişdir. Bölmələr bir dəfə daha yuyuldu, sonra etanolun dehidrasiyası və DPX ilə montaj edildi. Bütün bölmələr konfokal mikroskop vasitəsilə istifadə edilmişdir.
RNT izolyasiyası və qPCR
İkitərəfli 14 gauge NAc zımbaları Trizolda homogenləşdirildi və istehsalçının göstərişlərinə uyğun olaraq işləndi. RNA RNAesy Micro sütunları ilə təmizləndi və spektroskopiya ilə RNA 260/280 və 260/230 rasionlarının> 1.8 olduğunu təsdiqlədi. Daha sonra RNA, Bio-Rad iScript Dəstindən istifadə edərək əks transkripsiyaya məruz qaldı. cDNA, SYBR Green istifadə edərək qPCR tərəfindən təyin edilmişdir. Hər bir reaksiya iki və ya üç dəfə işlənmiş və əvvəllər normallaşma nəzarəti olaraq gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) istifadə edildiyi kimi describedCt metodundan sonra analiz edilmişdir (S7). Görmək Əlavə Cədvəl S5 mRNA primer sekansları üçün.
DNT mikroarraylı analiz
3 mikrosərilərinin ümumi qrupu olan mikroarray işi üçün dörd qrup (qrup başına 12 müstəqil bioloji replikasiya) istifadə edilmişdir. Son kokain enjeksiyasından sonra 1 saat sürən heyvanlar sürətlə kəsilmiş və beyinlər çıxarılmış və buz üzərində yerləşdirilmişdir. NAc-nin ayrılması 15-gauge iynə vuruşu ilə çəkilmiş və RNT-nin çıxarılana qədər tez quru buzda dondurulmuşdur. İki tərəfli zərbələr qrup başına 12 faresinin həcmini əks etdirən dörd heyvandan birləşdirildi. RNT izolyasiyası, mikroarray emalı və məlumatların təhlili daha əvvəl açıqlandığı kimi yerinə yetirilmişdir (S8). Qısaca, RNT yuxarıda göstərildiyi kimi təcrid olunmuş və təmizlənmiş və Agilent-in Bioanalizatoru ilə keyfiyyəti yoxlanılmışdır. Illumina MouseWG-6 v2.0 massivlərinə əks transkripsiya, amplifikasiya, etiketləmə və hibridləşdirmə UT Southwestern-in mikroarray nüvəsi tərəfindən standart prosedurlardan istifadə edilərək həyata keçirilmişdir. Xam məlumatlar Beadstudio proqramı istifadə edilərək fon çıxarıldı və normativləşdirildi. Normallaşdırılmış məlumatlar GeneSpring proqramı istifadə edilərək təhlil edildi və ümumistlər, p <1.3 p-dəyəri olmayan kəsiklə birləşdirilən 0.05 qat dəyişiklik kəsikinin əhəmiyyət meyarları istifadə edilərək yaradıldı.
Bu məlumatlara bir neçə səbəbdən yüksək dərəcədə etibar edirik. Birincisi, bütün heyvanlar eyni şərtlər altında eyni zamanda, işlənmiş, müalicə olunmuş və öldürülmüşdür. Eyni zamanda bütün RNK və dizi emal eyni zamanda həyata keçirildi. İkincisi, biz üçqat dizilişlər etdik və array nümunəsi başına birdən çox heyvan yığdıq, buna görə fərdi dəyişkənlik və artan statistika gücüS9). Üçüncüsü, bizim işimiz üçün istifadə olunan məlumatların təhlili meyarları MicroArray Keyfiyyətin idarə edilməsi layihəsi tərəfindən tövsiyə olunur, çünki bu meyarlar yüksək səviyyədə intersitiv reproducibility və inter-və sitopraktiv təkrarlanabilirlik təmin etmək üçün təsdiq edilmişdir (S10-S11).
Viral vektorların tikintisi
Viral vektorun yerləşdirilməsi ölçüsü məhdudiyyətləri səbəbindən ya wildtype G9a (G9a) ya da katalitik olaraq ölü G9a (G9aH1093K) üçün kodlama ardıcıllığı insan dərhal erkən sitomeqalovirus promoterinin (CMV) (G1005a) nəzarətində GFP ifraz edən bicistronic p9 + HSV plazmidinə alt klonlandı insertion ölçüsü ~ 3.96 kb, AAV-2 vektorları üçün maksimum əlavə ölçüsünü aşdı). IE4 / 5 promoteri G9a ifadəsini idarə edir. Fragmanlar, Klenow müalicə PmeI və EcoRI digested G1005a (pcDNA9-dən) və EcoRI digestionundan sonra CIP-müalicə olunan p3.1 + ilə blunt son ligations vasitəsilə bicistronic p1005 + HSV plazmidinə alt klonlandı. HSV-ΔJunD-GFP istehsalı üçün, EcoRI məhdudlaşdırma sahələri ilə yaranan ΔJunD kodlama ardıcıllığı EcoRI sahəsini əhatə edən primer oligonükleotidlərdən istifadə etməklə PCR tərəfindən yaradılıb. PCR məhsulu daha sonra p1005 + vektorunun EcoRI saytına qoşulmuşdur. NAc neyronlarında Cre recombinase'in yerli ifadəsi, AAV vektorunu istifadə edərək viral vasitə ilə aparılmış gen çatdırmaqla əldə edilmişdirS12). GFP və ya GFP-dən Cre-a bir N-terminal füzyonu bir splice donor akseptor sekansı və poliadenilasyon siqnalı bir CMV promoterini ehtiva edən bir rekombinant AAV-2 vektoruna subklonlandı. Bütün vektor ekstraktı dideoksi-sequencing tərəfindən təsdiq edilmişdir. Viral vektorlar əvvəllər təsvir edilən üçlü transfeksiyon, köməksiz üsullaS13). Təmizlənmiş virus -80 ° C-də saxlanılır. Viral keyfiyyət HEK293 hüceyrələrində qiymətləndirilən yoluxucu titerlə qiymətləndirilmişdir. AAV-ΔFosB-GFP virusları eyni şəkildə hazırlanmışdır. HSV-Cre üçün Cre ifadəsi İRENUMX / 4 promoterindən fərqli olaraq İRES-in təşəbbüskarı tərəfindən idarə olundu və Cre'in ifadəsini minimuma endirmək və nöronal toksisiteyi S14 virus quruluşu üçün). Hər halda, hər ikisi də viral overspression təsdiq edilmişdir vitro və in vivo qPCR vasitəsi ilə viruslar immunohistokimyasal olaraq əməliyyatdan sonra NAc-məhdud ifadəsini göstərmək üçün təsdiq edildi.
Stereotaksik cərrahiyyə
Ketamin altında (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg) anesteziya, siçanlar kiçik bir heyvan stereotaksik alətdə yerləşdirilib və kranial səthə məruz qaldı. 0.5 μl (AP + 10; ML + 1.6; DV-1.5) 4.4 μl / min dərəcəsi ilə NAc-yə 0.1 μl virüsünü iki tərəfli şəkildə iki dəfə endirdikdən sonra otuz üç ölçülü şpris iğnesi istifadə edilmişdir. HSV enjeksiyonlarını alan heyvanlar, əməliyyatdan sonra 2 gün ərzində bərpa edilərək, AAV vektorlarını qəbul edən davranış testi üçün istifadə olunan siçanların 20 günə qədər kondisioner yerləşdirilməsindən əvvəl bərpa olunmasına icazə verildi. Bu zamanlar iki vektor üçün maksimal viral vasitəçiliyi olan transgen ifadəsinin dövrləri ilə uyğundur. BIX01294 infüzyonları üçün iki mini pompanın hər biri siçan arxasına subkutan yerləşdirildi. Cannulae yerləşdirmə NAc üzərində iki kiçik kranial deşik qazma və qanadının bregma (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4) dən çatdırılması ilə əldə edilmişdir. Siçanlar 4-ə əməliyyatdan 5 gün əvvəl yerkökü prosedurasını aşağıda göstərildiyi kimi kokainə qədər bərpa etməyə icazə verildi.
Kondisyonlu yer üstünlüyü
Yerin kondisionerləşdirilməsi proseduru əvvəlcədən təsvir edilən kimi, aşağıdakı dəyişikliklərlə (S7). Qısaca, HSV-G3a-GFP, HSV-G9aH9K-GFP və ya HSV-GFP-nin daxili NAc infuziyalarından 1093 gün sonra, siçanlar üç fərqli mühitdən ibarət olan kondisioner otaqlarına yerləşdirildi. İki kondisioner otağından hər hansı birinə əhəmiyyətli dərəcədə üstünlük verən siçanlar tədqiqatdan kənarlaşdırıldı (bütün heyvanların <% 10-u). Kondisioner qrupları daha sonra mövcud ola biləcək hər hansı bir otaq qərəzinə uyğunlaşmaq üçün balanslaşdırılmışdır. Sonrakı günlərdə heyvanlara fizioloji maddə enjekte edildi və günortadan sonra 30 dəqiqəlik bir kameraya salındı və sonra kokain (10 mq / kq, ip) enjekte edildi və 30 gün axşam digər kameraya 2 gün (iki salin və iki kokain cütlüyü). Sınaq günü siçanlar 20 dəqiqə müalicə edilmədən aparata geri yerləşdirildi və hansını seçdiklərini qiymətləndirmək üçün sınaqdan keçirildi. Kokainə lokomotor reaksiyalar dərman müalicəsinin effektivliyini təmin etmək üçün kokain cütlü otaqlarda şüa fasilələri ilə qiymətləndirilmişdir. AAV və BIX01294 CPP təcrübələri üçün bir az dəyişdirilmiş protokol istifadə edilmişdir. Heyvanlara yenidən fizioloji və ya kokain (10 mq / kq, ip) enjekte edildi və 30 dəqiqəlik iclaslar üçün xüsusi otaqlarda məhdudlaşdırıldı, ancaq bunun əvəzinə gündə 4 dəfə gündə bir dəfə, sonra 5-ci gündə test aparıldı (heyvanlar şərtləndirildi) axşam və kondisioner müalicələri növbə ilə dəyişdirildi). Bütün qruplar üçün lokal lokalizasiyanın viral və ya inhibitor müalicəsindən təsirlənməməsini təmin etmək üçün duzluğa cavab olaraq başlanğıc lokomoziya qiymətləndirilmişdir.
İntravenöz kokain özünü idarə etmə
Təcrübənin başlanğıcında 230-250 g ağırlığında olan ergenlər Long-Evans siçovulları əldə edildi. Onlar 12 saatlıq işıqlı / qaranlıq dövründə (9: 00-da işıqlar) bir rütubət və temperatur nəzarətində mühitdə yerləşdiriliblər. ad libitum qida və suya çıxış. Siçovulların yeni mühitlərdə uyğunlaşmasına icazə verildi və gündəlik sınaqdan əvvəl 1 həftəyə baxıldı. Bütün prosedurlar Laboratuvar Heyvanlarının Qulluq və İstifadəsi üzrə Səhiyyə Milli İnstitutunun təlimatlarına uyğun olaraq aparılmış və Sinay dağının Heyvan Təminatı və İstifadəsi Komitəsi tərəfindən təsdiq edilmişdir. Özünü idarəetmə avadanlıqları lokomotor hərəkətləri ölçmək üçün infraqırmızı şüaları ilə təchiz edilmişdir. Özünü idarəetmə əvvəllər olduğu kimi həyata keçirilmişdir (S15-S16) izofluran (2.4-2.7%) anesteziyası altında sağ boyun venasına yerləşdirilmiş kateterlərlə. Kateterlər 0.1 U heparin və ampisilin (10 mq / kq) olan 50 ml salin məhlulu ilə yuyulur. Əməliyyatdan bir həftə sonra sağaldıqdan sonra işıq / qaranlıq dövrünün qaranlıq mərhələsində özünütəsdiq təlimləri başladı. Sabit nisbət-3 (FR0.75) möhkəmləndirmə cədvəli altında heyvanlara gündəlik 1 saatlıq kokainə (1 mg / kq / infuziya) icazə verildi, burada 1 aktiv qolu basaraq dərmanın tək bir infuziyası ilə nəticələndi. Siçovullar 6 gündən sonra kokain qəbulunu sabitləşdirdi (ardıcıl 15 gün ərzində reaksiya nisbətində <3% dəyişmə, ən azı 75% möhkəmləndirilmiş qola cavab verməklə). Son özünüidarə sessiyasından 24 saat sonra siçovulların başı tez kəsildi, beyinləri sürətlə çıxarıldı və RNA təcrid və qPCR üçün işləndi.
Kromatin immunoprecipitation (ChIP)
Təzə NAc yumruqları formaldehidə çapraz bağlıdır və əvvəlcədən təsvir edilmiş CHIP üçün hazırlanmışdır (S17-S18) kiçik dəyişikliklər ilə. Qısaca, heyvan başına 4 14-gauge NAc yumruları (nümunə ilə birləşdirilmiş 5 heyvanlar) toplanmış, 1% formaldehid ilə əlaqələndirilmiş və 2 ° C-də dondurmadan əvvəl 80 M glisinlə söndürülmüşdür. Nümunə sonication əvvəl 1 gün, qoyun anti-tavşan / siçan (yağış antikoru asılı olaraq) IgG maqnit boncuklar anti-G9a (dovşan poliklonal ChIP grade) və ya anti-H3K9me2 (siçan monoklonal ChIP grade) ilə müvafiq maqnit boncuklar inkubasiya tərəfindən hazırlanmışdır, blok halında sabit dönüş altında 4 ° C'de bir gecədə antikorlar. Doku sonication və kromatin kəsmə əvvəllər təsvir edilmişdirS17). Sonication sonra, kromatin bərabər konsentrasiyaları yeni borular köçürülüb və son məhsulların ~ 5% 'giriş' nəzarət kimi xidmət saxlanılır. Konjuge boncuk / antikor qarışıqlarının hərtərəfli yuyulması və yenidən süspansiyondan sonra, hər bir kromatin nümunəsinə bərabər həcmdə antikor / dəmir qarışıqları (~ 7.5 μg antikor / nümunə) əlavə edildi və 16 ° C da daimi fırlanma zamanı ~ 4 saat üçün inkubasiya edildi. Nümunələr, bir PCR təmizləyici dəsti ilə DNA təmizlənmədən əvvəl bir gün gecə 65 ° C'de yuyulur və tərs keçid edilir. DNT təmizlənməsindən sonra nümunələr qPCR-a məruz qaldı və əvvəlcədən təsvir edilən müvafiq 'giriş' yoxlamalarına normalləşdirildiS17). Bir siçan poliklonal anti-IgG antikoru istifadə edən normal siçan IgG immunoprecipitations də siqnal amplification müvafiq zənginləşdirilməsi nəzarət etmək üçün həyata keçirildi. Adenine fosforibosiltransferaz (APRT) kokain və ΔFosB oversexpression təcrübələri üçün mənfi nəzarət kimi istifadə edilmişdir. Görmək Əlavə Cədvəl S5 promoter primer sekansları üçün.
Dendritik omuz analizi
İn vivo-da nöronal morfologiyanın tənzimlənməsində G9a rolunu öyrənmək üçün əvvəllər aşağıdakı modifikasiyalarlaS1). HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (bütün viruslar wildtype C57Bl / 6J siçanlarında) və ya HSV-Cre-GFP (G9afl / fl fareler), viral ifadə maksimal olduqda, siçanlar perfüze edilmişdir, beyinlər cryoprotected və daha sonra vibratome 100 μm bölündü. Bölmələr daha sonra yuxarıda təsvir edilən GFP qarşı bir antikor istifadə immunostained edilmişdir (bax Immunohistochemistry). G9a aşırı ekspresyonu ve nakavtın omurga sayısına etkilerini ve ΔJunD aşırı ekspresyonunun etkisini değerlendirmek için, GFP eksprese eden NAc ortamından en azından 1 μm'lik sekonder dendritlere eşit olan nöron başına yaklaşık 2-299 nöuritte sarkma sayısını ölçdük spiny nöronlar (MSNs). MSNlərin NAc-da digər neyronal populyasiyalardan morfologiyadan fərqli olduğunu və HSV'nin bu beyin bölgəsində nöronları ifadə edən DARPP-32-ə yoluxduğunu bildirən əvvəlki hesabatlarS19), MSN'lerin yalnız bu işlərdə qiymətləndirildiyinə əminik. Hər bir heyvan üçün 6-8 nöronu 3-4 qrupunda hər qrupa (7 qrupları) nəzərdən keçirdik, sonra hər bir heyvan üçün statistik təhlili üçün orta dəyər əldə edildi. ΔFosB aşırı ekspresyonunun NAc omurga yoğunluğu üzerindeki etkilerini incelemek üzere tasarlanan deneyler, AAV vektörlerinin GFP veya ΔFosB-GFP'yi uzun süre (8 hafta) ifade etmek için kullanılması istisna olmaksızın, yukarıda açıklanan şekilde benzer şekilde taşındı. Bütün HSV şəkilləri bir 100X yağlı daldırma məqsədi ilə bir konfokal mikroskopla ələ keçirildi (AAV şəkilləri bir 63X neft daldırma məqsədi ilə ələ keçirildi). Şəkillər 1 təsadüfi vahid və 1024 × 1024 çərçivə ölçüsü ilə təyin olunmuş pinhole ilə əldə edilmişdir. Dendritik uzunluq NIH Image J proqramı ilə ölçüldü və slaydlar eksperimental taramadan əvvəl kodlaşdırıldığı üçün primer eksperimentator tərəfindən belin sayıları sayıldı. 10 μm dendrit başına ortalama ədədlər hesablandı.
Statistik təhlil
Bir və iki yollu ANOVA'lar kondisyonlu yer tercihleri ve dendritik omurga analizi üçün iki qrupdan daha çox olanların önemini belirlemek üçün yapıldı. HSV-GFP-ni HSX-Cre-də G9a-da müqayisə edən qPCR, qərb divotinqi, dendritik spinal analizini ehtiva edən digər müqayisələr üçün tələbələrin t testləri istifadə edilmişdirfl / fl siçanlar, mikroarray analizləri (yuxarıya bax) və xromatin immunoprecipitasiya təcrübələri. Planlaşdırılan tələbə t testləri, dərman müalicəsi və virusun əhəmiyyətli əsas təsirlərinin təsdiqi ilə ΔFosB həddindən artıq ekspresiyadan sonra dendritik onurğa sıxlığının iki tərəfli ANOVA analizindən sonra istifadə edilmişdir. Şəkil əfsanələrinə daxil olan bütün dəyərlər orta ± SEM-i təmsil edir (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Üçün ətraflı statistik analizlər İncir. 1-3 əsas mətndə verilmişdir: Statistikaları əhatə edən ətraflı şəkil əfsanələri.
Dəyişikliklər
Təsdiq edirəm ki, əlavədə olan materialların heç biri müəllif deyil Kokainə səbəb olan plastisitədə histon metiltransferazın G9a-nın əsas rolu əvvəllər nəşr edilmiş və ya digər yerlərdə, o cümlədən İnternetdə nəzərdən keçirilir.
Heyvanların istifadəsini nəzərdə tutan bütün işlər, Texas Universiteti Southwestern Tibb Mərkəzi Universiteti və Sinay Tibb Sinfi Məktəbinin institusional və IACUC qaydalarına uyğun olaraq aparılmışdır.
Referanslar və qeydlər
;
