Transira neŭrona inhibicio montras kontraŭajn rolojn de nerektaj kaj rektaj vojoj en sentivigado (2011)

abstrakta

Malgraŭ la superfortaj negativaj konsekvencoj de drogmanio, psikostimulanta uzado kaj misuzo restas ĝenerala. La progresado de komenca drogeksponiĝo al regula uzo kaj finfine al deviga, kutima konduto kaj la perdo de inhiba kontrolo implikas serion de molekulaj adaptoj en diskretaj neŭrocirkvitoj.^1,2,3. La striato estas identigita kiel ŝlosila loko por multaj el la kondutaj kaj neurobiologiaj adaptiĝoj opiniitaj por formi la kernajn procezojn, kiuj mediacias toksomanion.^1,2,3. La plimulto de neŭronoj ene de la striatumo (~ 95%) estas GABAergic meza spina projekciaj neŭronoj (MSNoj) tĉapelo diferencas en sia neuropeptida esprimo kaj formas du gravajn eferajn vojojn⁴.

• Striatopalaj MSNoj enhavas enkepalinon (ENK) kaj formas la nerektan vojon
• dum striatonigraj MSNoj enhavas dinorfinon (DYN) kaj substancon P kaj formas la rektan vojon.

Multaj konceptaj modeloj hipotezas, ke ĉi tiuj loĝantaroj de MSN oponas unu la alian ambaŭ meisticanike kaj funkcie^5,6. Tamen, ekzistas malmulte da empiriaj evidentaĵoj por subteni ilian diferencan rolon en la kontrolo de konduto ĉar ĉi tiuj ĉelaj populacioj estas fizike intermiksitaj kaj morfologie nedistingeblaj, farante selekteblan manipuladon teknike.

Por ekzameni la rolon de ĉi tiuj striataj ĉelaj populacioj en la disvolviĝo de kondutoj okazantaj post ripetita ekspozicio al drogoj de misuzo, ni kombinis du novajn strategiojn: viralajn vektorojn, kiuj uzas aŭ la iniciatintoj de genoj ENK aŭ DYN por celi transgenan esprimon al neŭrotriaj aŭ striatonigraj neŭronoj. , respektive, kaj projektita GPCR (G_{mi / o}- kuplita homa muscarina M₄ DREADD; Designer-Ricevilo Ekskluzive Aktivigita de Projektisto-Drogoj; hM₄D)⁷ tio estas aktivigita de alie farmakologie inerta ligando, clozapine-N-oksidon^8,9 (CNO; Fig. 1a, h). Post esprimo en kulturitaj neŭronoj, administrado de CNO stimulas G_{mi / o}-kombinita hM₄D-riceviloj tiel aktivigantaj interne rektigantajn kanalajn 3 (Kir3) kanalojn, rezultigante membranan hiperpolarizon kaj transigan neuronal silentigon.⁹.

  

figuro 1

Transira kaj laŭcela mildigo de stria ĉela signalado. (a, h) Amplicon-mapoj de pENK-hM₄D/pENK-GFP (a) kaj pDYN-hM₄D/pDYN-GFP (h) celantaj vektoroj. (b, mi) Konflikta mikroskopo montris, ke pENK-hM₄D riceviloj estis selekteme esprimitaj en striatopalaj ...

Por testi la ĉelan fenotipan specifecon de la viralaj vektoroj, ni uzis duoble-etiketan imunofluoreskan mikroskopion sekvantan dorsan striatuman infuzaĵon de virusoj (Suplementa Fig. 1) kiu esprimas hemagglutinin-etikeditan hM₄D-riceviloj sub kontrolo de aŭ la ENK-iniciatinto (pENK-hM₄D) aŭ la iniciatinto DYN (pDYN-hM₄D). Ni trovis ke pENK-hM₄D esprimo estis ĉefe en ENK-enhavaj MSNoj (90% de hemagglutininaj ĉeloj estis ENK +, 85 el 94; 6% el hemagglutininaj ĉeloj estis substanco P +, 4 el 70-ĉeloj; Fig. 1b) dum pDYN-hM₄D esprimo estis ĉefe en MS-anoj enhavantaj substancon P (95% de hemagglutininaj ĉeloj estis substanco P +, 109 el 115-ĉeloj; 5% el hemagglutininaj ĉeloj estis ENK +, 5 el 97-ĉeloj; Fig. 1i). Similaj rezultoj estis akiritaj post infuzaĵo de propagand-specifaj virusoj, kiuj esprimas verdan fluoreskan proteinonENK-GFP kaj pDYN-GFP; Suplementaj Koloj. 2a kaj 3a).

Konsiderante ke striatopallidal MSNs ĉefe projektas al la globus pallidus eksteraj (GPe) kaj striatonigralaj MSN-projektoj ĉefe al la substantia nigra pars reticulata (SNpr), ni uzis injektojn de la retrograda trakfluo-Fluoro en ĉi tiujn cerbajn regionojn sekvitajn de duobla etiketa fluoreska imunohokimio. por konfirmi, ke la pENK kaj pDINANO virusoj cedis voj-specifan infekton. Ni observis, ke pENK-GFP ĉeloj ko-lokalizitaj kun striata Fluoro-Ora esprimo sekvante infuzaĵojn en la GPe sed ne la SNpr (Suplementa Figuro 2b) dum pDYN-GFP ĉeloj ko-lokalizitaj kun striata Fluoro-Ora esprimo sekvante infuzaĵojn en la SNpr sed ne la GPe (Suplementa Figuro 3b). Esprimo de la viralaj vektoroj ne ŝanĝis la nombron de ENK + aŭ substanco P + neŭronoj en la regiono de viralaj infektoj, sugestante, ke uzo de ĉi tiuj iniciatantoj por viral-mediaciitaj genaj translokigoj ne interferis kun endogenaj neuropeptidaj niveloj. Ĉiuj ĉi tiuj rezultoj pruvas, ke la pENK kaj pDINANO viralaj vektoroj esprimas genojn en siaj adekvate apartigitaj striaj ĉelaj populacioj.

Kvankam hM₄D-receptor-bazitaj teknikoj pruviĝis moduli aktivecon de aliaj neŭronaj tipoj⁹, ilia kapablo tuŝi striajn neŭronojn ne estis ekzamenita. Tial ni infektis neŭtriajn mezajn spinecajn neŭronojn per hM₄D-riceviloj sub la kontrolo de iniciatinto de herpes simplex virus (HSV), preparis koronajn tranĉaĵojn de dorsal striatumo du tagojn poste, kaj ekzamenis kiel hM₄D-esprimaj mezaj spinaj striaj neŭronoj respondas al CNO. Ni observis, ke loka apliko de CNO (10 μM) kaŭzis hiperpolarizon de la membrana potencialo (~ 7 mV, la baza membrana potencialo alĝustiĝis al −80 mV; Fig. 1c) kaj reduktis la enigan reziston de la neŭronoj post CNO-apliko (Fig. 1d, t.e.), sugestante, ke konducia kalio (t.e., Kir3-mediata kurento) estas aktivigita de CNO en hM₄Neŭron-esprimantaj riceviloj de D. Plue, perfuzado de CNO substance malpliigis la nombron da elvokitaj agoj potencialaj en hM₄D-esprimantaj neŭronoj, sed ne en kontrolaj ĉeloj, tiel efike malhelpante la funkcian eliron de la viral-infektitaj neŭronoj Esprimo de hM₄D-riceviloj sole ne ŝanĝis enigan reziston (P = 0.84) aŭ ago potenciala pafo (P = 0.64). (Fig. 1f, g). Prenitaj kune, ĉi tiuj datumoj sugestas, simile al hipokampaj neŭronoj⁹, la hM₄D / CNO-bazita metodo povas efike malpliigi la eksciteblecon de rat-striaj neŭronoj.

Kiel aldona pruvo de koncepto, ni testis ĉu hM₄D-riceviloj blokus neŭrotransmision en bone establita cirkvito kie neŭra aktiveco estas antaŭvideble elvokita de kondut-rilataj stimuloj. Laŭe, ni infektis neŭrajn ventrajn tegmentajn areojn (VTA) per hM₄D-riceviloj sub kontrolo de HSV-iniciatinto, kiu esprimas forte en dopaminaj neŭronoj¹⁰, kaj uzita rapid-skana cikla voltammetrio por mezuri ŝanĝojn en dopamina liberigo en la kerno acumbens post neatendita liverado de manĝaĵo rekompencas¹¹. Administrado de CNO signife mildigis manĝaĵon elvokitan de dopamina liberigo de nutraĵoj en la kerno akciuloj kompare kun veturilo (Suplementa Fig. 4). Finfine, ni testis ĉu malpliiĝanta aktiveco de specifaj neŭronaj ĉelaj tipoj en la striatumo en vivo povus ŝanĝi la kapablon de amfetamino stimuli Fos-esprimon. Psikostimuliloj, kiel amfetamino, estas fortikaj aktivuloj de ĉ.fosi en la striato¹² kaj pliiĝos c-fosi en ambaŭ striatonigraj kaj striatopalaj neŭronoj sub niaj eksperimentaj kondiĉoj¹³. Krom ĝia uzo kiel markilo de neurona aktiveco, psikostimulanta indukto de ĉ.fosi ĝi pensas ke ĝi ludas gravan rolon en la iniciato kaj bontenado de la neŭralaj adaptoj asociitaj kun psikomotora sensivigo^1,14. Ni trovis, ke CNO-mediata aktivado de pENK-hM₄D riceviloj signife reduktis la tutan nombron de c-Fos-induktitaj de amfetaminoj en la striatum (Fig. 1k kaj Suplementa Bildo. 5a). Ĉi tiu redukto okazis en ambaŭ hemagglutinin-pozitivaj neŭronoj (t.e., kiuj esprimas hM₄D-riceviloj) kaj hemagglutinin-negativaj neŭronoj (t.e., tiuj ne esprimantaj hM₄D-riceviloj; Fig. 1l), sugestante neŭronan interkrucan efikon inter hM₄D-esprimantaj neŭronoj kaj neinfektitaj neŭronoj. Signifaj reduktoj en la totala nombro de amfetamin-elvokitaj c-Fos-ĉeloj kaj en la nombro de hemagglutinin-pozitivaj c-Fos-ĉeloj ankaŭ estis viditaj kiam hM₄D-receptoroj estis aktivigitaj en rektaj vojaj neŭronoj (Fig. 1n, o kaj Suplementa Figuro 5b). Grave, ĉi tiuj efikoj ne estas simple kaŭzitaj de viral-esprimo de nova ricevilo ekde esprimo de ambaŭ pENK-hM₄D aŭ pDYN-hM₄D riceviloj en manko de CNO-traktado havis neniun efikon al la nombro de Fos-elvokitaj amfetaminoj (Suplementaj Figoj. 6 kaj 7). Tiel, ĉi tiuj trovoj pruvas, ke la CNO-mediata aktivado de hM₄D-riceviloj ankaŭ povas konduki al malpliiĝoj de neurona aktiveco reduktante liberigon de neurotransmisiloj kaj atenuadon de intracelula signalado.

Ripeta ekspozicio al toksomaniulaj drogoj povas konduki al progresiva kaj konstanta pliigo de kondutisma respondeco, ofte nomata kondutisma sentivigo. Grave, sentivigado implikas iujn el la samaj neŭralaj cirkvitoj implikitaj en la disvolviĝo de homa drogmanio³. Ĉi tie ni uzas niajn novajn ilojn por esplori la efikon de cirkum-specifa malpliiĝo de stria neurona agado sur la disvolviĝo de amfetamina sentivigo. Ni hipotezis, ke rektaj kaj nerektaj vojaj neŭronoj havas kontraŭajn rolojn, kie striatonigraj neŭronoj antaŭenigas sentivigadon kaj striatopallidalaj neŭronoj subpremas sentivigadon, konformajn al iliaj konceptaj proponitaj roloj en kondutisma aktivado kaj inhibicio respektive.^5,6. Sekve, ni testis, ĉu biokemie malpliiĝanta neŭrona ekscitemo de striatopalaj neŭronoj kaŭzus sentivigon al amfetamin-doza reĝimo, kiu eligas sojlan nivelon de sentivigo kaj ĉu malpliiĝanta neŭrona ekscitemo de striatonigraj neŭronoj malhelpos sensibilizi en protokolo, kiu normale produktas fortikan sensibilizadon.

Por la unua studo, ni uzis kuracan reĝimon, kiu induktas sojlan nivelon de lokomotora sentivigo en GFP-kontroloj (kvar drogaj ekspozicioj). Post retiriĝperiodo, modera defia amfetamina dozo (2 mg / kg) estis administrita en la foresto de CNO-induktita atenuado de neŭrona aktiveco por determini ĉu sensibilizado daŭras. CNO-mediaciita aktivado de pENK-hM₄D riceviloj dum amfetamina traktado ne ŝanĝis la akran lokomotivan respondon al amfetamino (Fig. 2). Tamen, CNO-mediaciita interrompo de neŭrona aktiveco en nerektaj vojaj neŭronoj faciligis la disvolviĝon de signife pli fortika sentivigo kompare al GFP-kontroloj (Fig. 2b). Ĉi tiu plibonigo de sentivigo konserviĝis pri la amfetamina defio, kondukita unu semajnon poste en foresto de CNO-kuracado (Fig. 2c, d). Ĉi tiuj efikoj povas esti atribuitaj al CNO-dependa redukto de aktiveco de striatopallidalaj neŭronoj per hM₄D-riceviloj ĉar hM₄Esprimo de ricevilo D sen CNO-traktado ne produktas lokomotivan sentivigon al ĉi tiu milda dosiga reĝimo de amfetamino (Suplementa Fig. 6).

  

figuro 2

Transdone reduktante eksciteblecon de striatopalaj aŭ striatonigraj neŭronoj havis kontraŭajn efikojn pri amfetamina sentivigo. (a, e) Akraj lokomotoraj respondoj al amfetamino post CNO-induktita aktivigo de pENK-hM₄D (a) kaj pDYN-hM₄D (e) Riceviloj. ...

Por determini ĉu striatonigraj neŭronoj povas reguligi respondon al drogoj kontraŭa maniero, ni poste testis la efikon de biokemie malpliiganta eksciteblecon de striatonigraj neŭronoj en la dorsomedia striatumo dum kuracilo de reĝimo de amfetamino, kiu produktas fortikan sentivigadon en GFP-kontroloj (ses drogaj ekspozicioj) ) same kiel dum malalta defia dozo de amfetamino (0.5 mg / kg) en manko de ricevilo-mediata interrompo de neurona agado. Kiel ĉe nerekta vojo malpliiĝanta, CNO-mediaciitaj malkreskoj de ekscitemo de rektaj vojaj neŭronoj dum amfetamina traktado ne ŝanĝis la akran lokomotivan respondon al amfetamino (Fig. 2e). Kvankam la evoluo de sentivigo aperis simila al la GFP-kontroloj post CNO-induktita aktivigo de pDYN-hM₄D riceviloj dum la kurac-fazo (Fig. 2f), sentivigo ne persistis en la pDYN-hM₄D grupo sed daŭre estis firme subtenita en la GFP-kontroloj (Fig. 2g, h). Ĉi tiuj efikoj ankaŭ povas esti atribuitaj al CNO-dependa malkresko de aktiveco de striatonigraj neŭronoj per hM₄D-riceviloj ĉar hM₄Esprimo de ricevilo D en la foresto de CNO-traktado ne blokis la disvolviĝon de lokomotora sensibilizado ĉar sensibilizado estis observita dum la kurac-fazo kaj sur la drog-defio (Suplementa Fig. 7). Ĉi tiuj datumoj sugestas, ke striatonigraj neŭronoj povas esti speciale gravaj por reguligi la longtempajn kondutajn adaptojn, kiuj estas konsekvenco de ripetita uzado de drogoj.

Konklude, ĉi tiuj datumoj donas la unuajn pruvojn por la kritikaj, kaj kontraŭaj, roloj de striatopalaj kaj striatonigraj neŭronoj en la regulado de drog-spertaj kondutaj plastoj.. Krome, la manko de efiko de neurona inhibo sur la akra lokomotora respondo al amfetamino donas pliajn pruvojn, ke la mekanismoj reguligantaj akrajn respondojn al drogoj diferencas de tiuj, kiuj modulas la daŭrajn adaptojn okazantajn kun ripetita drogeksponiĝo. Finfine, kombini fenotipajn specifajn viralajn vektorojn kun projektaj riceviloj kapablaj ŝanĝi neuronalan agadon sen konstante interrompi ĉelan funkcion provizas novan kaj potencan aliron por dekonstrui la molekulan bazon de toksomanio.

Suplementa Materialo

Dankojn

Piednotoj

Referencoj