J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.
Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.
tinubdan
Departamento sa Psychiatry, Center for Basic Neuroscience, The University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas 75390-9070, USA.
abstract
Ang transkripsyon nga hinungdan sa DeltaFosB (gipunting usab ingon FosB2 o FosB [mubo nga porma]) usa ka hinungdanon nga tigpataliwala sa dugay nga termino nga plastik nga nadasig sa utok pinaagi sa talamak nga pagkaladlad sa daghang mga matang sa psychoactive stimuli, lakip na ang mga droga nga nag-abuso, stress, ug mga seizure sa electroconvulsive . Ang usa ka lahi nga bahin sa DeltaFosB mao nga, sa makausa pa maaghat, kini nagpadayon sa utok sa labi ka dugay nga yugto sa panahon nga wala’y dugang nga pagdasig. Hinuon, ang mga mekanismo nga nagpailalom niining dayag nga kalig-on, bisan pa, nagpabilin nga wala nahibal-an Dinhi, gipakita namon nga ang DeltaFosB usa ka hinungdanon nga transkripsyon nga hinungdan, nga adunay katunga sa kinabuhi nga gibana-bana nga 10 h sa kultura sa cell. Dugang pa, gipakita namon nga ang DeltaFosB usa ka phosphoprotein sa utok ug ang phosphorylation sa usa ka labi nga gitipig nga serine residue (Ser27) sa DeltaFosB nanalipod niini gikan sa proteasomal nga pagkadaot. Naghatag kami pipila ka mga linya sa ebidensya nga nagsugyot nga kini nga phosphorylation gihusay sa casein kinase 2. Kini nga mga nahibal-an mao ang una nga ebidensya nga ang DeltaFosB nga gipasiugdahan ug gipakita nga ang phosphorylation nakatampo sa kalig-on niini, nga mao ang kahinungdan sa katakus sa paghusay sa dugay na nga pagpahiangay sa utok.
Pasiuna
Ang transcript factor nga ΔFosB, nga gilaraw usab nga FosB2 o FosB [mubo nga porma], usa ka variant C terminus-truncated splice sa gilayon nga una nga gene fosb (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu ug Nathans, 1991; Yen et al., 1991). Sama sa tibuuk nga FosB, ang ΔFosB adunay usa ka batakang domain nga nagbugkos sa DNA ug usa ka leucine zipper nga pinaagi niini kini nagkalainlain sa mga protina ni Jun aron maporma ang mga activator nga protina-1 (AP-1) mga komplikado nga hinungdan sa transkripsyon, nga nag-regulate sa pagpahayag sa daghang mga gen (Morgan ug Curran, 1995; Rylski ug Kaczmarek, 2004). Bisan sa kulang nga bahin sa domain nga transactivation nga nakit-an sa C terminus sa FosB, ang ΔFosB naglihok ingon usa ka hinungdanon nga transcriptional activator ug manglupig sa kultura nga mga selula ug utok (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu ug Nathans, 1991; Chen et al., 1997; McClung ug Nestler, 2003; Kumar et al., 2005).
ΔAng FosB naaghat sa taas nga lebel sa us aka piho nga paagi sa utok human sa talamak, apan dili mahait, pagkaladlad sa lainlaing mga psychoactive stimuli, lakip ang stress, pipila ka mga samad, antipsychotic ug antidepressant nga mga droga, mga droga sa pag-abuso, ug natural nga ganti (Paglaum et al., 1994b; Hiroi ug Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Bing et al., 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Andersson et al., 2003; Colby et al., 2003; Peakman et al., 2003; Perrotti et al., 2004; Zachariou et al., 2006). Ang induction sa ΔFosB nga may kalabutan nga direkta sa mga epekto sa daghang mga kini nga mga stimulus sa utok. Ang pagkamakanunayon sa ΔFosB bisan kung wala’y dugang nga pagdasig nga nagpalahi niini gikan sa tanan nga uban pang mga hinungdan sa transaksyon sa pamilya Fos, nga dali nga naaghat sa pagtubag sa mahait nga stimuli, pagkadunot balik sa basal nga lebel sulod sa pipila ka oras, ug sa kasagaran nagpakita sa desensitization human sa talamak nga pagdasig (Paglaum et al., 1992; Daunais et al., 1993; Persico et al., 1993; Hiroi ug Graybiel, 1996; Perrotti et al., 2004). Gihimo kini nga ΔFosB nga usa ka makapaikag nga kandidato nga magtaliwala sa pila ka dugay nga mga pagbag-o sa mga ekspresyon sa gene nga nagpaubos sa lig-on nga pagpahiangay sa neuronal nga gipahinabo sa pila ka monyu nga stimuli.
Tungod kay ang dugay nga presensya sa ΔFosB mahitabo sa wala’y dugang nga induction sa mRNA niini (Chen et al., 1995), gihunahuna namon nga, dili sama sa tibuuk nga FosB ug ang tanan nga ubang mga protina sa pamilya nga Fos, nga dili mapugngan, ang ΔFosB mahimo’g usa ka dili kaayo lig-on nga transkripsyon nga hinungdan (Paglaum et al., 1994b; Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001; McClung et al., 2004). Dugang pa, ang pag-analisar sa immunoblotting sa mahait nga kontra sa talamak nga gipukaw nga tisyu sa utok nagsugyot nga ang ΔFosB nagbag-o nga makita Mr (molekula nga molekula) gikan sa ∼33 kDa sa mahait nga kondisyon hangtod sa ∼35-37 kDa sa panahon sa pagtambal (Paglaum et al., 1994a; Chen et al., 1995). Tungod kay wala’y ebidensya sa paglungtad sa dugang nga mga mRNA nga mahimo’g maka-encode alang sa lainlaing mga isoform, dugang nga gibanabana naton nga ang ΔFosB giusab ang posttranslationally ug nga tingali kini nakaamot sa dili kasagaran nga kalig-on niini. Karon, bisan pa, wala’y pag-analisar sa biochemical nga pag-analisar sa pagbag-o o posttranslational modipikasyon sa ΔFosB. Ang katuyoan sa karon nga pagtuon mao ang aron mahibal-an kung ang ΔFosB usa ka phosphoprotein ug kung ang phosphorylation adunay papel sa kalig-on niini.
Nahiuna nga SeksyonSunod nga Seksyon
Mga Materyal ug Pamaagi
Ang mga linya sa cell sa Mammalian ug mga konstruksyon sa DNA.
Ang mga selyula sa PC12 (Clontech, Mountainview, CA) gilaraw sa high-glucose DMEM nga adunay l-glutamine (L-Gln) ug gidugangan sa 5% fetal bovine serum (FBS), 10% kabayo serum (parehong gikan sa Invitrogen, Carlsbad, CA) , 100 U / ml penicillin, ug 100 μg / ml streptomycin (pareho sa Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Ang mga selula sa HeLa (Koleksyon sa American Type Culture, Manassas, VA) nga kulturan sa high-glucose DMEM nga adunay L-Gln ug gidugangan sa 10% FBS, penicillin, ug streptomycin. Ang parehong mga linya sa cell gipadayon sa 37 ° C sa usa ka umog nga 5% CO2 atmospera.
Alang sa nagbalhin-balhin nga mga impeksyon na adunay DNA, ang PC12 o mga selula sa HeLa nasabod sa unom ka atabay nga mga plato (pinahiran sa mga kolagen I alang sa mga selula sa PC12) aron makaabot sa 90-100% pagkalumpag sa sunod adlaw ug dayon gibalhin gamit ang Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Sa pipila ka mga eksperimento (tan-awa Mga igos. 1⇓⇓⇓⇓⇓-7), Ang ΔFosB kanunay nga gipahayag sa mga PC12 cells pinaagi sa impeksyon uban sa recombinant herpes simplex virus (HSV).
Ang ΔFosB ug FosB cDNAs nakuha gikan sa among kaugalingon nga pTetop-constructs (Chen et al., 1997), ug gisulat sa usa ka pcDNA3.1 vector (Invitrogen). Kini nga mga konstruksyon sa pcDNA3.1-ΔFosB / FosB gigamit alang sa pagpahayag sa mga selula sa mammalian ug ingon usa ka template alang sa mutagenesis nga gitultolan sa site. Ang Recombinant HSV-ΔFosB giandam sama sa gihulagway kaniadto (Neve et al., 1997), ug ang pagpangandam adunay titer sa ∼1 × 108 pfu / ml.
Mga eksperimento sa pulso.
Gibana-bana nga 24 h pagkahuman sa impeksyon / pagbalhin, ang mga selyula (PC12 o HeLa) sa unom ka atabay nga mga plato gihugasan duha hangtod tulo ka beses sa 2 ml sa PBS ug gipatubo sa 37 ° C alang sa ∼1 h sa 2 ml sa Cys / Met-free DMEM (Invitrogen) nga gidugangan uban sa 5% gipilde sa FBS (Hyclone, Logan, UT) aron mapaubos ang mga intracellular pool nga Met ug Cys. Sa pagtapos sa kini nga "gutom" nga panahon, ang mga tambal (kung gitambalan ang mga selula) gidugang, ug ang mga selyo giparkahan (pulso) nga adunay 12-25 Ci ni 35S Protein Labeling Mix (PerkinElmer, Wellesley, MA) alang sa ∼1 h sa 37 ° C aron ma-label ang tanan nga bag-ong gipintalan nga mga protina. Ang radiolabel dayon gikuha pinaagi sa paghugas sa mga cell duha hangtod tulo ka beses sa 2 ml sa PBS, ug 35Gisundan ang mga protina nga adunay S-label (gigukod) pinaagi sa pag-ilis sa medium sa "bugnaw" (nonradioactive) medium nga gidugangan sa 5% FBS ug nag-ani sa mga selyula sa lainlaing mga punto sa oras. Ang mga pagtambal sa cell gipadayon sa paggukod. Ang tanan nga mga numero sa kini nga mga eksperimento nagpakita sa susamang pasiuna nga kantidad sa lainlaing mga protina aron ma-optimize ang mga pagtandi sa ilang mga rate sa pag-turnover.
Mga hayop ug laygay nga pagtambal sa electroconvulsive nga pag-agaw.
Mga daga sa lalaki nga Sprague Dawley (200 – 300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) gitambalan makausa matag adlaw nga adunay mga electroconvulsive seizure (ECS) alang sa 7 – 9 d. Ang ECS gihimo sama sa gihulagway kaniadto (Paglaum et al., 1994a) paggamit sa usa ka Ugo Basile (Comerio VA, Italya) yunit sa ECS nga adunay mga mosunud nga setting: frequency, 100 pulses / s; pulso sa, 0.5 ms; kadugayan sa shock, 1.0 s; ug karon, 75 mA. Ang mga hayop sa pagpugong sa sham parehas sa pagtambal pinaagi sa pag-apply sa mga electrodes sa ear-clip nga wala’y koryente.
32 P metabolic label.
Alang sa pag-label sa mga hiwa sa utak, ang mga ilaga gilusbog, ang utok dali nga nagkabulag, ug ang 300 μm frontal cortical slars giandam uban ang usa ka DSK microslicer (Ted Pella, Redding, CA). Ang mga hiwa nahumok sa sulod sa mga plastik nga tubo sa 2 ml nga kulang sa posporo nga kulang sa artipisyal nga CSF (ACSF) ug gipadayon sa 30 ° C ubos sa kanunay nga malumo nga pagbusbog nga adunay O2/ CO2 sagolHemmings et al., 1989). Ang mga hiwa (duha ka hiwa sa matag tubo) gimarkahan og 1.3 mCi alang sa 8-10 h sa presensya o pagkawala sa okadaic acid (100 ng / ml). Sa pagtapos sa kini nga pag-incubation, ang mga hiwa gipamasa labing menos tulo ka beses sa bugnaw nga ACSF ug dayon gipamomodohan pinaagi sa sonication sa 250 μl sa bugnaw nga radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v ) Igepal, 0.5% (w / v) sodium deoxycholate, 0.1% (w / v) SDS, 1 mm EDTA] gidugangan sa wala pa magamit gamit ang SDS hangtod 0.6%, ang protease inhibitor cocktail alang sa mga cell sa mammalian (gigamit sa 5 Xl / ml; Sigma-Aldrich), phosphatase inhibitor cocktails I ug II (gigamit sa 1: 100; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF, ug 2% glycerol. Ang homogenates dayon gilat-an alang sa 15 min ug gihawan pinaagi sa centrifugation sa 15,000 × g alang sa 15 min. Ang konsentrasyon sa protina sa mga sangputanan nga mga supernatant gisusi gamit ang BCA protina assay (Pierce, Holmdel, NJ).
Kay ang mga 32Ang paglansad sa P sa mga kulturan nga selula, ∼24 h pagkahuman sa impeksyon / pagbalhin, ang mga selula gihugasan duha hangtod tulo ka beses nga adunay medium nga pospeyt ug gipatubo sa kini nga medium alang sa ∼1 h. Pagkahuman sa panahon sa kagutom, 0.2-0.3 mCi sa 32PH3PO4 (PerkinElmer) gidugang sa matag atabay, ug ang mga selula gimarkahan alang sa 4 – 12 h depende sa klase nga eksperimento (tan-awa ang Figs. 1-7 alang sa mga detalye). Ang mga selula pagkahugasan tulo nga beses sa PBS ug gihilantan sa yelo alang sa 15 min nga 50 μl sa suplemento nga RIPA buffer. Ang mga lysate nakolekta pinaagi sa pag-scrap ug gipasa nga mga panahon sa 10 pinaagi sa usa ka dagum sa 25 ga sa shear DNA, giluto alang sa 10 min, ug gisentro sa 15,000 rpm alang sa 15 – 30 min sa 4 ° C. Ang gihinloan nga lysates (supernatants) gibalhin sa usa ka bag-ong tubo ug gihimo ang usa ka protina sa BCA protina (Pierce). Ang tanan nga mga numero sa kini nga mga eksperimento nagpakita sa parehas nga kantidad sa total wild-type (WT) ug S27A ΔFosB nga mga protina aron ma-optimize ang pagtandi sa ilang paryente nga lebel sa phosphorylation.
Pagtambal sa mga kemikal ug cell culture.
Ang okadaic acid (OA; Sigma-Aldrich) natunaw sa ethanol ug gigamit sa usa ka katapusang konsentrasyon sa 100 ng / ml. Ang 5,6-Dichloro-1-β-d-ribofuranosyl-benzimidazole (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) natunaw sa dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich) ug gigamit sa kultura sa selula sa usa ka katapusang konsentrasyon sa 50 μm. Ang Spermine (Sigma-Aldrich) natunaw sa tubig ug gigamit sa usa ka katapusang konsentrasyon sa 200 μm. Ang Calphostin-C (Biomol) natunaw sa DMSO ug gigamit sa 0.2 μm, samantalang ang phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; Promega, Madison, WI) natunaw sa DMSO ug gigamit sa 0.1 μm. ang myristoylated-autocamtide-2 nga may kalabotan nga peptide (m-AIP; Biomol) natunaw sa tubig ug gigamit sa katapusan nga konsentrasyon sa 1 ug 10 μm. Ang lapad nga spekular nga proteksyon kinase nga mga inhibitor nga H-7 ug H-8 (Biomol) natunaw sa tubig ug gigamit sa katapusan nga konsentrasyon sa 150 ug 200 μm, sa tinuud. Ang MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) ug epoxomicin (Peptides International, Louisville, KY) pareho nga natunaw sa DMSO ug gigamit sa katapusan nga konsentrasyon sa 12.5 ug 7.5 μm, sa tinuud. Sa tanan nga mga eksperimento, ang DMSO (sakyanan) gidugang sa mga selyula kung gikinahanglan aron mapadayon ang kanunay nga kantidad sa DMSO sa mga pagtambal. Alang 32Mga eksperimento sa pag-label, ang mga tambal gidugang dayon sa wala pa ang label ug gitipigan alang sa nahabilin sa panahon sa pag-label. Alang sa mga eksperimento sa pulso, ang mga tambal gidugang sa panahon sa Cys / Met "pagkagutom," gipadayon sa panahon sa pag-label, ug dayon gidugang sa paghabol sa medium. Ang mga proteasome inhibitors gikutlo matag 3-4 h sa bug-os nga paghabol aron mabawi ang dali nga pagbalhin sa kini nga mga peptides.
Immunoprecipitation sa ecFosB, immunoblotting, ug autoradiography.
Alang sa mga immunoprecipitations, ang mga lysate natunaw 1: 5 nga adunay yano nga RIPA aron madala ang konsentrasyon sa SDS sa 0.1% sa wala pa ipadayon ang immunoprecipitation (IP). Aron malimitahan ang dili hinungdanon nga pagbugkos, ang mga lysate una nga na-clear sa immunoprecipitating sa nonimmune IgG ug protina nga G-Sepharose (Sigma-Aldrich) labing menos 4 h. Ang ΔFosB dayon wala mabulag gikan sa nalimpyohan nga mga lysate gamit ang usa ka polyclonal antibody nga kanding nga nakilala ang usa ka panloob nga epitope nga naa sa FosB ug ΔFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) sa 0.5 – 1 μg IgG matag 10 g sa lysate (50 – 300 μg sa tibuuk nga protina) sa tibuuk nga gidaghanon sa 0.5 ml. Ang mga IP nga hinayhinay nga gisagol sa 4 ° C sa usa ka rotor nga labing menos 8 h ug dayon ang 15 μl sa protina nga G-Sepharose ug ang mga IP gisagol alang sa labing gamay nga 4 h. Ang mga IP gipagawas sa pag-spin sa 3000 × g alang sa 3 – 5 min sa 4 ° C, gihugasan tulo ka beses sa 0.5 ml sa bugnaw nga kapatagan RIPA ug duha ka beses nga adunay bugnaw nga PBS nga adunay 0.1% Tween 20. Ang mga IP dayon gibalikbalik sa 0.5 ml sa bugnaw nga PBS, gibalhin, giputus sa usa ka bag-ong tubo, ug ang mga protina nga immunoprecipitated dayon gipakli sa pagdugang sa 15-25 μl sa 2 × pagkunhod sa Laemmli protein sample buffer. Kini nga protocol sa IP miresulta sa piho ug epektibo nga pag-ulan sa hapit tanan nga ΔFosB sa lysate. Ang mga protina nga immunoprecipitated gisakup sa SDS-PAGE pinaagi sa pagkarga sa tibuuk nga IP sa usa ka 12.5% Tris-HCl Criterion gel (Bio-Rad, Hercules, CA), ug dayon gibalhin sa PVDF o nitrocellulose. Pagkahuman gibalhin, ang lamad nga gipauga sa hangin ug 32P- ug 35Ang mga band nga protina sa S-radiolabeled naobserbahan sa autoradiography gamit ang Kodak (Rochester, NY) autoradiographic film, ingon man usab sa phosphorimaging gamit ang usa ka Bagyo (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager. Ang kabug-usan (unphosphorylated ug phosphorylated) ΔFosB sa cell lysates o utok homogenates nakit-an sa immunoblotting sa bisan unsang protina nga immunoprecipitated (gamit ang parehas nga lamad nga gigamit aron makit-an ang 32P-may label nga protina), o parehas nga kantidad sa protina sa lysate / homogenate nga gisakup sa SDS-PAGE ug gibalhin sa PVDF o nitrocellulose. Ang lamad unang gipugngan pinaagi sa pagpahipos sa 1% (w / v) nonfat dry milk (Bio-Rad) sa PBS nga gidugangan sa 0.1% (v / v) Tween 20 (Sigma) alang sa 1 h sa 25 ° C. Ang lamad dayon wala mabalhin sa gabii sa 4 ° C uban ang among kaugalingon nga koneho nga anti-FosB polyclonal antibody nga gihimo batok sa amino acid 1-16 sa FosB / ΔFosB (gigamit sa 1: 10,000). Pagkahuman sa panguna nga pagkubkob, ang mga lamad nahugasan upat ka beses alang sa 5 min nga adunay blocking buffer, ug dayon gipatubo sa 25 ° C alang sa ∼1 h kauban ang usa ka kanding nga anti-rabbit IgG nga nakigsagol sa horseradish peroxidase (gigamit sa 1: 5000 sa pagpugong sa buffer, gikan sa Vector Laboratories, Burlingame, CA). Ang mga lamad dayon gihugasan tulo ka beses alang sa 10 min nga adunay blocking buffer ug usa ka higayon alang sa 5 min sa PBS. Ang kinatibuk-an nga mga bandang protina sa bandsFosB nakita sa pelikula nga Kodak MR pinaagi sa pagpaayo sa chemiluminescence (Pierce) ug / o pinaagi sa pagkakita sa fluorescence gamit ang ECL-Plus reagents (Amersham Biosciences) ug Storm PhosphorImager.
Sobrang pagkontrol ug paglimpyo sa recombinant ΔFosB gikan sa mga cell sa insekto.
Ang ΔFosB napuno sa mga selula sa insekto sa Sf9 ingon usa ka protina nga N terminus hexa-His-tag-tag (N-His (6) ΔFosB) gamit ang Bac-to-Bac baculovirus expression system (Invitrogen) ug pagsunod sa mga panudlo sa tiggama. Sa mubo, ang ΔFosB cDNA (nahabilin nga 2-237) nauna sa kaakibat nga tag nga N-terminal nga MGHHHHHHAG gisulat sa pFASTBacTM1 vector, nga gigamit aron makamugna ang recombinant baculovirus. Ang mga selula sa Sf9 na-impeksyon sa virus nga recombinant, ug ang N-His (6) ΔFosB nalimpyohan gikan sa mga cell lysates pinaagi sa ubay-ubay nga mga lakang sa chromatographic lakip na ang pag-isa sa chromatography gamit ang usa ka kolum nga nikel (Qiagen, Valencia, CA), pagbinayloay sa anion gamit ang kolum nga mono-Q (Amersham Ang mga biosciences), ug ang paggawas sa gidak-on gamit ang usa ka kolum sa pagsala sa gel-filing (Amersham Biosciences).
Sa vitro Mga pagtuon sa phosphorylation.
Sa vitro Ang reaksyon sa phosphorylation alang sa kurso sa oras ug pagtuki sa stoichiometry gihimo sa usa ka gidaghanon sa 30 μl nga adunay 10 μm substrate (N-His (6) ΔFosB o usa ka positibo nga control substrate), 250 μm ATP, ug 1 μCi / μl [γ-32P] ATP, ang buffer nga gihatag sa taghimo sa kinase, ug usa sa mga musunod nga kinase: CK2 (20 ng / l; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / l; Upstate), PKC (1.6 ng / l; Calbiochem) o p70S6K (2.5 mU / μl; Upstate). Ang mga reaksyon sa kurso sa oras gihimo pinaagi sa pagtangtang sa 5 l aliquots gikan sa solusyon sa reaksyon sa gitudlo nga mga puntos sa oras ug pagdugang usa ka managsama nga gidaghanon sa 4 × nga pagkunhod sa sample nga buffer sa Laemmli protein. Ang mga parameter sa Michaelis-Menten kinetic alang sa reaksyon nga CK2 gipiho sa ilalum sa empirikal nga gipasabut nga mga linya sa mga kondisyon nga padayon. Kini nga mga reaksyon gihimo alang sa 15 min sa usa ka gidaghanon sa 10 μl nga adunay 2 ng / μl enzyme, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [γ-32P] ATP, ug N-His (6) concentrFosB nga konsentrasyon gikan sa 2.5 – 30 μm. Ang tanan nga mga reaksyon gihimo sa 30 ° C sa usa ka kaligoanan sa tubig. Pagkahuman sa SDS-PAGE ug pagdaot sa gel uban ang Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad), ang gel nalaya, ug 32Ang paglakip sa P-phosphate gisusi sa pagsusi sa phosphorimaging (tan-awa sa ubos, Pag-ihap sa datos, pagkalkula, ug istatistika).
Duha ka dimensional nga posporo nga pospepteptide ug pagtuki sa phosphoamino acid.
Ang duha sa kini nga mga pagtuki gihimo sama sa gihulagway sa Ploegh ug Dunn (2000). Sa mubo, uga nga mga fragment gel nga adunay sulod 32May marka nga P-may ngalan nga ΔFosB (gikan sa sa vitro mga reaksyon o gikan sa mga immunoprecipitates sa mga selula nga may marka nga metaboliko), gipaukyab, gibag-o, nahugasan, ug gipaubos sa tryptic digestion. Ang supernatant nga naglangkob sa mga produkto sa pagtunaw sa tryptic mao ang lyophilized ug ang lyophilate nahugasan sa daghang mga higayon ug gibalhin sa 10 μl sa electrophoresis buffer, pH 1.9. Ang sample (3 μl) nakit-an sa usa ka cellulose manipis nga layer nga chromatography (TLC) plate (Analtech, Newark, DE) ug gibulag sa usa ka sukod pinaagi sa electrophoresis ug uban pang dimensyon pinaagi sa pagsaka sa TLC. Ang sangputanan nga mga mapa sa phosphopeptide nakita pinaagi sa autoradiography ug phosphorimaging. Alang sa pagsusi sa phosphoamino acid, ang 2 μl sa mga tryptic digest nga na-resuspended sa electrophoresis buffer dugang nga nahilayo sa HCl hydrolysis sa 105 ° C alang sa 25 min sa 3 m HCl sa ilalum sa usa ka N2 atmospera. Ang reaksyon gihunong pinaagi sa usa ka unom ka pilo nga pagsabwag sa tubig, ug ang sagol nga nalusno. Ang lyophilate gisubli usab sa 5 l sa electrophoresis buffer, pH 1.9, ug nakita ang usa ka cellulose TLC plate uban ang phospho-Ser, -Thr, ug -Tyr nga mga sukdanan. Gihimo ang electrophoresis nga sobra sa usa ka katunga sa gitas-on sa plato TLC nga gigamit ang electroforesis buffer, pH 1.9, ug dayon ang plato gibalhin sa pH 3.5 buffer, ug ang electrophoresis gihimo aron mahuman. Ang mga pamatasan sa phosphoamino acid nakita pinaagi sa pagsabwag sa plato TLC nga adunay 1% (v / v) nga siyamnapulo nga solusyon sa acetone, ug ang 32Ang mga p-nga may sulud nga amino acid nga mga sample gipakita sa autoradiography ug phosphorimaging.
gipugos sa siRNA nga CK2α pagtuktok.
Gigamit namon ang usa ka paagi sa pagsamok sa RNA aron pilion nga ituktok ang lebel sa CK2 (Di Maira et al., 2005). Ang mga selula sa PC12 gipugas sa collagen I-coated coated nga unom nga mga plato aron maabot ang ∼70-80% pagkalumpag sa sunod nga adlaw, sa diha nga sila nagbalhinbalhin sa 20 nm (katapusang konsentrasyon) sa bisan unsang wala’y sapaw nga siRNA o siRNA nga gitumong padulong sa mRNA sa catalytic Ang mga subunit sa Rat CK2, nga gigamit ang 5 μl sa ahente sa pagbalhin nga SilentFectin (Bio-Rad) ug pagsunod sa mga panudlo sa tiggama. Gibana-bana nga 24 h sa ulahi, ang mga selyula kanunay nga gibalhin sa transfFosB plasmid, ingon sa gipahayag sa ibabaw. Gibana-bana nga 24 h sa ulahi (∼48 h pagkahuman sa pagbalhin sa siRNA), ang mga selula gipailalom sa bisan kinsa 32P metabolic label o pag-analisa sa pulse-chase sama sa gihulagway sa ibabaw. Ang mosunud sa upat nga mga CK2α siRNAs gigamit nga adunay parehas nga mga resulta: 5′P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ′, 5′P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3 ′, 5′P-UAGUCAUAUAAAUUUMUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAIU Ingon usa ka negatibo nga pagpugong, gigamit namon Silencer negatibo nga pagpugong sa #3 siRNA gikan sa Ambion (Austin, TX). Ang kasangkaron sa pagtuktok sa CK2 gisubay sa immunoblotting gamit ang usa ka anti-CK2 polyclonal antibody (katalogo # 06-873 gikan sa Upstate) sa tibuok gabii sa usa ka 1: 1000 nga pagsulud. Ang Tub-Tubulin gigamit ingon usa ka pagkontrol sa pagkarga ug nakit-an nga adunay usa ka monoclonal antibody (katalogo # 05-661 gikan sa Upstate) sa gabii sa usa ka 1: 20,000 pagsabwag.
Direkta nga site nga mutagenesis.
Ang pagbag-o sa Ser27 hangtod sa Ala o sa Asp natuman gamit ang usa ka Quick Change Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA) ug pagsunod sa mga panudlo sa tiggama. Aron ipakilala ang mga mutX nga Ser27 sa protina sa mouse nga ΔFosB, gigamit ang mga mosunud nga mutagenesis primer. Ser27 hangtod Ala: (baliktad nga primer) 5′GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 ′. Ser27 hangtod sa Asp (unahan sa unahan) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 ′. Ang mga mutated nga mga sukaranan lig-on, ug ang Ser27 codon gialicized.
Mga Bioinformatics.
Ang mga potensyal nga site sa phosphorylation ug kinases alang sa ΔFosB gipangita pinaagi sa pagsumite sa pagkasunud sa mouse nga protina sa mga espesyalista nga database lakip ang ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost et al., 2004), ug NetPhosK (Blom et al., 2004).
Pag-ihap sa datos, kalkulasyon, ug estadistika.
Ang kantidad sa protina nga naa sa PVDF o nitrocellulose membrane ang gisukat gamit ang usa ka Storm PhosphorImager ug ang kauban nga ImageQuant software (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). Sa kulturan sa selula ug utok nga pagpadagan sa mga pagtuon sa phosphorylation, ang mga kantidad nga nakuha alang sa 32Ang protina nga may marka nga P-unya gibahin sa mga kantidad nga nakuha alang sa kinatibuk-ang ΔFosB, ug gipahayag ingon usa ka ratio. Sa sa vitro Mga pagtuon sa phosphorylation, ang kantidad sa 32Ang p-label nga ΔFosB matag taling sa ΔFosB (stoichiometry) gikalkulo ingon gihubit kaniadto (Sahin et al., 2004). Ang tanan nga mga sukod gikuha sa sulud sa linya sa linya sa instrumento nga gigamit. Ang mga kinetic nga mga parameter gibanabana gamit ang modelo nga Michaelis-Menten, kung diin V = VMax[S] / ([S]+KM) ug VMax = k2[Etotal]. Ang katunga sa kinabuhi (t1/2) sa ΔFosB ug FosB gibanabana gikan sa mga pulso-chase plots (gamit ang nonlinear regression nga labing angay sa mga punto sa datos) ug katumbas sa oras kung diin ang kantidad sa nahabilin nga protina mao ang 50% sa orihinal. Sa tanan nga mga numero, ang mga resulta nga gipakita mao ang representante sa labing menos duha hangtod tulo nga independente nga mga eksperimento. Sa tanan nga mga grapiko, ang datos nga gipakita gipakita usa ka average nga SEM SEM (3 ≤ n ≤16). Ang estatistika nga hinungdan sa mga kalainan gitimbang-timbang sa paggamit sa usa ka wala bayad t pagsulay, gitul-id alang sa daghang mga pagtandi, ug gipaila ang mga asterisk p ≤ 0.05.
Nahiuna nga SeksyonSunod nga Seksyon
Resulta
Ang ΔFosB usa ka hinungdanon nga transaksyon nga hinungdan
Bisan kung nahunahuna na naton kaniadto nga ang ΔFosB usa ka medyo lig-on nga transkripsyon nga hinungdan (Nestler et al., 2001), usa ka direkta nga pagsusi sa profile sa turnover sa protina wala pa nahuman karon. Aron masulbad kini nga pangutana, nagpahigayon kami og mga eksperimento sa pulso nga gigamit ang mga cell sa PC12, nga daghang gigamit ingon usa ka linya sa selula sa neuron, diin ang ΔFosB kanunay nga gipahayag pinaagi sa impeksyon sa usa ka recombinant herpes simplex virus (HSV-ΔFosB). Ang bag-ong gipintalan nga mga protina gitambal nga metaboliko 35S-Met / Cys, ug ang sumbanan sa pagkadaot sa 35S-may marka nga ΔFosB (35Ang S-ΔFosB) nabantayan pinaagi sa immunoprecipitating niini gikan sa mga cell lysates nga nakuha sa lainlaing mga oras sa oras human makuha ang radiolabeled amino acid. Ang pag-analisar sa mga immunoprecipitates sa SDS-PAGE ug autoradiography nagpadayag nga ang katunga sa kinabuhi sa ΔFosB sa mga PC12 cells mao ang ∼10 h (Fig. 1). Gipakita niini nga mga nahibal-an nga ang katunga sa kinabuhi sa ΔFosB mas taas kaysa sa kadaghanan sa dili mahibal-an nga mga hinungdan sa transkripsyon (tan-awa ang Panaghisgot), lakip na ang tibuuk nga kinabuhi sa FosB, kansang katunga sa kinabuhi sa kultura sa selyo ang gikataho nga ∼90 min (Dobrazanski et al., 1991; Carle et al. 2004). Gawas pa, angay nga matikdan nga ang pagkadaut sa ΔFosB dili mahiangay sa usa ka first degree degree exponential curve curve, apan sa baylo kini biphasic, nga nagsugod sa usa ka hinay nga pagkadaut sa rate. Kini nagsugyot sa paglungtad labaw pa sa usa ka species sa ΔFosB ug / o labaw pa sa usa ka agianan sa pagpakaubos.
Daghang bersyon:
Figure 1.
Ang ΔFosB usa ka hinungdanon nga transaksyon nga hinungdan. Ang katunga sa kinabuhi sa ΔFosB mao ang ∼10 h sa cell culture. Ang ΔFosB gipahayag sa mga PC12 cells pinaagi sa bisan unsang impeksyon sa HSV-ΔFosB o pagbalhin nga pagbalhin sa us aka ΔFosB nga adunay plasmid, ug ang mga selyula gipailalom sa mga eksperimento sa pulso-chase sama sa gihulagway sa Mga Materyal ug Mga pamaagi. Ang managsama nga mga resulta nakuha bisan unsa pa ang pamaagi nga gigamit sa sobrang pag-overpress sa ΔFosB. Gipakita sa numero ang kurso sa oras (ug representante nga autoradiogram) sa pagkawagtang sa ΔFosB. Ang datos nga gilaraw mao ang average nga ± SEM nga labing menus sa 15 mga indibidwal nga puntos sa datos nga nakuha gikan sa labing menos lima nga mga independyenteng eksperimento. Alang sa pagtandi, ang gitaho nga tunga nga kinabuhi sa tibuuk nga FosB gipakita.
Ang ΔFosB usa ka phosphoprotein sa utok
Gisabut namon nga ang pagbag-o sa posttranslational nga pag-usab sa ΔFosB mahimong makatabang sa dayag nga kalig-on. Tungod kay gipakita ang phosphorylation aron mabag-o ang kalihokan sa mga hinungdan sa transkrip sa daghang mga paagi, lakip ang ilang kalig-on (alang sa pagsusi, tan-awa Desterro et al., 2000; Ang Whitmarsh ug Davis, 2000), gisusi namon kung ang ΔFosB usa ka phosphoprotein. Niini nga katuyoan, ang ekspresyon sa ΔFosB naaghat sa utok sa ilaga nga gigamit ang chronic ECS, usa ka pagtambal nga nailhan aron mapukaw ang taas nga lebel sa ΔFosB, labi na sa frontal cortex (Paglaum et al., 1994a). Usa ka adlaw pagkahuman sa katapusan nga pagtambal sa ECS, kung ang mga lebel sa ΔFosB nagpabilin nga taas, nipis nga mga frontal cortical nga mga hiwa giandam ug gitagalan sa metaboliko nga 32P-orthophosphate. Ang usa ka managsama nga hugpong sa mga hiwa wala ma-radiolabel, ug kini gigamit aron mahibal-an ang kinatibuk-ang lebel sa ΔFosB. Pagkahuman sa immunoprecipitation nga adunay piho nga anti-FosB / ΔFosB nga antibody ug pagbulag sa mga protina nga immunoprecipitated pinaagi sa SDS-PAGE, phosphorylated 32Ang P-may label nga ΔFosB nakit-an sa autoradiography, samtang ang kinatibuk-ang wasFosB nakita pinaagi sa immunoblotting. Kini nga pag-analisar nagpadayag nga ang ΔFosB gi-phosphorylate sa utok, ingon nga gipamatud-an sa usa ka piho nga 32P-may label nga band sa ∼35 kDa nga naa sa kanunay nga giatiman nga mga sampol sa utok, apan halos dili mapakali sa mga gipamugalan nga sham-treated (Fig. 2A). Kini nahiuyon sa kamatuoran nga, sa pagkawala sa laygay nga pagpukaw, basal nga lebel sa ΔFosB ubos kaayo. Ang piho nga reaksyon sa immunoprecipitation nga reaksyon gihulagway sa kakulang sa signal sa dili pag-uswag nga nonimmune IgG.
Daghang bersyon:
Figure 2.
Ang ΔFosB usa ka phosphoprotein sa utok. A, Ang ΔFosB gi-phosphorylate sa utok. Ang endogenous ΔFosB naaghat sa utok sa ilaga pinaagi sa laygay nga pagtambal sa ECS sama sa gihulagway sa Mga Materyal ug Mga pamaagi. Ang frontal cortical nga mga hiwa gitagalan sa metaboliko 32PH3PO4 sa daghang oras. Pagkahuman sa homogenization sa mga hiwa, ang ΔFosB wala mabag-o, ug ang phosphorylated ΔFosB (32Ang P-ΔFosB) nakit-an sa autoradiography (top panel). Ang kinatibuk-ang ΔFosB sa nonradioactive immunoprecipitates nakit-an sa immunoblotting (ubos nga panel). Ingon negatibo nga pagpugong, gipakita ang immunoprecipitate sa usa ka sham-treated nga hayop ug nonimmune IgG. B, Ang mga site nga posporo ug phosphatelation sa mga kandidato nga adunay katugbang nga mga marka sa panagna alang sa mouse sequenceFosB nga pagkasunud sa protina nakuha pinaagi sa pag-analisar sa bioinformatic. Ang mga site sa kandidato nga adunay mas taas nga marka sa tagna gipasiugda sa pagkasunud sa protina ug gilista sa lamesa. Ang domain-binding (basic) domain ug leucine siper nangahas sa sunud-sunod nga protina. C, D, ΔFosB nga phosphorylation gipataas sa Ser / Thr nga phosphatase inhibitor OA. C, 32Ang lebel sa P-ΔFosB sa immunoprecipitates gikan sa mga uniporme sa cortical nga mga hiwa nga gimarkahan sa wala (Ctr) o presensya sa 100 ng / ml OA (grap ug top panel) nakita sa autoradiography. Gipakita sa ilalum sa panel ang total nga ΔFosB nga nakit-an sa mga immunoprecipitates gikan sa mga dili hiwa nga hiwa pinaagi sa immunoblotting. D, Ang mga selula sa PC12 gi-impeksyon sa HSV-ΔFosB o HSV-LacZ (vector) ug adunay sulud nga label nga 32PH3PO4 sa wala (Ctr) o presensya sa 100 ng / ml OA. 32Ang lebel sa P-ΔFosB sa immunoprecipitates nakit-an sa autoradiography (grap, top panel). Gipakita sa ilalum sa panel ang total nga ΔFosB nga nakit-an sa mga cell lysate pinaagi sa immunoblotting.
Ingon usa ka una nga lakang padulong sa pagwagtang nga mga (mga) kinase ug site (s) nga nahilambigit sa ΔFosB nga phosphorylation, gisakop namon ang pagkasunud sa amino acid sa pila ka mga pagtuki sa bioinformatic. Gipadayag kini nga, bisan kung ang ΔFosB wala’y mga site nga kandidato sa posporo nga Tyr, adunay sulud kini daghang mga site nga Ser / Thr kinase consensus, lakip ang tulo nga mga site nga CaMKII, tulo nga mga site nga CK2, ug duha ka mga site sa PKC nga adunay taas nga mga tagna sa posibilidad nga posporasyon (Fig. 2B). Kung, ingon nga gitagna pinaagi sa bioinformatics, ang ΔFosB usa ka phosphorylated lamang sa mga residue sa Ser o Thr, nan ang phosphorylation niini kinahanglan nga mahinayon pinaagi sa kalihokan sa Ser / Thr phosphatases. Aron masulayan kini nga hipotesis, gipirmahan namon ang mga prutas nga cortical frontal 32P-orthophosphate sa presensya o pagkawala sa OA, usa ka inhibitor nga phosphatase nga Ser / Thr protein. Ingon sa gipakita sa Figure 2C, Ang OA hinungdan sa usa ka dako (∼2.5-pilo) nga pagdugang 32P-ΔFosB. Nagpahinabo usab kini usa ka gamay nga pagtaas sa kinatibuk-ang lebel sa ΔFosB, nga nahiuyon sa mga naunang mga taho nga nagsumpay sa mga epekto sa carcinogenic sa OA sa katakus nga mapukaw ang pipila ka dali nga mga una nga gen lakip na ang mga Fos proteinMiller et al., 1998; Choe et al., 2004). Ang sangputanan sa pukot usa ka mahinungdanon nga us aka kinatibuk-ang pagtaas (∼60%) sa lebel sa phosphorylated ΔFosB.
Gisusi namon dayon kung, sa mga selula sa PC12, nga labi ka masaligan sa pagmaniobra sa eksperimento, ang ΔFosB nagpakita usa ka pattern sa phosphorylation nga susama sa nakita sa utok. Gipahayag namon ang ΔFosB sa mga selula sa PC12 pinaagi sa impeksyon uban ang HSV-ΔFosB ug gitagalan sa label nga mga selula nga 32P-orthophosphate sa presensya o pagkawala sa OA. Ang malampuson nga pagpahayag ug immunoprecipitation sa protina gikan sa mga selula nga nataptan sa HSV-ΔFosB gipakita pinaagi sa presensya nga pareho sa immunoblot (Fig. 2D, sa ubos nga panel) ug ang autoradiograph (top panel) sa usa ka ∼35 kDa band, wala sa mga cell nga nataptan sa vector. Ingon sa naobserbahan sa utok, ang OA hinungdan sa gamay nga pagtaas sa tibuuk nga lebel sa ΔFosB apan labi ka taas (gibana-bana nga duha ka pilo) nga pagtaas 32P-ΔFosB, nga miresulta sa usa ka mahinungdanon (∼50%) net nga pagtaas sa ΔFosB phosphorylation. Dugang pa, subay sa mga panagna sa bioinformatic, ang pagtambal sa mga PC12 cells nga adunay usa ka Tyr phosphatase inhibitor wala moresulta sa daghang mga pagbag-o sa 32Mga lebel sa P-ΔFosB (datos nga wala gipakita). Naghiusa, ang mga nahibal-an nga nahibal-an nga gipadayag nga ang ΔFosB nga posporo sa Ser ug / o Thr residues sa utok ug sa mga PC12 nga mga selula ug nakumpirma ang ulahi nga usa ka maayo nga sistema sa kultura sa cell diin dugang nga tun-an ang mga phosphorylation ug degradation profiles sa ΔFosB.
Ang CK2 apan dili PKC o CaMKII nga mga phosphory template ΔFosB sa vitro
Ingon sa gihisgutan sa ibabaw, ang pag-analisar sa ΔFosB amino acid sunod nga gipadayag ang mga tag-as nga marka sa tagna alang sa mga CK2, PKC, ug CaMKII phosphorylation sites. Aron mahibal-an kung kinsa sa mga kinases ang mahimo nga phosphorylate ΔFosB, nagpahigayon kami usa ka serye sa sa vitro Ang reaksyon sa phosphorylation nga gigamit ang purified kinases ug giputli nga recombinant ΔFosB. Ingon sa gipakita sa Figure 3A, sa tulo nga kandidato kinases, ang CK2 nga phosphorylated ΔFosB lamang sa usa ka makahuluganon nga paagi. Gawas pa, daghang ubang mga kinases ang gisulayan (pananglitan, GSK3 ug p70S6K) apan napakyas sa mahinungdanon nga phosphorylate ΔFosB (wala gipakita ang datos). Ang dugang nga pagpaila sa reaksyon sa CK2 pinaagi sa pag-analisar sa kurso sa oras nagpadayag nga kini nga kinase mahimong makapalihok sa paglakip sa ∼0.5 mol sa phosphate matag taling sa ΔFosB (Fig. 3B). Ang kamatuoran nga ang CK2 mahimo nga phosphorylate ΔFosB sa vitro sa usa ka daghang stoichiometry (∼50%) mao ang hinungdan sa reaksyon nga adunay kalabutan sa physiologically. Gitun-an dayon namon ang mga kinetiko sa kini nga reaksyon pinaagi sa pagpadako sa CK2 sa presensya sa pagdugang nga kantidad nga naputli nga ΔFosB, ug gipiho namon nga ang CK2 phosphory template latesFosB adunay usa ka VMax sa 5.8 pmol · min-1 · Μg-1 sa enzyme, a KM sa 18.4 μm, ug a kIring sa 0.2 / s (Fig. 3C). Ang mga kantidad nga nakuha alang sa mga kinetic nga mga parameter dugang nga nagsuporta sa kalabutan sa physiological sa kini nga reaksyon. Pananglitan, ang KM sa CK2 alang sa DARPP32, usa sa labing nailhan nga substrates, mao ang 3.4 μm, ug ang kIring mao ang ∼0.3 / s (Girault et al., 1989); ang KM alang sa ATP gikan sa ∼10-40 μm (Cochet et al., 1983; Silva-Neto et al., 2002), ug kana alang sa casein gikan sa ∼10-50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin et al., 1987). Sa tingub, kini nga mga datos nagpaila nga ang ΔFosB usa ka bona fide substrate alang sa CK2 sa vitro.
Daghang bersyon:
Figure 3.
Ang CK2 apan dili PKC o CaMKII nga mga phosphory template ΔFosB sa vitro. Gipakita sa autoradiograph (top panel) ang produkto nga phosphorylated, ug ang gel nga adunay sulud sa Coomassie (ubos nga panel) nagpakita sa total nga ΔFosB nga naa sa reaksyon. A, Giputli nga recombinant ΔFosB gisakup sa sa vitro Ang phosphorylation sa lainlaing mga kinases sa kandidato (tulo nga gipakita). B, Ang kurso sa oras ug pag-analisar sa stoichiometric nagpaila nga ang CK2 mahimo nga phosphorylate ΔFosB sa vitro nga adunay usa ka stoichiometry sa ∼50%. C, Kinetic nga pag-analisar sa reaksyon nga CK2 nga ang ΔFosB usa ka bona fide sa vitro substrate. Ang linearization sa reaksyon gipakita sa usa ka doble nga timaan sa timaan (sa ilawom), apan ang mga kinetic nga mga parameter nakuha gikan sa Michaelis-Menten curve (ibabaw).
Gipahiangay sa CK2 ang phosphorylation ug kalig-on sa ΔFosB sa mga buut nga selula
Aron mahibal-an ang kalabotan sa physiological sa CK2-mediated phosphorylation sa ΔFosB, gipahigayon namon ang pagtandi nga phosphopeptide mapping gamit ang sa vitro Ang phosphorylated ug PC12-cell-phosphorylated ΔFosB. Pagkahuman sa SDS-PAGE ug gel elution sa 32P-ΔFosB (gikan sa sa vitro reaksyon o gikan sa immunoprecipitate sa 32Ang mga selula nga may marka nga P), ang protina gisudlan og trypsin, ug ang mga sangputanan nga phosphopeptide gipailalom sa pagbulag sa duha nga dimensional. Kini nga pag-analisar nagpadayag nga ang panguna nga phosphopeptide gikan sa reaksyon nga CK2 mibalhin sa usa sa duha ka dagkong mga phosphopeptides gikan sa ΔFosB nga phosphorylated sa mga PC12 cells (Fig. 4A), samtang ang mga phosphopeptides nga naggikan sa PKC o CaMKII (wala gipakita ang datos) nga reaksyon wala. Adunay usa ka ikaduha nga ΔFosB phosphopeptide nga naa sa mapa gikan sa mga PC12 nga mga selyula, apan tungod sa pagkadili katakus sa bisan unsang mga kinase nga nasulayan namon aron makamugna ang usa ka susama nga phosphopeptide sa vitro, wala kami karon nahibal-an kung kini nga ikaduha nga pospepteptide naglangkob sa usa ka site nga phosphorylation nga lahi sa uban nga phosphopeptide o kung kini nagrepresentar sa usa ka lahi nga tryptic peptide nga adunay parehas nga site nga phosphorylation.
Daghang bersyon:
Figure 4.
Gipahiangay sa CK2 ang phosphorylation ug kalig-on sa ΔFosB sa mga buut nga selula. A, Ang CK2 apan dili ang PKC ingon og phosphorylate ΔFosB sa mga selyula. Duha ka dimensional nga mga mapa nga phosphopeptide sa ΔFosB nga phosphorylated ni CK2 o PKC sa vitro o pinaagi sa mga bug-os nga PC12 cells. Gipakita sa mga udyong ang paglihok sa CK2-phosphorylated peptide apan dili ang PKC-phosphorylated nga adunay usa sa mga ΔFosB nga phosphopeptides nga nakuha gikan sa mga PC12 cells. B, Ang phosphFosB nga phosphorylation sa mga PC12 cells gipataas pinaagi sa pagtratar sa mga selula nga adunay potensyang CK2 activator spermine (SP) ug mikunhod sa pagtambal kauban ang CK2 inhibitor DRB. Sa kasukwahi, ang ΔFosB nga phosphorylation sa mga PC12 cells dili apektado sa pagtambal bisan sa usa ka aktibo nga PKC (PMA) o PKC nga piho nga inhibitor nga calphostin-C (Calph). Gipakita ang usa ka representante nga autoradiogram (top panel) ug immunoblot (sa ubos nga panel). C-F, Epekto sa kalihokan nga CK2 sa kalig-on sa ΔFosB. Gipakita sa mga numero ang kurso sa oras (ug representante nga autoradiogram) sa pagkadaut sa ΔFosB. Ang mga PC12 cells nga kanunay nga nagpahayag sa ΔFosB gipailalom sa mga eksperimento sa pulso-chase nga gihimo sa wala o presensya sa CK2 inhibitor DRB (C), ang CK2 activer spermine (D), o ang halapad nga spectrum kinase nga inhibitor H-8 (E), nga gigamit aron makontrol alang sa mga dili maayong epekto sa DRB. F, Epekto sa pagpukan sa catalytic subunit sa CK2 sa kalig-on sa ΔFosB. Ang mga selula sa PC12 gibalhin sa bisan unsang nontargeting siRNA (Ctr) o siRNA nga target sa mga rat nga CK2α ug 24 h sa ulahi gibalhin sa usa ka ΔFosB plasmid. Ang top panel naghulagway sa mga immunoblots nga bug-os nga cell lysate nga nagpakita sa epekto sa CK2 siRNA sa lebel sa CK2 ug ΔFosB. Ang katumbas nga immunoblot alang sa β-tubulin gipakita ingon usa ka pagkontrol sa pagkarga.
Aron mapadayon ang pagtubag sa kalabutan sa physiological sa CK2 ingon usa ka ΔFosB kinase, gitagad namon ang ΔFosB nga nagpahayag sa mga selula sa PC12 nga adunay duha nga mga tambal nga nagbag-o sa kalihokan nga CK2. Ingon sa gipakita sa Figure 4B, ΔFosB nga phosphorylation nga pagkunhod sa pagtambal sa mga PC12 cells nga adunay cell-permeable CK2 inhibitor DRB (Meggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995), ug gidugangan pinaagi sa pagtambal kauban ang polyamine spermine, nga nailhan nga usa ka kusog nga CK2 activator (Cochet ug Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983). Sa kasukwahi, ang pagtambal sa mga cell PC12 nga adunay PKC inhibitor calphostin-C (Kobayashi et al., 1989; Tamaoki et al., 1990) o ang PKC activator PMA (Schmidt ug Hecker, 1975; Beh et al., 1989) wala miresulta sa hinungdan nga mga pagbag-o sa phosphFosB nga phosphorylation. Sa kaso sa PMA, ang gamay (ug dili mahinungdanon) pagtaas sa 32Ang P-ΔFosB mahimo’g maisip sa pagdugang sa tibuuk nga lebel sa ΔFosB hinungdan sa kini nga tambal; sa tinuud, gikataho nga ang phorbol esters nagpahulag sa pagpahayag sa daghang mga protina sa pamilya Fos, lakip ang FosB (Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). Dugang pa, pagtambal sa mga selyula nga adunay piho nga cell-permeable CaMKII inhibitor m-AIP (Ishida ug Fujisawa, 1995; Stevens et al., 1999) wala usab miresulta sa pagkunhod sa ΔFosB nga phosphorylation (wala gipakita ang datos). Mag-uban, kini nga mga sangputanan nahiuyon sa among sa vitro mga nakit-an ug gipakita nga sa mga buut nga selula ang ΔFosB lagmit nga gipasiugdahan sa CK2 apan dili PKC o CaMKII. Ang kamatuoran nga ang pagpugong sa CK2 dili hingpit nga mapugngan ang ΔFosB nga phosphorylation nagpaila sa paglungtad sa mga dugang nga site nga phosphorylation sa protina.
Sunod namon nga gisusi kung ang CK2 adunay papel sa turnover sa ΔFosB ug sa ingon sa kalig-on niini. Niini nga katuyoan, nagpahigayon kami og mga eksperimento sa pulso gamit ang ΔFosB-pagpahayag sa mga PC12 nga mga selula nga gitambalan sa bisan usa nga tigdakup sa CK2 o ang pagpaandar sa CK2 nga gigamit sa pagtuon nga phosphorylation. Ingon sa gipakita sa Figure 4C, pagtambal sa mga selyula nga adunay CK2 inhibitor DRB adunay usa ka hinungdanon nga epekto sa rate sa turnover sa ΔFosB, nga napamatud-an sa pagbag-o sa dagway sa degradation curve, gikan sa biphasic ngadto sa usa ka kurba nga hapit sa kana sa usa ka exponential decay. Sa kabaliskaran, ang presensya sa CK2 activer spermine hinungdan sa usa ka hinungdan nga pagkunhod sa pagkadaot sa rate sa ΔFosB, nga hinungdan sa pagtipon sa protina sa mga unang oras sa paghabol (Fig. 4D).
Sama sa kaso sa daghang mga kinase activator ug inhibitor, ang spermine ug DRB mahimo’g adunay mga epekto sa metaboliko gawas sa pag-usab sa kalihokan nga CK2. Sa tinuud, gipakita ang DRB nga likayan ang transkripsyon nga IIH (TFIIH) -associated kinase (Yankulov et al., 1995), nga nagresulta sa pagdili sa RNA polymerase II-mediated transkripsyon. Tungod kay kini nga epekto mahimo’g makaapekto sa kalig-on sa ΔFosB, among gisusi ang epekto sa halapad nga spectrum kinase inhibitor H-8 (Hidaka ug Kobayashi, 1992) sa ΔFosB turnover sa usa ka konsentrasyon (200 μm) nga nahibal-an nga makapugong sa TFIIH nga may kalabutan sa kinase apan dili CK2 (Yankulov et al., 1995). Sama sa gipakita sa Figure 4E, ang pagtambal sa H-8 wala makaapekto sa rate sa pag-usab sa ΔFosB. Ang parehas nga mga resulta nakuha sa H-7, lain nga lapad nga spectrum kinase inhibitor, nga gigamit sa usa ka konsentrasyon nga nagpugong sa kinase nga may kalabutan sa TFIIH apan dili CK2 (ang datos wala gipakita). Kini nga mga datus dugang nga nagsuporta sa paghubad nga ang pagkunhod sa kalig-on sa ΔFosB nga gipahinabo sa DRB lagmit nga gipahinungod sa pagdili sa CK2.
Aron mas mapadayon ang papel sa CK2 sa ΔFosB turnover, gisusi namon ang mga sangputanan sa pagpukan sa CK2 pinaagi sa siRNA. Gihimo namon kini nga mga eksperimento gamit ang mga PC12 cells nga una nga gibalhin nga adunay control (nontargeting) siRNA o usa ka siRNA nga target sa mRNA sa catalytic subunit sa rat CK2 (CK2α) ug 24 h sa ulahi gibalhin sa ΔFosB. Ingon sa gipakita sa Figure 4F, pagbalhin sa CK2α siRNA nga hapsay ug piho nga gipukan ang lebel sa protina nga CK2α nga wala makaapekto sa lebel sa ΔFosB (top panel). Ang pag-analisa sa pulso nagpadayag nga ang pagpukan sa CK2 miresulta sa usa ka hinungdan nga pagtaas sa rate sa turnover sa turnFosB ingon nga napamatud-an sa labing kusog nga pagkubkob sa protina. Ang kamatuoran nga ang pag-undang sa kalihokan nga CK2 (bisan pinaagi sa pagtambal sa DRB o siRNA) nagdugang sa pag-usab sa ΔFosB ug miresulta sa pagkawagtang sa hinay nga rate sa bahin sa biphasic curve, samtang ang pagpaaktibo sa CK2 nagpalambo sa hinay nga bahin sa kurba, naghatag lig-on nga suporta alang sa ang ideya nga ang CK2 adunay papel sa pag-regulate sa ΔFosB nga kalig-on.
Ang CK2 nga mga phosphory template ΔFosB sa Ser27
Aron masugdan ang pag-ila sa mga (mga) site sa ΔFosB nga phosphorylated ni CK2, gipahigayon namon ang phospho-amino acid nga pagsusi sa recombinant ΔFosB nga phosphorylated ni CK2 sa vitro ug ΔFosB nga phosphorylated sa mga PC12 cells. Kini nga mga eksperimento nagpadayag nga, sa parehong mga kaso, ang bugtong phospho-amino acid nga nakita mao ang phospho-Ser (Fig. 5A). Kini nga pagpangita, kauban ang stoichiometry nga nakuha alang sa CK2 sa vitro reaksyon sa phosphorylation (∼50%) (Fig. 3B) ug ang presensya sa usa ra ka makahuluganon nga lugar sa mapa nga phosphopeptide sa CK2 (Fig. 4A), nagsugyot nga ang CK2 nga phosphorylation sa ΔFosB lagmit nga limitado sa usa ka nahabilin nga serine. Kini nga konklusyon nahiuyon sa pagsusi sa site sa phosphorylation consensus (Fig. 2B), nga gitagna lamang ang usa ka kandidato nga serine, ie, Ser27, alang sa CK2. Ang pag-analisar sa taxonomic nagpadayag nga ang Ser27 hingpit nga gitipig pinaagi sa ebolusyon taliwala sa mga miyembro sa pamilya nga Fos (Fig. 5B), nagsugyot nga mahimo’g magdala kini usa ka hinungdanon nga function sa physiological.
Daghang bersyon:
Figure 5.
Ang CK2 Phosphory template ΔFosB sa Ser27. A, Phrophoamino acid pagtuki sa CK2-phosphorylated (sa vitro) ug PC12 cell-phosphorylated ΔFosB nga nagpakita nga, sa parehas nga kaso, ang kadaghanan nga nahabilin nga phosphorylated mao ang serine. B, Ang pag-analisar sa cross-species sa FosB / ΔFosB amino acid sunod nga gipadayag ang taas nga pagkonserba sa Ser27 taliwala sa mga sakop sa pamilya nga Fos gikan sa tawo hangtod sa zebrafish (itum nga pagkatagbaw). Bisan pa, ang asido nga nahabilin sa posisyon + 3, nga gikinahanglan alang sa site nga CK2 consensus, dili gitipig (light highlight). C, Ang mga selula sa HeLa nga kanunay nga gibalhin sa bisan unsang wild-type ΔFosB (WT) o ΔFosB nga adunay usa ka punto mutation aron mapulihan ang Ser27 sa Ala (S27A). Ang mga selula nga gisagol sa metaboliko 32PH3PO4 ug pagtratar sa sakyanan o uban ang spermine (SP) aron ma-aktibo ang CK2. Gipakita ang usa ka representante autoradiogram (top panel) ug immunoblot (ilawom nga panel) sa nakuha nga ΔFosB immunoprecipitates. Gipakita ang immunoprecipitate sa mga selula nga gibalhin nga pagbutangbutang (vector).
Aron mahibal-an kung ang Ser27 usa ka phosphorylated sa ΔFosB, gipahinumdom namon kini nga nahibilin sa Ala, ug gisusi ang mga sangputanan sa kahimtang sa phosphorylation sa protina. Niini nga katuyoan, gigamit namon ang mga selula sa HeLa (nga mahimong ibalhin nga adunay mas taas nga kaepektibo) aron ipadayon ang pagpahayag bisan WT o S27A mutant ΔFosB. Gibana-bana nga 24 h pagkahuman sa pagbalhin, ang mga selyula gisagol sa metaboliko 32Ang P-orthophosphate, ug bug-os nga cell lysate giandam. Pagkahuman sa immunoprecipitation ug SDS-PAGE, 32Ang P-ΔFosB nakit-an sa autoradiography ug total ΔFosB pinaagi sa immunoblotting. Ingon sa gipakita sa Figure 5C (sa ilawom nga panel), ang ΔFosB wala nakit-an sa mga selyula nga gibalhin sa vector, samtang ang mga selyula nga gibalhin sa WT o S27A mutant ΔFosB malampuson nga nagpahayag sa protina. Nahibal-an namon nga ang pagbalhin sa S27A hinungdan sa usa ka hinungdan (∼30%) nga pagkunhod sa 32Mga lebel sa P-ΔFosB (Fig. 5C, ibabaw nga panel ug grapiko), nagpaila nga sa mga buhi nga selyula, ang ΔFosB gi-phosphorylated sa Ser27. Sa paningkamot nga maestablisar kung ang mga selyula nga Ser27 tinuod nga gipasiugdahan sa CK2, gitandi namon ang abilidad sa CK2 activer spermine nga modulate ang phosphorylation sa WT ug S27A ΔFosB. Sama sa naobserbahan namon kaniadto sa mga PC12 cells (Fig. 4B), pagtambal sa mga selula sa HeLa nga adunay spermine kamahinungdanon nga nagdugang phosphorylation sa WT protina. Ang kamatuoran nga kini nga epekto grabe nga pagkunhod pinaagi sa S27A mutation (Fig. 5C) nagsuporta sa paghubad nga ang Ser27 sa ΔFosB usa ka pisyolohikal nga substrate alang sa CK2.
Ang Phosphorylation sa Ser27 nag-regulate sa kalig-on sa ΔFosB
Nahimong lig-on nga ang kalig-on sa ΔFosB mikunhod kung ang CK2 gipugong ug gipalambo kung ang CK2 gi-aktibo (Fig. 4), ug kana nga CK2 phosphory template latesFosB sa Ser27 (Fig. 5), gitagna namon nga ang pagpugong sa phosphorylation sa kini nga site kinahanglan nga makatag-an sa protina. Ang mga eksperimento sa pulso nga gihimo sa mga selula sa HeLa nga kanunay nga nagpahayag bisan ang WT o S27A mutant ΔFosB nagpadayag nga, ingon sa gitagna, ang pagbuut sa S27A miresulta sa usa ka mahinungdanon nga pagdugang sa rate sa pagpaubos sa ΔFosB, ug usa ka panagsama nga pagkunhod sa katunga sa kinabuhi sa protina (Fig. 6A). Gisusi namon dayon kung ang kini nga mekanismo sa regulasyon nahitabo usab sa labi ka neuron-like nga PC12 cell line. Ang kini nga mga eksperimento nagpadayag nga, ingon sa atong nakita sa mga selula sa HeLa, ang S27A point mutation hinungdan sa usa ka mahinungdanong pagkunhod sa katunga sa kinabuhi sa ΔFosB sa mga PC12 cells (gikan sa ∼11 hangtod sa ∼4 h) (Fig. 6B). Ang kamatuoran nga kini nga pagpaayo sa kaamgid parehas sa hinungdan sa pagpugong o pagtuktok sa CK2 (Fig. 4) naghatag dugang nga suporta alang sa ideya nga ang CK2-mediated phosphorylation sa Ser27 nag-regulate sa kalig-on sa ΔFosB. Ang dugang nga ebidensya alang sa papel sa regulasyon sa Ser27 phosphorylation sa ΔFosB protein turnover nakuha pinaagi sa usa ka phosphomimetic Ser27 hangtod sa Asp mutation (S27D). Ang S27D mutation giisip nga phosphomimetic, tungod kay gibutang niini ang usa ka dako nga negatibo nga gisuhol (carboxyl) nga grupo sa amino acid 27 ug sa ingon usa ka bahin nga nagsundog sa phosphorylation sa Ser27. Ingon sa gipakita sa Figure 6C, ang pagbalhin sa S27D hinungdan sa kaatbang nga epekto sa pagbalhin sa S27A ug miresulta sa usa ka protina nga labi ka lig-on kaysa protina WT. Susama sa epekto nga nakuha human sa pagpaaktibo sa CK2 (Fig. 4D), ang S27D mutation nagresulta sa pagtipon ug sa ingon nadugangan ang lebel sa ΔFosB sa mga unang oras sa paggukod.
Daghang bersyon:
Figure 6.
Ang Phosphorylation sa Ser27 nag-regulate sa kalig-on sa ΔFosB. A, C, Ang pagtuki sa Pulse-chase nga nagpakita sa epekto sa Ser27 phosphorylation sa rate sa turnover sa ΔFosB. Ang profile sa pagkadaut ug gibanabana nga tunga sa kinabuhi sa mga wild-type ΔFosB (WT), ang Ser27 sa Ala mutant (S27A), ug ang phosphomimetic Ser27 hangtod sa Asp mutant (S27D) gipakita. Ang parehas nga nahibal-an nakuha sa mga selula sa HeLa (A) ug mga cell PC12 (B, C).
Ang Ser27 phosphorylation nagpalig-on sa ΔFosB pinaagi sa pagpugong sa proteasomal nga pagkadaot
Aron masugdan ang pagpahawa sa mekanismo diin ang phosphorylation sa Ser27 nagpalig-on sa ΔFosB, gisusi namon ang katakus sa mga inhibitor sa proteasome nga MG132 (Palombella et al., 1994; Tsubuki et al., 1996) ug epoxomicin (Hanada et al., 1992; Kim et al., 1999) aron mabag-o ang kadaut sa rate sa WT ug S27A mutant ΔFosB. Gihimo ang mga eksperimento sa pulso gamit ang mga PC12 nga mga selula nga na-impeksyon sa usa ka recombinant HSV nga nagpahayag sa bisan WT o S27A ΔFosB ug gitambalan uban ang DMSO o usa sa duha nga mga proteasome inhibitors. Ang kini nga mga eksperimento nagpadayag nga bisan kung ang nakadaot nga rate sa protina sa WT medyo dili makatarunganon sa presensya sa duha sa mga inhibitor nga proteasome (Fig. 7A), nga ang mutant S27A sensitibo sa kini nga mga droga (Fig. 7B). Gipasabut niini nga, dili sama sa protina sa WT, ang S27A mutant usa ka target sa pagpaminus sa proteasomal. Sa tinuud, ang pagtambal sa mga selyula nga adunay bisan kinsa nga MG132 o epoxomicin hingpit nga gibalikbalik ang epekto sa mutation S27A sa degradation rate sa ΔFosB, napamatud-an sa pagdugang sa katunga sa kinabuhi sa mutok S27A gikan sa ∼4 hangtod sa ∼9 h alang sa MG132 ug sa ∼ 12 h alang sa epoxomicin (Fig. 7B). Sa tingub, kini nga mga nakit-an nga timailhan nagpakita nga ang phosphorylation sa ΔFosB sa Ser27 nanalipod sa protina gikan sa proteasomal nga pagkadaot ug busa hinungdanon alang sa dili kasagaran nga kalig-on niini.
Daghang bersyon:
Figure 7.
Ang Phosphorylation sa Ser27 nagpalig-on sa ΔFosB pinaagi sa pagpugong sa proteasomal nga pagkadaot. A, B, Ang pagsusi sa Pulse-chase sa mga cells nga PC12 nga nataptan sa HSV nga nagpakita sa profile sa pagkadaut ug gibanabana nga katunga sa kinabuhi sa wild-type ΔFosB (A) o S27A ΔFosB (B) sa wala o presensya sa bisan hain sa duha nga mga inhibitor nga proteasome [MG132 ug epoxomicin (Epoxo)]. Hinumdumi ang kamatuoran nga wala ang tambal nga adunay mahinungdanon nga epekto sa pag-usab sa wild-type nga ΔFosB, samtang ang pagtambal sa mga selyula nga adunay bisan usa ka inhibitor nga proteasome miresulta sa pag-ayo sa S27A ΔFosB. C, Usa ka modelo alang sa papel sa phosphorylation sa Ser27 sa abilidad sa ΔFosB nga magtaliwala sa dugay nga pagkahuman sa plastik nga utok. Sa higayon nga maaghat, usa ka bahin sa ΔFosB napalig-on sa utok pinaagi sa CK2-mediated phosphorylation sa S27. Nagresulta kini sa pagkolekta niini, nga sa baylo moresulta sa mga dumalayong mga pagbag-o sa pagpahayag sa gene. Kini nga mga lig-on nga pagbag-o sa ekspresyon sa gene nakatampo sa lig-on nga pagpahiangay sa pamatasan. Hinuon, ang pagkunhod sa S27 pinaagi sa Ser / Thr phosphatases PP1 ug / o ang PP2A moresulta sa pagkadestino sa protina ug pagproseso sa makinarya nga proteasomal.
Nahiuna nga SeksyonSunod nga Seksyon
Panaghisgutan
Sa karon nga pagtuon, gipakita namon nga ang ΔFosB adunay katunga sa kinabuhi nga ∼10 h sa kulturang cell, nga naghimo niini nga lig-on kumpara sa tibuuk nga FosB ug kadaghanan sa dili mahibal-an nga mga hinungdan sa transkripsyon, kansang katunga sa kinabuhi sa kultura sa selula mahimong ingon kadali ingon sa pipila ka mga minuto ug panagsa ra nga molabaw sa 3 h (Hann ug Eisenman, 1984; Dobrazanski et al., 1991; Roberts ug Whitelaw, 1999; Ferrara et al., 2003; Hirata et al., 2004). Dugang pa, nahibal-an namon nga ang ΔFosB nga phosphorylated sa utok ug nga ang phosphorylation sensitibo sa PP1 / PP2A inhibitor okadaic acid. Gipakita sa among mga pagtuon sa kultura sa cell nga ang kalig-on sa ΔFosB giusab sa CK2, nga adunay mas taas nga kalihokan nga CK2 nga nagpalig-on sa protina. Sa katapusan, gisugyot sa among mga nahibal-an nga ang CK2 phosphory template latesFosB sa usa ka labi nga gitipig nga N terminus serine (S27) ug gipakita nga ang phosphorylation sa S27 nanalipod sa ΔFosB gikan sa proteasomal nga pagkalaglag. Busa gisugyot namon ang usa ka modelo diin ang phosphorylation sa ΔFosB sa S27 ni CK2 usa ka kritikal nga mekanismo sa paghan-ay sa ofFosB (Fig. 7C). Ang ingon nga phosphorylation-mediated stabilization sa ΔFosB hinungdanon nga hinungdanon, tungod kay ang pagtaas sa lebel sa ΔFosB sa partikular nga mga rehiyon sa utok gipakita nga direkta nga regulate ang daghang mga genonal nga gen Sa vivo ug aron magamit ang mga epekto sa pamatasan sa mga modelo sa hayop sa daghang mga sakit sa neuropsychiatric (tan-awa ang Pasiuna).
Bisan kung ang phosphorylation usa ka paspas ug mabag-o nga paagi sa pag-regulate sa kalihokan sa transkripsyon sa pipila nga mga hinungdan sa transkrip, sama sa CREB (elemento sa tubag sa cAMP nga nagbugkos nga protina) (Bohmann, 1990), ang pag-usab sa pagkadaut sa mga hinungdan sa transkrip naghatag usa ka labi ka kusug (dili kaayo dali nga mabalik) nga porma sa regulasyon (Desterro et al., 2000). Ang mga hinungdan sa transkripsyon kansang kalihokan nga gigamit sa regulasyon sa lebel sa pagkadaut niini naglakip sa NFκB (Desterro et al., 2000), c-Myc (Sears et al., 1999), ug c-Fos (Ferrara et al., 2003), taliwala sa uban. Sa daghang mga higayon, ang phosphorylation usa ka hinungdan nga regulator sa kalig-on sa usa ka transkrip factor, ingon sa gipakita alang sa c-Fos (Okazaki ug Sagata, 1995; Tsurumi et al., 1995), Fos nga may kalabotan sa antigen-1 (Fra-1) (Vial ug Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe et al., 2001), c-Jun (Fuchs et al., 1996), JunB (Fuchs et al., 1997), ATF2 (Fuchs et al., 2000), ug p53 (Buschmann et al., 2001). Ang among mga pagtuon sa ingon nagdugang sa ΔFosB sa kini nga lista sa mga hinungdan sa transkripsyon nga ang kalihokan nga kalihokan nga gi-regulate pinaagi sa kalig-on nga nakadepende sa phosphorylated.
Ang CK2 usa ka sa tanan nga lugar ug kanunay naglihok nga Ser / Thr kinase nga adunay> 300 nga gituohang mga substrate nga naila hangtod karon ug naapil sa daghang proseso sa biyolohikal, lakip ang pagkamatay sa cell ug pagkabuhi (Litchfield, 2003; Unger et al., 2004), tubag sa stress sa cellular (Yanagawa et al., 1997; Kato et al., 2003), ug pag-ayo sa DNA ug pag-usab sa chromatin (Barz et al., 2003; Krohn et al., 2003). Labaw sa usa ka ikatulo nga bahin sa mga putative substrates nga CK2 ang mga protina nga nahilambigit sa regulasyon sa pagpahayag sa gene (Meggio ug Pinna, 2003). Sa tinuud, gipakita ang CK2 nga usa ka bantog nga nukleyar nga kinase (Krek et al., 1992) (alang sa pagsusi, tan-awa Yu et al., 2001) ug aron makigsulti sa mga bZIP nga mga domain sa daghang mga hinungdan sa transkrip (Yamaguchi et al., 1998). Gipakita usab ang CK2-mediated phosphorylation nga modulate sa pagkadaot (bisan sa pagpalambo o pagminus niini) sa daghang mga protina, lakip ang IkB (Schwarz et al., 1996), PTEN (Torres ug Pulido, 2001), lens connexin (Yin et al., 2000), protina nga may kalabutan sa chromatin HMG1 (Wisniewski et al., 1999), ug daghang mga hinungdan sa transkripsyon sama sa HMGB (Stemmer et al., 2002), Myf-5 (Tingtugnaw et al., 1997), ug c-Myc (Channavajhala ug Seldin, 2002). Ang CK2 labi ka daghan sa utok (Alcazar et al., 1988; Girault et al., 1990), ug ang kalihokan niini nahibal-an sa daghang mga aspeto sa function sa utok, lakip ang pagkaluwas sa neuronal (Boehning et al., 2003), pagkalahi (Nuthall et al., 2004), function sa channel sa ion (Si Jones ug Yakel, 2003; Ang Bildl et al., 2004), ug dugay nga potentiation ug neuronal plasticity (Diaz-Nido et al., 1992; Lieberman ug Mody, 1999; Reikhardt et al., 2003).
Bisan pa niining nagtubo nga ebidensya alang sa papel sa CK2 sa regulasyon sa function sa neuronal, gamay ang nahibal-an bahin sa kung unsa ang nagkontrol sa kalihokan niini. Ang CK2 giisip nga aktibo nga aktibo, nga adunay regulasyon sa katakos nga makahimo sa piho nga mga substrate nga nagsalig sa kadaghanan sa mga pagbag-o sa iyang intracellular localization (pananglitan, cytosol vs nucleus) (Si Ahmed ug Tawfic, 1994; Yu et al., 1999). Kini nga kasayuran nagpatunghag hinungdanon nga pangutana bahin sa kung unsang mga senyas ang gikinahanglan aron mapukaw ang pagtipon sa ΔFosB sa utak pagkahuman sa pagdasig (Fig. 7C). Usa ka kinahanglanon mao ang balikbalik nga pagpaaktibo sa fosB gene ug induction sa ΔFosB mRNA (Chen et al., 1995). Gipakita sa among datos nga ang CK2 phosphorylation sa ΔFosB kritikal alang sa kalig-on niini, nga nagsugyot nga ang usa ka ikaduha nga signal mahimong kinahanglanon alang sa mga dugay nga epekto sa ΔFosB sa expression sa gen, nga mao, usa ka senyas nga nagpukaw sa phosphorylation sa protina sa CK2. Mahimo nga maglakip kini sa pagpaaktibo sa CK2 pinaagi sa pipila nga wala mailhi nga mekanismo o ang paghubad niini sa nucleus. Sa laing paagi, ang CK2 nga phosphorylation sa ΔFosB mahimo nga konstitusyon, sama nga ang protein nga ΔFosB gihubad agig tubag sa matag stimulus, usa ka bahin sa kini makakuha og phosphorylated ug sa ingon napadayon, busa sa balik-balik nga stimulasyon nga kini natigum sa taas nga lebel sa apektadong mga neuron.
Gipakita sa among mga nahibal-an nga ang CK2 ug S27 lagmit dili lamang ang kinase ug site nga responsable sa ΔFosB phosphorylation, tungod kay wala’y pagdili sa CK2 ni ang S27A mutation nga bug-os nga makapugong sa ΔFosB nga phosphorylation. Pinaagi sa parehas nga timaan, ang kamatuoran nga ang pagbulag sa S27A nagresulta sa usa ka pagkunhod sa 30% sa phospho-osFosB nangatarungan nga ang S27 usa ka hinungdan nga site nga phosphorylation sa protina. Kami, bisan pa, gisusi ang uban nga mga putative kinases ug mga site sa phosphorylation sa ΔFosB. Sa katapusan, mahimo’g hinungdanon usab ang pag-analisar sa phosphorylation sa S27 ug bisan unsang uban pang mga site nga phosphorylation sa ΔFosB sa utok Sa vivo pagkahuman sa lainlaing mga matang sa laygay nga pagdasig, pananglitan, pinaagi sa paggamit sa mass spectrometry o phosphospecific antibodies.
Ingon sa nahisgutan sa ibabaw, ang S27 sa ΔFosB gitipigan sa tibuuk nga ebolusyon ug taliwala sa ubang mga protina sa pamilya Fos. Bisan pa, ang site sa consensus alang sa CK2 dili: ingon sa gipakita sa Figure 5B, ang FosB / ΔFosB (ug ang Zebrafish xenolog), apan dili c-Fos o Fra-2, adunay usa ka acidic residue sa + 3, usa ka hinungdanon nga determinant sa CK2 phosphorylation (Marin et al., 1986; Meggio et al., 1994). Sa ingon, ang kakulang sa CK2 phosphorylation sa S27 mahimong ipatin-aw ngano nga ang ubang mga protina sa pamilya Fos dili ingon ka lig-on sama sa ΔFosB. Bisan pa, wala kini ipatin-aw kung ngano ang tibuuk nga FosB, nga adunay parehas nga site nga consensus nga CK2 ingon ΔFosB, dili parehas nga napadayon. Wala kami mahibal-an kung ang hingpit nga FosB nga gipasiugdahan sa CK2 sa kini nga nahabilin nga nahabilin. Ang bugtong mga taho sa FosB (Skinner et al., 1997) ug c-Fos (Okazaki ug Sagata, 1995; Chen et al., 1996) Gihulagway sa phosphorylation ang mga site sa C-terminal nga rehiyon sa kini nga mga protina, nga wala sa ΔFosB. Ang potensyal nga phosphorylation sa bug-os nga gitas-on nga FosB ug uban pang mga protina sa pamilya nga Fos pinaagi sa CK2 nanginahanglan direkta nga pagsusi. Bisan pa, bisan kung kini phosphorylated, ang uban nga mga protina sa pamilya nga Fos nahibal-an nga adunay mga motif sa ilang C termini nga target ang mga protina alang sa paspas nga pagkadaut (Papavassiliou et al., 1992; Jariel-Encontre et al., 1997; Acquaviva et al., 2002). Pananglitan, gipakita nga ang usa ka panon sa mga nahibilin sa ∼21 nga ania sa C terminus sa tanan nga mga protina sa pamilya Fos, apan wala sa ΔFosB, naglihok ingon usa ka malungtaron nga domain alang sa c-Fos (Acquaviva et al., 2001). Nahibal-an namon nga bisan ang kini nga han-ay parehas nga nagtino sa hingpit nga FosB (Carle et al., 2004), ang pagkawala sa kini nga domain sa ΔFosB dili bug-os nga account sa stabilization niini. Hinuon, ang kombinasyon sa wala niini nga domain sa C terminus ug Ser27 phosphorylation daw sa bug-os nga nag-asoy sa gibana-bana nga lima ka pilo nga kalainan sa kalig-on tali sa ΔFosB ug FosB.
Bisan kung ang pagkahuyang sa mga protina sa pamilya nga Fos komplikado ug wala masabti sa hingpit, ang pagkadaut sa proteasomal ingon usa ka panguna nga agianan nga nalambigit (Salvat et al., 1999; Acquaviva et al., 2002; Ferrara et al., 2003). Ang datos nga gipresentar dinhi, kung diin ang mga inhibitor sa proteasomal wala mabag-o ang pagbag-o sa rate sa pagpaubos sa ΔFosB, nangatarungan nga, dili sama sa ubang mga protina sa pamilya Fos, ang ΔFosB naglikay sa 26S proteasome, ug kini adunay hinungdan nga papel sa pag-asenso niini. Busa gisugyot namon ang usa ka laraw diin ang gipalambo nga kalig-on sa BFosB hinungdan sa panagsama sa duha nga punoan nga mga hinungdan: (1) ang pagkawala sa usa ka domain nga C-terminal nga nagpanghatag ug (2) ang phosphorylation sa S27 ni CK2.
Sa katingbanan, ang karon nga pagtuon naghatag mekanismo nga panan-aw kung ngano nga ang ΔFosB, usa ka produkto sa gilayon nga una nga gene fosB, mao, dili sama sa tanan nga ubang mga sakop sa pamilya nga Fos, usa ka medyo dugay nga protina. Bisan kung ang uban nga mga protina sa pamilya Fos gihunahuna nga maghusay sa paspas apan nagbalhin-balhin nga pagpadako-paglitbit nga pagkabit (Morgan ug Curran, 1995), ang paryente nga kalig-on sa ΔFosB nagsalig sa niini ang kaarang sa pagpataliwala sa dugay-dugay nga mga pagbag-o sa transkripsyon nga gipahinabo sa laygay nga pagdasig. Gisuportahan niini ang panan-aw nga ang ΔFosB naglihok ingon usa ka padayon nga molihok nga molekular sa utok, anam-anam nga gibag-o ang mga mahait nga tubag sa talamayon nga pagbagay. Ang pag-ila sa Ser27 phosphorylation ingon usa ka sentral nga mekanismo alang sa kalig-on sa ΔFosB nagbukas sa bag-ong mga avenues alang sa pagpauswag sa mga pamaagi aron i-regulate ang function sa ΔFosB ug sa ingon moduso ang dugay na nga epekto sa neural ug behavioral plasticity.
Nahiuna nga SeksyonSunod nga Seksyon
Mga footnote
- Gidawat Nobyembre 21, 2005.
- Ang rebisyon nakadawat Pebrero 21, 2006.
- Gidawat nga Abril 2, 2006.
- Ang kini nga buhat gisuportahan sa usa ka National Alliance for Research sa Schizophrenia ug Depression Young Investigator Award sa PGU, usa ka National Institute on Drug Abuse (NIDA) National Research Service Award sa PGU, ug gihatag gikan sa National Institute of Mental Health ug NIDA hangtod sa EJN Kami James Bibb sa pagtabang niya sa sa vitro Ming-Hu Han nagsulti, si Dr. Ming-Hu Han alang sa iyang tabang sa pag-andam sa mga hiwa sa utok nga gigamit alang sa pag-label sa metabolic, ug Dr. Rachael Neve alang sa iyang panabang sa pagputos sa mga HSV nga nagbag-o.
- Karon nga pakigpulong ni G. Rudenko: Life Science Institute ug Department of Pharmacology, University of Michigan, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
- Ang korespondensya kinahanglan nga itumong ngadto ni Eric J. Nestler, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070. Email: [protektado sa email]
mga pakisayran
Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) Ang pag-ila sa usa ka C-terminal tripeptide motif nga nalambigit sa pagkontrol sa kusog nga pagkadaut sa proteasomal nga c-Fos proto-oncoprotein sa panahon sa pagbalhin sa G (0) -to-S. oncogene 20:7563-7572.
Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) Daghang mga pagkadaot nga agianan alang sa mga protina sa pamilya nga Fos. Ann NY Acad Sci 973:426-434.
Ahmed K, Tawfic S (1994) Ang mekanismo sa intracellular regulation sa protein kinase CK2: papel sa stimulus-mediated subnuclear nga panag-uban. Cell Mol Biol Res 40:539-545.
Alcazar A, Martin E, Lopez-Fando J, Salinas M (1988) Usa ka maayo nga pamaagi sa paglimpiyo ug mga kabtangan sa casein kinase II gikan sa utok. Neurochem Res 13:829-836.
Andersson M, Westin JE, Cenci MA (2003) Panahon sa kurso sa striatal nga DeltaFosB sama sa immunoreactivity ug prodynorphin mRNA nga lebel pagkahuman sa paghunong sa laygay nga pagtambal sa dopaminomimetic. Eur J Neurosci 17:661-666.
Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W (2003) Ang mga screen sa pagpahayag sa Genome nga gipakita sa usa ka global nga papel alang sa protina kinase CK2 sa pag-usab sa chromatin. J Cell Sci 116:1563-1577.
Beh I, Schmidt R, Hecker E (1989) Duha ka mga isozymes sa PKC nga nakit-an sa mga selula sa HL-60 nagpakita nga usa ka kalainan sa pagpaaktibo sa phorbol ester TPA. FEBS Lett 249:264-266.
Ang Bildl W, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) Ang protina kinase CK2 giubanan sa gamay nga pagdumala Ca (2 +) - gipalihok ang mga K + nga kanal ug nag-regulate sa mga gate sa channel. Neuron 43:847-858.
Bing G, Wang W, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Jin L, Zhang W, Bing R, Hong JS (1997) Dugay nga pagpahayag sa mga kalabotan nga adunay kalabutan sa Fos ug lumalabay nga pagpahayag sa delta FosB nga may kalabutan sa mga seizure sa rat hippocampus ug striatum. J Neurochem 68:272-279.
Blom N, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) Ang pagpanagna sa glycosylation sa post-translational ug phosphorylation sa mga protina gikan sa pagkasunud sa amino acid. Proteomics 4:1633-1649.
Boehning D, Buwan C, Sharma S, Hurt KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) Ang carbon monoxide neurotransmission nga gi-aktibo sa CK2 phosphorylation sa heme oxygenase-2. Neuron 40:129-137.
Bohmann D (1990) Ang phosphorylation factor sa transkripsyon: usa ka sumpay tali sa transduction sa signal ug ang regulasyon sa pagpahayag sa gene. Mga Cell cells sa cancer 2:337-344.
Buschmann T, Potapova O, Bar-Shira A, Ivanov VN, Fuchs SY, Henderson S, Fried VA, Minamoto T, Alarcon-Vargas D, Pincus MR, Gaarde WA, Holbrook NJ, Shiloh Y, Ronai Z (2001) Ang Jun NH2-terminal kinase phosphorylation sa p53 sa Thr-81 hinungdanon alang sa pag-stabilize sa p53 ug mga kalihokan sa transkripsyon agig tubag sa stress. Mol Cell Biol 21:2743-2754.
Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) Ang pagkawala sa usa ka gitipig nga pamilya Fos C-terminal domain nakatampo sa talagsaon nga kalig-on sa deltaFosB. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.
Channavajhala P, Seldin DC (2002) Ang function sa interaksyon sa protina kinase CK2 ug c-Myc sa lymphomagenesis. oncogene 21:5280-5288.
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Paglaum BT, Nestler EJ (1995) Ang regulasyon sa delta FosB ug FosB-like protein pinaagi sa electroconvulsive seizure ug cocaine treatment. Mol Pharmacol 48:880-889.
Chen J, Kelz MB, Paglaum BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Ang mga antigens nga may kalabtanan nga Fos nga Fos: ang stable nga mga variant sa ΔFosB nga gipahinabo sa utok pinaagi sa mga pag-ayo nga pagtambal. J Neurosci 17:4933-4941.
Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J (1996) Ang Phosphorylation sa c-Fos sa C-terminus nagpalambo sa kalihokan sa pagbag-o. oncogene 12:1493-1502.
Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) Ang protina nga phosphatase 1 / 2A inhibitor okadaic acid nagdugang CREB ug Elk-1 phosphorylation ug c-fos expression sa rat striatum sa vivo. J Neurochem 89:383-390.
Cochet C, Chambaz EM (1983) Ang pagpaayo sa polyamine nga adunay sagol sa polyamine: usa ka posible nga target alang sa paglihok sa intracellular polyamine. Mol Cell Endocrinol 30:247-266.
Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) Ang mga katoliko ug molekular nga mga kabtangan sa usa ka labi ka putli nga g type casein kinase gikan sa tisyu sa baga sa baga. Biochim Biophys Acta 743:1-12.
Ang Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Kaugalingon DW (2003) Ang striatal cell type-specific overexpression sa DeltaFosB nagdugang insentibo alang sa cocaine. J Neurosci 23:2488-2493.
Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) Ang pagdumala sa kaugalingon nga cocaine nagdugang preprodynorphin, apan dili c-fos, mRNA sa rat striatum. NeuroReport 4:543-546.
Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) Ang regulasyon sa mga hinungdan sa transkripasyon pinaagi sa pagpaminus sa protina Cell Mol Kinabuhi Sci 57:1207-1219.
Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J (1992) Ang pagdugang sa cytoplasmic casein kinase II-type nga kalihokan nag-uban sa pagtubo sa neurite pagkahuman sa pagdili sa synthesis sa DNA sa mga selula nga neuroblastoma sa NIA-103. J Neurochem 58:1820-1828.
Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) Ang protina kinase CK2 nga mga phosphory template ug pag-upud sa Akt / PKB. Pagkalainlain nga Kamatayon sa Cell 12:668-677.
Dobrazanski P, Noguchi T, Kovary K, Rizzo CA, Lazo PS, Bravo R (1991) Ang parehong mga produkto sa gene nga fosB, FosB ug mubo nga porma, FosB / SF, mga transaksyonal nga mga aktibista sa fibroblasts. Mol Cell Biol 11:5470-5478.
Ferrara P, Andermarcher E, Bossis G, Acquaviva C, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2003) Ang mga istruktura sa istruktura nga responsable alang sa c-Fos nga protina sa proteasomal nga pagkalainlain lahi sa mga kondisyon sa pagpahayag. oncogene 22:1461-1474.
Fuchs SY, Dolan L, Davis RJ, Ronai Z (1996) Ang pag-target sa Phosphorylation nga c-Jun ubiquitination ni Jun N-kinase. oncogene 13:1531-1535.
Fuchs SY, Xie B, Adler V, Fried VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) c-Jun NH2-terminal kinases ang target sa ubiquitination sa ilang mga kauban nga transkripsyon. J Biol Chem 272:32163-32168.
Fuchs SY, Tappin I, Ronai Z (2000) Ang kalig-on sa factor sa transkrip sa ATF2 gi-regulate sa phosphorylation ug dephosphorylation. J Biol Chem 275:12560-12564.
Girault JA, Hemmings HC Jr, Williams KR, Nairn AC, Greengard P (1989) Ang Phosphorylation sa DARPP-32, usa ka dopamine- ug regulado nga phosphoprotein nga dopamine-, pinaagi sa casein kinase II. J Biol Chem 264:21748-21759.
Girault JA, Hemmings HC Jr, Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) Ang pagpaila sa utok sa mammalian nga utok sa DARPP-32 parehas sa casein kinase II. J Neurochem 55:1772-1783.
Hanada M, Sugawara K, Kaneta K, Toda S, Nishiyama Y, Tomita K, Yamamoto H, Konishi M, Oki T (1992) Ang Epoxomicin, usa ka bag-ong ahente nga antitumor nga gigikanan sa microbial. J Antibiot (Tokyo) 45:1746-1752.
Hann SR, Eisenman RN (1984) Ang mga protina nga gi-encode sa tawhanon nga c-myc oncogene: expression expression sa neoplastic cells. Mol Cell Biol 4:2486-2497.
Hemmings HC Jr, Girault JA, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) Ang ARPP-21, usa ka sikliko nga regulasyon nga AMP-regulated nga fosoprotein (Mr = 21,000) nga gihimo sa mga rehiyon sa utok nga dopamine-innervated. Ang pagkasunud sa Amino acid sa site nga phosphorylated sa cyclic AMP sa mga buut nga selyula ug kinetic nga pagtuon sa iyang phosphorylation sa vitro. J Biol Chem 264:7726-7733.
Hidaka H, Kobayashi R (1992) Ang pharmacology sa mga protein kinase inhibitor. Annu Rev Pharmacol Toxicol 32:377-397.
Hirata H, Bessho Y, Kokubu H, Masamizu Y, Yamada S, Lewis J, Kageyama R (2004) Ang pagkaayo sa Hes7 protina hinungdanon alang sa usa ka orasa nga pagbulag sa orasan. Nat Genet 36:750-754.
Hiroi N, Greybiel AM (1996) Ang mga atypical ug tipikal nga mga pagtambal sa neuroleptic nagpatunghag lahi nga mga programa sa ekspresyon nga transkripsyon nga hinungdan sa striatum. J Comp Neurol 374:70-83.
Paglaum B, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Ang regulasyon sa diha-diha nga pagpahayag sa una nga gene ug AP-1 nga nagbugkos sa daga nga nukusok nga accumbens pinaagi sa chronic cocaine. Proc Natl Acad Sci USA 89:5764-5768.
Paglaum BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) Ang sakit nga pagtambal sa electroconvulsive seizure (ECS) moresulta sa pagpahayag sa usa ka dugay nga komplikado nga AP-1 complex sa utok nga adunay gibag-o nga komposisyon ug mga kinaiya. J Neurosci 14:4318-4328.
Paglaum BT, Nye HE, Kelz MB, Kaugalingon DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Ang induction sa usa ka malungtaron nga komplikado sa AP-1 nga gilangkuban sa nabag-o nga mga protina nga sama sa Fos sa utok pinaagi sa talamak nga cocaine ug uban pang mga sakit nga pagtambal. Neuron 13:1235-1244.
Ishida A, Fujisawa H (1995) Ang pagpalig-on sa kalabotan nga protektado sa kalabotan sa kalabotan sa kalabotan sa protein pinaagi sa autoinhibitory domain. J Biol Chem 270:2163-2170.
Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piechaczyk M (1997) Komplikadong mga mekanismo alang sa c-fos ug c-jun nga pagkadaot. Si Mol Biol Rep 24:51-56.
Jones S, Yakel JL (2003) Ang casein kinase ii (protina kinase ck2) nag-regulate sa serotonin 5-ht (3) nga function sa channel nga receptor sa ng108-15 cells. Neuroscience 119:629-634.
Kato T Jr, Delhase M, Hoffmann A, Karin M (2003) Ang CK2 usa ka C-terminal IkappaB kinase nga responsable alang sa pagpaaktibo sa NF-kappaB sa pagtubag sa UV. Molula nga Cell 12:829-839.
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Diri sa DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ (1999) Ang pagpahayag sa hinungdan sa transkrip nga deltaFosB sa utok nagkontrol sa pagkasensitibo sa cocaine. Kinaiyahan 401:272-276.
Kim KB, Myung J, Sin N, Crews CM (1999) Ang pagpugong sa protina pinaagi sa natural nga mga produkto epoxomicin ug dihydroeponemycin: mga panan-aw sa pagkahinungdanon ug kahanas. Bioorg Med Chem Lett 9:3335-3340.
Kobayashi E, Nakano H, Morimoto M, Tamaoki T (1989) Ang Calphostin C (UCN-1028C), usa ka nobela nga mikrobyo nga tambal, usa ka labi ka kusog ug piho nga tigpugong sa protina nga kinase C. Biochem Biophys Res Commun 159:548-553.
Krek W, Maridor G, Nigg EA (1992) Ang Casein kinase II usa ka daghan nga nukleyar nga enzyme. J Cell Biol 116:43-55.
Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) Ang protina nga kinase CK2 nga mga phosphory template ang hataas nga grupo sa proteksyon sa domain sa paglihok nga SSRP1, nga nakapaila sa pag-ila sa nasunog nga UV nga DNA. J Biol Chem 278:12710-12715.
Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, Russo SJ, LaPlant Q, Whistler K, Neve RL, Kaugalingon DW, Nestler EJ (2005) Ang pag-usab sa Chromatin usa ka yawi nga mekanismo nga nagpailalom sa plastik nga gipadako sa cocaine sa striatum. Neuron 48:303-314.
Lieberman DN, Mody I (1999) Ang Casein kinase-II nag-regulate sa function sa channel sa NMDA sa hippocampal neuron. Nat Neurosci 2:125-132.
Litchfield DW (2003) Protein kinase CK2: istruktura, regulasyon ug papel sa mga desisyon sa cellular sa kinabuhi ug kamatayon. Biochem J 369:1-15.
Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) Ang pagkadaut sa c-Fos nga protina nga gipahayag sa N-methyl-d-aspartic acid sa mga nukleyar nga fraksiyon sa murine hippocampus. Brain Res 905:34-43.
Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI (1997) Paglikay sa usa ka padayon nga gipataas nga 37 kDa nga may kalabotan nga antigen ug ang AP-1 sama sa DNA nga nagbugkos nga kalihokan sa utok sa mga kainic acid-treated fosB null nga mga ilaga. J Neurosci 17:5407-5415.
Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA (1986) Ang lugar nga piho nga lugar sa casein kinase-2 (TS) gikan sa rat liver cytosol. Usa ka pagtuon uban ang modelo nga substrate peptide. Eur J Biochem 160:239-244.
McClung CA, Nestler EJ (2003) Ang regulasyon sa pagpahayag sa gene ug ganti sa cocaine pinaagi sa CREB ug DeltaFosB. Nat Neurosci 6:1208-1215.
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: usa ka molekular nga switch alang sa long-term adaptation sa utok. Brain Res Mol Brain Res 132:146-154.
Meggio F, Pinna LA (2003) Usa ka libo-ug-usa nga mga substrates sa protein kinase CK2? FASEB J 17:349-368.
Meggio F, Donella-Deana A, Pinna LA, Moret V (1977) Ang phosphorylation sa casein nga mga tipik pinaagi sa rat atay 'phosvitin kinase.'. FEBS Lett 75:192-196.
Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) Autophosphorylation sa type 2 casein kinase TS sa parehas nga alpha- ug beta-subunits. Ang impluwensya sa lainlaing mga epekto. FEBS Lett 160:203-208.
Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) Mga derivatives sa Ribofuranosyl-benzimidazole ingon mga inhibitor sa casein kinase-2 ug casein kinase-1. Eur J Biochem 187:89-94.
Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) Ang katakus sa pagkahuman sa protina kinase CK2. Cell Mol Biol Res 40:401-409.
Miller C, Zhang M, He Y, Zhao J, Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Di Battista JA (1998) Pagbalhin sa induction sa cyclooxygenase-2 gene pinaagi sa okadaic acid nga pagdili sa kalihokan nga phosphatase sa mga chondrocytes sa tawo: co-stimulation sa AP-1 ug CRE nukleyar nga mga protina nga nukleyar. J Cell Biochem 69:392-413.
Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Greybiel AM (1996) Ang mga pagbag-o sa lebel sa network sa pagpahayag sa dili mahibal-an nga mga protina nga Fos-Jun sa striatum sa panahon sa pagtambal sa cocaine ug pag-undang. Neuron 17:147-156.
Morgan JI, Curran T (1995) Sayo nga mga una nga gen: napulo ka tuig sa. Mga us aka Neurosci 18:66-67.
Nakabeppu Y, Nathans D (1991) Usa ka natural nga nahitabo nga dagway sa FosB nga nagpugong sa kalihokan sa transkripsyon sa Fos / Jun. cell 64:751-759.
Nestler EJ, Barrot M, Kaugalingon DW (2001) Ang Delta FosB: usa ka padayon nga molihok sa molekula alang sa pagkaadik. Proc Natl Acad Sci USA 98:11042-11046.
Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) Pasiuna ang glutamate receptor subunit 1 sa mga motor neuron sa vitro ug sa vivo gamit ang usa ka recombinant herpes simplex virus. Neuroscience 79:435-447.
Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) Ang Phosphorylation sa serine 239 sa Groucho / TLE1 pinaagi sa protina nga kinase CK2 hinungdanon alang sa pagsanta sa pagkalahi sa neuronal. Mol Cell Biol 24:8395-8407.
Okazaki K, Sagata N (1995) Ang agianan sa Mos / MAP kinase nagpalig-on sa c-Fos pinaagi sa phosphorylation ug gipadako ang kalihokan niini nga pagbag-o sa mga selula nga NIH 3T3. EMBO J 14:5048-5059.
Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T (1994) Gikinahanglan ang ubiquitin-proteasome pathway alang sa pagproseso sa NF-kappa B1 precursor protein ug pagpaaktibo sa NF-kappa B. cell 78:773-785.
Ang Papavassiliou AG, Treier M, Chavrier C, Bohmann D (1992) Gipunting ang pagkadaot sa c-Fos, apan dili v-Fos, pinaagi sa usa ka signal nga nakadepende sa phosphorylation sa c-Jun. Science 258:1941-1944.
Ang Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Kaugalingon DW, Nestler EJ , Schaeffer E (2003) Dili masabut, ekspresyon nga utok sa rehiyon sa utok nga usa ka nagpatigbabaw nga negatibo nga mutant sa c-Jun sa mga transgenic nga ilaga nagpakunhod sa pagkasensitibo sa cocaine. Brain Res 970:73-86.
Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) Ang induction sa DeltaFosB sa mga istruktura sa utok nga may kalabotan sa ganti human sa grabe nga stress J Neurosci 24:10594-10602.
Persico AM, Schindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR (1993) Ang ekspresyon sa hinungdan sa transaksyon sa utok: mga epekto sa mahait ug laygay nga amphetamine ug stress sa indeyksiyon. Brain Res Mol Brain Res 20:91-100.
Ploegh HL, Dunn BM (2000) Pagkausab sa post-translational: phosphorylation ug phosphatases. Sa: Mga karon nga protocol sa syensya sa protina (Dunn BM, ed.) P. 13.01–13.02. New York: Wiley ug Anak.
Pyerin W, Burow E, Michaely K, Kubler D, Kinzel V (1987) Ang mga katoliko ug molekular nga mga kabtangan sa labi ka putli nga phosvitin / casein kinase type II gikan sa mga selula sa epithelial sa kultura (HeLa) ug kalabotan sa ecase protein kinase. Biol Chem Hoppe Seyler 368:215-227.
Reikhardt BA, Kulikova OG, Borisova GY, Aleksandrova IY, Sapronov NS (2003) Ang kahimtang sa sistemang "protein kinase CK2-HMG14" sa amnesia nga may kalabutan sa edad sa mga ilaga. Neurosci Behav Physiol 33:799-804.
Roberts BJ, Whitelaw ML (1999) Ang pagkadaut sa batakan nga helix-loop-helix / Per-ARNT-Sim homology domain dioxin receptor pinaagi sa ubiquitin / proteasome pathway. J Biol Chem 274:36351-36356.
Rost B, Yachdav G, Liu J (2004) Ang server nga PredictProtein. Nucleic Acids Res 32:W321–W326.
Rylski M, Kaczmarek L (2004) Ang target sa Ap-1 sa utok. Sa atubang nga Biosci 9:8-23.
Sahin B, Kansy JW, Nairn AC, Spychala J, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA (2004) Ang pagpaila sa molecular sa recombinant mouse adenosine kinase ug pagtimbang-timbang ingon usa ka target alang sa phosphorylation sa protina. Eur J Biochem 271:3547-3555.
Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piechaczyk M (1999) Adunay daghang ubay-ubay nga mga agianan sa proteolytic nga nag-ambag sa c-Fos, c-Jun ug p53 nga paglala sa protina sa vivo? Si Mol Biol Rep 26:45-51.
Schmidt R, Hecker E (1975) Autoxidation sa phorbol esters ubos sa normal nga mga kondisyon sa pagtipig. Cancer Res 35:1375-1377.
Schwarz EM, Van Antwerp D, Verma IM (1996) Ang constitutive nga phosphorylation sa IkappaBalpha ni casein kinase II mahitabo labi ka maayo sa serine 293: kinahanglan alang sa pagpahuyang sa libre nga IkappaBalpha. Mol Cell Biol 16:3554-3559.
Sears R, Leone G, DeGregori J, Nevins JR (1999) Gipalambo sa Ras ang kalig-on sa protina sa Myc. Molula nga Cell 3:169-179.
Silva-Neto MA, Fialho E, Paes MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) Ang siklo nga nucleotide-independente nga phosphorylation sa vitellin ni casein kinase II nga gihinloan gikan sa Rhodnius prolixus oocytes. Insekto nga Biochem Mol Biol 32:847-857.
Skinner M, Qu S, Moore C, Kaalam R (1997) Ang paglihok sa pagbalhin ug pagbag-o sa protina sa FosB nanginahanglan og phosphorylation sa domainbox sa pagpaandar sa carboxyl-terminal. Mol Cell Biol 17:2372-2380.
Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) Ang protina kinase CK2 kalainan sa phosphory template naggikan sa chromosomal nga high mobility group B (HMGB) nga mga protina nga nag-usab sa ilang kalig-on ug mga interaksyon sa DNA. J Biol Chem 277:1092-1098.
Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede W, Goris J (1999) Ang pag-ila sa cyk, usa ka siklo nga B2 kinase, ingon usa ka nobela nga calcium / kalabasa nga pagsalig sa protina nga kalasa sa kalabotan sa kalabotan ug kalabotan sa Xenopus laevis oocyte. Exp Cell Res 252:303-318.
Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) Ang regulasyon sa pagpahayag sa c-fos ug c-jun gene pinaagi sa lipopolysaccharide ug mga cytokine sa panguna nga kultura nga mga astrocyte: epekto sa mga agianan sa PKA ug PKC. Arch Pharm Res 27:396-401.
Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N, Ballesta JP (1995) Ang nagkalainlain nga phosphorylation sa ribosomal acidic nga protina gikan sa lebadura nga selula sa duha nga mga endogenous protein kinase: casein kinase-2 ug 60S kinase. Si Acta Biochim Pol 42:357-362.
Tamaoki T, Takahashi I, Kobayashi E, Nakano H, Akinaga S, Suzuki K (1990) Ang Calphostin (UCN1028) ug mga kalabotan nga may kalabutan sa calphostin, usa ka bag-ong klase sa piho nga mga espesipikasyon ug potente nga mga inhibitor sa protein kinase C. Adv Second Messenger Phosphoprotein Res 24:497-501.
Torres J, Pulido R (2001) Ang tumor suppressor nga PTEN gi-phosphorylate sa protein kinase CK2 sa C terminus niini. Ang mga impresyon alang sa kalig-on sa PTEN ngadto sa pagkahugno sa proteasome. J Biol Chem 276:993-998.
Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kawashima S (1996) Ang pagkalainlain nga pagdili sa mga kalihokan sa calpain ug proteasome pinaagi sa peptidyl aldehydes sa di-leucine ug tri-leucine. J Biochem (Tokyo) 119:572-576.
Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki M, Okazaki K, Sagata N (1995) Ang pagkadaut sa c-Fos sa 26S proteasome gipadali sa c-Jun ug daghang mga kinase sa protina. Mol Cell Biol 15:5682-5687.
Unger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmed K (2004) Ang protina nga kinase CK2 ingon regulator sa pagkaluwas sa selyula: mga implikasyon sa therapy sa kanser. Mga Taripa sa Kurso nga Kurso sa Kurso 4:77-84.
Vial E, Marshall CJ (2003) Ang lig-on nga kalihokan nga kinase sa ERK-MAP nanalipod sa FOS nga membro sa pamilya nga FRA-1 batok sa pagkadaot sa proteasomal sa mga selula sa carcinoma. J Cell Sci 116:4957-4963.
Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) Ang ΔFosB nagkontrol sa pagdagan sa ligid. J Neurosci 22:8133-8138.
Ang Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) Ang regulasyon sa transkripsyon nga hinungdan sa pagpaandar pinaagi sa phosphorylation. Cell Mol Kinabuhi Sci 57:1172-1183.
Tingtugnaw B, Kautzner I, Issinger OG, Arnold HH (1997) Duha ka putative protein kinase CK2 nga mga site nga phosphorylation hinungdanon alang sa kalihokan sa Myf-5. Biol Chem 378:1445-1456.
Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petry I, Schwanbeck R, Renner U (1999) Ang constitutive nga phosphorylation sa acidic nga mga ikog sa taas nga grupo sa paglihok nga 1 nga protina sa casein kinase II nagbag-o sa ilang panagsama, kalig-on, ug pagtino sa DNA. J Biol Chem 274:20116-20122.
Yamaguchi Y, Wada T, Suzuki F, Takagi T, Hasegawa J, Handa H (1998) Ang Casein kinase II nakigsabut sa mga domain sa bZIP nga adunay daghang mga hinungdan sa transkrip. Nucleic Acids Res 26:3854-3861.
Yanagawa T, Yuki K, Yoshida H, Bannai S, Ishii T (1997) Ang Phosphorylation sa A170 nga protina sa stress pinaagi sa casein kinase II nga sama sa kalihokan sa macrophage. Biochem Biophys Res Commun 241:157-163.
Yankulov K, Yamashita K, Roy R, Egly JM, Bentley DL (1995) Ang transcriptional elongation inhibitor 5,6-dichloro-1-beta-d-ribofuranosylbenzimidazole nga likway ang transkripsyon hinungdan IIH nga may kalabutan sa protina kinase. J Biol Chem 270:23922-23925.
Yen J, Kaalam RM, Tratner I, Verma IM (1991) Ang usa ka alternatibo nga nabuak nga porma sa FosB usa ka negatibo nga regulator sa pagpaayo sa transkripsyon ug pagbag-o sa mga protina sa Fos. Proc Natl Acad Sci USA 88:5077-5081.
Yin X, Jedrzejewski PT, Jiang JX (2000) Ang Casein kinase II phosphory template lens connexin 45.6 ug nalakip sa pagkadaut niini. J Biol Chem 275:6850-6856.
Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) Induksiyon nga mga sangkap sa transkripsyon sa AP-1 sa pagpaaktibo sa T-cell pinaagi sa interleukin 1 ug phorbol ester. Pagkalainlain nga Pagtubo sa Cell 3:677-684.
Yu S, Wang H, Davis A, Ahmed K (2001) Mga sangputanan sa pagtimaan sa CK2 sa nukleyar nga matrix. Mol Cell Biochem 227:67-71.
Yu S, Davis AT, Guo C, Green JE, Ahmed K (1999) Ang pagkalainlain nga target sa protina nga kinase CK2 sa nukleyar nga matrix sa kanunay nga pag-overexpression sa mga subunits. J Cell Biochem 74:127-134.
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) ΔFosB: usa ka hinungdanon nga papel alang sa osFosB sa nucleus nga nakadawat sa aksyon sa morphine. Nat Neurosci 9:205-211.
Mga artikulo nga naghatag niini nga artikulo
- Ang mga Panglantaw sa Kaugalingon ug Structural sa Talamayong Cocaine Nagkinahanglan sa usa ka Feedforward Loop nga naglakip sa {Delta} FosB ug Calcium / Calmodulin-Dependent Protein Kinase II sa Nucleus Accumbens Shell Journal of Neuroscience, 6 Marso 2013, 33(10):4295-4307
- Ang Striatal Overexpression sa {Delta} FosB Nag-usab sa Lihok nga Lihok sa Levodopa nga Dili Mausab nga mga Kalihokan Journal of Neuroscience, 26 Mayo 2010, 30(21):7335-7343
- abstract
- Full Text
- Full Text (PDF)
- abstract
- Full Text
- Full Text (PDF)
- abstract
- Full Text
- Full Text (PDF)
- abstract
- Full Text
- Full Text (PDF)
- Transcriptional nga mga mekanismo sa pagkaadik: papel sa {Delta} FosB Philosophical Transactions sa Royal Society B: Biological Sciences, 12 Oktubre 2008, 363(1507):3245-3255
- Paglahutay sa kahuyang sa pagbalik sa methamphetamine-seeking behavior sa glial cell line-derived neurotrophic factor mutant mice Ang FASEB Journal, 1 Hulyo 2007, 21(9):1994-2004
- Ang activator Protein-1 Transcription Factor sa respiratory Epithelium Carcinogenesis Research Molecular Cancer, 1 Pebrero 2007, 5(2):109-120
;