Bağımlılığın davamlılığına dair Mesolimbic Dopamin Neyron stimullaşdırılması (2015)

giriş

Asılılıq, bir neçə mərhələdə inkişaf edən bir xəstəlikdir (Everitt et al., 2008, George et al., 2014). Diaqnoz, rekreasiya istifadəsi mənfi nəticələrə baxmayaraq davamlı olaraq kompulsiv hala gəldikdə qoyulur. Aparıcı bir asılılıq fərziyyəsi, sui-istifadənin narkotiklərin beyində dopamin (DA) konsentrasiyasını həddindən artıq artırdığına görə xəstəliyə səbəb olduğunu iddia etsə də, bu sistemi tetiklemenin istirahət istifadəsindən asılılığa keçidləri idarə etmək üçün yetərli olub olmadığı aydın deyil (Di Chiara və Bassareo, 2007, Volkow və Morales, 2015). Dərmanların möhkəmləndirilməsinə dair DA hipotezinin dəstəkləyici dəlilləri bir neçə onillikdə toplanmışdır və dərmanların ilkin təsirinə əsaslanır. Məsələn, asılılıq yaradan dərmanlar, orta beyindən DA proyeksiyasını yüksəldən başqaları arasında bir lif yolunun olduğu medial ön beyin paketinin kəllədaxili özünü stimullaşdırma (ICSS) həddini azaldır (Stein, 1964, Crow, 1970, Kornetsky et al., 1979). Farmakologiya və lezyon tədqiqatları sonra mezokortikolimbik DA sistemini bu dövrənin mənşəyi kimi təyin etdi (Wise and Bozarth, 1982). 1980-ci illərin sonunda mikrodializlə birbaşa hüceyrədaxili DA konsentrasiyasının ölçülməsi, asılılıq yaradan dərmanların NAc-da bir DA dalğalanmasına səbəb olma xüsusiyyətini paylaşdığını təsdiqlədi (Di Chiara və Imperato, 1988). Bu, asılılıq yaradan dərmanların mexanik bir təsnifatı təklifinə səbəb oldu (Lüscher və Ungless, 2006).

Dərman istifadəsinin bu ilkin təsirlərinin asılılığa keçidi necə asanlaşdırdığı çox az bilinir. Asılılıq yaradan dərmanların digər farmakoloji hədəfləri olduğu üçün DA-dan asılı mexanizmlər nəzərdən keçirilmişdir. Məsələn, kokain, DA daşıyıcısını (DAT) inhibe etməklə yanaşı, serotonin və norepinefrin geri alımını azaltmaq üçün SERT (serotonin transporter) və NET (norepinefrin transporter) ilə əlaqələndirir, bu da bütün əsas monoaminlərin (Han və Gu, 2006, Tassin, 2008). Oxşar narahatlıqlar digər psixostimulyatorlara da aid ola bilər. Üstəlik, afyantların ən azından ilk mərhələdə DA-nın müstəqil olduğu iddiası var (Badiani et al., 2011, Ting-A-Kee və van der Kooy, 2012). DA hipotezi, DA sisteminə müdaxilə etdikdən sonra bəzi dərmanlara uyğunlaşma davranışının hələ də aşkar olduğu genetik siçan modellərinə əsaslanaraq etiraz edildi. Məsələn, DAT nakavt siçanları kokainin özünü idarə etməsi (Rocha və digərləri, 1998) və DA sintezini ya farmakoloji (Pettit və digərləri, 1984) ya da genetik olaraq ləğv etmək (Hnasko və ark., 2007) dərmanın öz-özünə tətbiq edilməsinin qarşısını ala bilmədi. və ya şərti yer seçimi. Bu transgenik siçanların daha yaxşı xarakterizə edilməsi və ikiqat monoamin daşıyıcılarının nakavtlarının yaranması bu məsələlərin bir hissəsini həll etsə də (Rocha, 2003, Thomsen et al., 2009), DA-nın bağımlılığın kardinal xüsusiyyətlərini tetiklemek üçün yetərliliyi bilinmir. Qeyri-spesifiklik məsələlərini atlamaq üçün siçanların optogenetik bir yanaşma istifadə edərək VTA DA nöronlarını özləri stimullaşdırmasına icazə verməyə qərar verdik.

Son tədqiqatlar göstərir ki, orta beyindəki DA nöronlarının aktivləşdirilməsi yer seçiminə səbəb ola bilər (Tsai və s., 2009) və ya instrumental davranışı gücləndirə bilər (Adamantidis və ark., 2011, Witten və s., 2011, Kim və s., 2012, Rossi vd., 2013, McDevitt vd., 2014, Ilango vd., 2014). DA yollarının bu seçici aktivasiyası, mükafat sisteminin təyin olunmasında 30 ildən çox əvvəl aparılan kəllədaxili özünü stimullaşdırma (ICSS) tədqiqatlarını təsdiqləsə də (Fouriezos və digərləri, 1978), gecikmiş mərhələli adaptiv davranışın induksiyasını nümayiş etdirərək qısa müddətə düşdülər. asılılığı müəyyənləşdirir və bunun altında yatan nöronal uyğunlaşmaları müəyyənləşdirmirlər. Burada optogenetik manipulyasiyanı təkcə möhkəmləndirmənin başlanğıcında fazik DA siqnalının yetərlilik kriteriyasının birbaşa yoxlanmasına imkan vermək üçün deyil, həm də asılılığa keçid üçün test etmək üçün istifadə etdik.

Xəstəliyin sonrakı mərhələlərinin təəccüblü bir müşahidəsi budur ki, ən çox asılılıq yaradan dərmanlarla belə, istifadəçilərin yalnız bir hissəsinin asılılığı yaranır (Warner et al., 1995, O'Brien, 1997). İnsan bağımlıları, mənfi nəticələrə baxmayaraq narkotik maddə istehlakına davam edəcəklər (bax: Amerikan Bağımlılığı Tibb Cəmiyyətinin “Bağımlılığın Tərifi”, DSM5, Amerikan Psixiatriya Birliyi, 2013), ümumiyyətlə vaxtında gecikən sosial və psixoloji məğlubiyyətlərlə əlaqəli. Eynilə, gəmiricilərdə, kokainin öz-özünə idarəsini əldə edən beş heyvandan biri, nəticədə, asılı olaraq təsnif edilir (Deroche-Gamonet et al., 2004, Kasanetz et al., 2010; lakin George və s., 2014). Mənfi nəticələrə baxmayaraq dərman qəbulu əzmkarlığı, gəmiricilərdə istehlak cədvəlinə sadə bir azaldıcı stimul tətbiq etməklə də modelləşdirilə bilər. İnsan xəstəliyi daha mürəkkəb olsa da, cəzanı istehlakla əlaqələndirmək, asılılığın əsas hissəsinin birbaşa bir modelidir.

Burada kokain, sukroz və optogenetik özünü stimullaşdırmanın özünü idarə etməsinin nəticəsini qiymətləndirmək üçün yumşaq ayaq şoku istifadə etdik. DA neuron özünü stimullaşdırmanın mənfi nəticələrə baxmayaraq istifadəsi ilə əlaqəli iki bağımlılıkla əlaqəli davranış-təzadlı mükafat axtarış və kompulsivliyə səbəb ola biləcəyini araşdırır və bu davranışlarla əlaqəli nöral plastisiyanı xarakterizə edir.

Nəticələr

DA nöron aktivitesini nəzarət etmək üçün, biz bir Cre-inducible adeno ilə əlaqəli virus (AAV) enjekte etmişik, double-floxed inverted açıq oxu çərçivəsi (DIO) ChR2 DAT-Cre siçanlarının VTA-sına gücləndirilmiş sarı floresan zülal (eYFP) (Atasoy et al., 2008, Brown et al., 2010) ilə birləşdi. Bundan əlavə, VTA-nı hədəf alan bir optik lif yerləşdirildi (ChR2Bax Eksperimental prosedurlar). Xüsusiyyətləri ChR2 EYFP-nin DA sintezi üçün lazım olan bir ferment olan Tyrosine Hydroxylase (TH) ilə birgə lokalizasiyası ilə təsdiq edilmişdirŞəkil 1A). 

Əvvəlcə lazer stimullaşdırma protokolunu qurmaq üçün siçanlar aktiv bir qolu basa biləcəyi bir operant qutusuna yerləşdirildi və bu da hər biri dəyişən (1, 2, 8, 32, 60 və ya 120 partlama) lazer stimulasiyasına səbəb oldu. iki seans. Fasik atəş modelini təqlid etmək üçün (Hyland və digərləri, 2002, Mameli-Engvall və digərləri, 2006, Zhang et al., 2009) ümumiyyətlə təbii mükafat tərəfindən yaradılan (Schultz, 1998), partlayış stimullaşdırmasından istifadə etdik. Bir partlama, 4 Hz-də 20 ms-lik beş lazer zərbəsindən ibarət idi və saniyədə iki dəfə təkrarlandı. Siçanların qolu basma davranışlarını lazer stimullaşdırılması üçün partlayışların bir funksiyası olaraq uyğunlaşdırdığını və beləliklə alınan partlayışların ümumi sayını idarə etdiyini gördük (Şəkil 1B). Bu davranış infuziya başına doza dəyişildiyi zaman asılılıq yaradan dərmanların öz-özünə verilməsini xatırladırdı (Piazza və digərləri, 2000). Növbəti təcrübələr üçün, bir qolu presi başına 30 partlayış tətbiq etməyi seçdik və yarı-maksimum partlayış sayını verdik (Şəkil 1B). Dərmanların venadaxili tətbiq edildiyi zaman müşahidə olunan DA artımının gecikməsini təqlid etmək üçün (Aragona et al., 2008), lazer stimulyasiyasını 5 saniyə təxirə saldıq və 10 saniyə yanıb sönən bir işarə işığı əlavə etdik (Şəkil 1C).

Ardıcıl 12 gün ərzində siçanların 80 saat ərzində maksimum 2 dəfə özünü stimullaşdırmasına icazə verildi. Siçanlar lazer stimullaşdırma sürətini sürətlə artırdı və sessiyanın ilk saatının bitməsindən əvvəl 80 lazer stimulyasiyasına (LS) çatdı (Rəqəmlər 1D və 1E). Aktiv və qeyri-aktiv qolu arasında fərqlər sürətlə əldə edildi və aktiv qolu presinin sayı artan sabit nisbət (FR1, 2, 3) cədvəlləri iləRəqəmlər 1F və 1G). D-Kristal və ya γ-aminobütirik turşusu (GABA) nöronlarında (VTA-nın inhibitor neyronlarını hədəfləyən GAD-Cre + siçanlarında) ChR2-ni ifadə edən DAT-Kritik və ya siçanı istifadə edən nəzarət təcrübələrində özünü stimullaşdırma dərəcələri aşağı və davamlı olaraq azaldı iclaslar. Bu, həmçinin post-hoc validasiya VTA'nın ChR2-eYFP (göstərilməyib) ilə yoluxmadığını göstərdiyi iki Cre + heyvanına tətbiq olundu. Bundan əlavə, aktiv və qeyri-aktiv kol arasında heç bir ayrı-seçkilik aşkarlanmadı (Rəqəmlər S1A və S1B).

DAT-Cre + siçanlarının lazer stimullaşdırılması üçün lazım olana nisbətən aktiv qolu daha tez basdığını müşahidə etdik. Əslində bu cür "boş olmayan" aktiv qolu presləri bütün aktiv qolu presslarının 30% -dən çoxunu təşkil edir (Şəkil S2A) və baş verən sessiyaların gedişi kimi - başlanğıcda lazer stimullaşdırılması başlanğıcıRəqəmlər S2B və S2C). Alınması zamanı yaranan bu tək davranış və dürtüsel cavabları əks etdirə bilər.

Birlikdə götürülən, VTA DA neyronlarındakı hərəkətlər lehinə cavab verən qüvvəti gücləndirir.

VTA DA Nöron Kokain tərəfindən özünü stimullaşdırmanın təzahürüdür

VTA DA nöron özünü stimullaşdırma davranışını gücləndirmək üçün asılılıq yaradan dərmanların hədəf aldığı eyni beyin dövrələrində asılı olub olmadığını yoxlamaq üçün öz stimullaşdırma seanslarından dərhal əvvəl kokain intraperitoneal (ip) vurduq (lazerə 45 dəqiqə pulsuz giriş, Şəkil 2A). Başlanğıcda, yaxşı öyrədilmiş heyvanlar FR400 cədvəli çərçivəsində 85 dəqiqə ərzində 45 LS əldə etmək üçün təxminən 3 dəfə basdılar. Kokain inyeksiyasından sonra, doza bağlı olaraq, ən yüksək doza malik 30 qollu pres üçün təxminən 100 LS-ə qədər performans əhəmiyyətli dərəcədə azaldı (Şəkil 2B). Bu tıxanma seansın ilk 30 dəqiqəsində dərmanın farmakokinetikasını əks etdirən ən çox ifadə edildi (Şəkil 2C). Bu təcrübə göstərir ki, kokain tərəfindən optogenetik özünü stimullaşdırma və möhkəmləndirmək nörəvi sxemlərin əsasını təşkil edir.

Optogenetik öz stimullaşdırmasını asılılıq yaradan dərmanlarla daha da müqayisə etmək üçün bir neçə həftə çəkildikdən sonra siçanların VTA DA nöronlarının öz-özünə stimullaşdırılmasına yenidən başlayıb-getmədiyini soruşduq. Cue ilə əlaqəli dərman axtarma müəyyən bir relaps modeli olduğundan (Epstein və s., 2006, Soria və s., 2008, Bossert vd., 2013), siçanları son özündən 30 gün sonra yenidən əməliyyat otağına yerləşdirdik. aktiv qolu basaraq indi işarənin işığını tetiklediği stimullaşdırma seansı olmadan lazer stimullaşdırılması (Şəkil 3A). Yüksək dərəcədə aktiv lever presləri ilə nümayiş olunan güclü replika ilə əlaqəli davranış yalnız eYFP-ChR2 VTA DA neyronlarında (DAT-Cre +, lakin DAT-Cre− siçanları deyil, Şəkil 3B).

Əvvəlki tədqiqatlar, DA D1R (Pascoli, Terrier və s., 2014) ifadə edən NAc nöronlarının bir alt tipində kokain tərəfindən əmələ gələn replika ilə əlaqəli residiv və sinaptik plastika arasındakı nedensel əlaqəni göstərmişdir. Buna görə də, bu sinaptik plastisiyanı qiymətləndirmək üçün keçdiyimiz DAT-Cre siçanlarını yaratdıq Drd1a-tdTomato NAc-də orta ölçülü spiny nöronların (MSNs) alt növünü müəyyən etmək üçün siçanlarda istifadə olunur. Təcrübə testinin əvəzinə NAX dilimləri D1R-MSN-lərin qırmızı olduğu yerdə hazırlanmış və flox-ChR2-eYFP (yoluxmuş VTA DA nöronlarından yaşıl liflərdən fərqli olaraq)Şəkil 3C). Ex vivo bütün hüceyrəli yamaq-qısqac qeydləri AMPAR-dan qaynaqlanan postsinaptik cərəyanlar (AMPAR-EPSC) üçün düzəldici cərəyan gərginliyi əlaqəsini və AMPAR / NMDAR nisbətinin artdığını (Rəqəmlər 3D və 3E), D1R-MSN-lərdə, lakin D2R-MSN-lərdə deyil. Daha əvvəl kokainin öz-özünə tətbiq edilməsindən çəkildikdən sonra əldə edilən oxşar tapıntılar, D2R-MSN-lərə ayrı girişlərdə GluA2 çatışmazlığı və AMPAR ehtiva edən GluA1-nin birləşdirilmiş şəkildə yerləşdirildiyini göstərmişdir (Pascoli, Terrier və s., 2014).

Cəzaya baxmayaraq özünü təşviq etmək

Maddənin mənfi nəticələrə baxmayaraq istifadəsi, asılılığın daha vacib bir xüsusiyyətidir (bax DSM5 tərifi, Amerikan Psixiatriya Birliyi, 2013). Siçovul modelləri qurulmuşdur (Deroche-Gamonet et al., 2004, Pelloux et al., 2007, Pelloux et al., 2015, Chen et al., 2013), burada kokainin öz-özünə tətbiqetmə cədvəlində tətbiq olunan elektrik çarpması kokaini basdırır. bəzi heyvanlarda istehlak. 12 günlük ilk maruz qalma (əldə etmə) sonrasında, siçanların FR3-də üç əlavə seans keçirməsinə icazə verildi, lakin azaldılmış seans kəsikləri ilə (maksimum 60 dəqiqə və ya 40 mükafat). Bu üç seans, sonrakı dörd seans üçün bir təməl rolunu oynadı, burada hər üçüncü lazer stimulyasiyasının yeni bir işarənin proqnozlaşdırdığı bir ayaq şoku (500 ms; 0.2 mA) ilə qoşulduğu (Şəkil 4A). Ayaq şokunun intensivliyi və müddəti sukroz mükafatı üçün qolu basaraq tamamilə dayandırmaq üçün düzəldilmişdir (aşağıdakı məlumatlara da baxın). Cəza cədvəli iki qarşılıqlı davranış reaksiyasına səbəb oldu (Şəkil 4B). Bəzi siçanlar cəzanın tətbiq olunduğunda ("həssas" adlandırıldığı zaman) cavab vermədilər, digərləri isə lazer stimullarının maksimum sayını almaq üçün cavab verməyə davam etdilər və cəzaya "davamlı" hesab edilə bilər. Heyvanların iki qrupu dörd cəza seansının sonunda tamamilə ortaya çıxdı (Şəkil 4C). "Həssas siçanlar" 20% -dən daha çox özünü stimullaşdırma azaldıb "davamlı siçanlar" lazer stimullaşdırma sayını (80% azalma az) qoruyurdu. Bu meyarlara görə, yalnız bir heyvan (boz nöqtələr) təyin edilə bilmədi. Bu müşahidə göstərir ki, VTA DA nöronlarının özünü stimullaşdırılması ilə uyğundur ki, zorakı partlayış fəaliyyəti siçanların bir hissəsində mənfi nəticələrə baxmayaraq istehlakın davam etməsinə səbəb olur. Nəzarət kimi, özünü stimullaşdıran cəzaya qarşı müqavimət və ya həssaslıq yaradan siçanların müstəqil bir qrupunda nosiseptiya quyruq-flick testi ilə qiymətləndirilmişdir. Həssas və dayanıqlı arasında isti suya batırılan quyruğu geri çəkmək üçün gecikmənin fərq etmədiyi (Şəkil S3).

Sonradan soruşduqda post-hoc, özünü stimullaşdırma mərhələsində hər hansı bir xüsusiyyətin cəzaya qarşı müqaviməti öngördüyünü söylədi. Həssas və davamlı siçanlar, başlanğıc iclaslarında eyni sayda aktiv və qeyri-aktiv qolu basdılar və bütün siçanlar maksimum 80 LS (Rəqəmlər S4A və S4B), oxşar miqdarda (Rəqəmlər S4A və S4C). Artıq aktiv qolu mətbuatının tərkib hissəsi iki sub-populyasiya (Rəqəmlər 4D və S4D), lazer stimullaşdırılması başlamazdan əvvəl boşluq qolu presləri sayıları əldə seanslarının sonuna qədər davamlı siçanlarda əhəmiyyətli dərəcədə yüksək olmuşdur (Rəqəmlər 4E və S4E). Bu davranış əldə etmə əsnasında inkişaf etdikcə, fitri impulsivliklə birlikdə (Economidou et al., 2009, Broos et al., 2012, Jentsch et al., 2014), cəzaya müqavimət göstərməyə kömək edə bilər. Əlavə olaraq, optogenetik stimulyasiyanın motivasiyasını təyin etmək üçün 11-ci gündə mütərəqqi bir nisbət sınağı aparıldı (Richardson və Roberts, 1996). Davamlı siçanlar həssas siçanlardan statistik olaraq fərqli olmayan bir qırılma nöqtəsi sərgilədilər (Şəkil S4F).

Kokainə qarşı suçroz üçün deyil, cəzaya qarşı müqavimət

Zərərli nəticələrə baxmayaraq istehlak paradiqmasının impuls qolu basması ilə yanaşı asılılıq yaradan bir dərmanın kompulsiv qəbulunu da proqnozlaşdırdığını yoxlamaq üçün siçanların yeni bir qrupu 12 gün kokainin öz-özünə tətbiq olundu. Kokainin öz-özünə idarəolunması üçün eksperimental parametrlər, alış zamanı 80 saat ərzində ən çox 4 kokain infuziyası və dörd cəza iclasından əvvəlki üç əsas iclasda 40 saat ərzində 2 infuziya ilə təyin edilmişdir (Rəqəmlər 5A və S5A). Yenə kokain mükafatını elektrik şoku ilə cütləşdirdikdən sonra iki qrup ortaya çıxdı. Həqiqətən, 5 siçanlarından 22, 20 həssas (17% -dən az azalma) və bir heyvan arasındakı (80 gündə 13 infusions) (19 günündə) düşdü (XNUMX gündə XNUMX)Şəkil 5B). Daha sonra cəzaya qarşı müqavimət göstəricilərini axtardıq. İki qrup arasındakı infuziya sayı, infuziya nisbəti və aktiv və ya qeyri-aktiv lever presslarının sayı fərqli olmadı (Rəqəmlər S5B-S5D) və qırılma nöqtələri oxşar idi (Şəkil S5E). Fəallığın lehinə mətbuatın vaxtında paylanmasının təkamülü idi. İlk dörd seansda, həm də davamlı və həssas siçanlarda zaman aşımı dövründə qeyri-qənaətbəxş lever presləri müntəzəm olaraq azaldı, lakin əldə edildikdən sonra yalnız həssas siçanlar bu davranışıRəqəmlər 5C və 5D və S5F). Əksinə, müqavimətli siçanlar, qeyri-kafi lever presslarının ümumi sayınıRəqəmlər 5C və S5D), xüsusilə zamanın son hissəsinin sonuncu rübündə (Şəkil 5D). Əvvəllər DA nöronlarının optogenetik stimullaşdırılması ilə yuxarıda qeyd edilən müşahidəyə nitel olaraq oxşar olduqda, erkən vaxt müddətində qeyri-kafi mətbuatın kümelenməsi kokain ilə müşahidə edilməmişdir, əksinə, dərman preparatının yavaş kinetikası sayəsində DA səviyyələrini artırdı. Buna baxmayaraq, oxşar nəticələr, "DA dalğasının daxili aşkarlanmasından" əvvəlki qısa müddət ərzində qeyri-leqal lever mətbuatının bölünməsinin təkamül təkamülünə əsaslanaraq tərtib oluna bilər. Baxışlarımız beləliklə, qeyri-fəal aktual lever presslarının paylanması narkotik istehlakını nəzərdə tutur mənfi nəticələrə baxmayaraq.

Nəhayət, təcrübəni saqqal mükafatı üçün leyten mətbuatına verə bilən ad libitum-fed siçanlarla təkrarladıq. Cəza tətbiq olunduqdan sonra, bütün siçanlar sukrozun özünü idarə etməsini dayandırdılar (Şəkil 5E) bu cədvəl qeyri-zəruri təbii mükafatın alınmasını basdırdığını göstərərək, bir addictive narkotik və ya güclü DA neuron stimullaşdırılması kompulsif alınması aşkar imkan verdi.

Birlikdə götürülən bu nəticələr göstərir ki, VTA DA-nın özünü stimullaşdırılması siçanların alt hissəsində (68%) cəzaya qarşı müqavimət göstərdiyi kimi kompulsivliyə səbəb ola bilər. Eynilə, kokain SA-dan sonra bəzi siçanlar sukroz SA-dan sonra heç vaxt olmadığı cəzaya (23%) qarşı müqavimət göstərdi.Şəkil 5F).

Mənfi nəticələrə baxmayaraq özünütəsdiqdə davam etmə qərarını idarə edə biləcək beyin sahəsini təyin etmək üçün əvvəlcə cəza iclasının 15-də dərhal erkən gen cFos ifadəsini tetiklediği nöron sayını hesablayaraq ümumi "nöronal aktivliyi" izlədik. müxtəlif bölgələr. Siçanlar son cəza iclasının bitməsindən 90 dəqiqə sonra intrakardial olaraq PFA ilə mükəmməlləşdirildi. Nəzarət qrupları sadəlövh heyvanları və aldığı zərbələrin sayının qarışıq təsirini idarə etmək üçün həssas və ya davamlı siçanlara boyunduruğu olan siçanları da əhatə edirdi.

Seçilən bölgələrin əksəriyyətində, cFos-pozitiv nöronların sayı sadiq siçan dilimlərinə nisbətən davamlı siçanlardan olan dilimlərdə ən yüksək idi, ikincisi isə prelimbic korteks (PL) və lateral OFC olan nümunələrdir. PL-də biz müqavimət göstərən siçanlarda cFos-pozitiv hüceyrələrin və onların çəkilmiş nəzarətində bənzər bir artım gördük, OFC-də isə bu artım yalnız davamlı,Rəqəmlər 6A və 6B). Bu fərqi ölçmək üçün bütün məlumatlar ilk növbədə sadəlövh heyvanlardakı ifadə səviyyələrinə normalləşdirilmişdir. Sonra nisbəti həssas həssaslıqla boyunduruqdan həssas həcmdə dayandığına görə bölünmüş (Ratio_cfos = (R / S) / (YR / YS), Şəkil 6B). Bu prosedur, singulat korteksini, OFC və VTA-nı müqavimətli, lakin həssas siçanlarda aktivləşdirilməyən və hər iki qrup bağlanan nəzarətdə az fərq olduğu bölgələr olaraq təyin etdi (əslində, boyunduruqdakı oxşar cFos-pozitiv neyronlar). . VTA-nın tapılması təəccüblü deyil, çünki lazerlə stimullaşdırılmış neyronların bölgəsidir. Bu, ChR2 stimulyasiyasının cFos aktivasiyasını başlatdığını göstərən əvvəlki bir hesabata uyğundur (Lobo və digərləri, 2010, Van den Oever və digərləri, 2013). Aşağı nisbət_cfos aktivləşmənin həssas və davamlı olduğu (məsələn CeA və PAG kimi) olduğu bölgələrdə aşkar edilmişdir. Bu nisbət_cfos aktivləşmə, çəkilmiş nəzarətdə yüksək fərqlə (məsələn, PL, Şəkil 6C ümumiləşdirilmiş nisbət üçün_cfos məlumatlar). Buna görə də davamlı və çəkilməyən davamlı siçanlarda oxşar cFos ifadəsi ayaq şoklarının sayına görə çox güman ki, cəzaya qarşı müqavimətlə əlaqədardır. Birlikdə, yüksək nisbətdə alındı_cfos OFC-də bu bölgədəki sinir fəaliyyəti cəzaya müqavimət ilə əlaqəli olduğunu və bu səbəbdən asılılığa keçidini təmin edə biləcəyini düşünür.

Cəzaya müqavimət göstərən siçanlarda OFC-də artan nöronal aktivliyin substratını müəyyənləşdirmək üçün son cəza sessiyasından sonra 24 saat ərzində PL və L-OFC dilimlərini hazırladıq. İki bölgə, əvvəlki təcrübələrdə çox fərqli c-Fos ifadəsi nümunələri sayəsində seçildi. Neyronal həyəcan bütün hüceyrə qeydlərində artan cərəyan miqdarının (0 ilə 600 pA arasında) vurulması nəticəsində yaranan hərəkət potensialının (AP) sayılması ilə təyin edilmişdir. Bu qeydlər həssas və ya sadəlövh siçanlarla müqayisədə PL müqavimətli siçanların piramidal nöronlarında (və onların boyunduruq nəzarətində) davamlı bir hipo-həyəcan yaradır (Şəkil 7A). Qeydə alınmış nöronların istirahət membran potensialı (RMP) eksperimental qruplar arasında fərqlənmədi (Şəkil 7B). Bu nəticələr şübhəsiz ki, PL-də neyronların həyəcanlanmasının alınan şokların sayı ilə birbaşa əlaqələndirir və bəlkə cəzaya qarşı çıxma qərarı ilə deyil. Bu, çox güman ki, əvvəlki ayaq şokları ilə ortaya çıxan nöronal həyəcanların səbəb olduğu mənfi bir geribildirim uyğunlaşmasını əks etdirir. Əksinə, L-OFC neyronları yalnız davamlı siçanlarda daha həyəcanlı idi. Nöronların işarələnmiş siçanlardan həddən artıq irəliləməsi naı siçanlardan neyronların həyəcanlanmasından fərqlənmirdi, ayaq şokunun özünü təsirini (Rəqəmlər 7C və 7D). OFC neyronlarının artması bu cFos ifadəsinin əsasını təşkil edir və cəzaya qarşı müqavimət göstərə bilər.

İnkişaf etmiş OFC neyron həyəcanı və cəzaya qarşı müqavimət arasındakı səbəbi yoxlamaq üçün DAT-Cre + siçanlarının OFC-nin piramidal neyronlarında inhibitor DREADD (yalnız dizayner dərmanları tərəfindən aktivləşdirilmiş dizayner reseptorları: CamKIIα-hM4D) ifadə etdik (Şəkil 8A). OFC-dən kəskin dilimlərdə CNO (klozapin-N-oxid) cənub tətbiqi, bərium (Ba²⁺), kalium kanallarının qeyri-spesifik bir blokeri (Şəkil 8B). CNO həmçinin giriş / çıxış əyri istiqamətini sağa (Şəkil 8C). OFC-də AAV1 / CamKIIα-hM4D-mCherry ilə yoluxmuş DAT-Cre + siçanıŞəkil 8D) DA nöron özünü stimullaşdırma paradiqmasını əldə etdi və ardından cəza cədvəli ilə bir-birinin ardınca iki blok, birincisi CNO iştirakı ilə, ikincisi CNO olmadan. İki blok cəzasız 6 gün kəsildi (Şəkil 8E). İlk cəza blokunun sonunda, CNO iştirakı ilə 5 siçanlarından yalnız 16 davamlıdır (Şəkil 8F, sol panel). Əksinə, OFC inhibisyonu olmadan, ikinci cəza dövründə, 14-dan 16, "davamlı" (Rəqəmlər 8F, sağ panel və 8G). Başqa sözlə, eyni şərtlərdə sınaqdan keçmiş 34 siçanlarının ilk kohortuna nisbətən (qrup müqayisəsi, Şəkil 8H) və CNO (qrup içi müqayisədə) olmadan ilk kohorta bənzəyir. Nəhayət, həssasdan müqavimət göstərən dokuz siçan üçün, CNO, daldırma suyunu isti suya atdıqdan sonra quyruq fiqurlu gecikməni dəyişdirməmişdir (Şəkil 8I).

Birlikdə çəkilən bu təcrübə, OFC'nin piramidal nöronlarının fəaliyyətinin, kemiricilərdə asılılığa keçidin əsas xüsusiyyətini əks etdirən mənfi nəticələrə baxmayaraq, özünü stimullaşdırmağı davam etdirmək qərarını irəli sürdüyünü göstərir.

Müzakirə 

Bu yaxınlarda təklif olunan bir bağımlılık modeli, xəstəliyin inkişafında üç addımı ayırır: sporadik rekreativ narkotik istifadəsi, ardından nəzarətin itirilməsi ilə əlaqəli intensiv, davamlı, artan narkotik istifadəsi və nəticədə kompulsiv istifadə (Piazza və Deroche-Gamonet, 2013; George et al., 2014). Araşdırmamız VTA DA nöronlarının stimullaşdırılmasının nisbətən sürətli bir zaman gedişi ilə bu irəliləməni idarə etmək üçün kifayət etdiyini göstərir.

Təbii olaraq meydana gələn bir partlayış atış modelini təqlid edərək, VTA-nın hədəf bölgələrində, məsələn NAc (DA və s., 2010) da DA-nın səmərəli sərbəst buraxılması tələb olunur. Buna görə NAc-dəki DA səviyyələri, ehtimal ki, DA konsentrasiyası eşikdən aşağı düşdükdən sonra növbəti kokain və ya eroin infuziyasını gəmiricilər özləri idarə etdikləri kimi, öz stimullaşdırılmasını da idarə edirlər (Wise et al., 1995). Buna, kokainin, inyeksiya olunan ipin öz stimullaşdırılmasını maneə törədə biləcəyi müşahidəmiz də dəstək verir. Beləliklə, DA neyronun öz-özünə stimullaşdırılması dərmanların öz-özünə verilməsinə bənzəyir, baxmayaraq ki kinetiği, bu işdə müşahidə olunan fərqli reaksiyalar dərəcəsi ilə təklif olunduğu kimi kokain daxil olmaqla hər hansı bir farmakoloji maddədən daha sürətli olur.

VTA-nın DA neyronlarını seçici şəkildə hədəf aldığımız halda, onların optogenetik öz stimullaşdırılması fərqli fizioloji funksiyaları olan hüceyrə qruplarını aktivləşdirmiş ola bilər. Məsələn, son zamanlarda bəzi DA nöronlarının aversiv stimul üçün kod verdikləri irəli sürülmüşdür (Lammel və digərləri, 2012, Gunaydin və s., 2014). Bu hüceyrələr mPFC-yə proqnozlaşdırılır, lateral NAc qabığına proqnozlaşdırılan VTA DA nöronları müsbət möhkəmləndirməyə vasitəçilik edir (Lammel və digərləri, 2012). Seçici hədəfləmə ilə özünü stimullaşdırma və irəliləməni qiymətləndirmək maraqlı olardı (Günaydın və digərləri, 2014). Kokainin bütün DAT-ı ifadə edən neyronlara təsir etdiyi kimi, manipulyasiyamız bütün VTA DA nöronlarını aktivləşdirdiyindən, bəzi DA nöronlarının möhkəmləndirmə öyrənməsinə, digər DA nöronlarının isə nifrət öyrənməsinə səbəb olacağı düşünülür. Xalis təsir yenə də davranışın möhkəmləndirilməsi olacaq; bununla birlikdə “nifrət nöronları” rəqib prosesinin başlanmasına kömək edə bilər (Koob, 2013, Wise and Koob, 2014).

Məcburi abstinasiyadan sonra, dərman residivinin qurulmuş bir gəmirici modeli olan özünü stimullaşdırma axtarışına səbəb olan kontekstə yenidən ekspozisiya. Diqqətəlayiq olaraq, yatan sinir plastisitesinin kokainin özünü idarə etməsindən çəkildikdən sonra müşahidə ediləndən fərqlənmir (Pascoli, Terrier və s., 2014). Bu, daha əvvəl tək bir optik stimulyasiya seansı və ya bir asılılıq yaradan dərmanın ilk inyeksiyası ilə yaranan VTA DA nöronlarında eyni sinaptik plastisiyanı bildirən bir işə əlavə edir (Brown və digərləri, 2010). Sinaptik uyğunlaşma nümunəsi ortaya çıxmaqdadır ki, bütün asılılıq yaradan dərmanlara xas olan adaptiv davranış.

Araşdırmamızın təəccüblü bir xüsusiyyəti, bütün heyvanlarda vacib olmayan təbii mükafatın istehlakını pozacaq qədər güclü bir aversiv stimula cavab olaraq ikiqatlıqdır. Bizim vəziyyətimizdə, müqavimətli siçanlar, siçovullarda kokain ilə edilən bir araşdırmaya zidd olan mükafatın özünü çatdırması üçün əhəmiyyətli dərəcədə yüksək bir motivasiya göstərmədi (Pelloux və digərləri, 2007). Siçanlardakı cəzaya qarşı müqavimət üçün davranış proqnozlaşdırıcısı, DA nöron stimulyasiyasının başlanğıcından əvvəl 5 saniyə ərzində boş bir qolu basmaq idi. Mükafatın çatdırılmasına qədər gözləmək imkansızlığı bu səbəbdən impulsivliyin göstəricisi kimi qəbul edilə bilər (Dalley və digərləri, 2011, Olmstead, 2006, Everitt və digərləri, 2008, Winstanley, 2011, Leyton və Vezina, 2014). Dürtüsel qəbulun yalnız bir neçə dəfə özünü stimullaşdırma seansından sonra inkişaf etdiyi müşahidəsi bizi maraqlandırdı. Bu, cəzaya qarşı müqavimətin (və asılılığa qarşı həssaslıq baxımından) tamamilə fitri olmaya biləcəyini, ancaq asılılığa doğru ilkin mərhələlərdə inkişaf etmə ehtimalını artırır. Əgər belədirsə, bizim və başqalarının müşahidə etdiyi ikilik (Deroche-Gamonet et al., 2004) yalnız genetik faktorlarla müəyyən edilə bilməz. Bu, fərdlərin oxşar bir hissəsinin genetik cəhətdən nisbətən homojen bir siçan ştammlarına və genetik cəhətdən daha fərqli insan populyasiyalarına aludə olmasını izah edəcəkdir.

Cəzaya müqavimət, kokain ilə birlikdə insanlarda% 20-yə qədər olduğu təxmin edilən bağımlılığa qarşı fərdi zəifliyi aşkar edərsə (Warner və ark., 1995, O'Brien, 1997, George və s., 2014), onda burada daha yüksək nisbət var birbaşa və selektiv DA neyron stimulyasiyasının gücünü əks etdirə bilər. Başqa sözlə, selektiv DA neyron stimullaşdırması hər hansı bir dərmana nisbətən daha çox asılılıq yarada bilər. Bu, farmakoloji maddələrin qeyri-seçici təsiri ilə izah edilə bilər. Məsələn, kokain məsələsində, DA xaricindəki monoaminlər, asılılığın induksiyasını gecikdirə bilər. Həqiqətən, serotonin, şərti mükafatlandırma, özünü stimullaşdırma və şərtləndirilmiş yer seçiminə cavab vermək kimi DA-ya bağlı adaptiv davranışlara qarşı çıxa bilər (Wang et al., 1995, Fletcher və Korth, 1999, Fletcher və digərləri, 2002). rahatsız edici stimullara dair işarələr (Bauer, 2015, Hindi Attar et al., 2012). Alternativ olaraq, fərq, optogenetik özünü stimullaşdırma və hüceyrə xaricindəki DA artımının farmakoloji induksiyası arasındakı kinetik fərqdə ola bilər. Bu cür asılılıq-güc dəyişikliyi müxtəlif sui-istifadə dərmanları arasında da mövcud ola bilər (George et al., 2014).

Cəza müqavimətinin qurulmasına kömək etmək üçün DA azad və / və ya nisbi siqnalizasiyadan fərqli olaraq istisna edə bilməməyimizə baxmayaraq, bu ssenari mümkün deyil, çünki tədqiqata daxil edilən heyvanların infeksiyasının histoloji təsdiqi göstərdi eYFP-CHR2 bütün VTA-da ifadə. Bundan əlavə, DA azadını satmaq üçün nəzərdə tutulmuş optogenetik stimullaşdırma protokolu təşviq motivasiyasını əks etdirən qırılma nöqtəsi üçün qeyri-mötədil olaraq paylanmış dəyərlər ilə nəticələnən özünü stimullaşdırmağa gətirib çıxardı.

Başqa bir təəccüblü nəticə, elektrik ayaq zərbələrinin sayının PL-dəki nöronların həyəcanlandırıcılığı ilə əlaqəli olmasıdır. Piramidal nöronların həyəcanının azalması və eyni hüceyrələrin piramidal nöronlarında AMPAR / NMDAR nisbətinin artması “asılı siçovullarda” müşahidə olunmuşdur, lakin bu tədqiqatlar elektrik çarpmalarının təsirini nəzarət etməmişdir (Kasanetz et al., 2010, Kasanetz və s., 2013, Chen və digərləri, 2013). Ayrışmamaq bu səbəbdən həm qərar proseslərində həm də qorxu inteqrasiyasında mPFC-nin ikili rolu ilə izah edilə bilər (Peters və digərləri, 2009). Əksinə, infralimbik korteksdəki piramidal nöronların həyəcanının dəyişməsi ayaq zərbələri ilə əlaqələndirilir (Santini və s., 2008). Bu dəlil mPFC-nin suqəbuledici axtarış qərarı üçün əhəmiyyətli bir rol oynadığını istisna etmir. Bununla birlikdə, cFos analizimiz və daxili həyəcanverici müşahidələrimiz OFC və singulat korteksinə işarə edir. Bundan əlavə, OFC-də DREADD ilə nöron həyəcanının inhibisyonu cəzaya müqavimətin qarşısını aldı. Bu səbəb əlaqəsi, asılılığa keçiddən məsul olan hüceyrə mexanizmlərinin anlaşılmasında mühüm bir addımdır. Bunun asılılıq yaradan dərmanların bütün növlərinə də aid olub olmadığını yoxlamaq üçün gələcək araşdırmalara ehtiyac olacaqdır.

Bizim tapıntılarımız OFC-nin bir disfunksiyasının mənfəət və qərar qəbuletmə prosesini zəiflədə biləcəyi (Seo və Lee, 2010, Walton et al., 2010, Fellows, 2011) və kompulsiv davranışlara səbəb ola biləcəyi (Burguière et al., 2013) müşahidələri ilə uyğundur. ). İnsanlarda narkotikdən sui-istifadə sui-istifadə qərarı qəbul etmə və dəyişdirilmiş OFC funksiyası ilə əlaqələndirilir (Lucantonio et al., 2012, Gowin et al., 2013). Birlikdə OFC nöronlarının aktivliyi kompulsiv dərman istifadəsinə keçid üçün əsas təyinedici rol oynayır (Everitt və digərləri, 2007). Bu, burada və digər tədqiqatlarda müşahidə olunan MSN-lərin üzərində həyəcanverici afferentlərdə dərmanla əlaqəli plastisiyanın rolunu istisna etmir (Kasanetz və digərləri, 2010). OFC-nin həyəcanlanmasına nəzarət etməyi hədəfləyən manipulyasiyaların asılılıqdakı motivasiyaya təsir edib etmədiyini qiymətləndirmək maraqlı olacaq.

Burada DA-nöronun öz-özünə stimullaşdırılmasını, asılılığa aparan mərhələləri öyrənmək üçün güclü bir model olaraq təklif edirik. Narkotik asılılığının relaps, sinaptik plastika və mənfi nəticələrə baxmayaraq istehlak əzmkarlığı kimi əsas komponentlərini çoxaltırıq. Model, şübhəsiz ki, müəyyən bir dərman üçün effektləri öyrənmək üçün uyğun deyil (məsələn, opioid ilə psixostimulyatorları müqayisə edin), bunun bir neçə üstünlüyü var. Mükafat verilməsinin dəqiq bir müvəqqəti nəzarətinə imkan verir, yalnız VTA DA nöronlarını aktivləşdirir və ən sonuncusu, siçanların dərmanların öz-özünə tətbiq edilməsindən daha uzun müddət öyrənilməsinə imkan yaradır. Asılılıq yaradan dərmanların müəyyənləşdirilən ortaqlığına odaklanarak ümid, maddədən asılı olmayan bağımlılıq formalarının (Alavi və digərləri, 2012, Robbins və Clark, 2015) təməlində olan sinir mexanizmlərini açmaq və bununla da ümumi bir nəzəriyyəyə kömək etməkdir. xəstəlik. Optogenetik xəstəlik modelləri beləliklə, bağımlılığın son mərhələlərində iştirak edən nöronal disfunksiyanın hərtərəfli başa düşülməsi üçün həlledici bir addım atmağa imkan verir və hazırda müalicəsi olmayan bir xəstəliyin yeni, rasional müalicəsinə rəhbərlik edəcəkdir.

VP, JT və AH davranış təcrübələrini həyata keçirərkən VP elektrofizyoloji qeydlər etdi və təhlilini koordinasiya etdi. Tədqiqat bütün yazarlar tərəfindən hazırlanmış və yazılmışdır.

İş İsveçrə Milli Fondu və ERC qabaqcıl qrant (MeSSI), Cenevrə Akademik Cəmiyyəti Carigest SA və Fondation Privée des Hopitaux Universitaires de Genève tərəfindən dəstəkləndi. JT, İsveçrə Konfederasiyası tərəfindən ödənilən bir MD-Doktorluq tələbəsidir.

Sənəd S1. Əlavə eksperimental prosedurlar və rəqəmlər S1-S6

Cədvəl S1. Statistik Analizlər