PSMC5, 19S Proteasomal ATPaz, Nüvə Akumbensində Kokain hərəkəti tənzimləyir (2015)

PLoS One. 2015 May 11; 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / jurnal.pone.0126710. eCollection 2015.

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, Nakamura T3, Ohno M4, Kennedy PJ5, Yasuyuki O6, Nişi A7, Neve R8, Tsuzuki T4, Nestler EJ5.

mücərrəd

ΔFosB, kokain və ya digər istismar dərmanlarına xroniki təsir göstərməyə cavab olaraq, beynin mükafat dövranının əsas hissəsi olan nüvə akumbensində (NAc) yığılan sabit bir transkripsiya faktorudur. ΔFosB-nin Jun ailənin üzvü ilə aktiv transkripsiya faktor kompleksi yaratmaq üçün heterodimerləşməsi məlum olduğu halda, bu günə qədər beyində ΔFosB üçün digər mümkün bağlayıcı tərəfdaşların açıq bir tədqiqatı aparılmamışdır. Burada, maya iki hibrid analizlərindən istifadə edərək, 5S proteazomal kompleksin bir ATPase ehtiva edən birimi olan SUG1 olaraq da bilinən PSMC19-i identifyFosB ilə yeni qarşılıqlı təsir göstərən bir protein olaraq təyin edirik. NAc içindəki endogen ΔFosB və PSMC5 arasındakı bu cür qarşılıqlı əlaqələri doğrulayırıq və hər iki zülalın da gen aktivasiyası ilə əlaqəli digər kromatin tənzimləyici zülallarla kompleks meydana gətirdiyini nümayiş etdiririk. Xroniki kokainin NAc-da PSMC5-in nüvə səviyyəsini artırdığını, lakin sitoplazmik olmadığını və bu beyin bölgəsində PSMC5-in həddindən artıq ekspresyonunun kokainə lokomotor reaksiyalarını artırdığını göstərməyə davam edirik. Bu tapıntılar birlikdə, ΔFosB hərəkətlərinə kömək edən və ilk dəfə PSMC5-i kokainin yaratdığı molekulyar və davranış plastisiyasına təsir edən yeni bir mexanizmi təsvir edir.

Citation: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O, et al. (2015) PSMC5, bir 19S Proteasomal ATPase, Nucleus Accumbens'də kokain fəaliyyətini tənzimləyir. PLOS ONE 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / jurnal.pone.0126710

Akademik redaktor: James Edgar McCutcheon, Leicester Universiteti, Birləşmiş Krallığı

Alınan: Dekabr 10, 2014; Qəbul edildi: Aprel 7, 2015; Tarix: 11 May 2015

Copyright: © 2015 Ohnishi et al. Bu, şərtlərinə görə paylanan açıq giriş məqaləsidir Creative Commons Attribution Lisenziyası, hər hansı bir mühitdə məhdudiyyətsiz istifadəyə, yayılmağa və reprodüksiyaya icazə verən, orijinal müəllif və mənbə verilmişdir

Məlumatların mövcudluğu: Bütün məlumatlar kağız içərisindədir.

Maliyyələşdirmə: Bu iş Milli Səhiyyə İnstitutunun, Narkotik maddələrin istismarı üzrə Milli İnstitutun qrantları və İşibaşı Fondu və Yaponiyanın Elmin Təşviqi Cəmiyyəti (KAKENHI nömrələri: 24591735, 26290064, 25116010) tərəfindən dəstəklənmişdir. Maliyyələşdirənlərin öyrənmə tərtibatında, məlumatların toplanmasında və təhlilində, nəşr olunma qərarında və ya əlyazmanın hazırlanmasında heç bir rolu olmayıb.

Rəqabət maraqları: Müəlliflər heç bir rəqabət mənsubu olmadığını bəyan etdi.

giriş

ΔFosB, -ın kəsilmiş məhsuludur FosB gen, trans-faktor ailəsinə aiddir, bunlara c-Fos, tam uzunluğu FosB, Fra-1 və Fra-2 daxildir. ΔFosB, digər Fos zülalları kimi, aktiv bir AP-1 (aktivator protein-1) transkripsiyası amil kompleksini meydana gətirmək üçün Jun ailəsi zülalı ilə birləşir - c-Jun, JunB və ya JunD - xüsusi hədəf cinslərin ifadəsini gətirən və ya sıxışdıran [1,2].

ΔFosB narkotik asılılığında əsas rol oynadığı göstərilmişdir [2]. Fos ailəsi zülalları arasında misilsiz olaraq, yüksək səviyyəli sabitliyi səbəbiylə dərman təkrarən qəbul edildikdən sonra nüvə böyüməsi (NAc) və digər mükafatla əlaqəli beyin bölgələrində yığılır [3,4], C-terminal deqron domenlərinin olmaması və bir neçə zülal kinazları tərəfindən fosforlaşma ilə vasitəçilik edir.5-7]. AFosB-nin NAc vasitəçilərində bu cür tətbiq edilməsi sui-istifadə dərmanlarına qarşı davranış reaksiyalarını artırdı. Beləliklə, adultFosB-nin yetkin heyvanların bu beyin bölgəsində ya viral vektorlardan, ya da keçə bilməyən bitransgenik siçanlardan istifadə edərək, heyvanın kokain və tiryəklərin lokomotor və aktivləşdirici və mükafatlandırıcı təsirlərinə həssaslığını, habelə bir heyvanın özünü idarə etmə motivini artırır. kokain [7-11]. Əksinə, ΔFosB-nin dominant mənfi antaqonistlərinin həddən artıq ekspressiyası əks davranış fenotiplərinə səbəb olur [10-12].

Biz və başqaları əvvəllər gel növbə təhlillərindən istifadə edərək JunD və bəlkə də digər Jun ailə zülallarının in vivo ilə beyindəki ΔFosB-nin əsas bağlayıcı tərəfdaşları olduğunu təsdiqlədik.13-15]. Ancaq bu günə qədər ΔFosB-nin beyindəki bağlayıcı tərəfdaşlarının açıq, qərəzsiz bir qiymətləndirməsi olmamışdır. Burada bir maya iki hibrid təhlili istifadə edərək ΔFosB üçün yeni bağlayıcı tərəfdaşları axtarmağa çalışdıq.16,17]. Əldə etdiyimiz məlumatlardan məlum oldu ki, SUG5 kimi tanınan PSMC1 vitFosB'nin həm in vitro, həm də in vivo ilə NAc'ın sağlam tərəfdaşıdır və burada CBP (CREB bağlayıcı zülal da daxil olmaqla cocFosB-yə kokain mənşəli transkripsiya aktivləşdirmə kompleksinin bir hissəsi kimi qoşulur) ) və p300 - həm histon asetiltransferazaları (HATs) - həm də BRG1 (bir xromatin düzəldici protein). Kokainə xroniki məruz qalma, NAc-da 5S proteasomal kompleksinin bir ATPase ehtiva edən PSMC19 nüvə səviyyəsini dəyişdirdiyini və PSMC5, öz növbəsində kokainə qarşı davranış reaksiyalarını idarə etdiyini göstərməyə davam edirik.

Material və metodları

Maya iki hibrid tarama

MaV203 maya hüceyrələri (Invitrogen Life Technologies) pDBLeu ilə birlikdə differentFosB zülalının müxtəlif fraqmentlərini idarə etdi və siçan beyin kitabxanası pPC86 (Invitrogen Life Technologies) -də subklonasiya edildi. Transformasiya edilmiş hüceyrələr, lösin, triptofan və histidinə sahib olmayan və 10 mM 3-aminotriazol ehtiva edən SC-mühitdə böyüdülər. FosB fraqmentləri və namizəd tərəfdaş arasında bağlanması üç reportyor genini məcbur edir (His3, Ura3və LacZ) və induksiya istifadə olunan mədəniyyət şəraitində transformatorları yaşamağa qadir edir. Müsbət klonlar MaV203 hüceyrələrində təkrar çevrilmə təhlilləri ilə təzə pDBLeu-osFosB parçaları ilə sınanmışdır.

Hüceyrə xətləri

Siçan Neuro 2A neyroblastoma hüceyrələri (ATCC), 10 ° C və% 37 CO-da% 5 fetal iribuynuzlu serum (FBS) ilə tamamlanan Qartalın minimum əsas mühitində (ATEM) saxlanıldı.2. Rat 1A hüceyrələri Yusaku Nakabeppu'dan bir hədiyyə idi (Fukuoka, Yaponiya) [18] və Dulbecco'nun MEM (DMEM) (Həyat Texnologiyaları) -nda saxlanılır, 10 ° C və 37% CO-da 5% FBS ilə əlavə olunur2. Plazma DNT-si olan hüceyrələrin transfeksiyası istehsalçının göstərişlərinə əsasən Effektin (Qiagen) istifadə edərək həyata keçirildi.

PSMC5 və ΔFosB konstruksiyaları

Hər birinin N-terminallarında FLAG etiketli PSMC5-ın bir neçə mutant formaları immunoprasiya və ya virusla vasitəçilik edilmiş gen ötürmə təcrübələrində istifadə üçün yaradıldı. Bunlara daxildir: PSMC5-K196M, PSMC5-örtülmüş coil domain (PSMC5-ΔCC, amin turşuları olmayan 27-68), PSMC5-NT (zülalın N-terminal fraqmentindən ibarət olan amin turşuları 1-151X) -CT (zülalın C-terminal fraqmentindən, 5 amin turşularından ibarətdir) (bax) Əncir 1). Leosin-fermuar sahəsindəki mutasiya ilə (FosB) və N-terminal MYC etiketli formalarından da istifadə etdik (amin turşularının 182-dən 205-a qədər dəyişməsi və heterodemizasiyanı Jun ailəsinin zülalları ilə məhv etdiyi məlumdur.)6].

kiçik
1 şəkli. ΔFosB PSMC5-ı vitro-ya bağlayır.

 

A. Leysin fermuar domeninin protFosB heterodimerləşməsini Jun zülalları ilə XFosB N-terminalının ilk 2 amin turşusu olmayan Δ78ΔFosB məhv etmək üçün mutasiyaya uğradığı ΔFosB, ΔFosB-LZM sxematikası. B. PSMC5, PSMC5 ilk 151 amin turşusu olmayan PSMC5 amin turşularını ehtiva edən PSN5-NT və amin turşularını əhatə edən PSMC235-NT sxematikası . AAA domeni, bir çox ATPase-də mövcud olan müxtəlif hüceyrəli fəaliyyətlərlə əlaqəli bir ATPases'ə uyğundur. C. 5 mkg pcDNA5-osFosB (28-68 zolaqları) və ya ΔFosB-LZM (zolaqlı 2.4) 3.1 μg FLAG etiketli PSMC1 hüceyrələrə və ya müxtəlif silmə mutantları ilə Neuro4a hüceyrələrinə əlavə edilmişdir. Transfeksiyadan iki gün sonra hüceyrələr lizinqə uğradı və anti-FLAG antikoru ilə immunoprepatiyaya məruz qaldı, sonra Qərb ΔFosB və ya anti-FLAG antikoru ilə ləkələndi. Qeyd edək ki, ΔFosB-LZM olmayan osFosB, PSMC5 və ya PSMC2.4-NT ilə möhkəm bağlanır, lakin PSMC5-CT və ya PSMC2-ΔCC deyil. Şəkildə göstərilən məlumatlar üç ayrı eksperimentin hər birində üçdə təkrarlandı.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

Heyvanlar

Doqquz - 11 həftəlik C57BL / 6J kişi siçanları (Cekson Laboratoriyası) bütün təcrübələr üçün istifadə edilmişdir. Heyvanlar yemək və suya çıxışı olan bir 12-saatlıq yüngül qaranlıq bir dövrə üzərində yerləşdilər ad libitum və sınaqdan əvvəl 1 həftə əvvəl məskunlaşdılar. İki kokain müalicəsi rejimi istifadə edildi. Kokainin biokimyəvi təsirini öyrənmək üçün heyvanlara gündəlik 7 dozada kokain (20 mq / kq) və ya salin verildi və son inyeksiyadan sonra 24 saat sonra deapitasiya ilə öldürüldü. Bu dərmana çoxsaylı molekulyar və hüceyrə reaksiyalarının verildiyi göstərilən standart bir protokoldur.7]. PSMC5-nin nüvələrdəki akkumulyatorların kokainə qarşı davranış reaksiyalarına təsirini öyrənmək üçün PSMC7.5-ın ΔFosB kimi bir heyvanın həssaslığını artıracağına dair hipotezə əsaslanaraq dərmanın alt həddindən artıq dozasını istifadə etdik (5 mq / kq; aşağıda Lokomotor həssaslığı). kokain [8]. Bütün heyvan təcrübələri Sinay dağındakı institusional Heyvanlara Qayğı və İstifadə Komitəsi tərəfindən təsdiq edilmişdir.

İmmunopraziya və Qərb laxtalanması

Neuro 2A hüceyrələri PSMC5 vəhşi və ya mutant formaları ilə köçürülmüşdür. Transfeksiyadan iki gün sonra, hüceyrələr PBS-də yuyuldu, RIPA tamponda (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% natrium deoksikolat, 10 mM sodyum inhibitatoru) . Lizatlar 3 saat ərzində 4 saat ərzində qeyri-immun IgG (Sigma) və ya anti-FLAG antikorları (Sigma) ilə kəsilmiş və inkubasiya edilmişdir. Təsvir edildiyi kimi İmmunopriyatiya Protein G muncuqları (Invitrogen) ilə aparıldı19]. Qısaca, immunopriptizləşdirilmiş zülallar SDS-SƏHİFƏ məruz qaldı və dərc edilmiş protokollara əsasən anti-FosB / ΔFosB antikoru (Hüceyrə Siqnal Texnologiyası) istifadə edərək Qərb ləkələnməsi ilə təhlil edildi [7]. Vivo zülal bağlayıcı təhlillərində xroniki kokain müalicəsindən sonra sıçrayışla parçalanmış NAc siçanlarından təmizlənmiş nüvə fraksiyalarını istifadə etdik (son inyeksiyadan sonra 20 saat sonra siçan istifadə edərək 7 gün ərzində gündəlik 24 mq / kq IP). Nüvə fraksiyalarından co-immunopretasiya istehsalçının göstərişlərinə əsasən Nüvə Kompleksi Co-IP dəstindən (Active Motif) istifadə edilməklə həyata keçirilmişdir. Aşağıdakı antikorlar istifadə edildi: MYC və ya ß-aktin, Hüceyrə Siqnal Texnologiyası (Danvers, MA), PSMC5 və histon H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 və BRG1, Santa Cruz Biotexnologiyası (Santa Cruz, CA) və FLAG M2, Sigma.

İmmünohistokimya

İmmunohistokimya dərc edilmiş prosedurlara əsasən aparıldı [20]. Siçanlar PBS-də 4% paraformaldehid ilə qaraciyər içərisində anesteziya edilmiş və mükəmməl şəkildə müalicə edilmişdir. Beyin 30% saxaroza ilə kriyoprotektasiya edildi və sonra donduruldu və istifadəyə qədər -80 ° C-də saxlanıldı. Koronal hissələr (40 μm) bir kristat üzərində kəsilmiş və immunohistokimya üçün işlənmişdir. Sərbəst üzən hissələr, 0.3% Triton və 3% normal eşşək serumunu ehtiva edən bir tamponda əvvəlcədən inkubasiya edildi. ΔFosB, zülalın N-terminal hissəsinə (1 / 1000 Santa Cruz Biotexnologiyası) qarşı qaldırılmış bir keçi poliklonal antikor istifadə edərək təsbit edildi. PSMC5, bir dovşan poliklonal antikor (1 / 100 Abcam, Cambridge, MA) istifadə edərək təsbit edildi. Şəkillər bir konfokal mikroskop (60x böyüdücü; Zeiss) ilə çəkildi.

Lokomotor həssaslaşdırma

Bütün siçanlar, iynələrin stresinə öyrəşmək üçün 3 gün ərzində gündəlik salin IP iynələrini aldılar. Ertəsi gün siçanlara salin ilə İP inyeksiya edildi və ya kokainin alt həddində bir doza (7.5 mq / kq; yuxarıdakı Heyvanlar altına bax) dərhal yeni lokomotor qutulara yerləşdirildi. Siçanların lokomotor fəaliyyəti fotobeam sistemindən istifadə edərək 30 dəqiqə ərzində ambulator şüa fasilələri şəklində qeydə alındı. Bu müalicə gündəlik 3 gün ərzində təkrarlanırdı.

Viral vasitəçilik edən gen transfer

Viral vasitəçilik edən gen köçürməsi üçün geniş yayılmış metodlardan istifadə etdik.7,8,11,19]. Qısaca, PSMC5 və ya onun bir neçə mutantı üçün ifadə plazmidləri (bax PSMC5 və yuxarıdakı ΔFosB konstruksiyaları), CMV təbliğatçısı və PSMC1005 və ya onun mutantlarının nəzarəti altında GFP ifadə edən bikistronik p5 (+) HSV plazmidinə daxil edilmişdir. IE4 / 5 təqdimatçısı. Ketamin (100 mq / kq) / ksilazin (10 mq / kq) anesteziya altında siçanlar kiçik bir heyvan stereotaksiya alətinə yerləşdirildi və kranial səthə məruz qaldı. Otuz üç ölçülü şpris iynəsi bir XSV vektorun 0.5 μl-ni 10 ° bucaqla (AP + 1.6; ML + 1.5; DV -4.4) 0.1 μl / dəq sürətlə NAc-a ikitərəfli yoluxmaq üçün istifadə edildi. HSV enjeksiyonlarını qəbul edən heyvanlara təcrübədən əvvəl əməliyyatdan sonra 2 gün ərzində bərpa olunmağa icazə verildi.

Statistika

ANOVA və tələbənin t testləri istifadə edildi, çoxlu müqayisə üçün düzəldildi və əhəmiyyəti p <0.05 olaraq təyin edildi.

Nəticələr

PSMC5: ΔFosB-nin yeni bağlayıcı tərəfdaşı

Sistemi aktivləşdirmədən bir maya iki hibrid təhlildə yem kimi xidmət edən ΔFosB-nin uyğun bir parçasını müəyyənləşdirmək üçün ilkin təcrübələr apardıq. Holo-osFosB, zülalın N-terminalı 1-78 amin turşusu parçası kimi öz-özünə məruzəçi gen fəaliyyətinə səbəb oldu. Bununla birlikdə, bir N-terminal uncFosB (Şəkil 1A), zülalın ilk 2 amin turşusunu itirən Δ78ΔFosB bu təsir göstərmədi. Buna görə it2ΔFosB yemi protein kimi istifadə etdik.

Potensial bağlayıcı tərəfdaşları ekranlaşdırmaq üçün, pPC86-də subcloned bir siçan beyin kitabxanasından istifadə etdik. Bağlı tərəfdaşlar üçün 11 namizədlərini müəyyən etdik. Bu zülallara ΔFosB-nin tanınmış heterodimerləşmə tərəfdaşları daxil olmasına baxmayaraq, c-Jun və JunD (Cədvəl 1), indiyə qədər ən çox namizəd olan PSMC5 idi. Təəccüblü olsa da, bu maraqlı bir tapıntı idi, çünki PSMC5 il əvvəl bir hesabatda c-Fos in vitro ilə bağlanması üçün göstərilmişdir [21]. Bununla birlikdə, PSMC5-in kokain təsirində iştirak etməsi barədə əvvəlcədən məlumat verilmir. Buna baxmayaraq, maya iki hibrid təhlildə PSMC5 siqnalının gücü olduğundan, mümkün olan ΔFosB-PSMC5 qarşılıqlı təsirini daha da öyrənməyə başladıq.

kiçik
Cədvəl 1. Ast2ΔFosB ilə maya iki hibrid seçiminin nəticələri.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

Əvvəlcə ΔFosB və PSMC5 arasındakı fiziki qarşılıqlı əlaqəni təsdiqləmək üçün vitro co-immunopripediya təcrübələrində apardıq. FLAG etiketli PSMC5 (Şəkil 1B), Neuro 2A hüceyrələrinə köçürülərək ΔFosB təsirli şəkildə aşağı çəkildiŞəkil 1C). İkincisi, ΔFosB ilə bağlanmasına cavabdeh olan PSMC5-də bölgəni müəyyən etmək üçün bir neçə FLAG etiketli PSMC5 mutantı yaratdıq (Şəkil 1B) və birgə immunopritet təcrübəsini təkrarladı. ΔFosB zülalın (PSMC151-CT) C-terminalı 5 amin turşusu parçası ilə deyil, PSMC5 (PSMC172-NT) N-terminal 5 amin turşuları ilə təsirli bir şəkildə çəkildi (Şəkil 1C). Paslanmış coil domeni olmayan PSMC5 (PSMC5-ΔCC), ΔFosB-ni çökməyə də təsirsiz ötüşmədi. Bu tapıntılar PSMC5-in osFosB-ni onun qıvrılmış qıvrılmış domeni (amin turşuları 27-68) vasitəsilə bağladığını göstərir. Üstəlik, FLAG etiketli PSMC5, mutasiya edilmiş lösin fermuar domeni (ΔFosB-LZM) ilə osFosB mutant formasını çökmədi (Şəkil 1C) göstərir ki, osFosB ya PSMC5-ni bu domen vasitəsilə bağlayır və ya daha çox ehtimal ki, PSM5 bağlaması üçün ΔFosB heterodimerləşməsinin tələb olunur.

Xroniki kokain qəbulundan sonra NMC-də PSMC5-NFosB bağlanır

Vitrodakı bu tapıntılara əsaslanaraq, NAcdakı PSMC5 səviyyəsinin xroniki kokain tətbiqinə cavab olaraq dəyişdirildiyini öyrəndik. Subcellular fraksiya və Qərb ləkələməsi nəticəsində xroniki kokainin sitoplazmik səviyyələrdə dəyişiklik etmədən bu beyin bölgəsindəki PSMC5 nüvə səviyyəsini artırdığını tapdıq (Şəkil 2A). Bu effekt tək dozada kokaindən sonra görünməmişdir (məlumatlar göstərilmir). Daha sonra PSMC5 və ΔFosB'nin NAcdakı konkokal immunofluoresan mikroskopiyası ilə lokalizasiyasını araşdırdıq. Biz siçanları 24 saat sonra kokainin təkrar təkrar dozasından sonra, ΔFosB-nin yeganə aşkarlanacağı bir zaman nöqtəsini təhlil etdik FosB gen məhsulu (bax Nestler 2008). Güclü bir nüvə siqnalı daxil olmaqla, NAc-də güclü PSMC5 immunoreaktivliyini tapdıq. PSMC85 üçün ləkələnmiş ΔFosB + nüvələrin ~ 5% (Şəkil 2B). Əlavə olaraq, NAc ekstraktları üzərində ortaq immunoprepatiya təcrübələri apardıq və xroniki kokain müalicəsindən sonra osFosB anti-PSMC5 antikoru ilə təsirli şəkildə endirildiyini gördük (Şəkil 2C). Bundan fərqli olaraq, narkotik sadəlövh NAc analizi (təkrar salin inyeksiyasından sonra) aşkarlanan ΔFosB-nin aşağı çəkilməməsi aşkarlandı (məlumatlar göstərilmir). Bu məlumatlar hüceyrə mədəniyyətindəki tapıntılarımıza uyğundur və ΔFosB və PSMC5-in NAc ilə in vivo halında qarşılıqlı təsir etdiyini təsdiqləyir.

kiçik
2 şəkli. Siçan NAc-da PSMC5 tənzimlənməsi.

 

Hər gün 20 gün ərzində fizioloji və ya kokainlə (7 mq / kq) müalicə olunan NAc siçanların nüvə və sitosolik fraksiyalarının qərbdə ləkələnməsi, heyvanların son enjeksiyondan 24 saat sonra təhlili. Kokain, PSMC5-in nüvə, lakin sitosolik səviyyələrini artırmaz. Kokaindən təsirlənməyən histon H3 və ß-aktin yükləmə nəzarəti olaraq istifadə edilmişdir. Məlumat orta ± SEM (n = 8-10 / qrup, * p <0.05). B. Xroniki kokain müalicəsindən sonra AC siçan NAc nüvə lizatları kimi xroniki olaraq kokainlə müalicə olunan siçanların NAc-sında endogen PSMC5 (yaşıl) və ΔFosB (mavi) lokalizasiyası nəzarət olaraq anti-PSMC5 antikoru və ya siçan IgG ilə immunopresipitasiyaya məruz qaldı. və sonra Western anti-FosB / ΔFosB antikoru ilə ləkələndi. Şəkil in vivo olaraq NAc-da PSMC5-ΔFosB qarşılıqlı təsirlərini göstərir. B və C-dəki məlumatlar üç ayrı təcrübənin hər birində üç nüsxədə təkrarlandı.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5, vitroda ΔFosB ifadəsini artırır

PSMC5, proteasome kompleksinin tanınmış üzvü olduğundan, Rat 1A hüceyrələrini istifadə edərək ΔFosB səviyyələrini tənzimlədiyini yoxladıq. PSMC5 overexpression ΔFosB-nin bazal səviyyələrinə təsir göstərmədi, lakin hüceyrələrin serum stimullaşdırılması zamanı uponFosB induksiyasının kiçik, lakin əhəmiyyətli dərəcədə genişlənməsinə səbəb oldu (Şəkil 3A). Bənzər bir tendensiya tam uzunluqlu FosB üçün görüldü, lakin təsir statistik əhəmiyyətə çatmadı. Əksinə, PSMC5-ı hədəfləyən siRNA-ların istifadəsi ilə əldə edilən Rat 1A hüceyrələrində endogen PSMC5 ifadəsinin basdırılması bazal ΔFosB səviyyələrinə təsir etməmiş, lakin serum stimullaşdırması ilə ΔFosB induksiyasını güclü şəkildə maneə törətmişdir (Şəkil 3B). Bənzər effektlər tam uzunluqlu FosB üçün də görüldü. Bu məlumatlar PSMC5 proteasomun əsas alt hissəsi kimi gözlənilə bilən ΔFosB-nin proteasomal deqradasiyasını təşviq etmədiyini göstərir, əksinə bunun maksimum yığılması üçün tələb olunur FosB in vitroda gen məhsulları, bəlkə də zülalları sabitləşdirmək yolu ilə.

kiçik
3 şəkli. Rat 5A hüceyrələrində FosB / ΔFosB ifadəsinin PSMC1 tənzimlənməsi.

 

A. Siçovul 1A hüceyrələri 4 μg PSMC5 və ya nəzarət DNT ilə transfekte edildi. PSMC5 həddindən artıq ekspression, FosB və ya ΔFosB zülalının Qərb ləkəsi ilə təyin olunduğu bazal ekspresiya səviyyələrinə təsir göstərməmişdir, lakin serum stimullaşdırılması ilə ΔFosB induksiyasında kiçik, lakin əhəmiyyətli bir artım meydana gətirmişdir (F (2,21) = 9.75, p = 0.001). B. Siçovul 1A hüceyrələri iki siRNA ya da pişmiş RNT (nəzarət) hər birinin 5 pmol ilə transfekte edildi. Hər iki siRNA, nəzarət şərtləri ilə müqayisədə PSMC5 protein səviyyələrini təsirli şəkildə azaltdı (siRNA # 1, nəzarətin 23 ± 5%; siRNA # 2, 18 ± 6%; p <0.05; n = 4). PSMC5 dağıtması bazal FosB və ya ΔFosB səviyyələrinə təsir göstərmədi, lakin həm FosB, həm də ΔFosB induksiyasını serum stimulyasiyası ilə zəiflədi (FosB: F (2,6) = 20.99, p = 0.002; ΔFosB: F (2,6) = 22.83 , p = 0.002).

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

AFosB və PSMC5 NAc-da CBP, p300 və BRG1 olan komplekslər

PSMC5-in osFosB funksiyasına təsir göstərə biləcəyi transkripsiya mexanizmlərini daha yaxşı başa düşmək üçün, xroniki kokainlə müalicə olunan şəraitdə NAcdakı iki zülal üçün mümkün əlavə bağlayıcı tərəfdaşları araşdırdıq. PSMC5-nin CBP-HAT-a bağlandığı və HeLa hüceyrələrində MHC-II proksimal təbəqəsində histon H3 asetilasiyasını artırdığı barədə bir xəbər var.22]. Bundan əlavə, CBP-də çatışmazlığı olan siçanlar kokainə qarşı davranış həssaslığını, habelə histon asetilasiyasını azaldır FosB təşviqatçı [23]. Beləliklə, PSMC5-nin CBP və bəlkə də digər transkript aktivatorlarını ehtiva edən komplekslərin bir hissəsi olaraq osFosB ilə bağlaya biləcəyini sınadıq.

Əvvəlcə ΔFosB'un həm CBP, həm də p300, əlaqəli bir HAT olan Neuro2A hüceyrələrinə təsirli şəkildə endirdiyini göstərdik (Şəkil 4A). Bunun əksinə olaraq, osFosB-nin leucine fermuar mutant forması, gözlənildiyi kimi, bu fəaliyyəti göstərmədi. Eynilə, PSMC5 CBP və p300-ni effektiv şəkildə çəkdi (Şəkil 4B). Maraqlıdır ki, bu təsir PSMC5-ΔCC-də də osFosB-ni çəkməyən PSMC5-in protein və digər maddələr ilə CBP və p300 ilə qarşılıqlı təsir göstərdiyini və ΔFosB-yə bağlanmağını göstərir.

kiçik
4 şəkli. ΔFosB və PSMC5 in vitro və vivo halında CBP, p300 və BRG1 ilə qarşılıqlı təsir göstərir.

 

A. Neuro2A hüceyrələri 2.4 mkg MYC etiketli ΔFosB və ya MYC etiketli ΔFosB-LZM ilə köçürüldü. Hüceyrə ekstraktları anti-CBP və ya anti-p300 antikor ilə immunoprolidasiya edildi və çöküntülər eyni antikor və ya anti-MYC antikoru ilə Qərb ləğv edildi. Həm CBP, həm də p300 ΔFosB ilə qarşılıqlı əlaqə qurur və bu cür qarşılıqlı təsirsiz lösin fermuarını tələb edir. B. Neuro2A hüceyrələri 2.4 mkg FLAG etiketli PSMC5 və ya FLAG etiketli PSMC5-ΔCC ilə köçürüldü. Hüceyrə ekstraktları anti-CBP və ya anti-p300 antikor ilə immunoprolidasiya edildi və çöküntülər eyni antikor və ya anti-FLAG antikoru ilə Qərb ləğv edildi. Həm CBP, həm də p300 PSMC5 ilə qarşılıqlı əlaqə qurur və bu cür qarşılıqlı təsirlər CC domenini tələb etmir. C. Xroniki kokain müalicəsindən sonra siçan NAcının nüvə lizatları anti-CBP və ya anti-p300 antikoru ilə immunopretasiya məruz qaldı. Əldə edilən çöküntülərin anti-FosB / ΔFosB antikoru ilə sonrakı Qərb ləkələnməsi osFosB və CBP / p300 arasında endogen qarşılıqlı təsir göstərdi. D. Eyni nüvə lizatlarının aliqotları anti-BRG1 və ya anti-PSMC5 antikoru ilə immunoprepatiyaya məruz qaldı, ardınca Qərbdə anti-FosB / ΔFosB və ya anti-BRG1 antikor ilə çöküntülər ləkələndi. Nəticələr ΔFosB və BRG1 və BRG1 və PSMC5 arasında endogen qarşılıqlı təsir göstərir. E. osFosB: CBP / p300, BRG1 və PSMC5 ilə qarşılıqlı təsir göstərən JunD heterodemerlərindən ibarət transkripsiyalı aktivasiya kompleksinin sxematik təsviri.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

Bu qarşılıqlı təsirlərin in vivo halında baş verdiyini təsdiqləmək üçün kokaini xroniki olaraq osFosB və nüvə PSMC5 səviyyələrini, sonra anti-CBP və ya anti-p300 antikorları olan immunoprolidasiya edilmiş NAc ekstraktlarını artırmaq üçün təyin etdik. Hüceyrə kulturası məlumatlarımıza uyğundur, CBP və ya p300-nin immunopretasiyası effektiv şəkildə aşağı çəkildi ΔFosB (Şəkil 4C). SWI-SNF xromatin remodeling kompleksinin əsas tərkib hissəsi olan BRG1-in, BRG5-nin xroniki kokaindən sonra NAc-da aktivləşməsi ilə birlikdə müəyyən bir ΔFosB hədəf genlərinə cəlb olunduğunu əsas götürərək, ΔFosB və PSMC1 ilə əlaqəli olub olmadığını sınadıq.24]. NGC ekstraktlarında BRG1-nin immunopretifikasiyasının ΔFosB-ni aşağı saldığını və PSMC5-nın immunopreparatı ilə eyni zamanda endogen BRG1-in də təsirsiz hala gətirdiyini aşkar etdik.Şəkil 4D). Birlikdə götürülən bu nəticələr, CBP / p5 və BRG300 (NAc) tərkibli ΔFosB-PSMC1 komplekslərini meydana gətirir.Şəkil 4E).

PSMC5 overtekspression lokomotor kokainə qarşı reaksiyaları artırır

NMC-də PSMC5-in ΔFosB ilə əlaqəli olması, bu beyin bölgəsindəki PSMC5 səviyyəsinin artması kokainə qarşı davranış reaksiyalarını tənzimlədiyini araşdırmağa vadar etdi. Herpes Simplex Virusu (HSV) vektörünü yaratdıq ki, ya PSX5 ya da və ya onun mutantlarından birini oversekspress edir və NAc-da vektorları in vivo ilə təsdiqləyir (Şəkil 5A). PSMC5-in viral vasitəçi ifadəsi hüceyrə nüvəsində üstünlük təşkil edir (Şəkil 5B). Vəhşi tipli PSMC5 tipli siçanlar, kokainin ilk dozalarına dəyişdirilmiş cavab göstərməmiş, lakin GFP ifadə edən siçanlarla müqayisədə təkrar kokain dozalarına cavab olaraq lokomotor aktivasiya artmışdır. Bunun əksinə olaraq, PSMC5'ın mutant formasını sıxan siçanlar, həddindən artıq qıvrılmış domen sahibi olmayan (PSMC5-lCC) bu təsiri göstərmədi (Şəkil 5B). Maraqlıdır ki, vəhşi zülalın ATPase aktivliyi olmayan PSMC5-K196M-in həddindən artıq həssaslığı kokainin lokomotor reaksiyalarını da artırır.

kiçik
5 şəkli. NAc'dakı PSMC5 overtekspression lokomotor reaksiyaların kokainə artmasını təmin edir.

 

A. Medial NAc-da HSV-vasitəçiliyi ilə transgen ifadəsi. AC, ön komissura. Şəkildə NAc əsas və qabıq alt bölgələri qeyd edilmişdir. B. HSV-PSMC60 inyeksiyasından sonra NAc neyronlarında PSMC5-in immunohistokimyəvi boyanmasının daha yüksək böyüdücülərini (5x) əks etdirən protein DAPI boyanma ilə qeyd olunduğu kimi zülalın əsasən nüvə olduğunu göstərir. C. Siçanlara NAc-a ikitərəfli HSV enjeksiyonları edildi və ardından gündəlik kokain dozaları (7.5 mq / kq) alt IP dozaları daxil edildi. Lokomotor reaksiyalar, dərmanın gündəlik 3 dozasının ilk və sonuna cavab olaraq göstərilir. PSMC5 və ya PSMC5-K196M-nin həddindən artıq ekspresiyası PSMC5-aineCC ilə görünməyən bir təsiri təkrarlanan kokainə lokomotor reaksiyalarını artırır. Transgenlərin başlanğıc kokain dozalarına lokomotor reaksiyalar üzərində əhəmiyyətli bir təsiri olmamışdır. ANNOVA F (3,125) = 4.163, * p <0.05 Dunnettin posthoc testi ilə.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

Müzakirə

Bu tədqiqatın nəticələri ΔFosB beynə təsirlərini və kokain təsirində iştirak edən yeni bir mexanizmi ortaya qoyan yeni bir mexanizm ortaya qoyur. Bir qərəzsiz yanaşma, bir maya iki hibrid təhlili istifadə edərək PSMC5-ı ΔFosB üçün yeni bağlayıcı tərəfdaş olaraq təyin etdik. Bu tapıntını həm inkişaf etmiş PSMC5-osFosB məcburiyyətini nümayiş etdirərək həm vitro, həm də NAc in in vivo şəklində təsdiqlədik. Vacibdir ki, PSMC5 nüvə səviyyəsi NAc-da xroniki kokain qəbulu ilə alınır. Daha sonra göstərdik ki, PSMC5-osFosB bağlanması bir neçə digər transkripsiyalaşdırıcı zülallarla, yəni CBP və p300 (iki HAT) və BRG1 (SWI-SNF xromatinin yenidən qurulma komplekslərinin əsas tərkib hissəsi) ilə bir yerdə baş verir. Tapdıqlarımız, PSMC5-nin xroniki kokain qəbulu zamanı ən az müəyyən ΔFosB səbəb olan genlərə cəlb olunan transkripsiyal aktivləşdirmə kompleksinin bir hissəsi olduğuna dair fərziyəni dəstəkləyirik (Şəkil 4E). Bu fərziyyəyə uyğundur, PSF5'nın NAc'a həddindən artıq ekspressiyası, ΔFosB'nin həddindən artıq ekspressiyası kimi, kokainə qarşı davranış reaksiyalarını təşviq edən əlavə bir tapıntıdır. Gələcək tədqiqatlarda bunları in vitro müxbirinin təhlillərindən istifadə edərək PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1 qarşılıqlı təsirlərinin səciyyələndirilməsi ilə vivo müşahidələrində izləmək maraqlı olardı.

PSMC5-in kokain fəaliyyətində iştirakı tamamilə yenidir. Əvvəlcə proteazomu meydana gətirən böyük bir ATPazın bir üzvü olaraq təyin olunan PSMC5, illər ərzində c-Fos, p53, nüvə hormonu reseptorları və bazal transkripsiya kompleksinin tərkib hissələri daxil olmaqla bir neçə transkripsiya faktoru ilə qarşılıqlı təsir göstərmişdir. [25] lakin, illər ərzində az funksional tədqiqat aparılmışdır [26]. Ən yaxşı qurulmuş fəaliyyət, mədəniyyətli hüceyrələrdə MYC transkripsiyası amillərinin fəaliyyətini təşviq etməkdir.27]. PSMC5'nin transkripsiya mexanizmlərində təsiri, gen transkripsiyasının tənzimlənməsində ubitivasiya-proteasomal fəaliyyətin potensial rolunu təklif etdi, lakin PSMC5-in bu tənzimləmədə iştirakı bu günə qədər demək olar ki, sınanmamışdır.28,29].

Beyindəki PSMC5 funksiyası haqqında çox az şey məlumdur. Daha əvvəl edilən bir araşdırma, PSMC5 mRNA-nın beynin hər yerində geniş yayıldığını nümayiş etdirdi.30], lakin onun funksional fəaliyyəti araşdırılmamış qalmışdır. Əldə etdiyimiz tapıntılar, bu maraqlı zülalın gələcəkdə gen transkripsiyasının tənzimlənməsindəki rolunu və beynindəki ubiqitinasiya-proteasomal funksiya ilə əlaqəsini daha yaxşı başa düşmələri üçün daha sonra araşdırmalara səbəb olur. PSMC5-in ΔFosB-a bağlanması PSMC5-in coil-coil domeni ilə vasitəçidir. Bundan əlavə, PSMC5-in kokainə lokomotor reaksiyalarını təşviq etmək qabiliyyəti, qıvrılmış qıvrılmış domen tələb edərkən, zülala aid olmayan ATPase fəaliyyətini tələb etmir. Bu nəticələr, heç olmasa sistemimizdə PSMC5-ın əsas fəaliyyətinin osFosB və digər transkripsiyalı tənzimləyici zülallarla bağlanması yolu ilə vasitəçilik edilə bilər və proteasomal ilə əlaqəli fəaliyyət sayəsində deyil. Bu və alternativ imkanları birbaşa yoxlamaq üçün əlavə iş tələb olunur. PSMC5-ın viral vasitəçiliklə həddindən artıq dərəcədə artması ilə kokainə qarşı lokomotor reaksiyaların ΔFosB ilə qarşılıqlı təsirləri nəticəsində 3 günlük kokain müalicəsi rejimindən istifadə edilməsinə baxmayaraq, bu fasilədə ΔFosB-nin təqdir olunan səviyyələrinin beyində toplandığı məlumdur [3].

Mövcud tapıntılar, beyin tənzimlənməsinin molekulyar əsaslarının öyrənilməsində qərəzsiz, açıq eksperimental yanaşmalardan istifadənin faydasını daha da əsaslandırır. PSMC5-a olan ilk diqqətimiz maya iki hibrid təhlildə osFosB ilə əlaqəli olduğuna əsaslandı, buna baxmayaraq, NAc-da təkrar kokain qəbulu ilə cəlb olunan transkripsiyal dəyişikliklərin vacib bir hissəsi oldu. PSMC5 nüvə səviyyəsinin kokainlə əlaqələndirildiyi və PSMC5-in daha sonra kokainlə əlaqəli transkripsiyalı aktivləşdirmə komplekslərinə töhfə verdiyi ətraflı mexanizmləri daha yaxşı anlamaq cari araşdırmaların diqqət mərkəzindədir. Bu vaxt, mayamız iki hibrid təhlili, osFosB-nin bir neçə əlavə yapışdırıcı bağlayıcı tərəfdaşını ortaya qoydu (Cədvəl 1) indi də kokain modellərində birbaşa müayinə üçün zəmanət verir. Birlikdə bu iş, kokainin NAc funksiyasını dəyişdirdiyi mürəkkəb molekulyar mexanizmlər haqqında artan bir anlayışa kömək edir.

Minnətdarlıq

Bu iş, Narkotiklərlə Mübarizə üzrə Milli İnstitutun qrantları və İşibaşı Fondu və Yaponiyanın Elmin Təşviqi Cəmiyyəti (KAKENHI nömrələri: 24591735, 26290064, 25116010) tərəfindən dəstəklənmişdir.

Müəllif iştirakları

Təcrübələri qəbul etdilər və tərtib etdilər: YHO YNO EJN. Təcrübələr həyata keçirdi: YHO YNO PJK RN. Məlumatları təhlil etdi: YHO YNO EJN. Tərtib edilmiş reagentlər / materiallar / analiz vasitələri: TN MO OY AN RN TT. Kağızı yazdı: YHO EJN.

References

  1. 1. Morgan JI, Curran T (1995) Dərhal erkən genlər: on il davam edir. Neurosci 18: 66-67 istiqamətləri. pmid: 7537412 doi: 10.1016 / 0166-2236 (95) 80022-t
  2. 2. Nestler EJ (2008) Bağımlılığın transkripsiyal mexanizmləri: deltaFosB rolu. Philos Trans R Soc London B Biol Sci 363: 3245-3255. doi: 10.1098 / rstb.2008.0067. pmid: 18640924
  3. Maddə bax
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Maddə bax
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Maddə bax
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Maddə bax
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Maddə bax
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Maddə bax
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Maddə bax
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Maddə bax
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Maddə bax
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Maddə bax
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Maddə bax
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Maddə bax
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Maddə bax
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Maddə bax
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Maddə bax
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Maddə bax
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Maddə bax
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Maddə bax
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Maddə bax
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Maddə bax
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Maddə bax
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Maddə bax
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Maddə bax
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Maddə bax
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Maddə bax
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Maddə bax
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Maddə bax
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Maddə bax
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Maddə bax
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. 3. Ümid BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y və s. (1994) Xroniki kokain və digər xroniki müalicə üsulları ilə beyində dəyişdirilmiş Fos kimi zülallardan ibarət uzun müddət davam edən AP-1 kompleksinin induksiyası. Neuron 13: 1235-1244. pmid: 7946359 doi: 10.1016 / 0896-6273 (94) 90061-2
  91. 4. Hiroi N, Brown J, Haile C, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ (1997) FosB mutant siçanları: Fos ilə əlaqəli zülalların xroniki kokain induksiyasının itirilməsi və kokainin psixomotor və mükafatlandırıcı təsirlərinə həssaslıq. Proc Natl Acad Sci USA 94: 10397–10402. pmid: 9294222 doi: 10.1073 / pnas.94.19.10397
  92. 5. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ (2006) ΔFosB sabitliyinin fosforlaşma ilə tənzimlənməsi. J Neurosci 26: 5131-5142. pmid: 16687504 doi: 10.1523 / jneurosci.4970-05.2006
  93. 6. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A və s. (2007) Konservləşdirilmiş C-terminal degron domeninin olmaması ΔFosB-nin özünəməxsus sabitliyinə kömək edir. Eur J Neurosci 25: 3009-3019. pmid: 17561814
  94. 7. Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M və s. (2013) Xroniki kokainə qarşı davranış və struktur reaksiyalar, nüvənin böyüdülmə qabığında ΔFosB və CaMKII ilə əlaqəli bir ötürmə döngəsi tələb edir. J Neurosci 33: 4295 – 4307 doi: 10.1523 / JNEUROSCI.5192-12.2013. pmid: 23467346
  95. 8. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM və s. (1999) Transkripsiyası amilinin beyindəki "FosB" ifadəsi kokainə qarşı həssaslığı idarə edir. Təbiət 401: 272-276. pmid: 10499584
  96. 9. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) ΔFosB kokain üçün stimullaşdırmanı artırır. J Neurosci 23: 2488-2493. pmid: 12657709
  97. 10. McClung CA, Nestler EJ (2003) CREB və DFosB tərəfindən gen ifadə və kokain mükafatının tənzimlənməsi. Nat Neurosci 11: 1208-1215. pmid: 14566342 doi: 10.1038 / nn1143
  98. 11. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB və s. (2006) ΔFosB: phFosB nüvədəki rolu morfin təsirində böyüyür. Təbiət Neurosci 9: 205-211. pmid: 16415864 doi: 10.1038 / nn1636
  99. 12. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, et al. (2003) Transgenik siçanlarda c-iyunun dominant bir mənfi mutantının təsir göstərə bilən, beyin bölgəsinə xas olan ifadəsi kokainə həssaslığı azaldır. Brain Res 970: 73-86. pmid: 12706249 doi: 10.1016 / s0006-8993 (03) 02230-3
  100. 13. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y və s. (1995) Delta FosB və FosB kimi zülalların elektrokonservativ tutma və kokain müalicəsi ilə tənzimlənməsi. Mol Pharmacol 48: 880-889. pmid: 7476919
  101. 14. Hiroi N, Marek GJ, Brown J, Ye H, Saudou F, Vaidya VA və s. (1998) FosB geninin elektrokonvulsiv tutulmaların molekulyar, hüceyrə və davranış hərəkətlərində vacib rolu. J Neurosci 18: 6952-6962. pmid: 9712664
  102. 15. Perez-Otano I, Mandelzys A, Morgan JI (1998) MPTP Parkinsonizm, D-FosB kimi bir zülalın dopaminergik yollarda davamlı şəkildə ifadə edilməsi ilə müşayiət olunur. Mol Brain Res 53: 41-52. pmid: 9473580 doi: 10.1016 / s0169-328x (97) 00269-6
  103. 16. Ma J, Ptashne M (1988) Eukaryotik transkripsiyalı inhibitoru bir aktivatora çevirir. 55 hüceyrəsi: 443-446. pmid: 3180218 doi: 10.1016 / 0092-8674 (88) 90030-x
  104. 17. Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, Fields S (1991) İki hibrid sistem: maraq zülalı ilə qarşılıqlı olan zülallar üçün genləri müəyyənləşdirmək və klonlaşdırmaq üsulu. Proc Natl Acad Sci USA 88: 9578-9582. pmid: 1946372 doi: 10.1073 / pnas.88.21.9578
  105. 18. Nakabeppu Y 1, Oda S, Sekiguchi M (1993) delta FosB tərəfindən quisent Rat-1A hüceyrələrinin proliferativ aktivləşdirilməsi. Mol Cell Biol 13: 4157-4166. pmid: 8321220
  106. 19. Scobie KN, Damez-Werno D, Sun H, Shao N, Gancarz A, Panganiban CH və s. (2014) Poli (ADP-ribosil) ionunun kokain fəaliyyətində vacib rolu. Proc Natl Acad Sci USA 111: 2005-2010. doi: 10.1073 / pnas.1319703111. pmid: 24449909
  107. 20. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, et al. (2008) Zərərli dərmanlarla beyində osFosB induksiyasının fərqli nümunələri. Sinaps 62: 358-369. doi: 10.1002 / syn.20500. pmid: 18293355
  108. 21. Wang WL, Chevray PM, Nathans D (1996) Mammalian Sug1 və nüvə 26S proteasomundakı c-Fos. Proc Natl Acad Sci USA 93: 8236-8240. pmid: 8710853 doi: 10.1073 / pnas.93.16.8236
  109. 22. Koues OI 1, Dudley RK, Truax AD, Gerhardt D, Bhat KP, McNeal S və s. (2008) 19S proteasomal ATPase Sug1 tərəfindən əsas histokompozisiya mürəkkəb sinif II proksimal təqdimatçıda asetilasiyanın tənzimlənməsi. Mol Cell Biol 28: 5837-5850. doi: 10.1128 / MCB.00535-08. pmid: 18662994
  110. 23. Levine AA, Guan Z, Barco A, Xu S, Kandel ER, Schwartz JH (2005) CREB-bağlayıcı zülal, siçan striatumundakı fosB təqdimatçısında histonları asetilasiya edərək kokainə cavab verir. Proc Natl Acad Sci USA 102: 19186-19191. pmid: 16380431 doi: 10.1073 / pnas.0509735102
  111. 24. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT və s. (2005) Xromatinin yenidən qurulması, striatumda kokainin yaratdığı plastikliyin əsas açarıdır. Neuron 48: 303-314. pmid: 16242410 doi: 10.1016 / j.neuron.2005.09.023
  112. 25. St-Arnaud R (1999) Transkripsiya tənzimləyiciləri üçün ikili funksiyalar: mif və ya reallıq. J Cell Biochem Suppl 32/33: 32-40. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4644 (1999) 75: 32+ <32 :: aid-jcb5> 3.0.co; 2-x
  113. 26. Ferrell K, Wilkinson CRM, Dubiel W, Gordon C (2000), mürəkkəb bir problem olan 26S proteazomunun tənzimləyici alt birləşmələri. Biochem Sci 25: 83-88 istiqamətləri. pmid: 10664589 doi: 10.1016 / s0968-0004 (99) 01529-7
  114. 27. von der Lehr N, Johansson S, Larson LG (2003) Ubiquitin / proteasome sisteminin myc tənzimlənən transkripsiyasında təsiri. 2-5: 403-407 hüceyrə dövrü. doi: 10.4161 / cc.2.5.484
  115. 28. Geng FQ, Wenzel S, Tansey WP (2012) Ubiquitin və transkripsiyada proteasomlar. Annu Rev Biochem 81: 177-201. doi: 10.1146 / annurev-biochem-052110-120012. pmid: 22404630
  116. 29. Collins GA, Tansey WP (2006) Zülal: transkripsiya üçün bir köməkçi vasitə? Curr Op Genet Dev 16: 197-202. pmid: 16503126
  117. 30. Sun DH, Swaffield JC, Johnston SA, Milligan CE, Zoeller RT, Schwartz LM (1997) Siçan sinir sistemində fərqli olaraq ifadə olunan bir filogenetik olaraq qorunan Sug1 CAD ailə üzvünün təyin edilməsi. Dev Neurobiol 33: 877-890. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4695 (199712) 33: 7 <877 :: aid-neu2> 3.0.co; 2-5