PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
abstract
Ang mga pagbag-o nga gipahinabo sa cocaine sa pagpahayag sa gene hinungdan sa mga pagbag-o sa neuronal morphology ug pamatasan nga mahimo’g makasinati sa pagkaadik sa cocaine. Nahibal-an namon ang usa ka hinungdanon nga papel alang sa histone 3 lysine 9 (H3K9) dimethylation ug ang lysine dimethyltransferase G9a sa pagkahimo sa cocaine nga naaghat sa istruktura ug pamatasan nga pagka-plastik. Ang gibalik-balik nga pagdumala sa cocaine nakamenus sa lebel sa kalibutan nga lebel sa H3K9 dimethylation sa accumbens sa nucleus. TAng iyang pagkunhod sa histone methylation gipataliwala pinaagi sa pagsaway sa G9a sa kini nga rehiyon sa utok, nga gi-regulate sa cocaine-induced transcription factor ΔFosB. Pinaagi sa paggamit sa kondisyon nga mutagenesis ug pagbalhin sa viral nga gene nga pagbalhin, nahibal-an namon nga ang G9a downregulation nagdugang dendritic spine plasticity sa nucleus nga nagpadako sa mga neuron ug gipalambo ang pagpalabi sa cocaine, sa ingon nagtukod usa ka hinungdanon nga papel alang sa histone methylation sa mga dugay nga paglihok sa cocaine.
Pasiuna
Ang gibalik-balik nga pagkaladlad sa cocaine gihulagway sa padayon nga mga pagbag-o sa pagpahayag sa gene ug giusab nga morpolohiya sa neuronal sulod sa mga accumbens sa nucleus (NAc), usa ka hinungdanon nga sangkap sa circuitry nga gantihan sa utok (1-2). Ang pag-usab sa Chromatin hinungdanon sa daghang mga pagbag-o sa pagbalhin sa kini nga rehiyon sa utok nga mahimo’g makasinati sa mga aspeto sa pagkaadik sa cocaine (3-9). Ang regulasyon sa cocaine sa istruktura sa chromatin sa mga sangputanan sa NAc, sa bahin, gikan sa direktang pag-usab sa cocaine nga makina sa chromatin enzymatic nga makinarya, hinungdan sa mga pagbag-o sa histone acetylation ug phosphorylation (4, 7-9); bisan pa, ang mga tahas alang sa mga enzyme nga nagkontrol sa histone methylation wala pa gisusi.
Usa ka bag-o nga pag-analisar sa promosyon sa genome nga gigamit ang chromatin immunoprecipitation nga gisumpay sa microarrays (ChIP-Chip) gipaila nga nabag-o nga mga sumbanan sa mapanghimatuud nga histone H3 lysine 9 (H3K9) ug 27 (H3K27) metylation sa piho nga mga tigpasiugda sa gene sa pagtambal nga gisubli nga pagsubli sa pagpaayo sa gen.6). Tungod niini among gihipos ang daghang lysine methyltransferases (KMTs) ug demethylases (KDMs) nga nahibal-an nga nagkontrol sa H3K9 o H3K27 methylation (Fig. 1A). Duha ra ka mga enzyme, ang G9a ug GLP, ang nagpakita nga padayon nga transkripsyon nga regulasyon nga 24 mga oras pagkahuman sa balikbalik nga pagdumala sa cocaine, kung ang pagpahayag sa parehong mga gen grabe nga pagkunhod. Tungod kay ang G9a ug GLP espesipikong nagpahaom sa dimethylation sa H3K9 (H3K9me2), ang ilang pagkubkob sa cocaine nahiuyon sa pagkunhod sa lebel sa kalibutan nga euchromatic H3K9me2.Fig. 1B). Sa kasukwahi, ang tibuuk kalibutan nga lebel sa heterochromatic H3K27 methylation nagpabilin nga wala gibag-o sa gibalik-balik nga cocaine exposure (Fig. S1 sa pagsuporta sa online nga materyal). Tungod sa taas nga lebel sa kalihokan sa catalytic pareho sa vitro ug Sa vivo (10), gipunting namon aron sa dugang nga pagsusi sa katin-awan nga kahuluganan sa pagsupak sa G9a subay sa sublisubli nga pagkaladlad sa cocaine sa NAc. Ang lebel sa protina nga G9a, sama sa lebel sa mRNA, daghang pagkunhod sa oras nga 24 pagkahuman sa balikbalik nga pagdumala sa cocaine (Fig. S2). Bisan kung ang ekspresyon nga G9a mRNA gipaubos sa 35% sa NAc, ang pag-analisar sa immunohistochemical nagpadayag usa ka labi ka kasarangan nga pagkunhod sa 15% sa lebel sa protina G9a, nahiuyon sa naobserbahan nga pagkunhod sa 21% sa H3K9me2 pagkahuman sa gisubli nga cocaine administration (Fig. 1B). Ang ekspresyon sa G9a mRNA usab gipaubos sa rehiyon sa utok pinaagi sa 20% nga gisundan sa balikbalik nga pagdumala sa kaugalingon nga cocaine (Fig. S3).
Aron mahibal-an kung ang mga pagbag-o sa euchromatic H3K9me2 nagpahiuyon sa mga pagbag-o sa genome sa tibuuk nga ekspresyon sa gen sa NAc, gigamit namon ang pag-analisar sa microarray aron susihon ang mga profile sa ekspresyon sa gene nga naaghat sa usa ka hagit nga dosis sa cocaine sa mga hayop nga adunay o wala sa kasaysayan sa wala pa gibutyag ang cocaine (tan-awa ang supplemental lista sa gene sa Mga Talaan S1 – S3). Ang mga hayop nga nakadawat balikbalik nga cocaine nagpakita sa madugangan nga pagtaas sa ekspresyon sa gene nga 1 nga oras pagkahuman ang hagit sa cocaine kung itandi sa mga hayop nga gitambal nga maayo (Fig. 1C). Kini nga pagtaas sa ekspresyon sa gene nahitabo usab isip tubag sa usa ka hagit sa cocaine nga gihatag pagkahuman sa 1 nga semana sa pag-atras gikan sa gibalik-balik nga cocaine. Nahiuyon sa miaging mga taho, usa ka gamay nga porsyento sa mga gene (~ 10%) nagpakita nga desensitized nga mga tubag sa transkripsyon pagsunod sa balikbalik nga pagdumala sa cocaine (Fig. 1C; tan-awa Table S1) (5). Aron direkta nga susihon ang papel sa pagkubus sa G9a sa gipadako nga ekspresyon sa gene nga naobserbahan pagkahuman sa gibalik-balik nga cocaine, ang mga ilaga nakadawat mga iniksyon nga intra-NAc sa Herpes simplex virus (HSV) nga mga vectors nga nagpahayag bisan ang GFP o G9a ug gitambalan sa asin o gisubli nga cocaine aron mahibal-an kung ang G9a overexpression igo na aron mapugngan ang balik-balik nga pagpaayo sa cocaine nga gipalambo ang ekspresyon sa gene. Gikan sa usa ka hugpong sa 12 nga mga random nga napili nga mga gen nga nagpakita sa nagkataas nga lebel sa ekspresyon subay sa balikbalik nga cocaine, among nakita nga ang G9a mahinungdanon nga gipakunhod ang gipalambo nga ekspresyon sa 50% sa kini nga mga gen (Table S4).
Aron mahibal-an ang mga panghitabo sa transkripsyon sa agianan nga nagpataliwala sa balik-balik nga pagpugong sa cocaine sa ekspresyon sa G9a, gisusi namon ang usa ka posible nga papel alang sa ΔFosB, usa ka lig-on nga malig-on nga produkto sa pagdagan sa gilayon nga una nga gene fosB. Ang ΔFosB natigum sa NAc pagkahuman gibalik-balik nga gibutyag ang cocaine, diin kini nalambigit sa dugang nga ganti sa cocaine (11). Ang ΔFosB mahimo’g molihok ingon usa ka transcriptional activator o repressor depende sa target gen nga nahilambigit (3, 5, 6, 12). Paggamit sa bitransgenic NSE-TTA × tetOP-ΔFosB mga ilaga, diin ang ekspresyon nga ΔFosB mahimo’g maimpluwensyahan sa NAc ug dorsal striatum sa mga hayop nga hamtong (13), gisusi namon ang epekto sa ekspresyon sa ΔFosB sa regulasyon sa cocaine sa H3K9me2 ug KMT sa NAc. Ang sobrang overexpression nga osFosB igo aron makunhuran ang lebel sa pareho nga H3K9me2 (Fig. 1D) ug ekspresyon sa G9a (Fig. 1E), sa ingon gisundog ang mga epekto sa balik-balik nga cocaine. Sa kasukwahi, ang ΔFosB wala makunhuran ang ekspresyon sa GLP sa kini nga rehiyon sa utok, ug wala’y epekto sa SUV39H1 ug EZH2, ang punoan nga trimethylating enzymes alang sa H3K9 ug H3K27, sa tinuud (Fig. S4). Aron mapamatud-an kini nga mga datos gamit ang usa ka independente nga sistema sa overexpression nga ΔFosB, ang mga daga sa wildtype nga mga mice nakadawat bilateral intra-NAc mga iniksyon sa Adeno-kaugnay nga virus (AAV) vectors nga nagpahayag bisan GFP o ΔFosB. Ang pagpugong sa tibuuk nga virus sa ΔFosB mikunhod nga lebel sa pagpahayag sa G9a sa kini nga rehiyon sa utok (Fig. 1E).
Ang ingon nga gipahayag ug piho nga regulasyon sa G9a nag-aghat sa amon nga usisaon kung giusab ang pagbag-o nga ekspresyon sa G9a sa mga neuron nga NAc nga nag-regulate sa mga tubag sa pamatasan sa cocaine. Ang mga daga sa wildtype nakadawat intra-NAc injections sa HSV vectors nga nagpahayag sa GFP o G9a ug dayon gisusi gamit ang usa ka dili gibug-aton nga cocaine nga gikondisyon sa lugar nga gusto nga paradigma, nga naghatag dili direkta nga sukod sa gantihan sa droga. Ang sobrang pagkasobrahan sa virus sa G9a sa NAc neuron gipamatud-an human sa pagsulay sa pamatasan (Fig. 2A). Ang G9a nga pagkalupig hinungdanon nga pagkunhod sa kagustuhan sa cocaine kon itandi sa mga hayop nga sobra ang pag-atake sa GFP (Fig. 2B), ug nagdugang H3K9me2 nga lebel sa NAc (Fig. 2C). Paghinguyang sa usa ka catalytically dead mutant sa G9a (G9aH1093K) (14) wala makaapekto sa gusto sa cocaine (Fig. 2B) ug wala’y epekto sa H3K9me2 nga lebel sa kini nga rehiyon sa utok (Fig. 2C).
Aron dugang nga tun-an ang papel sa G9a sa mga epekto sa pamatasan sa cocaine, ug labi pa nga espesipikasyon nga ipasundayag ang balik-balik nga pagpatuyang nga naangkon sa cocaine nga gipahayag sa G9a sa NAc, hamtong nga G9afl / fl mga ilaga (14) nakadawat intra-NAc injection sa AAV vectors nga nagpahayag sa Cre recombinase o GFP ingon usa ka kontrol. AAV-Cre pagtuktok sa G9a sa NAc, nga nakumpirma nga immunohistochemically (Fig. S5), hinungdanon nga nadugangan ang mga epekto sa cocaine sa mga eksperimento sa pagpahugot sa lugar ug pagkunhod sa lebel sa H3K9me2 sa NAc (Ang numero 2D, E). Usa ka magamit nga komersyal nga tambal nga tigpugong sa G9a ug GLP, BIX01294 (15-16), gigamit aron mahibal-an kung ang pagdili sa enzyme parehas nga nakaapekto sa mga tubag sa pamatasan sa cocaine. Sa tinuud, ang pagdili sa pharmacological sa G9a ug GLP sa kamahinungdanon nagdugang nga gusto sa cocaine ug mikunhod ang H3K9me2 sa NAc (Ang numero 2F, G).
Gibalikbalik nga pagdumala sa cocaine nagdugang ang gibug-aton sa dendritic spines sa NAc medium spiny neuron (17), usa ka proseso nga may kalabutan sa mga pagbag-o sa pagpaandar sa excitatory nga glutamatergic synapses sa kini nga mga neuron (18-19) ug sensitibo nga mga tubag sa pamatasan sa tambal (17, 20). Sa ingon gipakita namon nga ang pag-downregulasyon sa kalihokan sa G9a sa NAc pinaagi sa balikbalik nga cocaine mahimo’g mamag-ayo sa katakus sa cocaine aron makontrol ang dendritic spine density sa NAc neuron. Pinaagi sa paggamit sa chromatin immunoprecipitation (ChIP) nga adunay anti-G9a antibody, nahibal-an namon ang daghang mga target nga gen nga G9a sa NAc, nga ang matag usa nga kaniadto gipahiangay sa pagkahumok sa cocaine nga gipatuo sa cocaine (Fig. 3A) (20-26). Nahibal-an namon nga ang balikbalik nga pagdumala sa cocaine mahinungdanon ang pagkunhod sa G9a nga paggapos, ingon man ang mga lebel sa H3K9me2, sa kini nga mga nagpasiugda sa gene (Fig. 3B). Sa kasukwahi, ang administrasyon sa cocaine nga paspas nga mikuha sa G9a sa pipila niining parehas nga mga promotor sa gene, nahiuyon sa nadugangan nga ekspresyon sa G9a nga naobserbahan sa oras nga NAc 1 pagkahuman usa ka mahait nga dosis sa cocaine (Fig. S6). Bisan kung ang G9a nga nagbugkos sa piho nga mga tigpasiugda sa gene nagpahiuyon sa mga pagbag-o sa ekspresyon niini, nagpabilin nga dili klaro kung ang ingon nga mga panghitabo nahusay sa giusab nga global nga lebel sa G9a sa NAc ug / o sa mga kalainan sa pagrekrut sa G9a subay sa mahait vs. gisubli nga cocaine administration.
Pinasukad sa regulasyon sa G9a sa daghang mga kalabotan nga may kalabotan sa plasticity sa NAc, gisusi namon direkta kung ang pagpadayon sa pagpahayag sa G9a sa kini nga rehiyon sa utok nga subay sa balikbalik nga pagtambal sa cocaine igo na aron mapugngan ang pagmugna sa cocaine-induced dendritic spine formation. Ang paggamit sa cocaine treatment protocol kaniadto gipakita aron mapauswag ang indendritic spine induction sa NAc (20), gisusi namon ang Densidad sa spine sa mga hayop nga gi-injected kauban ang HSV-GFP o HSV-G9a. Sa pag-uyon sa nangaging mga nakit-an, nakita namon ang usa ka hinungdanon nga pagtaas sa dendritic spine density sa NAc nga pagsunod sa pagtambal sa cocaine, usa ka epekto nga bug-os nga naharang sa G9a overexpression (Fig. 3C). Ang sobra nga pagpatuyang sa G9a dili igo aron makunhuran ang Densrine spine density sa NAc kung wala ang cocaine. Aron makompleto kini nga mga datos, G9afl / fl Ang mga ilaga nakadawat intra-NAc injections sa HSV-Cre ug ang spine density giihap ug gitandi sa mga hayop nga nakadawat HSV-GFP sa wala’y cocaine. Ang pagpanuktok sa ekspresyon sa G9a hinungdanon nga nagdugang ang kakulang sa spine sa NAc medium spiny neuron (Fig. 3C).
Gihatag ang ebidensya nga ang G9a ang pag-downregulation sa NAc pagkahuman gibalik-balik nga cocaine ang gipataliwala sa ΔFosB, susihon naton kung nahisama ba kini nga transkripsyon nga hinungdan sa pagdumala sa regulasyon sa NAc dendritic spines. Bisan kung ang ΔFosB wala pa naka-link nga hinungdan sa ingon nga plastik nga dendritik, ubay-ubay sa mga target niini, lakip na ang mga subdito sa Cdk5 ug NFitsB, gipahiuyon kaayo (20-23), ug ang makanunayon nga pagpahayag sa ΔFosB sa mga neuron nga NAc nga adunay kaarang sa pagdugang sa dendritic spine density human nga gisubli (27). Una, nahibal-an namon nga ang induction sa ΔFosB sa mga bitransgenic nga ilaga kung wala ang cocaine, nga gipaubos ang G9a ug H3K9me2 expression (Ang numero 1D, E), mikunhod ang G9a nga nagbugkos sa daghang mga gen nga may kalabotan sa plasticity, nga kadaghanan usab gipakita nga mga direktang target sa ΔFosB mismo (Fig. 3D) (3, 6). Gisundan namon dayon nga ang sobrang pag-atake sa virus sa ΔFosB sa NAc dako nga pagtaas sa dendritic spine density sa ilawom sa basal nga mga kondisyon, susama sa naobserbahan pagsunod sa balikbalik nga pagdumala sa cocaine (Fig. 3E). Sa kabaliskaran, ang sobrang pagpamatuud sa NAc sa ΔJunD, usa ka nagpatigbabaw nga negatibo nga mutant nga protina nga nagkontra sa kalihokan sa transkripsyon sa criptionFosB, gibabagan ang abilidad sa balikbalik nga cocaine aron madugangan ang pagporma sa dendritic spine sa NAc (Fig. 3C).
Ang among pag-obserbar nga ang ΔFosB nag-regulate sa ekspresyon sa G9a sa NAc, ug nga ang ΔFosB ug G9a nag-regulate sa pipila sa parehas nga mga genes nga target, nagdala kami sa pagsusi sa ubang mga interaksyon tali sa ΔFosB ug G9a. Pagkahuman sa mahait nga cocaine, kung ang mga lebel sa G9a nagdugang, nga gigapos sa G9a sa fosB gipataas ang gene, samtang pagkahuman sa balikbalik nga cocaine, kung gipugngan ang ekspresyon nga G9a, ang G9a nagbugkos sa fosB ang gen gipaubos (Fig. 3A). Ang ingon nga pagkunhod sa G9a nga nagbugkos human nga gibalik-balik nga cocaine wala maobserbahan c-fos, diin ang G9a nga pagbugkos gipadaghan pinaagi sa balikbalik nga cocaine (Fig. S7). Kini nahiuyon sa kamatuoran nga, dili sama fosB, c-fos gisalikway, wala maaghat, pinaagi sa laygay nga psychostimulant exposure (5). Ang sobrang overexpression sa exFosB sa mga daga sa bitransgenic igo nga pagkunhod sa G9a nga nagbugkos sa fosb gene (Fig. 3D). Dugang pa, igo ang pagpatuyang sa G9a aron mahanaw ang pagtaas sa ekspresyon nga ΔFosB subay sa balikbalik nga pagdumala sa cocaine (Table S4). Kini nga datos nagsugyot sa usa ka autoregulatory loop diin ang G9a sa sinugdanan naglimitahan sa induction sa ΔFosB pinaagi sa mahait nga administrasyon sa cocaine. Bisan pa, samtang ang ΔFosB magtigum uban ang nagbalik-balik nga pagkaladlad sa droga, gibabagan niini ang G9a ug sa ingon natapos ang kaugalingon nga dugang nga induction.
Sa pagtapos, gipakita namon nga ang histone lysine methylation sa NAc kritikal nga nahilambigit sa pag-regulate sa ekspresyon nga gen sa genonal nga tubag sa cocaine. Ang pagsaway sa G9a ug H3K9me2 kasunod sa balikbalik nga pagdumala sa cocaine nagpasiugda sa kagustuhan sa cocaine, sa usa ka bahin, pinaagi sa paglihok sa transkripsyon sa daghang mga genes nga nahibal-an nga nag-regulate sa mga aberrant nga porma sa dendritik nga pagkapakyas. Ang pag-angkon og labi ka maayo nga pagsabut sa mga gene nga gi-regulate pinaagi sa ingon nga mga mekanismo makapalambo sa among kahibalo sa komplikado nga biolohikal nga basehan sa pagkaadik sa droga ug makatabang sa pagpauswag sa labi ka epektibo nga pagtambal sa mga nakapaadik nga sakit.
Mga Materyal ug Pamaagi
Mga mananap ug mga tambal
Gawas kung giingon, ang mga ilaga gipahimutang upat hangtod lima sa matag hawla sa usa ka kolonya nga adunay usa ka oras nga 12 light / dark cycle (mga suga gikan sa 7: 00 AM hangtod 7: 00 PM) sa kanunay nga temperatura (23 ° C) ad libitum pag-access sa tubig ug pagkaon. Ang tanan nga mga protocol sa hayop gi-aprubahan sa IACUC sa parehong UT Southwestern Medical Center ug Mount Sinai School of Medicine.
Alang sa mga eksperimento sa cocaine [immunohistochemitry, western blotting, quantitative PCR (qPCR), pag-analisa sa microarray ug chromatin immunoprecipitation (ChIP)], 8- hangtod 10-semanang lalaki nga C57BL / 6J nga mga ilaga gigamit. Ang mga hayop nakadawat adlaw-adlaw nga mga injections sa bisan unsang 'saline' (7 treatment saline, ip), 'acute' cocaine (6 treatment saline + usa ka pagtambal 20 mg / kg cocaine-HCl, ip) o 'gisubli' nga cocaine (7 nga pagtambal 20 mg / kg cocaine-HCl, ip). Ang mga ilaga gihalad sa bisan unsang oras sa 1 o mga oras sa 24 pagkahuman sa katapusan nga pagtambal. Alang sa mga pagtuon sa microarray, ang mga hayop gitambalan matag adlaw nga adunay bisan unsang 'saline' (15 treatment saline, ip), 'acute' cocaine (14 treatment saline + 1 treatment / 20 mg / kg cocaine-HCl, ip), 'balik-balik nga' acute 'cocaine ( 7 treatment saline + 8 treatment 20 mg / kg cocaine-HCl, ip) o 'balik-balik nga pag-atras + talamak' cocaine (7 treatment 20 mg / kg cocaine-HCl + 7 treatment saline + 1 challenge challenge treatment 20 mg / kg cocaine-HCl, ip) ug gisakripisyo 1 oras human sa katapusang pagtambal. Sa mga eksperimento sa pamatasan, ang mga ilaga giawit sa post-operasyon ug gitambalan sa 10 mg / kg cocaine-HCl, ip ingon sa gihulagway sa ubos. Alang sa dendritik spine analysis ug validation sa microarray subay sa HSV-GFP ug HSV-G9a-GFP impeksyon, ang mga ilaga giatiman sa 'saline' (5 treatment saline, ip) o 'balikbalik nga cocaine' (5 nga pagtambal 20 mg / kg cocaine-HCl, ip ) sa dagan sa 3 nga mga adlaw, tungod kay kini nga protocol sa indeyksyon kaniadto gipakita aron sa pagdugang sa kakulang sa spine sa mga nukleyar nga accumbens (NAc) neuron sa panahon sa Herpes simplex virus (HSV) transgene expression (Dugang nga pagdugang S1). Ang mga ilaga nga gigamit alang sa dendritik spine analysis gisakripisyo sa mga oras nga 4 pagkahuman sa katapusan nga pagtambal.
Aron maaghat ang lokal nga pagtangtang sa G9a transcript nga gidili sa mga neuron nga NAc, gigamit namon ang mga mutice mice homozygous alang sa usa ka naglutaw nga G9a allele, nga gihubit nga detalyado sa ubang lugar (S2). Ang paggama-usab nga paggama sa pagmugna naghimo og exon 22 hangtod sa 25 nga pagbuak sa gawas nga frame nga hinungdan sa pagkabulok nga gipataliwala nga pagkabulok sa mutated transcript. Gigamit namon ang G9a nga mga salag nga ilaga nga bug-os nga nahi-backcross sa mga ilaga C57BL / 6J. Ang mga ilaga gitahud sa sterotaxically-injected sa NAc nga adunay mga vectors nga may kalabotan sa Adeno (AAV) virus (serotype 2) nga nagpahayag sa GFP o Cre-GFP tali sa edad nga 7 ug 10 nga mga semana. Ang pag-analisar sa immunohistochemical gigamit aron pamatud-an ang pagkaayo sa Cre-mediated recombination (tan-awa Dugang nga Fig. S5). Gigamit namon ang mga hayop nga gi-injected sa AAV nga mga 21 nga mga adlaw sa post-operasyon tungod kay ang pag-recombinasyon sa G9a nga mga salag sa ilaga lig-on ug labing taas sa kini nga oras, nga nahiuyon sa mga gipatik nga mga taho (S3-S4). Ang mga eksperimento sa G9a ug exJunD parehas nga gipahigayon gamit ang mga vectors nga HSV virus nga nagpahayag sa bisan diin nga GFP, wildtype G9a-GFP, patay nga namatay G9aH1093K-GFP o ΔJunD-GFP (tan-awa ang S2 alang sa mga detalye bahin sa pagpauswag sa mga konstruksyon sa G9a). Ang HSV nga pagpatuyang sa mga ilaga gigamit nga mga 3 nga mga adlaw nga post-operasyon tungod kay ang sobrang pag-awat labi ka kusog sa kini nga oras, ingon sa naobserbahan pinaagi sa immunohistochemistry. Tungod sa nagbalhin-balhin nga kinaiya sa ekspresyon sa HSV, ug ang labi ka labi ka lig-on nga kinaiya sa ekspresyon sa AAV, ang mga vectors sa HSV gigamit sa mga eksperimento nga nanginahanglan sa paspas, mubo nga termino nga transgene expression, samtang ang mga AAV vectors gigamit sa mga eksperimento nga nanginahanglan daghang mga yugto sa transgene expression. Gipakita ang duha nga mga vectors, sa daghang nahauna nga mga pagtuon, nga mahibal-an lamang ang mga organo sa selula sa neuronal sulod sa lugar nga gi-injected sa utok, nga wala’y impeksyon sa mga afferent o efferent neuron.
Alang sa mga eksperimento sa pamatasan nga gigamit ang pharmacological G9a / GLP inhibitor, BIX01294 (25 ng / ll), ang mga ilaga mga sterotaxically implanted nga adunay duha ka mga subcutaneous mini-pumps, ingon man ang giya sa bilateral cannulae, sa NAc. Ang mga mini-pumps gi-aktibo sa 12 nga oras sa wala pa implantation nga gisugdan ang padayon nga paghatud (0.25 )l / oras) sa bisan unsang sakyanan (5 hydroxypropyl β-cyclodextrin) o tambal alang sa 14 nga mga adlaw, kung diin gihimo ang mga pagsusi sa pamatasan sa oras.
Alang sa mga eksperimento sa ΔFosB nga overexpression [western blotting, qPCR, ug ChIP], lalaki bitransgenic NSE-TTA × tetOP-ΔFosB Ang mga ilaga gigamit (10 semana-bata), diin kung wala ang tetracycline derivative doxycycline (8 mga semana sa doxycycline), ang mga hayop nagpakita nga lig-on nga striatal gipugngan nga konstitusyonal nga pagpahayag sa ΔFosB (S5). Ang sobrang overpression sa ΔFosB sa kini nga mga ilaga gikumpirma pinaagi sa qPCR. Aron kumpirmahin ang mga nasabutan gamit ang NSE-TTA × tetOP-ΔFosB Ang mga ilaga, wildtype 8-week-old nga C57BL / 6J nga mga ilaga mga sterotaxically-injected intra-NAc nga adunay AAV vectors nga nagpahayag sa GFP o ΔFosB-GFP. Gigamit ang mga ve veor sa AAV, sa kini nga kaso, aron maseguro ang labing kadaghan nga ekspresyon sa ΔFosB sa poste nga pag-opera sa 8, nga nagtugot alang sa usa ka diretso nga pagtandi tali sa mga naapektuhan sa birtud ug mga bitransgenic ΔFosB nga sobrang pagpatuyang sa mga ilaga. Ang pagkontrol sa Viral gipamatud-an nga gigamit ang qPCR sa mga semana nga post sa operasyon sa 8 (ang 15-gauge NAc punch nabulag sa ilalum sa injection site). Ang AAV-GFP ug AAV-ΔFosB-GFP nga sobra nga pagpatuyang sa mga ilaga nga wala gigamit alang sa qPCR gitambalan sa saline (14 treatment saline, ip) o gisubli nga cocaine (14 nga pagtambal 30 mg / kg cocaine-HCl, ip) nga nagsugod sa 6 mga semana post- sa operasyon. Ang 4 nga mga adlaw pagkahuman sa katapusan nga pagtambal, ang mga utok natago sa 4% paraformaldehyde, nga gi-section sa usa ka vibratome ug gigamit alang sa pagsusi sa dendritik spine.
Pag-analisar sa Western blot
Ang 14-gauge NAc punch gikuha gikan sa mga seksyon nga coronal 1 mm nga nakuha gamit ang usa ka stainless steel mouse matrix utak ug gipanganak sa 1 M HEPES lysis buffer (1% SDS) nga adunay sulud nga protease ug phosphatase inhibitors. 10-Ang mga sample sa 30 μg nga kinatibuk-ang protina gihan-ay sa electrofores sa 18% SDS gels. Ang mga protina gibalhin sa mga lamad sa PVDF ug gipatubo sa bisan unsang anti-H3K9me2 (mouse monoclonal, 1: 500), anti-β-tubulin (mouse monoclonal, 1: 60,000), anti-total histone H3 (rabbit polyclonal, 1), anti-β-tubulin (mouse monoclonal, 5,000: 1), anti-total histone H1000 (rabbit polyclonal, 3) anti-GFP (gigamit alang sa pag-verify sa parehas nga ekspresyon sa viral sa punched tissue) (kuneho polyclonal, 27: 3), anti-H1K500me1 (koneho polyclonal, 60,000: 4) o mga anti-actin antibodies (mouse monoclonal, 5) 5) Ang 1 ° C (ang tanan nga mga lamad gipugngan sa 15,000% nga gatas o XNUMX% bovine serum albumin). Ang mga lamad dayon gipamubu sa mga gitawag nga peroxidase nga may label nga ikaduha nga mga antibodies (XNUMX: XNUMX-1: Ang 60,000 depende sa panguna nga gigamit nga antibody) ug ang mga banda gitan-aw gamit ang SuperSignal West Dura substrate. Ang mga banda giihap sa mga NIH Image J Software ug H3K9me2 mga banda ang na-normalize sa bisan usa ka actin o β-tubulin ug hangtod sa kinatibuk-an nga HoneNX nga kontrol sa H3. Ang gisubli nga cocaine walay epekto sa lebel sa actin (Fig. S8) o kinatibuk-ang histone 3 (Fig. S1) sa NAc. Dugang pa, ang HSV-G9a-GFP ug HSV-G9aH1093K-GFP walay epekto sa kinatibuk-ang lebel sa β-tubulin sa NAc (Fig. S8).
Immunohistochemistry
Ang mga ilaga gipahamtang sa usa ka makamatay nga dosis sa chloral hydrate ug gihapong gamit ang 4% paraformaldehyde sa wala pa masusi sa usa o doble nga immunohistochemistry sama sa gihubit kaniadto (S6). Sa mubo, ang mga post-fixed brains nga gitubuan sa temperatura sa kwarto sa tibuok gabii sa 30% sucrose sa wala pa ma-section sa 35 μm (ang mga utok nga gigamit alang sa dendritik spine analysis gibahin sa usa ka vibratome sa mga seksyon sa 100 μm sa wala nga 30% sucrose). Ang mga seksyon nga wala’y paglutaw sa NAc nahugasan sa 1X PBS, gibabagan (3% normal nga donum serum, 0.1% tritonX, 1X PBS) ug sa ulahi napauban sa anti-GFP (manok polyclonal, 1: 8000) ug / o anti-G9a (koneho polyclonal , 1: 500) mga antibodies sa solusyon sa pag-block. Ang mga seksyon nga gi-analisa alang sa dendritic spines gipatubo sa usa ka koneho nga polyclonal anti-GFP antibody sa 1: 200. Pagkahuman sa pag-incubation sa tibuok gabii, ang mga seksyon sa NAc nga gihugasan nga mga panahon sa 3 alang sa 10 minuto uban ang 1X PBS, gisundan sa pagkaprubis sa Cy2 ug / o ang Cy3 fluorescent-inubanan sa mga sekundaryong antibodies sa 1X PBS nga pag-block sa solusyon alang sa mga oras nga 2. Ang mga seksyon nga gigamit alang sa mga pagtuon sa morpolohiya gipatubo sa sekundaryong antibody sa gabii sa temperatura sa kwarto. Ang co-staining sa nukleyar nakab-ot pinaagi sa paglansad sa mga seksyon sa 1X PBS nga adunay sulud nga DAPI (1: 50,000) sa mga minuto nga 10. Ang mga seksyon nahugasan na usab, gisundan sa etanol dehydration ug pag-mount sa DPX. Ang tanan nga mga seksyon gisundog gamit ang confocal microscopy.
Ang pag-inusara sa RNA ug qPCR
Ang bilateral 14-gauge NAc punches homogenized sa Trizol ug giproseso sumala sa mga panudlo sa tiggama. Ang RNA giputli sa mga kolum sa RNAesy Micro ug gipamatud-an sa spectroscopy nga ang RNA 260/280 ug 260/230 nga rasyon> 1.8. Pagkahuman gibaliktad ang pagbalhin sa RNA gamit ang usa ka Bio-Rad iScript Kit. Ang cDNA giihap sa qPCR gamit ang SYBR Green. Ang matag reaksyon gipadagan sa duplicate o triplicate ug pag-analisar nga nagsunod sa pamaagi nga ΔΔCt sama sa kaniadto nga gihulagway gamit ang glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) ingon usa ka normalisasyon nga pagkontrol (S7). Tan-awa supplemental nga Table S5 alang sa han-ay sa una nga mRNA.
Ang pagsusi sa microarray sa DNA
Upat ka mga grupo (3 independyenteng biolohikal nga mga kopya matag grupo) ang gigamit alang sa pagtuon sa microarray, nga mikabat sa 12 microarrays. Ang 1 nga oras pagkahuman sa katapusan nga injection sa cocaine, ang mga hayop paspas nga nahurot ug gikuha ang utok ug gibutang sa yelo. Ang mga sayup nga NAc gikuha gamit ang usa ka 15-gauge needle punch ug dali nga gi-on sa uga nga yelo hangtud nga nakuha ang RNA. Ang mga bilateral nga mga suntok gipuno gikan sa upat ka mga hayop matag hulad, nga nagkantidad og mga 12 nga mga ilaga matag grupo. Ang RNA isolation, microarray processing, ug data analysis gihimo sama sa gihulagway kaniadto (S8). Sa laktud nga panahon, ang RNA nahimulag ug gihinloan sama sa gihulagway sa taas ug gisusi kung adunay kalidad nga gigamit ang Agilent's Bioanalyzer. Ang reverse transcription, amplification, labeling ug hybridization sa Illumina MouseWG-6 v2.0 arrays gipatuman gamit ang standard nga pamaagi pinaagi sa microarray core sa UT Southwestern. Ang hilaw nga datos gikuha ang background ug gi-normalize ang gidaghanon nga gigamit ang Beadstudio software. Gi-analisar ang naandan nga datos gamit ang GeneSpring software ug ang mga genelist ninggamit gamit ang mga sukaranan nga hinungdan sa usa ka 1.3 nga pagputol sa pagbag-o nga gikutuban sa usa ka dili higpit nga cut-p-value nga p <0.05.
Nagpadayon kami sa pagsalig sa kini nga datos tungod sa daghang mga hinungdan. Una, ang tanan nga mga hayop gidumala, gitambalan ug gipatay sa parehas nga mga kondisyon. Ingon man, tanan nga pagproseso sa RNA ug paghan-ay gihimo sa parehas nga oras. Ikaduha, naghimo kami nga mga triplicate arrays ug nag-pool sa daghang mga hayop matag sample, busa gipamub-an ang mga kalainan tungod sa pagkalainlain sa indibidwal ug pagdugang sa istatistika nga gahum (S9). Ikatulo, ang mga pamatasan sa pag-analisar sa datos nga gigamit alang sa among pagtuon girekomenda sa MicroArray Quality Control nga proyekto, tungod kay kini nga mga pamatasan gi-validate aron mahatagan usa ka taas nga lebel sa pagbag-o sa intersite ug inter- ug intraplatform reproducibility (S10-S11).
Ang pagtukod sa mga viral vectors
Tungod sa mga limitasyon sa gidak-on sa pagpasok sa vector, ang mga pagsunud sa pag-coding alang sa bisan unsang wildtype G9a (G9a) o mga patay nga namatay nga G9a (G9aH1093K) gipunting sa bicistronic p1005 + HSV plasmid nga nagpahayag sa GFP sa ilawom sa pagkontrol sa tawhanong GVNUMXa (G9aH3.96K). Ang gidak-on sa pagsulud mao ang ~ 2 kb, nga molabaw sa labing taas nga gidak-on sa pagsulud alang sa AAV-4 vectors). Ang IE5 / 9 promoter nagduso sa ekspresyon nga G1005a. Ang mga samad gibag-o sa bicistronic p9 + HSV plasmid pinaagi sa blunt end ligations sa Klenow nga giatiman ang PmeI ug EcoRI nga gilaraw G3.1a (gikan sa pcDNA1005) ug ang CIP nagtambal p1005 + pagsunod sa EcoRI digestion. Alang sa produksiyon sa HSV-ΔJunD-GFP, ang sunod-sunod nga pag-coding sa ΔJunD nga gisakyan sa mga lugar nga gipugngan sa EcoRI gihimo sa PCR gamit ang primer oligonucleotides nga adunay sulud nga EcoRI site. Ang produkto sa PCR dayon ligid sa EcoRI site sa pXNUMX + vector. Ang lokal nga ekspresyon sa Cre recombinase sa NAc neuron nakakab-ot pinaagi sa paghatud sa mga viral-mediated nga gamit nga gene gamit ang usa ka veavtor AAV sama sa gihulagway (S12). Ang GFP o usa ka pagbutang sa N-terminal sa GFP sa Cre gibalhin sa usa ka recombinant nga AAV-2 vector nga adunay usa ka promoter nga CMV nga adunay usa ka sunud-sunod nga pagdawat nga nagdawat sa donor ug signal nga polyadenylation. Ang tanan nga mga panudlo nga vector gipamatud-an pinaagi sa pagsunud sa dideoxy. Ang mga vector sa Viral gihimo gamit ang usa ka triple-pagbalhin, pamaagi nga walay tabang sa helper, sama sa gihubit kaniadto (S13). Ang nahinlo nga virus gitipigan sa −80 ° C. Ang kalidad sa Viral gisusi sa makatakod nga titer nga gisusi sa HEK293 cells. Ang mga virus nga AAV-ΔFosB-GFP parehas nga giandam. Alang sa HSV-Cre, ang ekspresyon sa Cre gimaneho sa usa ka tigpasiugda sa IRES, sukwahi sa promoter sa IE4 / 5, aron maibanan ang ekspresyon sa Cre ug mapugngan ang pagkahilo sa neuronal (tan-awa ang S14 alang sa viral nga pagtukod). Sa tanan nga mga kaso, gi-validate ang sobrang pag-overhot sa virus sa vitro ug sa vivo, pinaagi sa qPCR, ug ang mga virus napamatud-an nga gipatuman sa immunohistochemically aron ipakita ang ekspresyon nga gipugngan sa NAc pagkahuman sa operasyon.
Stereotaxic nga operasyon
Ubos sa ketamine (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg) anesthesia, ang mga ilaga gipahimutang sa usa ka gamay nga hayop nga stereotaxic nga instrumento, ug ang ibabaw sa cranial napadayag. Trayntay-tulo nga gauge syringe needles gigamit aron bilaterally infuse 0.5 μl sa virus sa NAc sa usa ka 10 ° nga anggulo (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) sa rate nga 0.1 μl / min. Ang mga hayop nga nakadawat sa mga injection gitugotan nga maulian sa 2 nga mga adlaw pagkahuman sa operasyon, samtang ang mga ilaga nga gigamit alang sa pagsulay sa pamatasan nga nakadawat sa AAV vectors gitugotan nga mabawi sa 20 nga mga adlaw sa wala pa mapailalom sa pagpahawa sa lugar. Kini nga mga panahon nahiuyon sa mga yugto sa labing kadaghan nga ekspresyon nga transgene nga gipahayag sa viral alang sa duha nga mga vectors. Alang sa mga infusions sa BIX01294, ang matag usa sa duha nga mga mini nga bomba nga gipahimutang nga subcutaneously sa likod sa mouse. Ang mga pagbutang sa cannulae nakakab-ot pinaagi sa pagbansay sa duha ka gagmay nga mga lungag sa cranial sa ibabaw sa NAc, ug pinaagi sa paghatud sa cannula gikan sa bregma (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4). Gitugotan ang mga ilaga nga makabawi gikan sa operasyon alang sa 4 hangtod sa 5 nga mga adlaw sa wala pa magsugod ang pamaagi sa pag-conditioning sa lugar sa cocaine sama sa gihulagway sa ubos.
Gipalabi ang lugar nga giandam
Ang pamaagi sa pagkondisyon sa lugar gihimo sama sa nahauna nga gihulagway, kauban ang mga musunod nga pagbag-o (S7). Sa daklit, 3 ka adlaw pagkahuman sa intra-NAc infusions sa HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP o HSV-GFP, ang mga ilaga gibutang sa mga silid sa pagkondisyon, nga gilangkuban sa tulo nga managlahi nga mga palibot. Ang mga ilaga nga gipakita nga makahuluganon nga pagpalabi sa bisan hain sa duha ka mga lawak sa pagkondisyon wala iapil gikan sa pagtuon (<10% sa tanan nga mga hayop). Gibalanse ang mga grupo sa pagpahan-ay aron maigo alang sa bisan unsang pagkiling sa kamara nga mahimo pa nga maglungtad. Sa misunod nga mga adlaw, ang mga hayop giindyeksyon ug asin ug gitago sa usa ka silid sa hapon sa 30 minuto ug pagkahuman giindyeksyon og cocaine (10 mg / kg, ip) ug gitago sulod sa 30 minuto sa pikas nga kabalayan sa gabii sa 2 ka adlaw (duha asin ug duha nga pagpares sa cocaine). Sa adlaw sa pagsulay, ang mga ilaga gibutang usab sa aparador nga wala gitambal sulod sa 20 minuto ug gisulayan aron masusi kung unsang bahina ang gusto nila. Ang mga tubag sa Locomotor sa cocaine gisusi pinaagi sa mga beam break sa mga kuwarto nga gipares sa cocaine aron masiguro ang pagka-epektibo sa pagtambal sa droga. Alang sa mga eksperimento sa AAV ug BIX01294 CPP, usa ka gamay nga gibag-o nga protokol ang gigamit. Ang mga hayop giindyeksyon pag-usab saline o cocaine (10 mg / kg, ip) ug gitago sa piho nga mga sulud sulod sa 30 minuto nga sesyon, apan sa baylo gikondisyon ra kausa sa usa ka adlaw sa 4 ka adlaw, gisundan sa pagsulay sa adlaw 5 (ang mga hayop gikondisyon. sa gabii ug ang pagpatambal sa pagpuli gipulihan). Alang sa tanan nga mga grupo, ang baseball locomotion isip tubag sa asin gi-assess aron maseguro nga ang locomotion dili apektado sa pagtambal sa viral o tigpugong.
Intravenous cocaine self-administration
Ang mga lalaki nga batan-on nga daga nga Long-Evans, nga gitimbang ang 230-250 g sa pagsugod sa eksperimento, nakuha. Nabutang sila sa usa ka umog nga temperatura ug kontrolado sa temperatura sa usa ka baligya nga 12 nga oras nga suga / ngitngit nga siklo (mga suga sa 9: 00 am) kauban ang ad libitum pag-access sa pagkaon ug tubig. Gitugotan ang pagdagayday sa pagdawat sa ilang bag-ong palibot ug gidumala adlaw-adlaw alang sa 1 nga semana sa wala pa magsugod ang eksperimento. Ang tanan nga mga pamaagi gipahigayon pinauyon sa Giya sa National Institute of Health alang sa Pag-atiman ug Paggamit sa Mga Binuhat sa Laboratory ug gi-aprubahan sa Komite sa Pag-atiman sa Pag-alima ug Paggamit sa Mga Hayop sa Mount Sinai. Ang mga gamit sa pagdumala sa kaugalingon nga gisangkapan sa mga sagbayan sa infrared aron sukdon ang pamatasan sa lokomotor. Ang pagdumala sa kaugalingon gihimo ingon sa nahauna nga gihulagway (S15-S16) nga adunay mga catheter nga gibutang sa tuo nga jugular vein sa ilalum sa isoflurane (2.4-2.7%) anesthesia. Ang mga catheter gipamula sa 0.1 ml nga solusyon sa asin nga adunay sulud nga 10 U heparin ug ampicillin (50 mg / kg). Pagkahuman sa usa ka semana nga pagkaayo gikan sa operasyon, ang pagbansay sa pagdumala sa kaugalingon nagsugod sa panahon sa ngitngit nga hugna sa suga / ngitngit nga siklo. Gitugotan ang mga hayop nga 3-oras adlaw-adlaw nga pag-access sa cocaine (0.75 mg / kg / pagpuga) sa ilalum sa usa ka gitakda nga iskedyul sa pagpalig-on sa ratio nga-1 (FR1), diin 1 nga aktibo nga lever press ang miresulta sa usa ka pagpuga sa tambal. Ang mga ilaga nagpalig-on sa ilang pag-inom sa cocaine pagkahuman sa 6 ka adlaw (<15% nga kalainan sa rate sa pagtubag sa 3 ka sunud nga adlaw, nga adunay labing menos 75% nga nagtubag sa gipalig-on nga pingga). 24 oras pagkahuman sa katapusan nga sesyon sa pagdumala sa kaugalingon, ang mga ilaga dali nga naputol, utok nga dali nga gikuha ug giproseso alang sa pagpalain sa RNA ug qPCR.
Chromatin immunoprecipitation (Chip)
Ang bag-ong mga pagsuntok sa NAc mga pormula nga may kalabutan sa crossaldehyde ug giandam alang sa ChIP sama sa gihulagway kaniadto (S17-S18) nga adunay gagmay nga mga pagbag-o. Sa mubo, ang 4 14-gauge NAc punch matag hayop (5 nga mga hayop nga gisagol sa matag sample) ang nakolekta, nga gi-link sa 1% formaldehyde ug gipahunong sa 2 M glycine sa wala pa mabugnaw sa −80 ° C. 1 adlaw sa wala pa sample nga sonication, ang mga karnero anti-rabbit / mouse (depende sa ulan nga antibody) Ang magnet nga kuwadra sa IgG giandam pinaagi sa paglakip sa angay nga mga magnet nga kuwadro nga adunay alinman nga anti-G9a (kuneho nga polyclonal ChIP grade) o anti-H3K9me2 (mouse monoclonal ChIP grade) mga antibody sa tibuok gabii sa 4 ° C ubos sa kanunay nga pagtuyok sa solusyon sa block. Ang tissue sonication ug chromatin shearing gihimo ingon sa gihubit kaniadto (S17). Pagkahuman sa sonication, ang managsama nga konsentrasyon sa chromatin gibalhin sa mga bag-ong tubo ug ~ 5% sa katapusang mga produkto giluwas aron magsilbing mga control 'input'. Pagkahuman sa bug-os nga paghugas ug resuspension sa conjugated bead / antibody mixtures, ang managsama nga kantidad sa mga sagol sa antibody / bead (~ 7.5 μg antibody / sample) gidugang sa matag sampol nga chromatin ug gipatubo alang sa ~ 16 nga mga oras ubos sa kanunay nga pagtuyok sa 4 ° C. Ang mga sampol gihugasan pa ug gibaliktad ang cross-link sa 65 ° C sa gabii sa wala pa ang paglimpyo sa DNA gamit ang PCR purification kit. Pagkahuman sa paglimpyo sa DNA, ang mga sampol gipailalom sa qPCR ug na-normalize sa ilang angay nga mga pagkontrol sa 'input' sama sa gihulagway kaniadto (S17). Kasagaran nga immunoprecipitations sa mouse nga gigamit ang mouse nga polyclonal anti-IgG antibody gihimo usab aron makontrol alang sa angay nga pagpauswag sa signal amplification. Ang adenine phosphoribosyltransferase (APRT) gigamit ingon usa ka negatibo nga pagpugong alang sa mga eksperimento sa sobrang pag-cocaine ug ΔFosB. Kitaa Supplemental nga Talaan S5 alang sa mga sunod-sunod nga promoter nga panudlo.
Pag-analisar sa spendritic spine
Aron matun-an ang papel sa G9a sa regulasyon sa neuronal morphology sa vivo, gigamit namon ang mga pamaagi nga gihubit kaniadto sa mga musunud nga pagbag-o (S1). Tulo ka adlaw pagkahuman sa indeyksiyon sa HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (ang tanan nga mga virus gigamit sa wildtype C57Bl / 6J mice), o HSV-Cre-GFP (gigamit sa G9afl / fl Mice), kung labi ka taas ang ekspresyon sa viral, ang mga ilaga mga pinahiran, ang mga utok gi-cryoprotected ug sa ulahi gi-section sa 100 μm sa usa ka vibratome. Ang mga seksyon kaniadto wala mabalhin gamit ang usa ka antibody batok sa GFP ingon sa gihulagway sa ibabaw (tan-awa ang Immunohistochemistry). Aron mahibal-an ang mga epekto sa G9a overexpression ug knockout sa mga numero sa spine, ingon man ang epekto sa ΔJunD overexpression, gisukat namon ang gidaghanon sa mga spine sa gibana-bana nga 1-2 neurite matag neuron nga katumbas sa 299 μm sa mga sekondaryang dendrite gikan sa GFP nga nagpahayag sa NAc medium spiny neuron (MSN). Gipasabot nga ang mga MSNs lahi sa morphologically gikan sa uban nga mga populasyon sa neuronal sa NAc, ingon man usab ang mga naunang mga taho nga nagpaila nga ang HSV nag-una nga nakapasakit sa DARPP-32 nga nagpahayag sa mga neuron sa kini nga rehiyon sa utok (S19), kami masaligon nga ang mga MSN eksklusibo nga gisusi sa kini nga mga pagtuon. Alang sa matag hayop, gisusi namon ~ Ang 6-8 nga mga neuron sa 3-4 nga mga hayop matag grupo (7 nga mga grupo), pagkahuman niini usa ka average nga bili ang nakuha alang sa matag hayop alang sa estadistika nga pagsusi. Ang mga eksperimento nga gilaraw sa pagsusi sa mga epekto sa sobrang pag-awas sa ΔFosB sa NAc spine density gidala sa susama sa gihulagway sa itaas, gawas nga ang mga A ve veortor gigamit aron ipahayag ang GFP o ΔFosB-GFP alang sa taas nga mga oras (8 nga mga semana). Ang tanan nga mga imahe sa HSV nakuha pinaagi sa usa ka confocal mikroskopyo nga adunay 100X oil-immersion nga katuyoan (nakuha ang mga imahe sa AAV nga adunay katuyoan sa 63X nga paglusbog sa lana). Nakuha ang mga imahe gamit ang pinhole set sa 1 nga arbitraryong yunit ug usa ka gidak-on sa frame sa 1024 × 1024. Ang dendritik nga gitas-on gisukod gamit ang software sa NIH Image J, ug ang mga numero sa spine giisip nga bulag sa nag-una nga eksperimento, ingon nga ang mga slide gi-cod sa wala pa ang eksperimento nga pag-scan. Ang average nga gidaghanon sa mga spine matag 10 μm sa dendrite gikalkulo.
Statistical analysis
Ang usa ug duha ka mga paagi nga ANOVA gihimo aron mahibal-an ang kamahinungdanon alang sa kondisyon sa lugar nga gusto ug dendritik nga spine analysis nga labi pa sa duha ka mga grupo. Ang mga pagsulay sa mga estudyante gigamit alang sa ubang mga pagtandi lakip ang qPCR, western blotting, dendritic spine analysis pagtandi sa HSV-GFP sa HSV-Cre sa G9afl / fl mga ilaga, pag-analisar sa microarray (tan-awa sa taas) ug mga eksperimento sa chromatin immunoprecipitation. Ang giplano nga mga t-test sa estudyante gigamit ang pagkahuman sa duha ka paagi nga pagtuki sa ANOVA sa dendritic spine density pagkahuman sa sobra nga pagpahayag sa ΔFosB nga adunay pagkumpirma sa hinungdanon nga mga punoan nga epekto sa pagtambal sa droga ug virus. Ang tanan nga mga kantidad nga gilakip sa mga legend sa numero naghawas sa gipasabut nga ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Detalyado nga mga pagtuki sa istatistika alang sa Mga igos. 1-3 sa mga nag-unang teksto gihatag sa: Detalyado nga Figure Legends nga Naglakip sa mga Istatistika.
Mga footnote
Gipasaligan ko nga wala sa mga materyal nga nahisulod sa sulud sa manuskrito nga adunay katungod Mahinungdanong Papel sa Histone Methyltransferase G9a sa plastik nga gipadako sa Cocaine kaniadto nga gipatik o gitagad sa bisan diin, lakip ang Internet.
Ang tanan nga gimbuhaton nga adunay kalabotan sa paggamit sa mga hayop gipahigayon pinauyon sa mga panudlo sa institusyonal ug IACUC sa parehong University of Texas Southwestern Medical Center ug Mount Sinai School of Medicine.
Mga reperensiya ug mga Nota
;