PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
abstrakta
Ŝanĝoj en la esprimo de genoj induktitaj de kokaino kaŭzas ŝanĝojn en neŭrona morfologio kaj konduto, kiuj povas esti bazitaj sur kokainka dependeco. Ni identigis esencan rolon por histona 3-lisina 9 dimethylation (H3K9) kaj la lizin dimetiltransferase G9a en kokain-induktita struktura kaj konduta plasticeco. Ripetita kokaina administrado reduktis tutmondajn nivelojn de dimetilación H3K9 en la kerno accumbens. Tlia redukto en histona metilado estis mediaciita per la subpremo de G9a en ĉi tiu cerba regiono, kiu estis reguligita de la faktoro de transskribo induktita de kokaino BFosB. Uzante kondiĉan mutagenezon kaj vir-mediatitan genetrandon, ni trovis ke G9a-malreguligo pliigis dendritan spinon-plasticecon de nukleo akumuliĝas neŭronojn kaj pliigis preferon por kokaino, tiel establante decidan rolon por histona metilado en longperspektivaj agoj de kokaino.
Enkonduko
Ripeta kokina-ekspozicio estas karakterizita per konstantaj ŝanĝoj en gena esprimo kaj ŝanĝita neŭrona morfologio en la kerno accumbens (NAc), ŝlosila komponanto de la rekompenca cirkvito de la cerbo.1-2). La remodelación de la cromatina estas grava en ŝanĝoj transcripcionales aberrantes en ĉi tiu regiono cerebral kiu povas esti bazitaj en aspektoj de la toksomanio al la kokaino. (3-9). Kokaina reguligado de kromatina strukturo en la NAc rezultas, parte, de rektaj kokain-induktitaj modifoj de la kromatina enzimata maŝinaro, kondukante al ŝanĝoj en histona acetilado kaj fosforilado (4, 7-9); tamen, roloj por enzimoj kontrolantaj histonmetiladon ankoraŭ ne estis esploritaj.
Lastatempa genoma-larĝa reklama analizo uzanta kromatina inmunoprecipitación kunigita al mikroorganoj (ChIP-Blato) identigis ŝanĝitajn ŝablonojn de subprema histono H3-lisina 9 (H3K9) kaj 27 (H3K27) metilado ĉe specifaj genaj reklamantoj en la NAc post ripeta kokaino.6). Ni tial profilis multajn lizinmetiltransferazojn (KMT) kaj demetilazoj (KDM), kiuj scias, ke ili kontrolas H3K9 aŭ H3K27-metiladon (Fig. 1A). Nur du enzimoj, G9a kaj GLP, montris konstantan transskriban reguladon 24 horojn post ripeta kokaina administrado, kiam la esprimo de ambaŭ genoj estis signife malreguligita.. Ĉar G9a kaj GLP specife katalizas la dimetiladon de H3K9 (H3K9me2), ilia malreguligo per kokaino kongruas kun malpliiĝintaj tutmondaj niveloj de eŭkromata UMNUMXK3me9 observitaj je ĉi tiu tempopunkto (Fig. 1B). En kontrasto, tutmondaj niveloj de heterocromata H3K27-metilado restis nemodifitaj de ripeta kokina ekspozicio (S1 en subtenado de interreta materialo). Pro ĝiaj altaj niveloj de kataliza agado ambaŭ en vitro kaj en vivo (10), Ni intencis plue esplori la funkcian signifon de subpremo de G9a post ripeta kokaĵa ekspozicio en la NAc. Niveloj de G9a proteino, kiel niveloj de ĝia mRNA, estis signife reduktitaj 24 horoj post ripetita kokaina administrado (Fig. S2). Kvankam G9a mRNA-esprimo estis reduktita per 35% en la NAc, immunohistochemical-analizo rivelis pli modesta 15% redukto en G9a proteino niveloj, kongrua kun la observita 21% malkresko en H3K9me2 post ripetita kokaina administrado (Fig. 1B). G9a mRNA-esprimo ankaŭ estis malreguligita en ĉi tiu cerba regiono de 20% post ripetita mem-administrado de kokaino (Fig. S3).
Por identigi ĉu ŝanĝoj en eŭkromata H3K9me2 korelacias kun ĝenom-larĝaj ŝanĝoj en gena esprimo en la NAc, ni uzis mikroarrajajn analizon por ekzameni genesprimajn profilojn induktitaj de defia dozo de kokaino ĉe bestoj kun aŭ sen historio de antaŭa kokaina ekspozicio. genaj listoj en Tabuloj S1-S3). Bestoj, kiuj ricevis ripetitan kokainon, montris draste pli grandan esprimon de genoj 1-horon post kokain-defio kompare kun akre traktitaj bestoj.Fig. 1C). Ĉi tiu pliigita gena esprimo ankoraŭ okazis laŭ reago de kokaino post 1 semajno de retiro de ripeta kokaino. Konsekvence kun antaŭaj raportoj, malgranda procento de genoj (~ 10%) montris sensencajn transkriptajn respondojn post ripeta kokaina administrado (Fig. 1C; lago Tablo S1) (5). Por rekte esplori la rolon de malreguligo de G9a en la plibonigita genetika esprimo observita post ripetita kokaino, musoj ricevis in-NAc-injektojn de vektoroj de Herpes simplex viruso (HSV) esprimantaj ĉu GFP aŭ G9a kaj estis traktitaj per salva aŭ ripetita kokaino por determini ĉu G9a troas. estis sufiĉa por bloki la ripetitan kokainan indukton de gena esprimo. De aro de 12 hazarde selektitaj genoj montrantaj pli grandajn nivelojn de esprimo post ripeta kokaino, ni observis, ke G9a signife reduktis la plibonigitan esprimon de 50% de tiuj genoj (Tablo S4).
Por identigi suprenirajn transskribajn eventojn, kiuj peras la ripetitan subpremon de la esprimo de G9a, induktita de kokaino, ni esploris eblan rolon por stableFosB, tre stabila kunligo de la tuja frua geno. fosB. ΔFosB akumuliĝas en la NAc post ripetata ekspozicio al kokaino, kie ĝi estis ligita al pliigita kokainkompenso.11). ΔFosB povas funkcii kiel aŭ transkripcia aktivigilo aŭ subpremanto depende de la cela geno implikita (3, 5, 6, 12). Uzante bitransgenan NSE-TTA × tetOP-ΔFosB musoj, en kiuj esprimo ΔFosB povas esti induktita selekte en la NAc kaj dors-striato de plenkreskaj bestoj (13), ni ekzamenis la efikon de esprimo de BFosB en reguligo de kokaino de H3K9me2 kaj KMT en la NAc. La tropresprimo de FosB sufiĉis por redukti nivelojn de ambaŭ H3K9me2 (Fig. 1D) kaj esprimo G9a (Fig. 1E), tiel imitante la efikojn de ripetita kokaino. Male, ΔFosB ne reduktis esprimon de GLP en ĉi tiu cerba regiono, kaj ne efikis sur SUV39H1 kaj EZH2, la ĉefaj trimetilatingaj enzimoj por H3K9 kaj H3K27, respektive (Fig. S4). Por konfirmi ĉi tiujn datumojn uzante sendependan surekspresan sistemon wildFosB, plenkreskaj plenkreskaj musoj ricevis duflankajn intra-NAc-injektojn de vektoroj de Adeno-asociita viruso (AAV) esprimantaj ĉu GFP aŭ ΔFosB. La sobreexpresión viral-mediada de ΔFosB malpliigis la nivelojn de esprimo de G9a en ĉi tiu regiono de la cerbo.Fig. 1E).
Tia prononcata kaj specifa regulado de G9a instigis nin esplori, ĉu ŝanĝo de esprimo de G9a specife en NAc-neŭronoj regas kondutajn respondojn al kokaino. Wildtype-musoj ricevis in-NAc-injektojn de HSV-vektoroj esprimantaj GFP aŭ G9a kaj tiam estis analizitaj uzante nepartianĝokondiĉan paradigmon pri preferata kokaino, kiu disponigas nerektan mezuron de drogpremio. Konstala esprimado de G9a en NAc-neŭronoj estis konfirmita post konduta testado (Fig. 2A). G9a troekspresado signife malpliiĝis preferon por kokaino kompare al bestoj tro troekspresante GFP (Fig. 2B), kaj pliigis H3K9me2-nivelojn en la NAc (Fig. 2C). Sobreexpresión de mutante catalíticamente mortinto de G9a (G9aH1093K) (14) ne influis kokanan preferon (Fig. 2B) kaj ne havis efikon al H3K9me2-niveloj en ĉi tiu cerba regiono (Fig. 2C).
Plue studi la rolon de G9a en la kondutaj efikoj de kokaino, kaj pli specife imiti la ripetitan kokainan induktitan subpremon de G9a en la NAc, plenkreska G9afl / fl musoj (14) ricevis intra-NAc-injektojn de AAV-vektoroj esprimantaj Cre recombinase aŭ GFP kiel kontrolo. Forigo de AAV-Cre de G9a en la NAc, kiu estis konfirmita imunohistoquímicamente (Fig. S5), signife pliigis la efikojn de kokaino en lokkondiĉaj eksperimentoj kaj malkreskis H3K9me2-nivelojn en la NAc (Fig. 2D, E). Komerce havebla farmakologia inhibitoro de G9a kaj GLP, BIX01294 (15-16), estis uzita por konstati ĉu enzim inhibicio simile influas kondutajn respondojn al kokaino. Efektive, farmakologia inhibado de G9a kaj GLP pliigis signife preferon por kokaino kaj malkreskis H3K9me2 en la NAc (Fig. 2F, G).
Ripeta administrado de kokaino pliigas la densecon de dendritaj dornoj sur NAc-meznivelaj neŭronoj (17), procezo asociita kun funkciaj ŝanĝoj ĉe ekscitemaj glutamaterikaj sinapsoj al tiuj neŭronoj (18-19) kaj sentivigis kondutajn respondojn al la drogo (17, 20). Ni tiel hipotezis, ke malreguligo de G9a-agado en la NAc per ripeta kokaino povus mediacii la kapablon de kokaino reguligi la dendritan dornan densecon de NAc-neŭronoj. Uzante kromatakinan kompensadon (ChIP) kun kontraŭ-G9a-antikorpon, ni identigis kelkajn supozajn genojn de G9a en la NAc, ĉiu el kiuj antaŭe estis implikita en kokaina dendrita plastikeco.Fig. 3A) (20-26). Ni trovis, ke ripetita kokaina administrado signife malpliigis G9a-ligadon, same kiel nivelojn de H3K9me2, ĉe ĉi tiuj genoj.Fig. 3B). Kontraŭe, akuta kokaina administrado rapide rekrutis G9a al iuj el ĉi tiuj samaj genaj reklamantoj, kongrue kun pliigita esprimo de G9a observata en la NAc 1-horo post akuta dozo de kokaino (Fig. S6). Kvankam G9a-ligado ĉe specifaj genaj reklamantoj korelacias kun ŝanĝoj en ĝia esprimo, restas neklare ĉu tiaj eventoj estas mediataj de ŝanĝitaj tutmondaj niveloj de G9a en la NAc kaj / aŭ per diferencoj en rekrutado de G9a post akra vs. ripetita kokaina administrado.
Surbaze de la reguligo de multnombraj plastec-genoj ĉe G9a en la NAc, ni ekzamenis rekte ĉu konservado de G9a-esprimo en ĉi tiu cerba regiono post ripeta kokaintrovo sufiĉis por bloki formadon de dendrita dorno en dorno. Uzante protokolon de traktado pri kokaino antaŭe elmontrita por antaŭenigi dendritan spino-indukton en la NAc.20), ni ekzamenis spino-densecon en bestoj injektitaj per HSV-GFP aŭ HSV-G9a. En konsento kun antaŭaj rezultoj, ni observis signifan pliiĝon de dendrita spino-denseco en la NAc post traktado de kokaino, efiko tute blokita de G9a troekspresado (Fig. 3C). Nur la troega esprimo de G9 ne sufiĉis por malpliigi NAc dendritan spino-densecon en la manko de kokaino. Por kompletigi ĉi tiujn datumojn, G9afl / fl musoj ricevis in-NAc-injektojn de HSV-Cre kaj spina denseco estis kvantumita kaj komparita al bestoj ricevantaj HSV-GFP en foresto de kokaino. Knokaŭro de G9a-esprimo signife pliigis dornodensecon ĉe NAc-mezvundaj neŭronoj (Fig. 3C).
Donita la evidenteco ke G9a malregulaĵo en la NAc post ripetita kokaino estas mediaciita de ΔFosB, ni sekve ekzamenis ĉu ĉi tiu transkripta faktoro estas same implikita en la regulado de NAc dendritaj dornarbaroj. Kvankam ΔFosB ne antaŭe estis ligita kaŭzeme al tia dendrita plastiko, kelkaj el ĝiaj celoj, inkluzive de Cdk5 kaj NFκB-subunuoj, estis tiel implikitaj. (20-23), kaj la konstanta esprimo de FosB en neŭronoj de NAk correlatas kun pliigita denseco dendrítica de la dorno post traktado ripetita de kokaino (27). Unue, ni trovis ke indukto de ΔFosB en bitransenaj musoj en foresto de kokaino, kiu malreguligis esprimon de G9a kaj H3K9me2.Fig. 1D, E), malpliiĝis G9a ligadon al multaj plastaj genoj, multaj el kiuj ankaŭ estis rektaj celoj de ΔFosB mem (Fig. 3D) (3, 6). Ni poste montris, ke surmezura viruso de osFosB en la NAc pliigis signife la densecon de dendrita dorno sub basaj kondiĉoj, simila al tiu observata post ripeta kokaina administrado (Fig. 3E). Kontraŭe, la sobreexpresión en la NAc de ΔJunD, proteino de negativa mutante reganta kiu antagoniza la aktiveco transcripcional ΔFosB, ĝi blokis la kapablon de ripetita kokaino por pliigi la formadon de dorno cráneo dendrítica en la NAc. (Fig. 3C).
Nia observo, ke BFosB reguligas la esprimon de G9a en la NAc, kaj ke ΔFosB kaj G9a reguligas iujn el la samaj celoj, kondukis nin ekzameni aliajn interagojn inter ΔFosB kaj G9a. Post akuta kokaino, kiam niveloj de G9a estis pliigitaj, ligado de G9a al la fosB geno pliiĝis, dum post ripeta kokaino, kiam G9a esprimo estis subpremita, G9a ligas al la fosB geno malpliiĝis (Fig. 3A). Tia malpliigita ligo de G9a post ripetita kokaino ne estis observata c-fos, kie G9a ligo estas pliigita per ripetita kokaino (Fig. S7). Ĉi tio kongruas kun la fakto, ke, malkiel fosB, c-fos estas subpremita, ne induktita, per kronika psikostimulanta ekspozicio (5). La tropresprimo de FosB en bitransenaj musoj sufiĉis por signife malpliigi G9a-ligadon al la fosb geno (Fig. 3D). Plue, la troekspresado de G9 sufiĉis por redukti pliigitan esprimon de BFosB post ripeta kokaina administrado (Tablo S4). Ĉi tiuj datumoj sugestas aŭtoreguligan buklon per kiu G9a komence limigas indukton de ΔFosB per akuta kokaina administrado. Tamen, ĉar ΔFosB akumuliĝas per ripetata medikamenta ekspozicio, ĝi subpremas G9a kaj tiel plifortigas sian propran indukton.
Konklude, ni pruvis, ke histona lizina metilado en la NAc estas grave implikita en regulado de la genealogia esprimo en respondo al kokaino. Subpremo de G9a kaj H3K9me2 post ripeta kokain-administracio antaŭenigas kokainan preferon, parte, per la transskriba aktivigo de multaj genoj, kiuj reguligas aberencajn formojn de dendrita plasticeco. Akiri pli bonan komprenon pri la genoj regataj per tiaj mekanismoj plibonigos nian scion pri la kompleksa biologia bazo de drogodependeco kaj povus helpi la evoluon de pli efikaj traktadoj de dependigaj malordoj.
Materialoj kaj metodoj
Bestoj kaj kuracadoj
Krom se alie dirite, musoj estis loĝigitaj kvar al kvin por kaĝo en kolonio kun 12-horo malpeza / malhela ciklo (lumoj de 7: 00 AM ĝis 7: 00 PM) je konstanta temperaturo (23 ° C) kun ad libitum aliro al akvo kaj manĝo. Ĉiuj bestaj protokoloj estis aprobitaj de IACUC ĉe ambaŭ UT Southwestern Medical Center kaj Mount Sinai School of Medicine.
Por kokainaj eksperimentoj [imunohistoquímica, okcidenta makulaĵo, kvanteca PCR (qPCR), mikroarray-analizo kaj kromatina inmunoprecipitación (KIP)], 8- al 10-semajnaj malnovaj masklo C57BL / 6J estis uzataj. Bestoj ricevis ĉiutagajn injektojn de ambaŭ 'salaj' (saleca traktado 7, ip), "akra" kokaino (salaj traktadoj 6 + unu kuracado 20 mg / kg koka-HCl, ip) aŭ "ripetita" kokaino (7-traktadoj 20 mg / kg kokaino-HCl, ip). Musoj estis oferitaj en 1-horoj aŭ 24-horoj post la fina kuracado. Por microarray studoj, bestoj estis traktitaj ĉiutage kun aŭ "sala" (15 traktadoj sala, ip), "akra" kokaino (14 traktadoj sala + 1 traktado 20 mg / kg kokaino-HCl, ip), 'ripetita + akra' kokaino 7-kuracadoj salaj + 8-traktadoj 20 mg / kg kokain-HCl, ip) aŭ 'ripeta retiriĝo + akuta' kokaino (7-traktadoj 20 mg / kg kokain-HCl + 7 salaj + 1-traktado 20 mg / kg kokain-HCl, ip) kaj estis oferitaj XNUMO horojn post la fina kuracado. En kondutaj eksperimentoj, musoj estis solece loĝigitaj post kirurgio kaj estis traktitaj per 1 mg / kg kokain-HCl, kiel priskribis sube. Por dendrita spino analizo kaj microarray validación post HSV-GFP kaj HSV-G10a-GFP infekto, musoj estis traktitaj kun "sala" (9 traktadoj sala, ip) aŭ "ripetita kokaino" (5 traktadoj 5 mg / kg kokaino-HCl, ip ) dum kurso de 20-tagoj, ĉar ĉi tiu injektada protokolo estis pruvita antaŭe pliigi dornodensecon ĉe nukleoj de kerno accumbens (NAc) ene de la tempodaŭro de la transgena esprimo de Herpes simplex viruso (HSV)Suplementa ref S1). Musoj uzitaj por dendrita spina analizo estis oferitaj 4 horojn post la lasta kuracado.
Por indukti lokan forigon de la G9a-transskribo limigita al NAc-neŭronoj, ni uzis mutaciajn musojn homocigotas por floksita G9a alelo, kiu estis detale priskribita aliloke (S2). Rec-induktita rekombino produktas ekson 22 al 25 ekster kadro-splisado kondukante al sensencaĵo-mediaciita kadukiĝo de la mutaciita transskribaĵo. Ni uzis G9a-floksitajn musojn, kiuj estis plene transigitaj al musoj C57BL / 6J. Musoj estis sterotike injektitaj en la NAk kun Adeno-asociita viruso (AAV) vektoroj (serotipo 2) esprimante GFP aŭ Cre-GFP inter la aĝo de 7 kaj 10 semajnoj. La analizo inmunohistoquímico uzis por kontroli la eficiencia de la recombinación mediada por Cre (vidu Suplementa Fig. S5). Ni uzis AAV-injektitajn bestojn 21-tagojn post-kirurgio ĉar rekombino en G9a-floksaj musoj estis stabila kaj maksimuma ĉe ĉi tiu tempo-punkto, kongrue kun eldonitaj raportoj (S3-S4). Eksperimentoj surkspresivaj de G9a kaj ΔJunD estis same faritaj uzante vektorojn de HSV-viruso esprimantaj ĉu GFP, sovaĝa speco G9a-GFP, G9aH1093K-GFP aŭ ticJunD-GFP (vidu S2 por detaloj pri la disvolviĝo de konstruoj de G9a). Oni uzis HSV-tro-esprimantajn musojn 3-tagojn post-kirurgio, ĉar tro-esprimado estis maksimuma ĉe ĉi tiu tempo-punkto, kiel observata per imunohisto-kemia. Pro la pasema naturo de HSV-esprimo, kaj la konsiderinde pli stabila naturo de AAV-esprimo, HSV-vektoroj estis uzitaj en eksperimentoj postulantaj rapidan, mallongatempan transgenan esprimon, dum AAV-vektoroj estis uzitaj en eksperimentoj postulantaj etendajn periodojn de transgena esprimo. Ambaŭ vektoroj estis montritaj, en ampleksaj antaŭaj studoj, por infekti nur neuronajn ĉelajn korpojn ene de la injektita cerba areo, sen iu ajn infekto de aferaj aŭ eŭentaj neŭronoj.
Por kondutaj eksperimentoj uzantaj la farmakologian G9a / GLP-inhibitoron, BIX01294 (25 ng / μl), musoj estis enmetitaj sterotike kun du subcutane mini-bomboj, same kiel duflankaj gvidaj kanoloj, en la NAc. Mini-bomboj estis aktivigitaj 12 horojn antaŭ enplantado komencanta la kontinuan liveron (0.25 μl / horo) de ĉiu veturilo (5-hidroxipropil-β-ciclodextrina) aŭ medikamento por 14-tagoj, dum kiuj tempo kondutaj taksadoj estis faritaj.
Por ΔFosB-sur-esprimaj eksperimentoj [okcidenta makulaĵo, qPCR, kaj KIPO], masklaj bitransenaj NSE-TTA × tetOP-ΔFosB musoj estis uzataj (10 semajnaĝa), per kiuj manko de tetraciklin derivaĵo doksiciclino (8-semajnoj for docekiklinon), bestoj montris fortan striatecan restriktan esprimon de ΔFosB (S5). Surtergaĵo de xFosB en ĉi tiuj musoj estis konfirmita per qPCR. Konfirmi trovojn per NSE-TTA × tetOP-ΔFosB musoj, sovaĝaj specoj 8-semajna C57BL / 6J-masklaj musoj estis sterotike-injektitaj intra-NAc kun AAV-vektoroj esprimantaj ĉu GFP aŭ ΔFosB-GFP. AAV-vektoroj estis uzitaj, en ĉi tiu kazo, por certigi maksimuman atFosB-esprimon ĉe 8-semajnoj post-kirurgio, permesante rektan komparon inter virale infektitaj kaj bitransgeniaj ΔFosB troeksprimaj musojn. Survizaĵo viral estis konfirmita uzante qPCR ĉe 8 semajnoj post kirurgio (15-mezurilaj NAc-pikoj estis sekcitaj sub la injektloko). AAV-GFP kaj AAV-ΔFosB-GFP troeksprimas musojn, kiuj ne estis uzataj por qPCR, estis traktitaj per salaj (14-traktadoj sala, ip) aŭ ripetita kokaino (14-traktadoj 30 mg / kg kokain-HCl, ip) komenciĝante ĉe 6 post semajnoj kirurgio. ĈAPITRO X post la fina kuracado, cerbo estis fiksita kun 4% paraformaldehido, sekcita sur vibratome kaj uzata por dendrita spino analizo.
Analizo de okcidenta blotado
Punzoj de 14-mezurilo NAc estis prenitaj de 1-koronaj sekcioj akiritaj per neoksidebla muskola cerba matrico kaj estis sonigitaj en 1 M HEPES liza-bufro (1% SDS) enhavanta proteasejojn kaj fosfatazajn inhibilojn. 10-30 μg specimenoj de totala proteino estis elektroforeitaj sur 18% SDS-ĝeloj. Proteinoj estis transdonitaj al PVDF-membranoj kaj kovataj per ĉu kontraŭ-H3K9me2 (musmoclonal, 1: 500), anti-β-tubulino (muskolona, 1: 60,000), kontraŭtotala histon H3 (kuniklo poliklona, 1: 5,000), anti-GFP (uzita por konfirmo de egala virala esprimo en truita histo) (kuniklo poliklona, 1: 1000), kontraŭ-H3K27me3 (kunikla poliklona, 1: 500) aŭ kontraŭ-aktina antikorpoj (muskla monoclonal, 1: 60,000) dumnokte ĉe 4 ° C (ĉiuj membranoj estis blokitaj en 5% lakto aŭ 5% bovaj serumalbumino). Membranoj tiam estis kovataj de peroksoksaj markitaj antikorpoj (1: 15,000)-1: 60,000 dependanta de la primara antikorpo uzata) kaj bandoj estis bildigitaj per substrato SuperSignal West Dura. Bandoj estis kvantumitaj kun NIH Bildaro J Programaro kaj H3K9meXmeXmX-bandoj estis normaligitaj al aŭ actino aŭ β-tubulino kaj al totala histono H2 por kontroli por egala ŝarĝo. Ripetita kokaino ne efikis sur niveloj de actino (Fig. S8) aŭ totala histono 3 (Fig. S1) en la NAc. Krome, HSV-G9a-GFP kaj HSV-G9aH1093K-GFP-infekto havis neniun efikon al tutaj niveloj de β-tubulino en la NAc.Fig. S8).
Immunohistoĥemio
Musoj estis seditaj per mortiga dozo de klorala hidrato kaj perfuzita kun 4% paraformaldehido antaŭ esti analizitaj per ununura aŭ duobla imunohistohmo kiel antaŭe priskribita (S6). Mallonge, post-fiksitaj cerboj estis kovataj ĉe ĉambra temperaturo dum la nokto en 30% sakarozon antaŭ esti apartigitaj ĉe 35 μm (cerboj uzitaj por dendrita spina analizo estis apartigitaj sur vibratomo ĉe 100 μm-sekcioj en la foresto de 30 μm sakarozo). Senpaga-flosigaj NAc-sekcioj estis lavitaj per 1X PBS, blokita (3% normala azeno, 0.1% tritonX, 1X PBS) kaj poste kovataj per kontraŭ-GFP (koksaj policlonaj, 1: 8000) kaj / kontraŭ-G9a (kuniklo policlonalaj). , 1: 500) antikorpoj en blokado de solvo. Sekcioj analizitaj por dendritaj dornoj estis kovataj per kuniklaj poliklonaj anti-GFP-antikorpoj ĉe 1: 200. Post nokta inkubacio, NAc-sekcioj estis enjuĝitaj 3-fojoj por 10-minutoj kun 1X PBS, sekvita de kovado kun Cy2 kaj / aŭ Cy3-fluoreskaj sekundaraj antikorpoj en 1X PBS-blokado solvo por 2X PBS-horoj. Sekcioj uzitaj por morfologiaj studoj estis kovataj de sekundara antikorpo sub ĉirkaŭ temperaturo. Nuklea ko-makulado estis atingita kovante sekciojn en 1X PBS enhavanta DAPI (1: 50,000) por 10-minutoj. Sekcioj denove estis lavitaj, sekvitaj de etanola deshidratación kaj muntado kun DPX. Ĉiuj sekcioj estis bildigitaj per mikroskopio.
Izolado de ARN kaj QPCR
Duflankaj 14-kalibraj NAc-stampiloj estis homogenigitaj en Trizol kaj prilaboritaj laŭ la instrukcioj de la fabrikanto. RNA estis purigita per RNAesy Micro-kolonoj kaj spektroskopio konfirmis, ke la porcioj RNA 260/280 kaj 260/230 estis> 1.8. RNA tiam estis inversa transskribita uzante Bio-Rad iScript Kit. cDNA estis kvantigita per qPCR per SYBR Green. Ĉiu reago estis duobligita aŭ triobligita kaj analizita laŭ la metodo ΔΔCt kiel antaŭe priskribite uzante gliceraldehidon-3-fosfatan dehidrogenazon (GAPDH) kiel normaligan kontrolon (S7). Vidu suplementa Tabelo S5 por mRNA-prilabori sekvencojn.
Analizo de DNA-mikroerĉoj
Kvar grupoj (3-sendependaj biologiaj reproduktoj per grupo) estis uzitaj por la mikrostroma studo, kun tuta 12-mikroarraoj. NENIAM horon post la lasta kokaina injekto, bestoj rapide senkapabligis kaj cerboj estis forigitaj kaj metitaj sur glacion. Diseksoj de NAc estis prenitaj uzante 1-mezurilajn pinglopinton kaj estis rapide frostigitaj sur seka glacio ĝis RNA estis eltirita. Duflankaj stampiloj estis kunigitaj de kvar bestoj po reproduktado, kun tuta 15-musoj por grupo. Izolado de ARN, prilaborado de mikroarray kaj analizo de datumoj estis faritaj kiel antaŭe priskribita (S8). Mallonge, RNA estis izolita kaj purigita kiel priskribite supre kaj estis kontrolita pri kvalito per Bioanalizilo de Agilent. Inversa transskribo, plifortigo, etikedado kaj hibridigo al Illumina MouseWG-6 v2.0-tabeloj estis plenumitaj per normaj proceduroj per la mikro-kerna kerno de UT Southwestern. Krudaj datumoj estis fono subtrahitaj kaj kvantigitaj normaligitaj per Beadstudio-programaro. Normaligitaj datumoj estis analizitaj per GeneSpring-programaro kaj genelistoj estis generitaj per signifaj kriterioj de 1.3-obla ŝanĝo-limo kunigita al ne-strikta p-valora detranĉo de p <0.05.
Ni konservas altan gradon de konfido al ĉi tiuj datumoj pro pluraj kialoj. Unue, ĉiuj bestoj estis manipulitaj, traktitaj kaj mortigitaj samtempe sub la samaj kondiĉoj. Ankaŭ, ĉiuj RNA-kaj-aranĝprilaborado estis faritaj samtempe. Due, ni plenumis triplikatajn arojn kaj kunmetis multoblajn bestojn per tabela specimeno, tiel minimizante diferencojn pro individua variado kaj kreskanta statistika potenco (S9). Trie, la kriterioj de uzata analizo de datumoj por nia studo estas rekomenditaj de la projekto pri kontrolo de kvalito MicroArray, ĉar ĉi tiuj kriterioj estis validigitaj por provizi altan gradon de interkruciĝa reproduktebleco kaj reproduktebleco inter kaj intra-transformo (S10-S11).
Konstruado de vektoraj vektoroj
Pro viraj vektoraj insercaj grandecoj limoj, kodigaj sekvencoj por ĉu sovaĝa speco G9a (G9a) aŭ katalike mortinta G9a (G9aH1093K) estis subclonitaj en la bicistronic p1005 + VS plasmido esprimanta GFP sub la kontrolo de la homa tuja frua citomegalovira iniciatinto (CMV) (la G9a insercada grandeco estis ~ 3.96 kb, kiu superas la maksimuman enmetan grandecon por AAV-2-vektoroj). La IE4 / 5-reklamanto pelas la esprimon de G9a. Fragmentoj estis subklonitaj en la bicistronan p1005 + HSV-plasmidon per malakraj finaj ligadoj kun Klenow-traktita PmeI kaj EcoRI digestita G9a (de pcDNA3.1) kaj CIP traktis p1005 + laŭ EcoRI-digesto. Por produktado de HSV-DJunD-GFP, la kodsekvenco de ΔJunD laŭflankita de EcoRI-restriklokoj estis generita per PCR uzante unue oligonucleotidojn enhavantajn la EcoRI-ejon. La PCR-produkto tiam estis ligita en la EcoRI-ejon de la p1005 +-vektoro. Loka esprimo de Cre recombinase en NAc-neŭronoj estis atingita per vir-mediata ĝena livero uzante AAV-vektoron kiel priskribita (S12). GFP aŭ N-fina fuzio de GFP al Cre estis subclonita en rekombinanta AAV-2-vektoro enhavanta CMV-reklamanton kun interpunkcio donanto-akceptanta vico kaj poliadeniladsignalo. Ĉiuj vektoraj insercoj estis konfirmitaj per dideoxi-sekvencado. Viraj vektoroj estis produktitaj uzante tri-transfecion, help-liberan metodon, kiel antaŭe priskribita (S13). Purigita viruso estis konservita ĉe −80 ° C. Viral kvalito estis taksita de infekta titolo pritaksita en ĉeloj HEK293. AAV-ΔFosB-GFP-virusoj estis same pretigitaj. Por HSV-Cre, Es esprimo estis pelita de IRES-reklamanto, kontraste al la IE4 / 5-reklama, por minimumigi Cre esprimon kaj malhelpi neuronal toksecon. S14 por vira konstruo). En ĉiuj kazoj, validigis sur-esprimon, ambaŭ en vitro kaj en vivo, per qPCR, kaj virusoj estis imunohistokemike konfirmitaj por montri NAc-limigitan esprimon post kirurgio.
Stereotaka kirurgio
Sub ketamino (100 mg / kg) / xilazino (10 mg / kg) anestezo, musoj estis enmetitaj en malgrand-bestan stereotaksa instrumento, kaj la krania surfaco estis eksponita. Tridek-tri kalibraj injektiloj estis uzitaj por bilateral infuzi 0.5 μl de viruso en la NAc ĉe 10 ° angulo (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) kun rapideco de 0.1 μl / min. Bestoj ricevantaj HSV-injektojn povis refreŝiĝi por 2-tagoj post kirurgio, dum musoj uzitaj por kondutaj testado ricevantaj AAV-vektorojn rajtis rekuperi por 20-tagoj antaŭ ol esti submetitaj al lokokondiĉo. Ĉi tiuj tempoj kongruas kun la periodoj de maksimuma vir-mediada transgeneca esprimo por la du vektoroj. Por BIX01294-infuzaĵoj, ĉiu el la du mini-bomboj estis poziciitaj subkure sur la musa dorso. Kanulaj allokigoj estis atingitaj per borado de du malgrandaj kraniaj truoj super la NAc, kaj per la transdono de la kanulo de bregma (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4). Musoj rajtis resaniĝi de kirurgio por 4 al 5-tagojn antaŭ ol komenci la lokkondiĉan procedon al kokaino kiel priskribita sube.
Kondiĉa loko prefero
La lokkondiĉa procedo estis farita kiel antaŭe priskribita, kun la sekvaj modifoj (S7). Mallonge, 3 tagojn post intra-NAc-infuzaĵoj de HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP aŭ HSV-GFP, musoj estis metitaj en la kondiĉajn ĉambrojn, kiuj konsistas el tri apartaj medioj. Musoj, kiuj montris signifan preferon por iu el la du kondiĉaj ĉambroj, estis ekskluditaj de la studo (<10% de ĉiuj bestoj). Kondiĉigaj grupoj tiam estis ekvilibrigitaj por adaptiĝi al iu ajn ĉambra antaŭjuĝo, kiu eble ankoraŭ ekzistas. En postaj tagoj, bestoj estis injektitaj kun saloza kaj limigitaj al unu ĉambro posttagmeze dum 30 minutoj kaj poste injektitaj al kokaino (10 mg / kg, ip) kaj enfermitaj dum 30 minutoj al la alia ĉambro vespere dum 2 tagoj (du salo kaj du kokainaj paroj). En la tago de la testo, musoj estis metitaj reen en la aparaton sen kuracado dum 20 minutoj kaj testitaj por taksi kiun flankon ili preferis. Lokomotoraj respondoj al kokaino estis taksitaj per radiaj paŭzoj en la kokainaj ĉambroj por certigi efikecon de drogokuraco. Por AAV kaj BIX01294 CPP-eksperimentoj, iomete modifita protokolo estis uzata. Bestoj denove estis injektitaj kun salo aŭ kokaino (10 mg / kg, ip) kaj limigitaj al specifaj ĉambroj por 30 minutaj kunsidoj, sed anstataŭe estis kondiĉigitaj nur unufoje tage dum 4 tagoj, sekvitaj de la testo en la 5a tago (bestoj estis kondiĉigitaj vespere kaj kondiĉigaj traktadoj alterniĝis). Por ĉiuj grupoj, baza lokomotivo responde al sala salo estis taksita por certigi, ke lokomotivo ne estis trafita de virusa aŭ inhiba traktado.
Intravena kokainfabrikado
Masklaj adoleskaj Long-Evans-ratoj, pezantaj 230-250 g komence de la eksperimento, estis akiritaj. Ili estis enhavataj en humida- kaj temperaturo-kontrolita medio sur inversigitan 12-horan lumon / malhelan ciklon (lumoj malŝaltitaj ĉe 9: 00 am) kun ad libitum aliro al manĝo kaj akvo. Ratoj rajtis alklimatigi ilin en sia nova medio kaj estis manipulitaj ĉiutage por 1 semajnon antaŭ la komenco de la eksperimento. Ĉiuj procedoj estis faritaj laŭ la Gvidilo por la Prizorgo kaj Uzo de Laboratorioj, laŭ la Nacia Instituto de Sano, kaj estis aprobitaj de la Komitato pri Bestoj-Zorgoj de Monto Sinaj. La mem-administrada ekipaĵo estis ekipita per transruĝaj traboj por mezuri lokomotoran konduton. Mem-administrado estis farita kiel antaŭe priskribita (S15-S16) kun kateteroj enplantitaj en la dekstran jugolan vejnon sub izoflurano (2.4-2.7%) anestezo. Kateteroj estis flulavitaj kun 0.1 ml de sala solvaĵo enhavanta 10 U-heparinon kaj ampicilinon (50 mg / kg). Post unu semajno de resaniĝo post kirurgio, memadministrada trejnado komenciĝis dum la malhela fazo de la luma / malhela ciklo. Bestoj rajtis 3-horan ĉiutagan aliron al kokaino (0.75 mg / kg / infuzaĵo) laŭ fiksa rilatuma-1 (FR1) plifortiga horaro, kie 1 aktiva levila gazetaro rezultigis ununuran infuzaĵon de drogo. Ratoj stabiligis sian kokainan konsumadon post 6 tagoj (<15% -varia respondo-rapideco dum 3 sinsekvaj tagoj, kun almenaŭ 75% respondantaj per la plifortigita levilo). 24 horojn post la fina memadministra kunsido, ratoj estis rapide senkapigitaj, cerboj rapide forigitaj kaj prilaboritaj por izolado de RNA kaj qPCR.
Senromprecipigo de kromatina (ChIP)
Freŝaj NAc-pugnoj estis formaldehido inter-ligitaj kaj pretaj por ChIP kiel antaŭe priskribite (S17-S18) kun malgrandaj modifoj. Mallonge, Xnumx 4-mezurilaj NAc-pikoj per animalo (14-bestoj kunigitaj per specimeno) estis kolektitaj, inter-ligitaj kun 5%-formaldehido kaj estingitaj per 1 M-glikino antaŭ frostiĝo ĉe −2 ° C. 80 tago antaŭ specimeno sonication, ŝafoj anti-kuniklo / muso (depende de precipitaĵo antikorpo) IgG magneta bildoj estis preparitaj por kovado taŭga magneta bidoj kun aŭ anti-G1a (kuniklo policlonal ChIP grado) aŭ anti-H9K3me9 (muso monoclonal ChIP grado) antikorpoj dumnokte ĉe 2 ° C sub konstanta rotacio en bloka solvo. Sonicación de ŝtofoj kaj cizallamiento de la cromatina efektivigis kiel ĝi priskribis antaŭe.S17). Post soniko, egalaj koncentriĝoj de cromatina estis transdonitaj al novaj tuboj kaj ~ 5% de la finaj produktoj estis ŝparitaj por servi kiel 'eniga' kontroloj. Post plena lavado kaj resuspendo de la konjugaciita bidaĵo / antikorpa miksaĵoj, egalaj volumoj de antikorpo / bendaj miksaĵoj (~ 7.5 μg-antikorpo / specimeno) estis aldonitaj al ĉiu kromatina specimeno kaj kovataj por 16-horoj sub konstanta rotacio ĉe 4 ° C. Specimenoj estis plu lavitaj kaj inversaj interligitaj ĉe 65 ° C dumnokte antaŭ DNA purigo uzante PCR puriga ilaro. Post purigado de DNA, specimenoj estis submetitaj al qPCR kaj estis normaligitaj al siaj taŭgaj "eniga" kontroloj kiel antaŭe priskribite (S17). Normala imunoprecipitaciones de IgG de muso uzante antikorpo policlonal anti-IgG de muso ankaŭ efektivigis por kontroli la taŭgan riĉiĝon de la amplificación de la signalo. La adenina fosforibosiltransferase (APRT) estis uzata kiel negativa kontrolo por eksperimentoj de troeksprimo de kokaino kaj ΔFosB. Vidu Suplementa Tablo S5 por reklam-komencaj sekvencoj.
Analizo de dendrita dorno
Por studi la rolon de G9a en la regulado de neurona morfologio in vivo, ni uzis metodojn antaŭe priskribitajn kun la sekvaj modifoj (S1). Tri tagojn post injekto de HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-DJunD-GFP (ĉiuj virusoj estis uzitaj en sovaĝaj tipoj C57Bl / 6J-musoj), aŭ HSV-Cre-GFP (uzita en G9afl / fl musoj), kiam vira esprimo estis maksimuma, musoj perfuziĝis, cerboj estis krioprotektitaj kaj poste apartigitaj ĉe 100 μm sur vibravoma. Sekcioj estis tiam imunorektitaj uzante antikorpon kontraŭ GFP kiel priskribita supre (vidu Immunohochimistry). Por taksi la efikojn de sobrepresión de G9a kaj knockout en numeroj de kolumno vertebral, tiel kiel la efekto de sobreexpresión DJunD, ni mezuris la numeron de dornoj sur neŭroj de 1-2 por neŭrono kiu egalas almenaŭ 299 μm de duonaj dendritas de GFP. dornaj neŭronoj (MSN). Ĉar MSN-oj estas morfologie diferencaj de aliaj neŭronaj populacioj de la NAc, same kiel antaŭaj raportoj indikantaj, ke HSV infektas ĉefe DARPP-32-esprimantan neŭronojn en ĉi tiu cerba regiono (S19), ni certas, ke MSNoj estis ekskluzive taksitaj en ĉi tiuj studoj. Por ĉiu besto, ni ekzamenis ~ 6-8-neŭronojn en 3-4-bestoj per grupo (7-grupoj), post kiu meza valoro estis akirita por ĉiu besto por statistika analizo. Eksperimentoj dizajnitaj por ekzameni la efikojn de sururba esprimo de BFosB sur dina spino-denseco estis portitaj simile al tiu priskribita supre, escepte ke AAV-vektoroj estis uzataj por esprimi GFP aŭ ΔFosB-GFP dum longaj periodoj (8-semajnoj). Ĉiuj HSV-bildoj estis kaptitaj uzante konfokan mikroskopon kun 100X oleo-mergi objektivon (AAV-bildoj estis kaptitaj kun 63X oleo-mergi celon). Bildoj estis akiritaj kun la stenifiko fiksita ĉe 1 arbitra unuo kaj 1024 × 1024-kadro-grandeco. La dendrita longo estis mezurita uzante NIH Image J-programaron, kaj spina nombroj estis kalkulitaj kiel blindaj de la ĉefa eksperimentanto, ĉar glitiloj estis koditaj antaŭ eksperimenta skanado. La averaĝa nombro de dornoj laŭ 10 μm de dendrita estis kalkulita.
Statistika analizo
Unu-du-manieraj ANOVA-oj estis faritaj por determini signifon por kondiĉita loko-prefero kaj analizo de dendrita dorso kun pli ol du grupoj. Student-t-testoj estis uzitaj por aliaj komparoj inkluzive de qPCR, western blot, dendrita spino analizo komparante HSV-GFP al HSV-Cre en G9afl / fl musoj, mikroaraj analizoj (vidu supre) kaj eksperimentoj pri imunoprecipitaj kromatinoj. La provoj de laŭplana studento estis uzataj post dudirekta ANOVA-analizo de dendrita spina denseco post ΔFosB-troesprimo kun konfirmo de signifaj ĉefaj efikoj de drogokuraco kaj viruso. Ĉiuj valoroj inkluzivitaj en la figuraj legendoj reprezentas meznombro ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Detalaj statistikaj analizoj por Figs. 1-3 en la ĉefa teksto estas en: Detalaj figuroj Legendoj Inkluditaj Statistikoj.
Piednotoj
Mi atestas, ke neniu el la materialoj inkluzivitaj en la manuskripto rajtas Esenca Rolo de la Histona Metiletransferazo G9a en Kaŭzita-inducida Plasticeco antaŭe estis publikigitaj aŭ pripensitaj aliloke, inkluzive interrete.
Ĉiu laboro kun la uzo de bestoj estis farita laŭ instituciaj kaj IACUC-gvidlinioj ĉe la Universitato de Teksaso Sudokcidenta Kuraca Centro kaj Mount Sinai School of Medicine.
Referencoj kaj Notoj
;
