Proc Natl Acad Sci ABŞ A. Apr 29, 2014; 111 (17): 6455-6460.
Onlayn nəşr Aprel 15, 2014. doi: 10.1073 / pnas.1404323111
PMCID: PMC4036004
Nevrologiyada
Teruko Danjo,a Kenji Yoshimi,b Kazuo Funabiki,a Satoshi Yawata,a və Şigetada Nakanishia,1
Bu məqalə olmuşdur istinadən PMC-də digər məqalələr.
əhəmiyyət
Ventral tegmental sahədə (VTA) dopamin (DA) nöronları əsasən müvəqqəti səssizləşmə ilə təcavüzkar stimullara reaksiya verir. Bu reaksiyanın birbaşa siçanların davranışında səbirli cavabı yaradır-etmədiyi aydın deyil. Bu sualın VTA-da DA neyronlarının optogenetik şəkildə idarə olunması ilə müayinə etdik və DA nöronların inaktivasiyası qəzəbli cavab və öyrənməyə səbəb oldu. VTA DA neyronlarının əsas çıxış nüvələri olan nucleus accumbens (NAc) bu cavabdan məsuliyyət daşıyırdı, ona görə biz D1 və ya D2 reseptorunun knockdown istifadə edərək, bu davranış üçün NAc-dakı əsas yolların hansı olduğunu araşdırdıq, və bu davranış üçün D2 reseptor spesifik yolunun vacib olduğunu tapdılar.
mücərrəd
Ventral tegmental bölgədən (VTA) olan dopamin (DA) ötürülməsi həm mükafatlandırıcı, həm də həssas davranışları idarə etmək üçün vacibdir. DA nöronların müvəqqəti səssizləşməsi təcavüzkar stimullara cavabdır, amma nəticələr və nervous mexanizmləri həddindən artıq reaksiya və öyrənmə ilə bağlı böyük ölçüdə qalıcı deyil. Burada, biz VTA DA nöronlarının optogenetik inaktivasiyasının dərhal aşağı tənzimlənən DA səviyyələrində olduğunu və nüvə funksiyalarının nüvəli aktivliyin yuxarı tənzimlənməsinə səbəb olduğunu bildiririk (NAc) Fos ifadəsi ilə qiymətləndirilmişdir. TDA neyron atəşinin optogenetik bastırılması dərhal əvvəlcədən üstünlük verilən qaranlıq otaqlara qarşı həssas cavablar doğurdu və optogenetik cəhətdən kondensasiya edilmiş yerə qarşı həssas öyrənməyə səbəb oldu. Vacibdir ki, bu yerdən yayınma dopamin D2 reseptorlarının knockdown tərəfindən ləğv edilib, lakin NAc-da D1 reseptorları tərəfindən deyil. VTA-da DA nöronların səssizləşməsi, beləliklə də, NAc-da dopamin D2 reseptorları vasitəsilə cəzalandırıcı cavablar yaratmaq və öyrənmək üçün əvəzedilməzdir.
Mezolimbik dopaminergiya sistemi yalnız motivasiya və öyrənmə sahəsində geniş rol oynayır,1-3), lakin onun disfunksiyası Parkinson xəstəliyi, şizofreniya və narkomaniyaya nümunə kimi göstərilən ağır nöropsikiyatrik xəstəliklərdə də təsirlənmişdir. Ventral tegmental sahədə (VTA) dopamin (DA) nörozları fasik atəş tərəfindən stimullaşdırıcı stimullara reaksiya verir və bu atəşin əsas funksiyası "mükafat proqnozu səhvini" kodlaşdırmaq üçün teorəndir, proqnozlaşdırılan mükafat və faktiki mükafat (4). Təşəbbüskar stimullara cavab olaraq fərqli olaraq, təcavüzkar stimullara qarşı reaksiyaları homologdur; yəni bəzi DA neyronları təkəbbürlü stimullara cavab olaraq aktivləşir, əksəriyyəti isə müvəqqəti olaraq onların atışlarını basdırmaqla cavab verir (5-9). Əslində, son dövrlərdə araşdırmalar göstərir ki, GABAerjik neyronların optogenetik aktivasiyası və DA neyronlarının nəticələnən inaktivasiyası mükafatın istehlakını basdırır və cəfəng cavab verməyə səbəb olur (10, 11). Bununla belə, VTA-da DA nöronların inaktivasiyasından sonra və mükafat istehlakını bastırmaq və cəzalandırıcı davranışları maneə etmək üçün davranış reaksiyalarının necə idarə olunduğundan sonra nöral sxemlərdə hansı mexanizmlərin vacib olduğu vacibdir.
Birləşdirilmiş sübutlar pozitiv və mənfi stimullara cavab verən motivasion və bilişsel öyrənmənin əsasən bazal ganglion (o cümlədən neyron circuit)12), midbraindən olan böyük miqdarda dopaminergik proqnoz alır. Striatumda, iki fundamental neyron sxemi müəyyən edilmiş orta ölçülü spiny nöronlar (MSN) tərəfindən hazırlanmışdır, hər biri DA reseptorunun13).
- Bir dövrə, birbaşa bazal ganglionun əsas nüvələrinə, əhəmiyyətli nigra pars reticulata (SNr) çıxış edən və əsasən dopamin D1 reseptorlarını (D1Rs) ifadə edən MSNlərdən ibarət olan birbaşa yoludur..
- Digər tərəfdən, globus pallidus vasitəsilə SNR-yə dolayı yolla başlayan və ilk növbədə dopamin D2 reseptorlarını (D2Rs) ifadə edən MSN-lərdən ibarət olan dolayı yol.
DA-dan midbrain siqnalları D1Rs və D2Rs vasitəsilə bu iki paralel yolları dinamik şəkildə modulyasiya edir və bu modulyasiya motivasion öyrənməni asanlaşdırır3, 14).
- Təşəbbüskar stimullara gəldikdə isə, mükafatlandırıcı siqnallarla əmələ gələn yuxarı tənzimlənən DA səviyyələri D1Rs aktivləşdirmək hesab olunur və əsasən nüvə accumbens (NAc).
- Digər tərəfdən dəvari stimullarına cavab olaraq DA neyron atəşlərinin basdırılması NAc-da DA səviyyələrini azaldır; və bu reaksiya aktivləşdirilmiş D2Rs vasitəsilə dolayı yolda siqnal ötürülməsini xüsusilə dəstəkləməlidir.
Farmakoloji strategiyaları və geri çevrilən neyrotransmission blokirovkası (RNB) metodundan istifadə edilən tədqiqatlar NAc-da bu tənzimləmə mexanizmini dəstəklədi15, 16DA neyron atəşinin basdırılmasının indirekt yolun fəaliyyətini təşviq etmək və sonradan qaçınma davranışına səbəb olmağın kifayət qədər olub-olmadığını məlumdur. Bu hazırkı işdə biz membran-hiperpolarizan Arch proteininin optogenetik olaraq manipulyasiya edilməsi ilə VTA-da DA neyronlarını selektiv şəkildə pozaraq bu məsələyə müraciət etdik17) və aydın şəkildə göstərmişdir ki, DA nöronların VTA-da dayandırılması NAc-da DA səviyyəsinin azaldılması və təcavüzkar reaksiya və öyrənməni səbəb olmuşdur. Bundan başqa, biz bu reaksiya tənzimlənməsinin mexanizmlərini tədqiq etdik və bu təcavüzkar reaksiyanın NAc-də D2Rs tərəfindən xüsusi nəzarət edildiyini açıqladıq.
Nəticələr
DA Neyronların Optogenetik İnaktivasiyası Qaranlıq Otaq Seçimi Blokları.
DA neyronlarının qaşınmalarını selektiv şəkildə ləğv etmək üçün Arch-eGFP [AAV-double-floxed inverted açıq oxu çərçivəsi (DIO) -Arch) kodlayan bir Cre-indüktiv adeno-əlaqəli viral quruluşu17) birtərəfli olaraq yetkin tirozin hidroksilazın (TH) VTA-daxil18) və yabanı tipli (WT) littermates və VTA-dan yuxarıda optik lif qoydularŞəkil S1 A və C). Əməliyyatdan iki həftə sonra Arch-eGFP, VTA-da məhdud şəkildə aşkar edilmişdir (Şəkil S1B). Arch proteininin hiperpolarizasiya təsirini elektrofizioloji qeydlərlə sınamış və AAV-DIO-Arch ilə əkilən TH-Cre siçanlarının VTA-nın optik stimullaşdırılması təsiri ölçülmüşdür. Anesteziyalı TH-Cre siçanlarının VTA'sında in vivo elektrofizioloji qeydlərdə, proqnozlaşdırıcı DA nöronlarının optik stimullaşdırılması onların atəşləriniŞəkil S2optik stimullaşdırmanın Arch-ifadə edən DA hüceyrələrinin membran potensialını kifayət qədər hiperpolarizə etdiyini və bununla da spontan atəşlərini maneə törədəcəyini ifadə edir.
Bu siçanlardan istifadə edərək, sonradan VTA'daki DA nöronların optik inaktivasiyasının davranışçı öyrənmə üçün çirkin bir siqnal ola biləcəyini araşdırdıq. Siçanlar qaranlıq bir ətraf mühitə19). Siçanların qaranlıq otaqları sərbəst şəkildə araşdıra biləcəyi və parlaq yer (Əncir 1A). Habitiyadan sonra, WT siçanları qaranlıq otaqda qaranlıq otaqda optik stimullaşdırma ilə və ya olmadan üstünlükdə qaldıŞəkil S1D) optik stimullaşdırmanın öz qaranlıq otağı üstünlük verən davranışlarına heç bir təsir göstərməməsini təmin edir. DA neyronlarının optik inaktivasiyasını onların davranışlarına təsirini test etmək üçün heyvanların davranış təcrübəsini planlaşdırdıqŞəkil S1E). Habitity və pretest sonra, siçanlar qaranlıq otaqda qaldıqda VTA DA nöronların optik stimullaşdırılması ilə şərtlənib. İlk 5 min kondisionerlə təmin edilərkən, TH-Cre siçanı əvvəllər üstünlük verilən qaranlıq otaqdan qaldı və ardıcıl kondisionerdənƏncir 1B). TH-Cre siçanı, posttestdə optik stimullaşdırma olmadıqlarına baxmayaraq qaranlıq otağa qarşı onların qarşısını ala bilməmişdir (Əncir 1C). Bu məlumatlar göstərir ki, DA nöronların hiperpolarizasiyası yalnız müvəqqəti cəhənnəm davranışını yaratmır, həm də qaranlıq otaqlara qarşı təcavüzkar öyrənmə üçün bir siqnal kimi xidmət edir və həmçinin DA nöronların inaktivasiyası həm müvəqqəti cəhənnəm davranışında, həm də uzun müddətli təhsildə öyrənməyə səbəb olur.
NAc-da DA səviyyələrinin optogenetik aşağı tənzimlənməsi.
Bundan sonra VTA-da DA nöronların inaktivasiyası əsas hədəf bölgəsində, NAc-də DA konsentrasiyasını dəyişdiyini araşdırdıq. AAV-DİO-Arch ilə VTA-ya enjekte edilmiş TH-Cre anesteziyalı TH-Cre siçanlarında tez-scan siklik voltametri (FSCV) tərəfindən NAc səviyyəsində DA səviyyələrini qiymətləndirdik. NAc-da DA səviyyələri VTA-nın elektriksel stimullaşdırılması ilə dərhal yüksəldilmişdir və VO-nın eyni vaxtda optik stimullaşdırılması ilə uyğundur.Şəkil S3). Sonra VTA-nın optik stimullaşdırılması NAc-də tonik DA səviyyəsini azalda bilərmi? Eyni eksperimental parametrlərdə, NAc-də DA səviyyəsinin 20 s VTA-nın optik stimullaşdırılması ilə keçici şəkildə azaldıldığını müşahidə etdik (Əncir 2), fers xəbərdarlıq stimuluna qarşı bildirilən FSCV reaksiya ilə uyğun gəlir (20). Bu məlumatlar göstərir ki, VTA-nın optik stimullaşdırılması VTA DA nöronlarını inaktivləşdirmək və davranış təcrübəsində NAc səviyyəsini azaltmaq üçün kifayət qədər effektivdir.
VTA-da DA Neyronların optik inaktivasiyası ilə Fos Geninin İfadəsi Up-tənzimlənməsi.
VTA-da DA neyronlarının şərti inaktivasiyası nəticəsində yaranan davranış dəyişikliyi optik stimullaşdırmanın birbaşa sinir aktivitesini dəyişdiyini və davranış göstəricilərinin dəyişməsinə gətirib çıxardığını irəli sürdü. Beləliklə, növbəti sinir aktivliyinin DA nöronların şərti inaktivasiyası ilə dərhal erkən genin Fos ifadəsini araşdıraraq yüksəltdiyi bölgələri araşdırdıq. Kondisionerin qaranlıq otaq testində yerinə yetirdikdən bir qədər sonra, siçanlar Fos ifadəsinin miqdarını kəmiyyətli in situ hibridizasiya təhlili ilə müəyyən etmək üçün tez işlənmişdir (Əncir 3 və Şəkil S4). VTA-dan böyük miqdarda dopaminergik proqnozlar alan bölgə NAc, TH-Cre siçanlarında Fos ifadəinin əhəmiyyətli dərəcədə artdığını göstərdi (Əncir 3). Bu up-tənzimləmə də optik stimullaşdırmanın qarşı tərəfli tərəfində aşkar edilmişdir ki, guya bunun yanına kiçik miqdarda virus infeksiyası səbəb olur. Bununla belə, yuxarı tənzimləmə ipsilateral tərəfdə optik stimullaşdırmanın əks tərəfi ilə müqayisədə daha yüksək idi və DA neyronların optik inaktivasiyası NAc-nin neytral aktivliyini birbaşa tənzimləyir. Artan Fos ifadəsi septum, striatumun periventrikulyar bölgələri, basolateral amigdala (BLA) və lateral hipotalamus daxil olmaqla digər beyin bölgələrində də müşahidə olunmuşdur, lakin yanal habenula və ya medial prefrontal korteksdə (mPFC; Şəkil S4). Bu nəticələr göstərir ki, DA nöronların optik inaktivasiyası ilə aktivləşdirilən bölgələr VTA DA nöronlarının birbaşa hədəf bölgələri ilə məhdudlaşmır, əksinə, neyron dövrə bağlı şəkildə dolayısı ilə aktivləşdirilə bilən bölgələri əhatə edir. Bu müşahidə DA nöronların optimal deaktivasiya edilməsini, dövrə nöronal aktivliyini dəyişdirmişdir və təkcə bir qəzəbli reaksiyaya səbəb ola bilməz, anksiyete, qorxu və stress reaksiyaları kimi bir sıra digər beyin funksiyalarını tetikleyebilir (21).
D2R vasitəsi ilə DA siqnalizasiyası Optogenetik cəhətdən istifadəyə verilmiş vəziyyətdə olan yerdən yayınma üçün vacibdir.
VTA'dan gələn dopaminergik siqnalların əksəriyyəti DA reseptorları, D1R və D2R vasitəsilə NAc-də MSN-lara ötürülür. D1R, demək olar ki, yalnız P maddəsində (Tac1 gen kodlu) ifadə olunur; MSN'lərin təqdim edilməsi və D2R əsasən enkefalində (Penk geni tərəfindən kodlaşdırılmış) ifadə olunur; hər bir MSN növü, sırasıyla, NAc (və ya3). DA üçün yaxınlığı D2R (nM sifariş) üçün D1R (μM sifariş)22, 23), DA səviyyəsində bir azalmanın G'nin inaktivasiyasına səbəb olduğu düşünülüriD2R lakin D1R (heç bir təsiri yoxdur)3, 24), beləliklə indirekt yolda xüsusi olaraq neyrot fəaliyyətini tənzimləyir. Bundan əlavə, Fos aktivasiyası Penk- və ya Drd2 (D2R) -xpressing hüceyrələrində Tac1- və ya Drd1a (D1R) -xpressing hüceyrələrindənŞəkil S5). Bu müşahidələrə əsasən, D2R vasitəsilə DA sinyalizasiya müşahidə olunan cəhənnəm şəraitində əsas rol oynaya biləcəyini fərz etdik.
Bu hipotezi sınamaq üçün üç kameralı klimalı yerdən yayınma (CPA) testiniŞəkil S6). Biz demək olar ki, eyni şərait və iki kiçik dəhliz olan iki otaqlı bir davranış aparatı hazırlamışıq. EBM testində bu obyektiv ekoloji vəziyyət bizə VTA DA nöronlarının inaktivasiyasını qaranlıq otaq seçimini maneə törətməklə yanaşı, təcavüzkar reaksiyanı və öyrənməni maneə törətməyə imkan verə biləcəyini araşdırmağa imkan verdi. Heyvanları bütün aparatı ətrafında sərbəst şəkildə hərəkət etməyə icazə verildikdə, onların əksəriyyəti pretestdə davranış fərqliliyi olmadan iki kamerada qaldı. Optik kondisioner daha sonra bir sabit kamerada optik stimullaşdırma ilə əlaqələndirildi. Kondisionerlərin hər hansı birinin istifadəsi üçün istifadə olunduqda belə, TH-Cre siçanı kondisionerlə və posttest (optimallaşdırılmış) kamerada qalıcı və əhəmiyyətli dərəcədə istisna olunduŞəkil S6 B-E). İstatistiksel analiz, WT farelerinin kalma süresiyle karşılaştırıldığında, OPT-Cre faresinin optik açıdan klimalı odada kalma süresinde önemli bir azalma olduğunu doğruladı (Şəkil S6F).
Daha sonra, NAc-da DA reseptorlarının hər birini basdırmaqla bu qəzəbli davranışa daxil olan DA reseptor subtiplərini müəyyən etməyə cəhd etdikƏncir 4 və Şəkil S7). Hər bir DA reseptoru üçün qısa saç tökmə RNA (shRNA) olan lentiviral vektorları mCherry-nin konstruktiv ifadəsi ilə dizayn və doğruladıq. Lentivirusun NAc-yə daxil edilməsindən üç həftə sonra mCherry-nin möhkəm ifadəsi NAcƏncir 4B). Hər bir reseptorun mRNA ekspresyonunun effektiv knockdownu kəmiyyət real-time PCR analizi ilə təsdiqlənmişdir (Şəkil S7A). Western blotting vasitəsilə zülal səviyyəsinin ölçülməsi də lentivirusların hər birinin injectionunun DA reseptorunun digər alt tipinin ifadə edilməsinə təsir etmədən hədəf protein məhsulunu selektiv şəkildə azaltdığını (Əncir 4C və Şəkil S7 B-G). ShD1R- və shD2R-ifadə edən lentivirüslər hədəf protein səviyyəsini sırasıyla 46.2 ± 1.1% və 38.4 ± 4.9% səviyyəsinə nəzarət virusu səviyyəsinəƏncir 4C). Bu nəticələr D1R və D2R üçün xüsusi olaraq şRNT-i ifadə edən lentiviral vektorların hədəf RNT-i seçicilərlə kifayət qədər bastırdığını və müvafiq protein məhsullarının miqdarını aşağı tənzimləməsini təsdiq etdi. Bundan başqa, lentivirüslə əlaqəli shRNA'nın VTA-a birbaşa təsir göstərməməsi istisna olmaqla, mCherry'nin virusla əlaqəli ifadəsi VTA-da aşkar edilməmişdir.
ShRNA olan bu lentiviruslardan istifadə edərək, DA reseptorunun DA nöronlarının optogenetik inaktivasiyası nəticəsində yaranmış cəhənnəm davranışından məsul olduğunu test etdik. TH-Cre siçanlarının sol VTA'sına AAV-DIO-Arch ilə birlikdə ikitərəfli NAc-da shRNA tərkibli lentivirus və ya nəzarət lentivirüsünü enjekte etdik. Optik fiber həmçinin VTA-nınƏncir 4A). Üç kameralı EBM testinin əməliyyatdan üç həftə sonra aparıldığı zaman, TH-Cre siçanları lenti ilə enjekte edildi: shD1R-mCherry hələ optik stimullaşdırma-eşli kameraya qarşı dəqiq EBM göstərdi, nəzarət lentivirus (lenti: mCherry). Əksinə, lenti ilə enjekte edilmiş TH-Cre siçanları: shD2R-mCherry kondisioner zamanı aydın EBM göstərmədi (Əncir 4D). TH-Cre siçanlarının lenti ilə şişirdilmiş eksklüziv tədqiqat kəsiri: shD2R-mCherry, posttestdə aversiv öyrənmə təhlili ilə daha da əsaslandırıldıƏncir 4E). Bu nəticələr DA neyron inaktivasiyası ilə şərtlənən yerə sürətləndirici davranışın NAc-də D2R vasitəsi ilə deyil, D1R vasitəsi ilə uyğundur.
Müzakirə
Striatumda tədqiqatlar göstərir ki, GsD1R, onun atəşini asanlaşdırır, GiD2R-büzülmüş atəş səmərəliliyi ilə nəticələnir (25). AcDA reseptorlarının spesifikliyinə əsasən, DA neyronların fasik atəşləri əsasən D1R vasitəsilə birbaşa yolun aktivləşdirilməsinə səbəb olur, DA neyron atışlarında isə müvəqqəti azalma əsasən D2R (3, 26). Bu tənzimləmə mexanizminə əsasən, DA neyronların siqnalizasiya edilməsinə mane olan stimullara cavab olaraq səssizləşmə əsasən dolaysız yol və embarqo davranışlarla nəticələnir (3). Son tədqiqatlar göstərdi ki, dolayı yolun sinaptik ötürülməsinin blokadası elektrik çarpması nəticəsində yaranmış cəhənnəm davranışını pozur (15) və bu pozğunluq D2R vasitəsi ilə ötürülən siqnal ötürülməsinin maneə törətməsindən16). MənBundan əlavə, dolayı yolda D2R-ifadə edən MSNlərin optogenetik up-tənzimlənməsi davranışdan yayınmağa səbəb olur (27). Bununla yanaşı, DA neuronları təkrarlanan xəbərdarlıqlara cavab olaraq həm inkişaf etmiş, həm də bastırılmış qüsurları sergilediğinden və şokla əlaqəli digər məlumatların beynində eyni zamanda işlənildiyi üçün DA nöronların səssizləşməsinin birbaşa çaşqınlıqlı reaksiya və öyrənməni tetikleyip etkilemediği, və bu reaksiya D2R-də MSN-lərin dolayı yolda ifadə ediləcəyi ilə tənzimlənir.
Bu çalışmada, iki davranış testinde DA nöron fırınlarının optogenetik kontrolü istifadə edildi: karanlık oda tercih testi ve üç kameralı EBM testi. Bizim optogenetik manipulyasiya VTA-da DA nöron qüvvələrinin effektiv basdırılması və NAc-da DA səviyyəsinin aşağı tənzimlənməsi göstərdi. DA neyron atəşkəslərimizin dəqiq optogenetik inaktivasiyası yalnız heyvanların şərtli otaqda qaldıqları dövrdə açıq bir şəkildə təcili reaksiyanı və öyrənməni uydurdu və müvəqqəti DA suskunluğunun birbaşa passiv qaçınma davranışına səbəb olduğunu göstərdi. Bundan başqa, bu araşdırma D2R-vasitə ilə işlənmiş siqnal emalının bu təcavüzkar reaksiyanın və öyrənmənin induksiyası üçün əsas həlledici olduğunu aşkar etdi.
Bizim məlumatlar D1R-nin davranış təcrübələrində EBM-ni meydana gətirmək üçün heç bir təsir göstərmədiyinə baxmayaraq, bir neçə tədqiqat DA nöronlarının fasik atəş etməsi qorxu reaksiyaları və təcavüzkar öyrənmə28, 29). Bu fərq, eksperimental qəbulu sayəsində; yəni bizim optogenik yanaşmamız, aktiv nöqtələrin DA neyronları vasitəsilə seysmik cəhətdən həssas davranışları ortaya çıxartmaq imkanını istisna etdi və DA neyronların inaktivləşdirilməsi cəhənnəm davranışını və öyrənməsini təmin etmək üçün kifayətdir. Həssas stimullar ilə uyğundur aktivləşdirilmiş DA atışının funksiyası və siqnal emalı burada tədqiq olunanlardan yayındırıcı davranışlara müxtəlif töhfələr verəcək və gələcəkdə aydınlaşdırılmalıdır.
DA neyronları həmçinin mPFC, amigdala və hipokampus da daxil olmaqla müxtəlif bölgələrə layihə verir. Son bir araşdırma bunu göstərdi VTA-da DA neyronlarına proqnozlaşdırılan lateral habenula neyronlarının optogenetik aktivasiyası hədsiz davranışa səbəb ola bilər və bu DA neyronları əsasən və xüsusilə mPFC (30), onların optogenetik kondisionerləri bizim hazırkı işimizdən fərqli olmasına baxmayaraq, onların optogenetik stimullaşdırılması bütün kondisioner seansları üçün uzadıldı. MPFC-yə dopaminergik girişin təkrarlayıcı stimullarla deyil, həm də xroniki stress ilə31, 32), mPFC proqnozlaşdırıcı DA nöronlarının fasiləsiz aktivləşdirilməsi olduqca stresli mühitdən siqnallar kimi qəbul oluna bilər; Stressli kondisiyalaşdırmanın nəticəsi olaraq, heyvanlar kondisiyalaşdırılmış kameraya sürətləndirici davranış göstərəcəkdi. Əksinə, DA neyronlarının atəş edilməsini yalnız heyvanlar vəziyyətdə olan otaqda qaldıqda inhibe etdik. Zamanlama uyğunlaşdırılmış kondisionerdən istifadə etdiyimiz davranış təcrübələrimizin nəticələrinə görə, DA siqnalının birdən-birə bastırılması ani qəzəbli bir giriş kimi qəbul ediləcək və bu, onların tez cəfəng cavabına gətirib çıxardı.
DA nöronları həmçinin qorxu reaksiyasına böyük təsir göstərən bölgə olan amigdalaya da layihəni həyata keçirir. Həqiqətən də, amigdalana dair DA siqnalları qorxu reaksiyasına və qorxu yaddaşının alınmasına təsir göstərmişdir (33, 34). Bizim çalışmamızda VTA'da DA nöronların etiketlenmesi, BLA'ya proqnozlaşdırılan DA nöronlarının bir sıra olduğunu təsbit etdi, lakin bu proqnozların miqdarı NAc-a proqnozlaşdırılana nisbətən daha aşağı idi. Amigdala proqnozlaşdırılan DA sinyalizasyonunun müşahidə olunan cəhənnəm davranışımıza həssas təsirini istisna edə bilməməyimizə baxmayaraq DA neyronlarının optogenetik inaktivasiyasının əsas təsiri NAc üzərində olmalıdır, çünki NAX-da D2R-nin xüsusi sökülməsi ilə əlaqədar təcrübələr kəskin şəkildə azalmışdır təcavüzkar davranış. DA-neyronların dövrə-geniş modifikasiyasının təsadüfi stimullara və qorxu kondisionerinə təsirlərini aydınlaşdırmaq üçün hədəf-müəyyən DA sinyalizasiya ilə bağlı gələcək tədqiqatlar tələb olunur.
Material və metodlar
Fənlər.
Tirosin hidroksilaz :: IRES-Cre (TH-Cre) döyünmü siçanlarda (EM: 00254) (18) Avropa Mouse Mutant Arxivindən əldə edilmişdir. Bütün eksperimental heyvanlar 57 nəsillərindən daha çox üçün C6BL / 10J suşuna geri çevrildi. Siçanlar C57BL / 6J WT siçanları ilə mated və standart 12-h işıqlı / 12-h qaranlıq dövrü ilə təchiz edilmiş və ərzaq və su ilə təmin olunmuşdur. Cre+ və Cre- Eyni litters (3-6 yaş yaşı) olan siçanlar təcrübələr üçün istifadə edilmişdir. Bütün heyvan təcrübələri heyvan təcrübələrinə əsaslanan Osaka Bioscience İnstitutunun heyvan komitəsi tərəfindən təsdiq edildi.
Davranış testləri.
Bütün davranış testləri zamanı siçanlar optik lif ilə əlaqəli idi və bütün aparatı ətrafında hərəkət etməyə icazə verildi. Siçanların hərəkəti onların başlarında optik fiber ilə əlaqəli olmasına baxmayaraq, heç bir maneə olmadan hərəkət edə biləcəyi təqdirdə izlənildi. Bir siçan mövqeyi davranış aparatı üzərində dayanan bir videokamera tərəfindən aşkar edilmiş və Labview proqramından istifadə edərək hazırlanmış bir proqramla təhlil edilmişdir.
Qaranlıq otağın üstünlük testi.
Sınaqda istifadə edilən xüsusi hazırlanmış davranış aparatı qaranlıq bir otaqdan (15 × 9.5 sm) və parlaq açıq yerdən (15 × 11 sm) ibarətdir. Qaranlıq otaqda divarlar, bir mərtəbə və bir çatı var idi. Bütün bunlar qara rəngdə idi və açıq bir parlaq yerə giriş (4.5 sm uzun) idi. Açıq parlaq yer ellips kimi formalaşmış və bir metal şəffaf mərtəbə və bir dam olmadan təmiz divarları olmuşdur. Test əvvəlində, bütün siçan cihazda 10 dəqiqə üçün alışmışdı. Test üç sessiyadan ibarət idi: günün yarısının 1 (pretest: 5 dəq), siçan bütün aparatı araşdırmağa icazə verildi. Günün son yarısından 1-ə qədər 4 (kondisioner: 35 min), siçanlar qaranlıq otaqda qaldıqlarında optik stimullaşdırma aldı. 5 günü, qaranlıq otaq üstünlüyü optik stimullaşdırma olmadan sınaqdan keçirildi (posttest: 5 min; Şəkil S1E).
Üç kameralı EBM testi.
Testdə istifadə edilən xüsusi hazırlanmış üç kameralı kondensasiya edilmiş yer seçimi / EBM aparatı iki ədəd (10 × 17 sm) və birləşdirici dəhlizdən ibarət idi. Test üç seansdan ibarət idi. Gündüz 1 (pretest: 15 dəqiqə): Siçanlar bütün cihazları sərbəst araşdırmağa icazə verildi. Digər tərəfdən bir otaqda 1.5 dəfə daha uzun olan siçanlar testdən kənarlaşdırıldı. Günlər 2 və 3 (kondiklama: 15 min hər): Siçanlar optik stimullaşdırma işıq yığılan kamerada qaldıqda qəbul etdi. İşıq eşitmiş kameranın seçimi balanslaşdırılmışdı. Gün 4 (son test: 15 dəq): Test pretestdə olduğu kimi,Şəkil S6A).
Kondisioner seansında, siçanların 30-lərin qaranlıq otaqda və ya yüngül eşli kamerada olduqca çox istilikdə qalması üçün 30 s üçün optik stimullaşdırma dayandırıldı. Lazer gücü, bütün davranış testlərində optik lifin ucunda təxminən 5 mW olduğu idarəsi edildi.
Vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry-də.
FSCV eksperimentləri əvvəlki tədqiqatlarda izah edilən üsulla35-37). Siçanlar, açıqlandığı kimi bir ketamine / xylazine qarışığı ilə anesteziya edilmişdir SI Materiallar və metodlar və stereotaksik çərçivəyə yerləşdirilir. Arch-ifadə edən DA neyronları stimullaşdırıcı elektrotun yaxınlığında stimullaşdırmaq üçün istifadə olunan optik lif. Uyarıcı optod daha sonra VTA-da yerləşdirildi (bregma: anterior-posterior, -3.2 mm, lateral, 0.5 mm və dorsal-ventral, 3.5 mm) və 0.25-mm intervalı ilə salındı. Voltammetrik qeyd üçün karbon fiber mikroelektron (uzunluğu 300 μm) NAc (bregma: ön posterior, 1.0 mm, lateral, 1.0 mm və dorsal-ventral, 3.5 mm) -dən aşağıya endirildi. Voltametri ölçümleri karbon fiber mikroelektronuna üçgen dalğa forması (100 V + 0.4 V-ə 1.3 V / s qarşı AG / AgCl ilə Ag / AgCl-ə qarşı 0.4 V) tətbiq edərək hər 400 ms halında edilmişdir. Dalğaform izolyasiyası və cari amplifikasiya üçün xüsusi hazırlanmış potentiostat istifadə edilmişdir. DA azadlığı 24-nabz stimullaşdırılması (100 μA, 5 ms müddəti, 30 Hz) istifadə edərək DA nöronların elektrik stimullaşdırılması ilə uyğundur. DA neyronların optik stimullaşdırılması (532 nm, fiber ucunda ~ 5 mW güc) 10 s üçün elektrik stimullaşdırılması başlamazdan əvvəl başlayan 5 s üçün tətbiq edilmişdir. Karbon fiber mikroelektrləri DA (0.2 μM, 0.5 μM və 1.0 μM) konsentrasiyaları ilə həll olunmuşdur. Bütün voltametri məlumatları Labview və Matlab proqramlarından istifadə edərək xüsusi hazırlanmış proqramlarla təhlil edilmişdir. DA səviyyələrində optik stimullaşdırma yolu ilə azaldılması əsas komponent təhlili ilə elektrik VTA stimulantlarından əldə edilən şaquli DA dalğa formasını dopamin siqnallarını ayırmaqla həll edilmişdir (35, 36).
Statistik Analiz.
Statistik analiz GraphPad PRISM 5.0 (GraphPad Software) istifadə edərək aparılmışdır. Verilər təkrarlanan tədbirlər ilə təhlil edilmişdir (ANOVAİncir. 1B, , 4D,4Dvə Şəkil S6 D və E) və ya birtərəfli ANOVA (İncir. 1C, , 3D,3D, 4 C və Evə İncir. S4 K-M, S6Fvə S7A), Bonferroni testi ilə post hoc təhlillər aparıldı. Bütün markalar / sütunlar və barlar sırasıyla ortalama və ± SEM'dir.
Virus hazırlığı və inyeksiya, elektrofizyoloji qeydləri və immunohistokimyəvi və mRNA analizi daxil olmaqla digər təcrübəli prosedurlar SI Materiallar və metodlar.
Minnətdarlıq
Lentivirus istehsalında və təmizlənməsində texniki məsləhətlər üçün R.Matsui'ye və E.Hayaşiyə veri analizinin proqramlaşdırılmasında texniki məsləhət üçün E. Boydenə təşəkkür edirik. Bu iş Təhsil Xadimi 22220005 (SN), 23120011 (SY və SN), 24700339 (TD) və 25871080 (SY) Təhsil, Mədəniyyət, İdman, Elm və Təhsil Nazirliyi tərəfindən dəstəklənmişdir. Yaponiya Texnologiyası və Takeda Elm Fondundan (SN) bir hədiyyə.
Dəyişikliklər
Müəlliflər heç bir maraq doğurmur.
Bu məqalədə online dəstək məlumatları var www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSupplemental.
References
;
