abstrakta
Psikostimulanto-induktita ŝanĝo de dendritaj dornoj pri dopaminokeptaj neŭronoj en kerno accumbens (NAcc) estis supozita kiel adapta neurona respondo ligita al longdaŭraj kutimaj kondutoj. NAcc estas plejparte kunmetita de du apartaj subpopulacioj de mezgrandaj dornaj neŭronoj, kiuj esprimas altajn nivelojn de dopaminaj D1 aŭ D2-receptoroj. En la nuna studo ni analizis dendritan dornan densecon post kronika kokaintratado en distingaj D1 aŭ D2-riceviloj kun mezgrandaj spikaj neŭronoj en Nokc. Ĉi tiuj studoj uzis transgenajn musojn, kiuj esprimis EGFP sub la kontrolo de la D1 aŭ D2-ricevanta reklamanto (Drd1-EGFP aŭ Drd2-EGFP). Post 28-tagoj da kokaintrovo kaj 2-tagoj de retiro, spina denseco pliiĝis en ambaŭ Drd1-EGFP- kaj Drd2-EGFP-pozitivaj neŭronoj. Tamen, la pliiĝo de spino-denseco estis konservita nur en Drd1-EGFP-pozitivaj neŭronoj 30 tagojn post drogo retiriĝo. Notinde, pliigita esprimo de FosB ankaŭ estis observita en Drd1-EGFP- kaj Drd2-EGFP-pozitiva neŭronoj post 2-tagoj da drogo retiriĝo sed nur en Drd1-EGFP-pozitivaj neŭronoj post 30-tagoj da drogo retiriĝas. Ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke la pliigita spino-denseco observita post kronika kokaintratado estas stabila nur en D1-ricevilaj-neŭronoj kaj ke osFosB-esprimo estas asociita kun la formado kaj / aŭ konservado de dendritaj dornoj en D1 same kiel D2-receptor-neŭronoj en NAcc.
La mezolimbika dopaminergia vojo konsistas el neŭronoj en la ventra tegmenta areo, kiu innervas la nukleon accumbens (NAcc), olfakta tubero, prefrontala kortekso kaj amigdalo (1), dum nigrostriatalaj dopaminergiaj neŭronoj en la substantia nigra (pars compacta) provizas kreskantan projekcion al dorsa striato (2). Psikosimulantoj levas sinapajn koncentriĝojn de dopamino en Nokc: kokaino, blokante dopaminan kaptadon de la sinapta fendego kaj amfetamino, per antaŭenigo de liberigo de dopamino de nervaj terminaloj (3-5). Ripeta, intermita administrado de psikostimulaj rezultoj en pliigitaj kondutaj respondoj (sentivigado) al la akraj stimulaj efikoj de tiuj medikamentoj6-8). Plej multaj atestoj sugestas, ke ŝanĝoj de adapto en la ventra tegmenta areo - NAcc-dopaminerĝa sistemo estas centraj en ŝanĝoj en la spert-dependa plasticeco, kiu baziĝas sur konduto kaŭzita de drogoj.
Aldone al dopamino, glutamato estas necesa por la evoluo de konduteca sentemo responde al psikostimulajxoj (9, 10). Mezgrandaj dornaj neŭronoj (MSN) en ventra striatum ricevas ekscitemajn glutamatergajn projekciojn el antaŭfronta kortekso kiu sinapsulas sur la kapoj de dendritaj dornoj. MSN-oj estas ankaŭ la ĉefa celo por dopaminergiaj aksonoj, kiuj sinapsigas sur kolumno-kolon (1, 11, 12). Sekve, dendritaj dornoj en MSN-oj reprezentas la ĉelan kupeon kie dopaminergiaj kaj glutamaterikaj transdonoj estas komence integritaj.
La dopamina agas sur du ĉefaj subfamilioj de riceviloj, la subfamilio D1 (subtipoj D1 kaj D5) kaj la subfamilio D2 (subtipoj D2, D3 kaj D4) (13). En dorsstriatumo, anatomiaj studoj montris, ke striatonigraj MSN enhavas altajn nivelojn de D1-riceviloj (kune kun substanco P kaj dinorfino), dum striatopalidaj MSN esence esprimas D2-receptorojn (kune kun enkephalin) (14-17). La projekcioj de NAcc estas pli kompleksaj ol en dorsa striato, kun la ŝelo kaj kernaj partoj de la NAcc projekciantaj al malsamaj subregionoj de la ventra pallidum kaj al la ventra tegmentala areo kaj substantia nigra18). Dum D2-riceviloj kaj enkephalino estas tre esprimitaj en projekcioj al la ventra pallidum, D1-riceviloj kaj substanco P troviĝas egale distribuitaj en projekcioj al ventrala pallidum kaj ventra tegmenta areo (19). Studoj de agonistoj kaj antagonistoj selektemaj por D1 aŭ D2-riceviloj montris, ke ambaŭ D1 kaj D2-receptoroj estas bezonataj por psiostimulantoj-dependaj de kondutaj ŝanĝoj (20-25). Tamen, la roloj de ĉi tiuj receptoroj ŝajnas diferencaj. Ekzemple, stimulo de D1-riceviloj malpligrandigas serĉadon de kokaino induktita de injektoj por iniciatado de kokaino kaj mediaj rilatoj al kokaino, dum stimulo de D2-riceviloj faciligas kokainon.26-28).
La kondutaj anomalioj asociitaj kun psikosimulanto-toksomanio estas ege longdaŭraj. Tial, estis konsiderinda intereso en identigado de longdaŭra drogo-induktita ŝanĝojn ĉe la molekula kaj struktura nivelo en neŭronaj cirkvitoj reguligitaj per dopamino kaj glutamato (29-32). Notinde, longdaŭra ekspozicio al kokaino aŭ anfetamino pliigis la nombron da dendritaj branĉpunktoj kaj dornoj de MSN-oj en NAcc.33-35). Ĉi tiuj strukturaj ŝanĝoj montris ke ili daŭras ĝis ≈XNUMO-1-monatojn post la lasta drogo-ekspozicio (30, 35) kaj estis sugestita al longaj daŭraj ŝanĝoj en sinapta plasticeco asociita kun psikosimulanta ekspozicio.
La celo de la nuna studo estis ekzameni ŝanĝojn de strukturoj de dendritaj dornicaj strukturoj induktitaj de kokaino en subpopulacioj de MSN akuŝaj, kiuj esprimas aŭ D1 aŭ D2-receptorojn. En ĉi tiuj studoj ni uzis bakteriojn transgenajn artefaritajn kromosomojn (BAC), kiuj esprimas EGFP sub la kontrolo de la D1 (Drd1-EGFP) aŭ D2 (Drd2-EGFP) dopaminaj riceviloj.36). La rezultoj indikas, ke kvankam pliigita spina denseco komence okazas en D1-ricevila MSN-oj kaj D2-ricevila-enhavanta MSN, la ŝanĝita spina denseco estas stabila nur en D1-ricevila-neŭronoj. Plie, ni trovas similajn ŝanĝojn en la esprimo de la transkriba faktoro BFosB, sugestante, ke osFosB povas esti implikita en la formado kaj / aŭ konservado de dendritaj dornoj en D1 same kiel D2-ricevila-neŭronoj en Nokc.
rezultoj
Analizo de MSN en Drd1-EGFP kaj Drd2-EGFP BAC Transgenaj Musoj.
La projekcia padrono de MSN de dorsa kaj ventra striatum en Drd1-EGFP aŭ Drd2-EGFP BAC-transgenaj musoj estis karakterizita per analizo de GFP-esprimo (36). La diferenciala esprimo de GFP en MSN-oj de dorsa striato egalrilatas ĝenerale al tiu de endogenaj D1 aŭ D2-riceviloj, respektive (36). Ni plue analizis diferencialan esprimon de GFP en NAcc en musoj Drd1-EGFP aŭ Drd2-EGFP.Figo. 1a kaj b). Kvankam UM58% de neŭronoj en NAcc esprimis GFP en Drd1-EGFP musoj (Figo. 1a), ≈48% de neŭronoj en NAcc esprimis GFP en Drd-2-EGFP-musoj (Figo. 1b). MSN reprezentas 90-95% de ĉiuj neŭronoj en Nokc (12, 37). D1-riceviloj estas esprimitaj nur en MSN, kaj D2-riceviloj estas esprimita en MSN kaj en kolinergiaj internerenoj, kiuj reprezentas 1-3% de striataj neŭronoj (37). Konsiderante ĉi tiujn faktorojn, la rezultoj sugestas, ke minimume ,10-15% de MSN en NAcc esprimas kaj D1 kaj D2-receptorojn.
Analizo de Dendritic Spines en Drd1-EGFP kaj Drd2-EGFP-Musoj.
GFP-esprimo en la musoj Drd1-EGFP kaj Drd2-EGFP estis utilaj por makuli ĉelajn korpojn de neuronoj. Tamen, la GFP-signalo en dendritoj kaj dendritaj dornoj estis tro malforta por permesi ilian analizon post imunuktado kun kontraŭ-GFP-antikorpoj. Partit-mediada balistika liveraĵo de fluoreskaj tinkturoj estis ĵus uzata por etikedi neŭronajn populaciojn rapide kaj efike.38). Tutaj neŭronoj povas esti etikeditaj uzante ĉi tiun teknikon, kaj la metodo ŝajnas komparebla al la makulaĵo de Golgi-Cox. Por analizi la dendritan morfologion de neŭronoj en NAcc, fiksitaj akuĉaj tranĉaĵoj estis markitaj per la lipofila fluoreskeca tinkturo 1,1′-diotadecil-3,3,3 ′, 3′-tetrametilindocarbocianina perklorato (DiI) uzante genan pafilon. Ekzemplo de DiI-makulita MSN estas montrita en Figo. 1c. Sub la kondiĉoj uzitaj, ni ĝenerale observis etikeditajn neŭronojn sen superrigardaj dendritoj de aliaj markitaj neŭronoj. Ĉe pli granda pligrandiĝo, detala dendrita morfologio, inkluzive de dendritaj dornoj, povus esti observata (Figo. 1d).
Ni tiam uzis kombinaĵon de diI etikedado kaj imunohistoquímica por GFP en aŭ Drd1-EGFP aŭ Drd2-EGFP-transgenaj musoj, kio estis ebla uzante malaltan koncentriĝon de detergento por ŝtofa permeabiligo. metodoj). Per zorga komparo de la esprimo de DiI kaj GFP en la ĉelaj korpoj de MSN, ni povus identigi neŭronojn DiI- kaj GFP-pozitivajn aŭ DiI-pozitivajn kaj GFP-negativajn en Drd1-EGFP (Figo. 2a) aŭ Drd2-EGFP (Figo. 2b) musoj. Por la sekvaj studoj, ni analizis dendritan morfologion nur en neŭronoj DiI- kaj GFP-pozitivaj de musoj Drd1-EGFP aŭ Drd2-EGFP.
Kronikaj Traktatoj de Kokaino Rezultas Pliigitan Dornan Densecon en Akcumbaj MSN -oj Esprimante Aŭ Drd1-EGFP aŭ Drd2-EGFP.
Drd1-EGFP aŭ Drd2-EGFP musoj estis injektitaj plurfoje kun kokaino (30 mg / kg) aŭ sala dum kvar sinsekvaj semajnoj (vidu metodoj). Du tagojn (2WD) aŭ 30-tagojn (30WD) post la lasta kuracada kuracado, cerboj estis prilaboritaj por diI-markado kaj imunohisto-kemia kiel priskribita supre. Antaŭa studo raportis, ke kronika kuracado per anfetamino pliigis spinsdensecon sur distalaj sed ne proksimaj dendritoj de MSN en Nokc (35). Ni do limigis nian analizon al distalaj dendritoj (te kun sekundaraj aŭ triaj ordaj branĉoj), inkluzive de finaj regionoj. Se analizite ĉe 2WD, spina denseco pliiĝis en MSNoj Drd1-EGFP-pozitivaj (128% de sala grupo) (Figo. 3a kaj c) kaj laŭ pli malgranda mezuro en Drd2-EGFP-pozitivaj neŭronoj (115% de sala grupo) (Figo. 3 b kaj d). Post 30WD, pliigita spina denseco estis konservita en Drd1-EGFP-pozitivaj neŭronoj (118% de sala kontrolo) (Figo. 3 a kaj c) sed ne en Drd2-EGFP-pozitivaj neŭronoj (Figo. 3 b kaj d).
La morfologio de dendritaj dornoj estas ŝanĝiĝema laŭ sia longo kaj larĝo de la spina kapo. Ni tial klasifikis dendritajn elstaraĵojn en kvar spino-klasojn (stumpecaj, fungoj, maldikaj kaj filopodia) ĉe 2WD de kokaino (datumoj ne montritaj). La denseco de fungi-speco (119.7 ± 4.0%, P <0.01) kaj maldikaj pikiloj (120.0 ± 3.4%, P <0.01) estis pliigita per kokaina traktado en MSN-Drd1-EGFP-pozitivaj, dum la denseco de stumpaj (182.4 ± 21.6%, P <0.05) kaj fungaj pikiloj (122.5 ± 5.0%, P <0.01) estis pliigita en MSN-Drd2-EGFP-pozitivaj. Ne estis signifa pliigo de dikaj pikiloj en neŭronoj Drd1-EGFP-pozitivaj aŭ de maldikaj pikiloj en neŭronoj Drd2-EGFP-pozitivaj.
Kronika Kokaino Induktas inFosB-Esprimon en Drd1-EGFP- aŭ Drd2-EGFP-MSNoj en NAcc.
BFosB estas membro de la Fos-familio de transskribaj faktoroj. Dum akuta administrado de kokaino induktas rapidan kaj pasan enkondukon de pluraj Fos-izoformoj en Nokc, ripetata ekspozicio al kokaino pliigas la nivelon de BFosB. Plie, la pliiĝo de persFosB-esprimo daŭras en NAcc dum semajnoj ĝis monatoj post ĉesigo de drogo-ekspozicio kaj estis sugestita esti implikita en longdaŭra regulado de gena esprimo, eĉ post kiam ĉesado de drogoj (29, 39, 40).
Por ekzameni la indukton de ΔFosB en NAcc de Drd1-EGFP aŭ Drd2-EGFP-musoj post traktado pri kokaino, ni analizis esprimon de FosB kaj GFP per duobla markado (Figo. 4 kaj tablo 1) La kontraŭ-FosB-antikorpo rekonas ĉiujn formojn de FosB, sed ni supozas, ke la pliigita imunorezisto reprezentas ΔFosB (vidu metodoj por plia diskuto. En sal-traktitaj musoj, 16% de Drd1-EGFP-pozitivaj neŭronoj kaj 15% de Drd2-EGFP-pozitivaj neŭronoj esprimis FosB-imunoreattivon kun relative malforta intenseco.Figo. 4 a kaj b kaj tablo 1). Ripeta kokaintraco sekvita de 2WD rezultigis signifan pliiĝon en la nombro de Drd1-EGFP-pozitivaj neŭronoj kiuj kunekzpresis ΔFosB (55% de GFP-pozitivaj neŭronoj) (Figo. 4c kaj tablo 1). Pli malgranda, sed tamen signifa pliiĝo en esprimo de FosB estis trovita en Drd2-EGFP-pozitivaj neŭronoj (25% de GFP-pozitivaj neŭronoj) (Figo. 4d kaj tablo 1). Kiel kun la ŝanĝoj en spino-denseco, la pliigita esprimo de ΔFosB estis konservita en Drd1-EGFP-pozitivaj neŭronoj (46% de GFP-pozitivaj neŭronoj) sed ne en Drd2-EGFP-pozitivaj neŭronoj (15% de GFP-pozitivaj neŭronoj) post 30WD (Figo. 4 e kaj f kaj tablo 1). Notu, ke la pliigita esprimo de FosB en Figo. 4f ĉeestas en Drd2-EGFP-negativaj neŭronoj.
diskuto
Longaj daŭraj adaptiĝoj en dopaminergia neŭtrransmisio verŝajne subtenas kutimajn kondutojn ligitajn kun psikosimulantoj. Precipe, hipotezis, ke psikostimuliloj-induktitaj pliiĝoj en dendrita kurbeca denseco de MSNoj en NAcc estas ligitaj al reorganizo de sinapta konektebleco (30). La NAcc estas plejparte kunmetita de du apartaj subpopulacioj de MSN-oj esprimantaj altajn nivelojn de aŭ D1 aŭ D2-dopaminaj riceviloj. En la nuna studo, ni analizis spanan densecon en distingaj D1 aŭ D2-ricevila MSN-oj en NAcc post kronika kokaintrato. La rezultoj akiritaj montras, ke kvankam pliigita dorno-denseco komence okazas en D1-ricevila MSN-oj kaj D2-enhavanta MSN-oj, ŝanĝita spino-denseco estas stabila nur en D1-ricevilaj neŭronoj. Plie, ni trovas similan skemon de ŝanĝoj en la esprimo de la transkripta faktoro BFosB en D1 kaj D2-ricevila MSN-oj.
Ĉi tiuj studoj uzis BAC-transgenajn musojn, kiuj esprimas GFP en specifaj subpopulacioj de MSN sub la kontrolo de la D1 aŭ D2-ricevanta reklamanto. Plie, ni disvolvis duoblan etikedantan metodon, kiu kombinis imuno-histokemion por GFP kun balia etikedado de neŭronoj uzante DiI. Antaŭaj studoj uzis la metodon Golgi-Cox por analizi la efikon de psikostimuliloj sur spino-denseco.34), kaj la metodo DiI uzata ĉi tie donis rezultojn kiuj estis kvante similaj. Ni disvolvis la duoblan etikedantan metodon ĉar Golgi-kolorado ne estas kongrua kun imunohisto-kemia. Immunostaining kutime postulas histan permeabiligon kun detergentes, procezo kiu tipe kaŭzas solubiligon de lipofilaj tinkturoj de la membrano (38). Tamen, en niaj nunaj studoj, GFP-imunurigado ne postulis altan koncentriĝon de detergento por ŝtofa permeabiligo kaj tiel povus esti uzata kune kun lipofila tinkturi markado. Nia duobla-markanta metodo devas esti ĝenerale utila por studoj de strukturaj ŝanĝoj en dendritaj dornoj, ekzemple kiam oni uzas por analizo de BAC-transgenaj muslinioj, kie GFP estas esprimita en specifaj populacioj de neŭronoj en ŝelo.36).
Kvankam ankoraŭ iom kontestata, oni kredas ke D1 kaj D2-receptoroj estas plejparte anatomie apartigitaj al la rektaj (striatonigraj) kaj nerektaj (striatopalida) striataj neŭronoj, respektive17, 41). Komenca karakterizado de la lokaligo de GFP en la musoj Drd1-EGFP kaj Drd2-EGFP estis konformaj al ĉi tiu konkludo (36). Plie, nia analizo de la nombro de GFP-pozitivaj neŭronoj en NAcc de Drd1-EGFP kaj Drd2-EGFP estas kongrua kun la konkludo ke ≈XNX% de MSN esprimas nur D50-receptorojn, ke ≈1-35% esprimas nur D40-receptorojn, kaj ke ≈2-10% kunpremas ambaŭ D15 kaj D1-receptorojn. Ĉi tiu valoro de kunekzisto estas simila al tiu implicita per studoj de dorsa striato, kiuj kombinis flikraktantan analizon de ununuraj striataj neŭronoj kun RT-PCR-teknikoj por izoli kaj pligrandigi mRNA-ojn (≈2% kunekzpreson de enkefalino kaj substanco P)42). Ni notu, ke niaj nunaj studoj ne traktas la demandon pri esprimo de riceviloj D3, D4 kaj D5, nek traktas la problemon de malaltaj esprimoj de D1-riceviloj en MSN-oj esprimantaj altajn nivelojn de D2-receptoroj aŭ inverse.
Pluraj antaŭaj studoj ekzamenis la neŭrona lokalizo de esprimo Fos induktita de psikosimulanto kaj la rolo de riceviloj D1 kaj D2 (43-45). Tiuj studoj subtenis la konkludon, ke Fos kaj ΔFosB-indukto estas mediaciitaj per aktivigo de D1-riceviloj. Tamen, la ĉela lokaligo de Fos-esprimo estas influita de la media kunteksto en kiu psikostimulaj drogoj estas administrataj (46, 47). Ekzemple, anfetamino aŭ kokaino donita en la hejma kaĝo provokas tujajn fruajn genojn (inkluzive de Fos) prefere en substancoj P-pozitivaj ĉeloj kiuj kunekzistas D1-receptorojn. En kontrasto, ĉi tiuj medikamentoj povas indukti Fos-esprimon en ambaŭ D1 kaj D2-receptoro-MSNoj kiam administrite en nova medio. La protokolo uzata en niaj nunaj studoj ne inkludis parigadon de injekto de drogoj kun ekspozicio al nova medio. Tamen, ni ne povas ekskludi iun specon de dependanta-kunteksta streĉo kiu respondecas pri esprimo de BFosB en MSN-enhavantaj D2-receptoron.
Rimarkinda trajto de la nunaj rezultoj estis la paralela padrono de pliigita spina denseco kaj esprimo de BFosB. Pliigita spina denseco kaj initiallyFosB-esprimo komence okazis en MSN -oj esprimantaj Drd1-EGFP kaj Drd2-EGFP. Tamen ĉi tiuj ŝanĝoj estis stabilaj nur en D1-receptor-neŭronoj. Unu ebla klarigo por la observo, ke pliigita spina denseco kaj wasFosB-esprimo estis laŭpaŝe trovitaj en D2-receptor-neŭronoj estas ke tio okazis en la malgranda frakcio de MSN kiuj kunekzistas kaj D1 kaj D2-dopaminajn receptorojn. Tiel, la pasema naturo de ĉi tiuj pliiĝoj povas esti asociita kun antagonismaj efikoj de D2-ricevila aktivigo sur signalaj vojoj D1-dependaj (48). Estas de intereso, ke la ŝanĝoj en spino-denseco kaj esprimo de FosB estis reverseblaj, kio povas reflekti la kapablon de D2-dependa ricevila signalo-vojoj influi la stabilecon de ΔFosB.
La observo ke ekzistas paralelaj ŝanĝoj en la esprimo de ΔFosB kaj spino-denseco kongruas kun la ideo ke ΔFosB estas implikita en la komenca formado kaj la posta konservado de dendritaj dornoj en D1-receptor-neŭronoj en Nokc. Esprimo de FosB estas kontrolita de la signa vojo de D1 / DARPP-32 / PP1-dependanta en MSNoj (49). Pluraj studoj montris, ke ΔFosB ludas gravan rolon en la rekompencaj kaj lokomotoraj agadoj de psikostimuliloj (39), verŝajne influante la esprimon de multoblaj genoj, kiuj inkluzivas ricevilojn de neurotransmisoroj, signalajn proteinojn kaj proteinojn implikitajn en reguligo de neŭrona morfologio (50). Tamen, la specifaj molekulaj mekanismoj implikitaj en kronika-induktita spino-formado ne estas nuntempe konataj. Niaj antaŭaj studoj montris, ke intraakbala infuzaĵo de la Cdk5-inhibitoro roscovitino malpliigis kokainan induktitan pliiĝon de spino.51). Krome, Cdk5 estas laŭflua celo geno por BFosB kaj estis implikita en kompensaj adaptaj ŝanĝoj asociitaj kun kronika kokaintrovo.52). Sekve, ŝanĝo en Cdk5-dependa fosforilado estas kredinda mekanismo subaktiva kokain-induktita spino-formado kaj / aŭ spino stabileco. PAK (53), β-katenino (54), PSD-95 (55), kaj spinofilino (56) estas substratoj por Cdk5 kaj estas ĉiuj implikitaj en reguligo de spina morfogenezo57-60). Plua karakterizado de ĉi tiuj kaj aliaj Cdk5-substratoj en dornoj espereble ĵetos lumon pri la mekanismoj implikitaj en reguligo de spino-formado de psiostimulantoj.
metodoj
Bestoj.
Musoj kun portanta EGFP-transgenon sub la kontrolo de la D1 aŭ D2-dopamina-riceviloj estis generitaj de la Gensat BAC-transgena projekto (36). La transgenaj musoj uzitaj en ĉi tiu studo estis 4-5 antaŭ semajnoj kaj estis sur Svis-Webster-fono. Musoj estis konservitaj en 12: 12-h malpeza / malhela ciklo kaj loĝataj en grupoj de 2-5 kun manĝaĵo kaj akvo disponeblaj ad libitum. Ĉiuj bestaj protokoloj estis konformaj al Nacia Gvidaj Institutoj pri Sano por la Prizorgo kaj Uzo de Laboratorioj-Bestoj kaj estis aprobitaj de la Institucia Komitato de Uzo kaj Uzo de Rockefeller University.
Traktado de drogoj.
Oni raportis, ke kronika kokaina kuracado (30 mg / kg, ĉiutage) produktas fortan pliiĝon de spino-denseco de MSN en ambaŭ la kerno kaj ŝelo de Nokc de rato, sed pli malalta dozo (15 mg / kg) pliigis dornan densecon nur en la ŝelo (61). Ni do uzis la pli altan dozon de kokaino por indukti strukturan modifon en ambaŭ partoj de NAcc. Musoj ricevis unu injekton (ip) de 30 mg / kg kokain-HCl (aŭ salajro) ĉiun tagon por 5 sinsekvaj tagoj, sekvitaj de 2-liberaj tagoj, kaj ĉi tiu proceduro ripetiĝis por 4 sinsekvaj semajnoj. Injektoj estis efektivigitaj en la hejma kaĝo. 2WD aŭ 30WD, muskoloroj estis prilaboritaj por diI-markado kaj / aŭ imunohistohemo.
Balistika Etikedado kun la Fluoreska Dye Di.
Musoj estis anestezitaj kun 80 mg / kg natriva pentobarbital kaj perfuzita transkore kun 5 ml de PBS, sekvita de rapida perfuzo kun 40 ml de 4% paraformaldehído en PBS (20 ml / min). Cerboj estis rapide forigitaj el la kranio kaj postfiksitaj en 4% paraformaldehído por 10 min. Cerbaj tranĉaĵoj (100 μm) estis markitaj per balistika liveraĵo de fluoreska tinkturo DiI (Molekula Probes) kiel priskribita en ref. 38. Kombinita diI-markado - imunohistoememia metodo estis disvolvita kun malalta koncentriĝo de detergento. DiI-etikeditaj sekcioj estis trapenetris kun 0.01% Triton X-100 en PBS por 15 min kaj tiam kovis en 0.01% Triton X-100 kaj 10% normala kapro-serumo en PBS por 1 h por minimumigi nespecifan markadon. Tisaj sekcioj tiam estis kovataj per 1% normala kapra serumo / 0.01% Triton X-100 kaj kontraŭ-GFP-antikorpon (Abcam, Cambridge, MA) por 2 h ĉe ĉambra temperaturo, lavita kaj kovita per 1: 1,000-diluvo de FITC- malĉefa antikorpo konjugaciita (Molecular Probes). Sekcioj estis metitaj sur mikroskopajn diapozitivojn kaj kovritajn kovrojn kun muntado. La balia etikeda metodo permesis detalan analizon de dendrita spino strukturo, kaj la rezultoj akiritaj estis kvalite kaj kvante kompareblaj kun antaŭaj studoj uzante la Golgi-Cox-fekunda metodo en rato cerbo tranĉaĵoj (34). Tamen, kontraste kun antaŭaj studoj, ni malofte observis dukapajn dornojn en DiI-makulitaj neŭronoj. Ĉi tiu diferenco povas esti kaŭzita de la sentiveco de makuladaj metodoj aŭ variado de muso (ĉi tiu studo) kontraŭ rato.34).
Immunohistoĥemio.
Bestoj estis anestezitaj kaj perfuzitaj kiel priskribita supre. Cerboj estis forigitaj kaj konservitaj de unu tago al 4% paraformaldehído je 4 ° C. Cerboj estis transdonitaj al 30% sakarozo en PBS-solvo por krizoprotekto. Koronecaj sekcioj (12 μm) estis tranĉitaj sur frosta mikroto (Leica) kaj poste prilaboritaj por imunohistohemo. Brain-sekcioj tiam permeablis en 0.3% Triton X-100 en PBS por 15-min kaj lavis dufoje en PBS. La sekcioj estis antaŭkombinitaj en 10% normala kapra serumo en PBS por 1 h ĉe 37 ° C, eksponitaj al primaraj antikorpoj (diluitaj en 1% normala kapra serumo en PBS) subite ĉe 4 ° C, kaj poste enjuĝitaj kun sekundara PBS. antikorpoj por 1 h ĉe 37 ° C. Oni uzis la jenajn antikorpojn: kuniklo kontraŭ-pato-FosB (SC-48, 1: 500; Santa Cruz Biotechnology), musmalsano (Chemicon), kunikla anti-GFP, FITC-konjektita kunikola anti-kuniklo IgG, kaj rodamino- konjugaciita anti-musa IgG (Molekula Sondoj). Por triobla etikedo (ΔFosB, NeuN, kaj GFP), cerbaj sekcioj unue estis imunotakitaj kun kontraŭ-pato FosB-antikorpon kaj kontraŭ-NeuN-antikorpon kaj tiam kovataj per duarangaj antikorpoj (rodamin-konjugita kontraŭejela kuniklo IgG kaj cian-konjugita anti-musa IgG ). Du-makulaj cerbaj sekcioj estis plue prilaboritaj por GFP-imunuktado uzante Zenon-markantan teknologion (Zenon Alexa Fluor 488, Molekula Probes). La kontraŭ-pato-FosB-antikorpo estis altigita al la N-finstacio de FosB kaj rekonas ΔFosB kaj plentunan FosB (62). Surbaze de antaŭaj studoj kiuj montris, ke ΔFosB sed ne FosB aŭ aliaj Fos-rilataj antígenoj estas konstante esprimita post kronika kokaintrato, ni supozas, ke la longdaŭraj pliigoj de imunoreactividad reprezentas stabilan esprimon de FosB. Tamen, la identeco de la imunoreactiva FosB-signalo observita en sal-traktitaj musoj estas nekonata. Statistika analizo en tablo 1 uzis la Studentoj t provo.
Analizo de Dendrita Spino.
Individuaj MSNoj en la Nokco estis elektitaj por spino analizo bazita sur pluraj kriterioj. (i) Ekzistis minimuma aŭ neniu koincido kun aliaj etikeditaj ĉeloj por certigi ke procezoj de malsamaj ĉeloj ne estu konfuzitaj. (ii) Almenaŭ tri primaraj dendritoj bezonis esti videblaj por ĉeloj uzendaj por analizo. (iii) Distalaj dendritoj (finaj dendritoj aŭ proksimaj al la fina dendrito) estis ekzamenitaj. Dendritoj de ambaŭ MSN-oj en la kerno kaj ŝelo de la NAcc estis analizitaj. Kvankam ni observis malabunde spinajn MSN-ojn (dornajn tipon II), ni analizis nur dense dornitajn MSN-ojn (dornajn tipojn I). Por kalkuli spindensecon, longo de dendrito (> 20 μm longa) estis spurita per konfokusa mikroskopo (Zeiss LSM 510) kun oleo-mergada lenso (× 40). Ĉiuj bildoj de dendritoj estis prenitaj ĉe malsamaj z niveloj (intertempoj de profundo 0.5-1 μm) por ekzameni la morfologion de dendritaj dornoj. Ĉiuj mezuroj estis faritaj per metamorfozaj analizaj programoj (Universal Imaging, Downingtown, PA). Statistika analizo uzis la teston Kolmogorov-Smirnov.
Elstaroj de dendritoj estis klasifikitaj en kvar specojn laŭ sia longo laŭ priskriboj de refs. 63 kaj 64. Klaso 1-elstaraĵoj, ankaŭ nomataj dikaj elstaraĵoj, longis <0.5 μm, malhavis grandan spinan kapon kaj ne ŝajnis havi kolon; klaso 2, aŭ fungoformaj pikiloj, longis inter 0.5 kaj 1.25 μm kaj estis karakterizitaj per mallonga kolo kaj granda spina kapo; klaso 3, aŭ maldikaj pikiloj, variis inter 1.25 kaj 3.0 μm kaj havis longformajn spinkolojn kun malgrandaj kapoj; klaso 4, aŭ filopodaj etendaĵoj, estis longaj fibrecaj elstaraĵoj al kiuj mankis videbla spinkapo.
Dankojn
Ĉi tiu laboro estis subtenita de la usona publika sanaservo Grant DA10044 (al PG kaj ACN) kaj de la Simons Foundation, la Peter J. Sharp Foundation, la Picower Foundation, kaj la FM Kirby Foundation.
mallongigoj
- NAcc
- kerno accumbens
- MSN
- mezgranda akra neŭrono
- BAC
- artefarita kromosomo bakterio
- Drd1
- Antaŭenigilo de dopamina receptorino D1
- Drd2
- Antaŭenigilo de dopamina receptorino D2
- DII
- 1,1′-diotadecil-3,3,3 ′, 3′-tetrametilindocarbocianina perklorato
- 2WD
- XNUMO tagojn post la lasta kuracado
- 30WD
- XNUMO tagojn post la lasta kuracado.
Referencoj
;
