PLoS One. 2013 Nov 25; 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.
Nişijima T, Kawakami M, Kita I.
mənbə
Davranış Fiziologiyası Laboratoriyası, İnsan Sağlamlığı Elmləri Yüksekokulu, Tokio Metropolitan Universiteti, Tokio, Yaponiya.
mücərrəd
Fiziki məşq hippocampal funksiyasının bir çox aspekti yaxşılaşdırır. Neyronal fəaliyyət nöron funksiyalarının təşviq edilməsi üçün əsas olduğuna dair anlayışa əsasən, əvvəlki ədəbiyyat tədqiqatların kəskin atışları hipokampusda nöronal aktivliyə səbəb olur. Təkrarlanan aktivləşdirici stimullar uzun müddətli nöral plastisiyaya vasitəçilik edən ΔFosB transkripsiyası amilinin birləşməsinə gətirib çıxarır.
Bu çalışmada hipokampusda ΔFosB ekspresyonunu indükleyen uzunmüddətli könüllü təkərin dorso-ventral axın boyunca hipokampal alt sahələrdə hər hansı potensial bölgəyə xüsusi təsirləri araşdırdığına dair hipotezi test etdik. Kişi C57BL / 6 siçanları 4 həftə üçün çalışan təkər ilə və ya olmadan yerləşdirilib. Uzunmüddətli təkər sürüşməsi, bütün hipokampal bölgələrdə FosB / ΔFosB immunoreaktivliyini əhəmiyyətli dərəcədə artırdı (yəni DG, CA1 və CA3 də dorsal və ventral hippocampus alt sahələrində). Nəticələr korteksdə FosB / ΔFosB immunoreaktivliyinə səbəb olan bölgəyə xüsusi təkan verən təkərlərin hipokampus içərisində FosB / ΔFosB-də vahid artımın qeyri-spesifik bir nəticə vermədiyini göstərdiyini təsdiq etdi. Western blot məlumatları göstərir ki, artmış hipokampal FosB / ΔFosB immunoreaktivliyi, əsasən, ΔFosB artması ilə əlaqədardır. Bu nəticələr göstərir ki, uzunmüddətli fiziki məşq bütün hipokampusa görə ΔFosB induksiyası üçün güclü bir tetiktir, bu səbəbdən exercise həm dorsal, həm də ventral hipokampusa bağlı funksiyaları inkişaf etdirə bilər. Maraqlıdır ki, DG-də FosB / ΔFosB ifadəsinin ikiqat kortin-immunoreaktiv (yəni, yetişməmiş) nöronların sayı ilə pozitiv olduğu aşkar edilmişdir.
ΔFosB'nin, egzersizle uyarılmış nörogenezi aracılık ettiği mekanizmalar halen belirsiz olsa da, bu veriler, egzersize bağlı nörojenezin en azından aktiviteye bağlı olduğunu gösterir. Birlikdə alındığımız nəticələr, ΔFosB'nin, egzos-hipokampal plastisiteyi tənzimləyən yeni bir molekulyar hədəf olduğunu göstərir.
giriş
Gəmiricilərdə hipokampusun molekulyar, struktur və funksional aspektləri üzrə müxtəlif faydalar təmin edir [1,2], bəziləri isə insan tədqiqatları tərəfindən dəstəklənmişdir [3,4]. Bununla belə, hipokampal plastisitədə tətbiq olunan dəyişikliklərin əsasını təşkil edən mexanizmlər kifayət qədər aydın deyil. Əvvəlki ədəbiyyat tədqiqatın davamlı olaraq göstərdi ki, gəmiricilərdə hipokampal nöron aktivləşməsinə səbəb olur. Keçid nöronal aktivliyin bir göstəricisindən olan c-Fos istifadə edərək immunohistokimyəvi tədqiqatlar göstərir ki, həm də zorla və könüllü qaçış, kemirək hipokampusunun dentat girus (DG), CA1 və CA3 alt sahələrində c-Fos ifadəini artırdı [5-7]. Bununla yanaşı, lazer-Doppler axını metodunu (LDF) istifadə edərək, əvvəlki bir işdə, siçovulların CA1 alt sahəsindəki yumşaq treadmill işarəsi, nöronal aktivasiya alternativ markeri olan regional serebral qan axını (rCBF)8]. İmmünohistokimyəvi tədqiqatlar LDF, məşq zamanı lokal bir sahədə rCBF-nin real-time monitorinqini təmin edərkən, məşq sonrasında ətraflı bölgəyə xüsusi analizlər təmin edir. Hər bir tədqiqatın üstünlükləri və məhdudiyyətlərinə baxmayaraq, bu tədqiqatlar eyni zamanda hipokampal nöronal aktivliyə tətbiq olunan kəskin fitinqlərin təsiri göstərmişdir. Bu nəticələr uzunmüddətli müntəzəm həyata keçirməklə hipokampal plastisiteyi neyronal aktivliyə dəfələrlə tetikləyən bir mexanizm təklif edir [9].
Transkripsiya faktoru ΔFosB, tam uzunluğunda FosB'nin kəsilmiş bir parçalı izoformu, müəyyən bir beyin bölgələrində təkrarlanan stimulların müxtəlif növləri ilə uyğundur, burada unikal sabitliyi (həftəlik yarım ömrü) sayəsində tədricən yığılır [10-12]. Artan bir sübut orqanı göstərir ki, ΔFosB səviyyəsinin artması xüsusi stimullarla əlaqəli uzun müddət davam edən sinir və davranışçı plastisiyaya vasitəçilik edir [11,13]. Məsələn, kokain və morfin kimi sui-istifadələrin xroniki şəkildə tətbiq edilməsi, bu dərmanlara artan həssaslıqların altından gələn molekulyar mexanizmlərdən birini təmsil edən nüvəli akumbensdə ΔFosB ifadəsini genişləndirir [11,14,15]. Syüksək yağlı pəhriz və cinsi təcrübə də daxil olmaqla, digər mükafat stimullarına imarak [16,17], lKönüllü könüllü təkər kəşfiyyatı həmçinin siçovul naxışlı akusherlərdə FosB / ΔFosB immunoreaktivliyinin artmasına səbəb olub, könüllü qaçış gəmiricilər üçün təbii mükafatdır [18,19]. Lakin, biliklərimizin ən yaxşısına görə, heç bir ədəbiyyat hipokampusda ΔFosB ifadəsini təkrarlayan fiziki məşqlərə məruz qaldığını yoxlayıb. Hipokampusda neyronal aktivliyin həyata keçirilməsi səbəbiylə uzun müddətli könüllü təkər axınının hipokampusda ΔFosB ifadəsini də doğuracağını düşündük. ΔFosB hipokampal plastisiteyi tənzimləyən dəqiq mexanizmlər hələ də qeyri-müəyyəndirsə, tədqiqatlar göstərir ki, fosB gen nümayişində hipokampal nörogenezi və depressiya kimi davranışları artırdı [20,21]. Mənndeed, egzersizin nörogenezini artırdığı və antidepresan xüsusiyyətlərə sahib olduğu bilinir [22-25]. Mənf hipotezimiz düzgündür, ΔFosB həyata keçirici hipokampal plastisiyaya vasitəçilik edən yeni bir potensial molekulyar hədəf olardı.
Hippocampus, uzunlamasına (dorso-ventral) eksen boyunca anatomik və funksional gradientə malikdir [26]. Dorsal hipokampus mekansal öyrənmə və yaddaşda əsas rol oynayır [27,28ventral hipokampus emosional davranışları tənzimləməsinə üstünlük verir [29,30]. Bundan əlavə, işlər fizioloji stimulların hipokampusun dorsal və ventral hissələrində c-Fos ifadəsinin müxtəlif nümunələrini ortaya qoyduğunu göstərir [31-33]. Egzersiz hem dorsal'ı yaxşılaşdırdığından [34-37] və ventral hipokampusa bağlı funksiyalar [24,25,38uzunmüddətli könüllü kəşfiyyatın hipokampusda ΔFosB-yə bölgə-özünəməxsus ifadəsinin yaranmasına səbəb olub olmadığını araşdırmaq vacibdir.
Bu tədqiqatın əsas fərziyyəsidir ki, uzunmüddətli könüllü təkər sürüşməsi siçan hipokampusunda ΔFosB ifadəsini yaradır. Bu hipotez regional və ventral hipokampal alt sahələrdə, DG, CA1 və CA3-da FosB / ΔFosB immunohistokimyası ilə bölgəyə xüsusi induksiyanı müəyyənləşdirməyə xüsusi diqqət yetirməklə araşdırılmışdır. Nəticələr isoformun müəyyənləşdirilməsi üçün istifadə edilən qərbli blotinq tərəfindən təsdiqləndi fosB hipokampusa səbəb olan gen məhsulları. Biz də bölgədəki FosB / ΔFosB induksiyası üçün korteksin beynində qeyri-spesifik olaraq artmış FosB / ΔFosB immunoreaktivliyini uzunmüddətli həyata keçirmə ehtimalını istisna etməliyik. Nəhayət, FosB / ΔFosB ifadə və neyrogenez arasındakı əlaqəli birləşmə hipokampal plastisiyanı tənzimləyən manevrlə bağlı ΔFosB induksiyasının funksional təsirlərini axtarmaq üçün ilk addım kimi tədqiq edilmişdir.
Material və metodlar
1: Heyvanlar və etika bəyanatı
20 kişilik C57BL / 6 siçanı (8 həftəlik yaş) ticari bir breederdən (SLC, Shizuoka, Yaponiya) alınmışdır. Experiment 1 üçün on siçan, Experiment 2 üçün digər 10 istifadə edildi. Siçanlar tənzimlənən istilik şəraitində (22-24 ° C) və işıqda (12 / 12-h yüngül / qaranlıq dövr, 0500-da işıq) yerləşdirildi və ərzaq və su təmin edildi ad libitum. Bütün eksperimental prosedurlar Tokio Metropolitan Universitetinin Heyvan Eksperimental Əxlaq Komitəsi tərəfindən təsdiq edildi.
Hər bir sınaqda, siçanlar təsadüfən bir nəzarət qrupuna (Control, n = 5) və ya çalışan qrupa (Runner, n = 5) təyin edildi. Birinci həftə ərzində, bütün siçanlar ilkin iklimləşdirmə üçün qruplarda (5 siçan / kafes) standart plastik qəfəslərdə yerləşdirilib. Sonra, Runner siçanları təkərli təkər ilə təchiz olunmuş kafedə (ENV-046, Med Associate Inc., Gürcüstan, VT, ABŞ) köçürülmüşdür. Çünki sosial izolyasiya hipokampusda həyata keçirici neyrogenezi bastırmaq üçün bilinir [39], Runner siçanlar əlavə 5 həftə bir qrup (4 siçan / kafes) kimi yerləşdirilib. Təkər fırlanma sayı hər səhər qeydə alındı və bədən çəkisi (g) həftəlik olaraq ölçüldü.
2: Təcrübə 1. FosB / ΔFosB ifadə və hipokampal nörogenezin immunohistokimyasal müayinəsi
2.1: Perfüzyon və toxuma emalatı
Çalışan dövrün son günündən sonra səhər (0900-1100) siçanlar pentobarbital natrium ilə dərindən anesteziya keçirdi və transcardially soyuq şoran ilə perfüzedildi. Beyin tezliklə çıxarıldı və 4% paraformaldehiddə 0.1 M fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) içərisində bir gecə qaldırıldı. Beyin daha sonra PBS-də 30% sukrozda cryoprotected və daha çox emal qədər dondurulmuşdur. Bir yarımkürənin koronal beyin bölmələri (40 μm) bir donma mikrotomu ilə əldə edilmiş və 0.01% sodyum azidlə PBS-də toplanmışdır.
2.2: İmmünohistokimya
FosB / ΔFosB immunostaninqi üçün bir-altı sıra bölmələri təsadüfi seçilmişdir. Nörogenezi qiymətləndirmək üçün təsdiqlənmiş olgunlaşmamış neyronların bir markeri olan doublecortin (DCX) etiketlənməsi üçün bitişik bir sıra istifadə edilmişdir [40,41]. 1% H ilə endogen peroksidaz aktivliyini söndürdükdən sonra2O2 PBS-də sərbəst üzən hissələr 10 h üçün PBS-də 2% normal at serumu olan məhdudlaşdırıcı həll yolu ilə preincübated edilmişdir. PBS-də durulmaların ardından bölmələr 1% Triton X-1000 və 48% BSA (PBST) ilə seyreltilmiş quş poliklonal pan-FosB antikoru (0.5: 100, sc-0.5, Santa Cruz Biotexnologiya, Dallas, TX, ABŞ) ilə inkübat edilmişdir -BSA) 24 saat üçün 4 ° C-də. 1 ° C'de 500 h üçün keçid poliklonal anti-DCX antikoru (8066: 48, sc-4, Santa Cruz) PBST-BSA ilə inkubasiya edilmişdir. Bölmələr PBST-BSA'da müvafiq biotinli edilmiş ikincil antikor (anti-rabbit IgG, 1: 1000, AP182B, anti-keçi IgG, 1: 1000, AP180B, EMD Millipore, Billerica, MA, ABŞ-dan hər iki antikor) ilə inkübe edilmişdir 2 h üçün otaq temperaturunda. Bölmələr daha sonra istehsalçının göstərişlərindən sonra 90 min üçün avidin-biotin-peroksidaz kompleksi (Vectastain ABC peroksidaz kiti, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA, ABŞ) ilə müalicə olunmuşdur. 0.02% H ehtiva edən 3,3 M Tris-HCl (pH 0.1) içərisində 7.6% 0.01-diaminobenzidin (DAB) ilə antigen nəhayət görüldü2O2. FosB / ΔFosB immünostainasiyası üçün reaksiya nikel ammonium sulfat ilə sıxıldı. DCX boyanma üçün hüceyrə nüvəsi Nissl boyama ilə qarşı-qarşıya qaldı. Bölmələr jelatinlə örtülmüş slaydlara quraşdırılmış və lövhələr yerləşdirilmişdir.
2.3: Image ərəfəsində istifadə FosB / ΔFosB immunoreaktivliyinin kantifikasiyası
Bu işdə istifadə olunan pan-FosB antikoru FosB və ΔFosB N-terminal bölgəsi tərəfindən bölüşdürülmüş bir daxili bölgəyə qarşı qaldırıldı, belə ki, iki izoform arasında fərq qoyulmur. Buna görə immunostained strukturlar FosB / ΔFosB immunoreaktiv (FosB / ΔFosB-ir) nüvəsi kimi təsvir edilmişdir. Baxmayaraq ki, slaydlar obyektiv bir kəmiyyətlə ölçülməmişdən əvvəl kodlaşdırılıblar. Siçanın beyin atlası [42] Dorsal hipokampusda DG (3 bölmələri), CA1 (3 bölmələrinin piramidal hüceyrə qat) və CA3 (2-3 bölmələri) piramidal hüceyrə təbəqəsi olan aşağıdakı regionların (ROI) yerlərinin müəyyən edilməsi üçün istifadə edilmişdir: (bregma'dan -2.2 mm -ə yaxın); Ventral hipokampusda DG (2 bölmələr), CA1 (2 bölmələr) və CA3 (2 bölmələr) (bregma -3.4 mm-ə qədər) (Şəkil 4, sol). Kaudal bölmələr hem hipokampusun dorsal və ventral hissələrini, həm də ventral hissəsini hədəf aldılar. DG-də suprapiramidal (DGsp) və infrapiramidal (DGip) bıçaqlar ayrı-ayrılıqda təhlil edilmişdir. Motor korteksi (2-3 bölmələr, bregma'dan 0.6 mm-a yaxın), somatosensory barrel korteks (2-3 bölmələr, bregma dən 0.6 mm üçün bağlanmışdır), görmə korteksləri (3 bölmələr, bregma), eşitmə korteksi (2.9 bölmələri, bregma'dan 3 mm-a yaxın) və xromosfatı lampası (bnqma'dan + 2.9 mm-ə qədər olan 3 bölmələri)Şəkil 6, sol).
Hər ROI rəqəmsal görünüşü (2070 × 1548 piksel) bir CCD kamera (DP-51, Olympus) və görüntüləmə proqramı (cellSens, Olympus) ilə təchiz olunmuş optik mikroskop (BX-73, Olympus, Tokio, Yaponiya) Objektiv lens böyüdücü hipokampal ROI və 10 × üçün kortikal ROI üçün 4 × idi. Orta-güclü FosB / ΔFosB immunoreaktivliyini müəyyən etmək üçünŞəkil 1D-G) əvvəlcədən bir neçə bölmədən istifadə edərək, hər ikisi də görüntü əldə etmə parametrləri (işığın intensivliyi, sahə dayanıqlığı, məruz qalma vaxtı və ağ balansının ölçüsü) və RGB komponentlərinin hər biri üçün ərazi səviyyəsi hipokampal və kortikal ROI üçün optimallaşdırılmışdır. Aşağıdakı analiz optimal şəraitdə (1) həyata keçirildi. ROI'lar düzensiz şekilli bir poliqon (Şəkil 1A, B) (2). Təsvir FosB / ΔFosB-ir nüvəsini qırmızı rəngəŞəkil 1C-G) (3). ROI, avtomatik olaraq aşağıdakı kimi hesablanır:% ROI = (çevrilən sahə (qırmızı) / ümumi ROI sahəsi) × 100.
Bu görüntü eşik analizini təsdiqləmək üçün, 20 bölgələri müxtəlif region ölçüləri olan müxtəlif beyin sahələrindən təsadüfi seçilmişdir. FosB / ΔFosB-ir nüvələrinin sayını seçilmiş bölgələrdə FosB / ΔFosB-ir çekirdeklerinin sayıları əl ilə hesablanmış və FosB / ΔFosB-ir nüvələrinin sıxlığı FosB / ΔFosB-ir nüvələrinin sayını ölçülə sahəsi (mm2).
2.4: Dentat girusda DCX-ir irəliləməyən neyronların miqdarı
Runner siçanlarının DG-də olan DCX-ir irəliləyən nöronları zəngin və üst-üstə düşmüşdür və optik mikroskop vasitəsilə DCX-ir soma-nın ayrı-ayrı sayını dəqiq hesablamaq çətindir. Əvvəlki bir araşdırmada, morfoloji qiymətləndirmə üçün Sholl analizi, hər bir DCX-ir nöronunun, sümüyünün 40 μm'sində ölçüldükdə ortalama bir dendritə malik olduğunu göstərdi [43]. Buna görə DCX-ir nöronların bölgəyə xüsusi kəmiyyətlə təmin edilməsi üçün aşağıdakı orijinal analiz hazırlanmışdır.
- (1) GCL-nin bir görüntüsü, görüntüləmə proqramı və 40 × obyektiv lens (2) istifadə edərək kompüter ekranında proqnozlaşdırıldı. Canlı təsvirdə, GCL (ortadakı) boyunca bir xətt seqmenti (150 ± 0.1 μm) çəkilmişdirŞəkil 2) (3). Fokus dərinliyini dəyişdirən, DCX-ir dendrites xətti seqmentinin neçə dəfə sayıldığı (4) sayıldı. ROIs (dorsal DGsp, dDGsp, dorsal DGip, dDGip, ventral DGsp, vDGsp, ventral DGip, vDGip) FosB / ΔFosB immunoreaktivliyinin analiz edildiyi bölgələrə (5) uyğun gəldi. Hər ROI'da 2-3 xətt seqmentləri hər bir hissəyə bölünmüşdür və keçidlərin sayı siçan başına 2-3 bölmələrində ortalamışdır. GCL'nin qalınlığı təxminən 60-80 μm olduğundan, keçidlərin sayı təhlil edilən məhdud ərazidə DCX-ir nöronların sayını əks etdirməlidir.
DCX-ir irəliləməyən nöronların və DCX-ir dendrites ilə keçid sayını hesablamaq üçün örtülmüş bir xətt seqmentinin (150 ± 0.1 μm) nümayəndəsi təsviri.
3. 2 sınağı. FosB / ΔFosB izoformunun təkər qaçışları ilə təyin edilməsi
3.1: Perfüzyon və toxuma emalatı
Experiment 1-da siçanların əlavə bir kohortu yuxarıdakı kimi işlənmişdir. 4 həftəlik müdaxilədən sonra siçanlar dərin anesteziya altında soyuq şoran ilə transcardial perfused edilmişdir. Hipokampus tezliklə süzüldü və maye azotla donduruldu və -80 ° C-də saxlandı. Hər siçanın hipokampi, RIPA tamponunda (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.6, 1% NP-40, 1% natrium deoksikolat, 0.1% SDS, #8990, Thermo Scientific, IL, ABŞ) inhibitorları (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Almaniya). Lysates 15 ° C'de 5000 rpm'de 4 dəq üçün santrifüj edilmiş və süpernatanlar toplanmışdır. Protein konsentrasiyaları BCA Protein Assay Kiti (#23227, Thermo Scientific, IL, ABŞ) ilə ölçüldü.
3.2: Western blotting
Eşit miqdarda protein (30 μg / lane) 10% poliakrilamid jelində elektroforez edilmiş, sonra PVDF membranına (Immun-Blot, 0.2 μm, Bio-Rad, MD, ABŞ) köçürülmüşdür. 1% BSA ehtiva edən TBST (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% Tween-20) içərisində 3 h üçün membranın preinkuva edilməməsi ilə qeyri-müəyyən bağlanma bloklandı. Membrana yuxarıda 1% BSA olan TBST-də həll edilən immunohistokimya üçün istifadə olunan pan-FosB antikoru (1000: 3) ilə inkubasiya edilmişdir. TBST ilə yuyularaq yuyulub, membran 1 h üçün otaq temperaturu üçün HRP-konjuge anti-tavşan IgG antikoru (TBST, 5000: 934, TBX, NA1, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) ilə inkubasiya edilmişdir. TBST ilə yuyulduktan sonra zülal bantları Enhanced Chemiluminescence (Western Lightning Plus-ECL, PerkinElmer, MA, ABŞ) ilə inkubasiya ilə görüntülendi və Image Quant LAS 4000 mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, Böyük Britaniya) istifadə edərək tutuldu. Membran daha sonra yükləmə idarəsi olaraq anti-gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) antikoru (TBX-T, 2275, 1: 5000, Trevigen, MD, ABŞ) ilə reprodedildi. Protein bantlarının optik sıxlığı Image-J istifadə edərək ölçülmüş və GAPDH səviyyəsinə normallaşdırılmışdır.
4: Statistik analiz
Siçan vücudunun ağırlığında dəyişikliklər iki tərəfli təkrar tədbirlər ANOVA (qrup x vaxt) ilə təhlil edilmişdir. Qruplar arasında statistik fərqlərin (Control vs. Runner) müəyyən edilməsi üçün ödənilməmiş bir t-test istifadə edilmişdir. Pearson'un korrelyasiya analizi, FosB / ΔFosB immunoreaktivlik analizini (əl sayma və görüntü əvvəldən salınma) təhlil etmək, FGD / ΔFosB ifadə səviyyəsi və DG-də DCX keçidlərinin sayı arasında əlaqələndirilməsini yoxlamaq üçün istifadə edilmişdir. Məlumat ortalama ± SEM olaraq təqdim edildi. Statistik əhəmiyyətə malik olan ərazi atıldı P <0.05.
Nəticələr
1: Bədən çəkisi və 1 və 2 təcrübələrində qaçış məsafə
1 və 2-da Experiments-da Control və Runner siçanlarının bədən çəkisi dəyişir Şəkil 3. İki yollu təkrar tədbirlər ANOVA əhəmiyyətli bir qarşılıqlı (qrup x vaxt, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) və qrupun əsas təsiri F(1, 18) = 6.07, P Runner siçanlarında bədən çəkisinin əhəmiyyətli dərəcədə aşağı olduğunu göstərən <0.05). Kafes başına qaçış məsafəsi göstərilir Cədvəl 1. Siçanların bir yerdə yerləşdiyi üçün hər bir siçanın dəqiq qaçış məsafə qeyri-müəyyən olsa da, müntəzəm müşahidə bütün siçanların tez-tez təkərli işləməsini təsdiqlədi. Eksperimental 2-da Runner siçanları Experiment 1-dən daha uzun qaçdı, amma ortalama çalışan məsafə (m / gün / qəfəs) hər bir sınaq boyunca ardıcıl idi.
2: FosB / ΔFosB immunoreaktivliyin ölçülməsini qiymətləndirmək
FosB / ΔFosB-ir bölgesi arasında imaj sayesinde ve FosB / ΔFosB-ir çekirdeğinin yoğunluğu ile elde edilen (r = 0.941, P <00001, Şəkil 4).
3: Hipokampusda FosB / ΔFosB immunoreaktivliyi
Dorsal və ventral hippocampal alt sahələrində FosB / ΔFosB immunostainqinin təsvirləri Şəkil 5. Analiz edilən bütün ROI'larda, Runner siçanlarında FosB / ΔFosB immunoreaktivitesi (Şəkil 5, sağda) nəzarət farelerindənŞəkil 5, Mərkəz). Runner siçanlarında kəmiyyət analizi həm Dorsal (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) və ventral hipokampal alt sahələr (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; Şəkil 6).
4: Korteksdə FosB / ΔFosB immunoreaktivliyi
Kortik ROI'lardaki FosB / ΔFosB immunostainin temsilcili görünüşleri gösterilmektedir Şəkil 7. Kəmiyyət analizində FosB / ΔFosB immunoreaktivliyində regiona bağlı dəyişikliklər uzun müddətli (Şəkil 8). Runner siçanlarında FosB / ΔFosB-ir sahəsi motor korteksindəP <0.05) və somatosensor lülə qabığı (P <0.05), lakin görmə qabığında deyil (P = 0.662) və ya kofe şampunP = 0.523). Eşitmə korteksində FosB / ΔFosB-ir sahəsi Runner siçanlarınınP = 0.105).
5: Neyrogenez
DCX immunostaninqinin nümayəndəsi şəkillərində göstərilir Şəkil 9. Dorsal hipokampusda, Runner siçanlarında DCX immunoreaktivliyi (Şəkil 9, sağda) Control mice ilə müqayisədə keyfiyyətcə yüksək idi (Şəkil 9, sol). Dorsal hipokampusa nisbətən, ventral hipokampusda DCX immunoreaktivliyi Control və Runner siçanlarında zəif idi. Runner siçanlarında keçidlərin sayı dDGsp-dəP <0.01) və dDGip (P <0.01; Şəkil 10). Ventral hipokampusda Runner siçanlarında keçidlərin sayı artmağa meylli idi, lakin qruplar arasında fərqlər olmurdu (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; Şəkil 10).
6: FosB / ΔFosB ifadə və neyrogenez arasında korrelyasiya
FosB / ΔFosB-ir sahəsi və DCX keçişlərinin sayı arasında korrelyasiya analizi aparılıb (Şəkil 11). Hər bir məlumat seti (məsələn, Control mice ildə dorsal DGsp) yalnız 5 cütlərindən ibarət olduğundan, analiz əvvəlcə bütün 40 cütləri ilə həyata keçirilir. Maraqlıdır ki, FosB / ΔFosB-ir sahəsi ilə DCX keçişlərinin sayı (r = 0.885, P <0.0001). Bundan əlavə, dorsal DG (r = 0.762, P <0.05) və ventral DG (r = 0.816, P <0.01) ayrıca analiz edilmişdir.
7: FosB / ΔFosB izoformunun uzunmüddətli işlədilməsi ilə təyin edilməsi
Nəhayət, izoformunu müəyyən etmək fosB uzunmüddətli qaçışa cavab olaraq hipokampusa səbəb olan gen məhsulları, əlavə sümük kohortundan gələn hipokampi, eyni pan-FosB antikorunu istifadə edərək qərb ləkələyinə məruz qaldı. 35-37 kDa-nın çoxlu bantları, ΔFosB'nin dəyişmiş izoformlarını təmsil edən [44, Runner ilə Control mice ()Şəkil 12, P <0.01). Digər tərəfdən, hər iki qrupda da 48 kDa FosB izoformu aşkar edilə bilmədi. 25 kDa-nın üstündə zəif görünən başqa bir bant, ehtimal ki, Δ2ΔFosB izoformunu (27 kDa) təmsil edir. 50 kDa və 37 kDa-dan yuxarı olan, daha çox qeyri-spesifik bağlanma səbəbindən daha iki bant var idi. Kəmiyyət göstərildikdə, qruplar arasındakı ΔFosB olmayan bantlarda heç bir fərq tapılmadı (məlumatlar göstərilmədi).
Müzakirə
Xülasə olaraq, bu araşdırma əvvəlcə 1-ni araşdırmaq üçün bir immunohistokimyəvi analizin aparıldığı) uzunmüddətli könüllü təkərin hipokampusda FosB / ΔFosB ifadəinin indiyədək çıxarılmadığını; və 2) dorso-ventral axını boyunca bölgəyə xüsusi cavab varmı?
Dörd həftə könüllü təkər kreslosu analiz edilən bütün hipokampal bölgələrdə (yəni hipokampusun dorsal və ventral hissələrinin DG, CA1 və CA3 alt sahələrində) FosB / ΔFosB immunoreaktivliyində əhəmiyyətli bir artım meydana gətirdi. 35-37kDa ΔFosB izoformunun əsas olduğunu təsdiqləyirik fosB Gen məhsulu uzunmüddətli çalışanlara cavab olaraq yığılır. Bu nəticələr uzunmüddətli müntəzəm məşqlərin hipokampusa görə ΔFosB induksiyası üçün güclü bir tetikleyicidir və onun induksiyası müxtəlif növ dorsal və / və ya ventral hipokampusa bağlı funksiyaları təsir edən yeni bir molekulyar mexanizm ola bilər.
1: Təsvir ölçməsini istifadə edərək FosB / ΔFosB immunoreaktivliyini qiymətləndirmə və məhdudlaşdırma
FosB / ΔFosB immunoreaktivliyinə bölgəyə xüsusi miqyaslaşdırma üçün bu işdə hədəf hüceyrələrin sayını və hüceyrə morfologiyasını qiymətləndirmək üçün immunohistokimyəvi tədqiqatlarda geniş istifadə olunan bir görüntü süzgə texnologiyası qəbul edildi [15,45,46]. FosB / ΔFosB immunoreaktivliyi səviyyələri arasında imicoraktivlik səviyyələri ilə əlamətlərin sayılması ilə və əl sayma ilə müqayisədə əhəmiyyətli bir korrelyasiya göstərilmişdir (Şəkil 4). Bununla birlikdə, sıxlıq və üst-üstə düşmə çox sıx ərazilərdə FosB / ΔFosB-ir nüvələrinin sayılmasının qarşısını aldığına görə, nümayiş olunan korrelyasiya yalnız FosB / ΔFosB-ir sahələri ümumi ROI-nin <~ 40% -ni təmsil etdikdə görüntü eşik ölçmə metodunun dəqiqliyini nəzərdə tutur. sahə. Bu səbəbdən, ümumi ROI sahəsinin 40% -i FosB / ΔFosB-ir sahələri üçün diqqətli bir şərh tələb olunur.
Xüsusilə, Runner siçanlarının DG-dəŞəkil 4), FosB / ΔFosB ifadəsi birbaşa işlədilir və FosB / ΔFosB-ir nüvələrinin əksəriyyəti üst-üstə düşdü. Bu sahələrdə FosB / ΔFosB ifadəsinin artımının artması ifadə səviyyəsinin daha az qiymətləndirilməsinə gətirib çıxarır (istifadə edilən kəmiyyətin ölçülmə metodundan asılı olmayaraq (image eşik və ya manuel hesablama). Buna baxmayaraq, qiymətləndirmənin riskinə baxmayaraq, hazırkı tədqiqat Runner siçanlarının DG-də FosB / ΔFosB-ir ərazisində əhəmiyyətli dərəcədə artım göstərdiyini qeyd etmək vacibdir. Bu, metodiki məhdudiyyətlərin tapıntılarımızı pozmamağını göstərir. Bunun əvəzində, potensial qiymətləndirmə hipokampusda uzunmüddətli işlərin FosB / ΔFosB immunoreaktivliyini artıran nəticələrin etibarlılığını artırır.
2: uzunmüddətli qaçış ilə hipokampusa daxilində ΔFosB-in vahid indüksiyası
Hipokampusun uzunlamasına ekseni boyunca anatomik və funksional dərəcələri var [26hipokampusun dorsal və ventral hissələrində FosB / ΔFosB immunoreaktivliyi ayrı-ayrılıqda təhlil edilmişdir. Məlumatlar göstərir ki, uzunmüddətli işləyən bütün hippocampal ROI-lərdə FosB / ΔFosB ifadəsini birmənalı şəkildə artırmışdır. FosB / ΔFosB immunoreaktivliyinin bu vahid induksiyası qeyri-spesifik olaraq uzunmüddətli qaçışla əlaqəli sistematik metabolik dəyişikliklərə səbəb ola bilər. Bununla yanaşı, korteksdə FosB / ΔFosB immunoreaktivliyinə regiona xüsusi artımlar olduğunu qeyd etmək vacibdir. Bu nəticəyə görə, qaçaqmalçılığın kəskin sürüşməsi hipokampusa regional serebral qan axını artdığını göstərir, amma koflin lampa deyil [8]. Bundan əlavə, Rhodes və ark. (2003), hipokampusun (CA7 ölçülməmiş) DG və CA2 / 3-da könüllü təkərlərin işlədildiyi 1 günün göstəricisini və sensor korteksdə, lakin görmə korteksində deyil,47]. Birlikdə aparılmış bu işlər hipokampusda FosB / ΔFosB ifadəinin vahid indüksiyasiyasının uzunmüddətli qaçışın qeyri-spesifik nəticəsi olmadığını göstərir. Maraqlıdır ki, Hawley et al. yaxınlarda kronik proqnozlaşdırıla bilməyən stress dorsalda FosB / ΔFosB ekspresyonunu artırdığını, lakin ventralda, sıçan hipokampusunun DG'sini [48]. Daha istintaqla, FosB / ΔFosB indüksiyonunun fərqli nümunələri, egzersiz ya da stres ilə ortaya çıxan hipokampusa stimulun təsirinə davamlı təsirləri davam etdirəcək.
Bu işdə istifadə edilən əsas pan-FosB antikoru FosB proteinlərinin bütün izoformlarını tanıyır. Qərb ləkələnmə analizinə əsasən, uzunmüddətli kəşfiyyatdan sonra hipokampusa artan yeganə izoformların Fosb (35-37 kDa) modifikasiya edilmiş izoformları olduğunu təsbit etdik, Fos ailə proteinləri arasında yeganə sabit izoformlar [11]. 35-37 kDa ΔFosB kronik stress ilə frontal korteksdə indiyədək başlıca Fos ailə proteini olduğunu göstərmək üçün pan-Fos antikorunu istifadə edərək əvvəlki işlərə uyğun olub [44]. Beləliklə, uzunmüddətli işləmənin yaratdığı hipokampal FosB / ΔFosB immunoreaktivliyinin artması, ehtimal ki, ΔFosB səviyyəsini əks etdirir.
Hipokampusun molekulyar və struktur aspektlərinə dair bölgəyə xüsusi təsirləri az bilinir. Lakin, çoxsaylı davranış tədqiqatları həm dorsal, həm də ventral hipokampal funksiyaların həyata keçirilməsinə səbəb olan inkişaflar üçün böyük potensialı göstərir. Məkan öyrənməsini və yaddaşını yaxşılaşdırmaq üçün hərəkətin nümayiş etdirildi [34-38] və məkan və kontekstli emal əsasən dorsal hipokampusdan asılıdır [27,28]. Əksinə, məşq anksiolitik və antidepressant xüsusiyyətləri də tətbiq etmək məlumdur [24,25,38] və bu duygusal reaksiyalar əsasən ventral hipokampus tərəfindən tənzimlənir [29,30]. Bu tədqiqatda görülən uzun müddətli ΔFosB formunun induksiyası bütün hipokampusa bir neçə nöroplastik dəyişikliyin meydana gəldiyini göstərir. Bunun səbəbi, dorsal və ventral hipokampusa bağlı funksiyaları təsir göstərə bilər.
3: Təcrübəli neyrogenezin bölgəyə xüsusi analizi
Dorsal və ventral hipokampus arasında nörogenezin funksional ayrışması da artan diqqətə alınır [49]. Bu çalışmada DCX-ir olgunlaşmamış nöronların morfolojik xüsusiyyətlərindən faydalanmaq [43], biz DCX-ir dendrites və GCL ortasında tərtib bir xətt seqmenti arasında kəsişmələrin sayını hesablamışıq. Bu ölçü DG-də ümumi DCX-ir nöronların sayını verməmişdir, lakin FosB / ΔFosB ifadə məlumatları (aşağıya bax) ilə korrelyasiya təhlili aparmaq üçün lazım bölgəyə xüsusi miqdarda imkan vermişdir. Uzun müddət davam edən DCX-ir nöronların sayı dorsalda əhəmiyyətli dərəcədə artdı, lakin ventral, DG deyil. Bu, DG-nin ventral hissəsi ilə müqayisədə dorsalda nevrogenizmin daha çox təsirlənə biləcəyini göstərir. Əvvəlki tədqiqatlar, həm də dorsal və ventral DG-də təkər sürüşməsinin neyrogenezinin artmasına səbəb olan ziddiyyətli nəticələr vermişdir [50,51]. Bu araşdırmada, ventral DG-də DCX-ir keçidlərinin sayı, kiçik nümunə ölçüsü (qrup başına 5 fareler) qruplar arasında statistik olaraq əhəmiyyətli bir fərqi aşkarlamaq qabiliyyətini məhdudlaşdıra bilsə də, qaçış ilə artmağa meyillidir. Buna görə də, könüllü təkər axının ventral hipokampal nörogenezi stimullaşdıra biləcəyi ehtimalını istisna etmə ehtimalı çox vaxt erkəndir. Daha çox detallı tədqiqatlar, çoxsaylı prosesi (hüceyrələrin yayılması, fərqləndirmə, miqrasiya və sağalma) ilə əlaqədar həyata keçirilmiş neyrogenezin regiona özünəməxsusluğunu anlamaq üçün zəruridir.
4: Hipokampal plastisiteyi tənzimləyən manevrlə bağlı ΔFosB induksiyasının funksional təsiri
Nəhayət, hipokampusa tətbiq olunan ΔFosB induksiyasının funksional təsirlərinin tanınmasında ilk addım olaraq, biz Dorsal və ventral DG-də FosB / ΔFosB immunoreaktivliyinin DCX-ir keçidlərinə olan əlaqəsini müayinə etdik və arasında ən əhəmiyyətli, müsbət korrelyasiya tapdıq iki dəyişən. ΔFosB'nin məşqlə bağlı neyrogenezi tənzimləyən dəqiq mexanizmlər hələ də müəyyən olmasına baxmayaraq, yeni bir araşdırma göstərir ki, fosBFosB, ΔFosB və Δ2DFosB (bütün fosB məhsullar), bazal hipokampal nörogenezdə, neyron progenitor hüceyrələrinin azaldılması, yenidoğulmuş neyronların ektopik miqrasiyasının artması və qeyri-normal DG strukturları daxil olmaqla,20]. Ancaq bu dəyişikliklər müşahidə edilmədi fosB(d / dFosB çatışmazlığı olan fəsillər deyil, ΔFosB / Δ2ΔFosB deyil. Maraqlıdır, içində fosB- Neytral siçanlar, o cümlədən bəzi neyrogenezlərlə əlaqəli genlərin ifadəsi Vgf (VGF sinir böyümə faktorunu indüklədilir) və Gal (Galanin prepropeptidi)20]. VGF və GAL sekresiya molekulları olduğundan, sözü tutan bir təklif, ΔFosB ifraz edən nöronların autokrin / parakrinin aktivliyi ilə neyrogenezi tənzimləyə biləcəyini hesab edir [20].
Əlavə olaraq qeyd etmək lazımdır ki, ΔFosB yerləşdirilən ərazidə nörogen aktivliyin yüksək olduğu bölgə ilə spatially işlədilir. Bu nəticəyə əsasən, həyata keçirilmiş nevrogenizmin minimum aktivlikdən asılı olduğu müəyyən edilir. Nöronal aktivasiya mərkəzi sinir sistemi funksiyasının saxlanılması və təkmilləşdirilməsi üçün əsasdır [9beyin kökündən gələn nörotrofik amilin (BDNF) ifadəsi və sərbəst buraxılması mexanizmləri vasitəsilə [52,53], qan-beyin bariyeri vasitəsi ilə serum insulin kimi böyümə faktorunun-1 (IGF-1)54,55], apoptozun dayandırılması [56] və mitokondrial motilliyin tənzimlənməsi [57]. Beləliklə, bu tədqiqat uzunmüddətli məşq təkrarlanan nöronal aktivliyə gətirib çıxarmışdır ki, artmışdır ΔFosB ifadəsində, hipokampal plastisitənin artırılmasına kömək edir, potensial olaraq yuxarıda təsvir edilmiş bu çox mexanizmlər vasitəsilə.
Bu tədqiqat yalnız DG-də exercise-induced nevrogenezi və onun FosB / ΔFosB ifadəsi ilə əlaqəsini qiymətləndirdi. Lakin, FosB / ΔFosB immunoreaktivliyi CA1 və CA3 alt sahələrində də yaranmışdır. Əlavə tədqiqatlar bu alt sahələrdə həyata keçirilmiş ΔFosB ifadəsinin funksional rollarını daha yaxşı başa düşmək üçün tələb olunsa da, əvvəlki ədəbiyyat perspektivli bir imkandır. Guan et al. (2011), CA5 və ya CA5 piramidal nöronlarda siklinə bağlı kinazın 1 (Cdk3) spesifik ablasyonunun yaddaş konsolidasiyasının və ya geri alınmasının azaldığını nümayiş etdirdi [58]. Maraqlıdır ki, Cdk5 ΔFosB'nin aşağı istiqaməti [59] və sinaptik plastisiyanı tənzimləmə ilə məşğul olur [60]. Buna görə də, CFX ekspresyonu CA5 və CA1 alt sahələrində Cdk3 aktivasiyası vasitəsilə sinaptik plastisiyanı tənzimləmək üçün istifadə edilə bilər.
Nəticə
Hipokampusda dərhal erkən gen proteinlərinin ifadə olunmasına gətirib çıxardıqda, bu tədqiqat, uzun müddətli müntəzəm məşqlərin əhəmiyyətli dərəcədə bütün hipokampusda ΔFosB ifadəsini istifadəsinə səbəb olan ilk sübut təqdim edir. ThΔFosB'nin birbaşa induksiyası, bir çox hipokampal funksiyanı inkişaf etdirmək üçün effektiv farmakoloji olmayan bir müdaxilə olduğunu anlayır. FosB / ΔFosB ekspresyonu ve nörogenezi arasında anlamlı bir korelasyonla birlikte, bu veriler provokatiftir ve nörogenezi de kapsayan hipokampal funksiyaya egzersizin etkilerini aracılaştırmada ΔFosB rolünü belirleyen daha ileri çalışmalara ehtiyac olduğunu göstərir.
Maliyyələşdirmə Hesabatı
References
;
