Proc Natl Acad Sci Usono A. 2005 Februaro 1; 102(5): 1737-1742.
abstrakta
Kokaino, medikamento de misuzo, pliigas sinaptajn dopaminajn nivelojn en la striato blokante dopaminan rekaptadon ĉe axonaj terminaloj. Cyclin-dependa kinaso 5 (Cdk5) kaj ĝia aktiviganto p35, proteinoj implikitaj en fosforilado de substratoj en postmitotaj neŭronoj, estis trovitaj esti ĝis-reguligitaj post kronika ekspono al kokaino. Por plu ekzameni la efikojn de indukto de Cdk5 kaj p35 sur signalon de dopamina striatala, ni generis du sendependajn transgenajn musliniojn, en kiuj Cdk5 aŭ p35 estis tro-esprimitaj specife en neŭronoj. Ni raportas ĉi tie, ke pliigita Cdk5-agado, kiel rezulto de p35 sed ne de Cdk5-troega esprimo, kondukas al mildigo de signalado de dopamino mediaciita de kokaino. Pliigita Cdk5-mediata fosforilado de dopamina kaj regulita fosfoproteino AMPc, molekula maso 32 kDa (DARPP-32) ĉe Thr-75, akompanis malpliiĝo de fosforilado de DARPP-32 ĉe Thr-34. Pliigita Cdk5-mediaciita fosforilado de eksterĉela signal-reguligita kinasa kinazo 1 ĉe Thr-286 estis akompanita de malpliiĝo de aktivigo de eksterĉela signal-reguligita kinaso 1 / 2. Ĉi tiuj efikoj kontribuis al mildigo de fosforilado de kokaino-indukto de protektado de AMPA-respektiva elemento-ligilo same kiel malplia indukto de c-fos en la striato. Ĉi tiuj rezultoj subtenas la ideon, ke la aktiveco de Cdk5 estas implikita en ŝanĝita gena esprimo post kronika ekspozicio al kokaino kaj sekve efikas la longdaŭrajn ŝanĝojn en neŭrona funkcio subkuŝanta dependecon de kokaino.
Kokaino pliigas sinaptajn dopaminajn nivelojn en la striato kaj ŝanĝas genan esprimon en la dopaminokeptaj neŭronoj per aktivado de intracelularaj vojoj kiuj disvastigas la komencan signalon de la dopamino D1-ricevilo al la nukleo (1). Kronika eksponiĝo al kokaino reguligas plurajn transskribajn faktorojn, rezultantajn longdaŭrajn ŝanĝojn en gena esprimo, kiuj supozeble subtenas neŭronajn adaptiĝojn en kokaindicteco2). ΔFosB, identigita kiel tia transkriba faktoro (3), estis montrita plibonigi la konduteman respondecon de bestoj al kokaino (4, 5). Tial, identigo de la celaj genoj kiuj estas reguligitaj per isFosB-indukto atendas kontribui al pli granda kompreno de la molekula mekanismo subkuŝanta kokainok dependecon. Us, kronika kuracado de bestoj kun kokaino montris supren reguligi la esprimon de ciclina-dependa kinaso 5 (Cdk5) kaj ĝia aktivulo p35 en la striato tra la indukto de ΔFosB (6, 7).
Cdk5 estas membro de la Cdk-familio de serino- / treonin kinazoj. Male al aliaj Cdks kiuj estas ĉefaj reguligantoj de ĉel-cikla progreso, Cdk5 estas ĉefe implikita en fosforilado de substratoj en postmitotaj neŭronoj. (8). La neŭrona specifeco de Cdk5-agado estas atingita per asocio kun ĝiaj aktivigantoj, ĉu p35 ĉu p39, kiuj estas esence esprimitaj en postmitotaj neŭronoj (8). Aldone al la esenca rolo de Cdk5 en cerba disvolviĝo (9, 10), it ankaŭ estis implikita en dopaminergia dissendo en postnaska cerbo11, 12). Inhibicio de Cdk5-agado rezultigas pliigitan liberigon de dopamino en la striato, indikante presinaptan funkcion de Cdk5 kiel negativa reguligilo de dopamina liberigo (11). Krome, Cdk5 modulas la efikecon de postsinapta dopamina signalado per fosforilado de dopamina kaj cAMP-reguligita fosfoproteino, molekula maso 32 kDa (DARPP-32) ĉe Thr-75, kiu konvertas DARPP-32 en inhibitoron de AMP-dependa kinaso (PKA) (12).
Ĉi tiuj observoj sugestas, ke Cdk5 kaj p35 estas laŭflue reguligiloj de la daŭra aktivigo de dopamina signalado post kronika ekspozicio al kokaino kaj tial en kokaina dependeco. Plu por trakti la rolon de Cdk5 pri striatala dopamina signalado, ni generis du transgenajn musliniojn, en kiuj ĉu Cdk5 aŭ p35 estis tro-esprimitaj specife en neŭronoj sub la kontrolo de la iniciatinto p35. Niaj rezultoj indikis, ke la aktiveco de Cdk5 estis pli reguligita kun pliigitaj niveloj de p35-proteino sed ne Cdk5-proteino, sugestante, ke la nivelo de p35-proteino limigas ritmo por Cdk5-agado. Ni provizas ĉi tie en vivo indico ke pliigita Cdk5-agado, kiel rezulto de p35-sur-esprimo, kondukas al mildigo de signalado de dopamino mediacita de kokaino al la nukleo tra inhibicio de la PKA kaj eksterĉelaj signal-reguligitaj kxinasoj (ERK) akvofaloj.
Materialoj kaj metodoj
Antikorpoj. Polyclonalaj antikorpoj al Cdk5 (C-8) kaj p35 (C-19) estis aĉetitaj de Santa Cruz Biotechnology. La fosforil-dependaj kaj -independaj antikorpoj kontraŭ ERK-katenon (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2, kaj cAMP-responda element-liganta proteino (CREB) estis akiritaj de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). La antikorpoj al fosfo-Thr-34 DARPP 32 (13), fosfo-Thr-75 DARPP-32 (12), tuta DARPP-3212), kaj c-fos (14) estis uzataj kiel priskribite. Antikorpo al actino estis aĉetita de Sigma.
Eksperimentaj Bestoj. Ni pli frue klonis la muson p35-genon Cdk5r1, kiu kodas p35-proteinon, kaj karakterizis ĝian genoman strukturon (15). Por generi la transgenan muson kun neŭrona sobreexpresión de p35 (Tgp35), la 6-kb eĥoRI-eĥoRI-fragmento enhavanta la 1.2-kb-promocian regionon estis subklonita en pGEM9Z (-) plasmido, kaj 45-bp-etikedo derivita de SV40 estis enigita en la KpnMi lokas laŭflue de la poli (A.)+) signalo (Figo. 1A). La etikedo enhavis SpeMi loko por genotipado de la bestoj. La 6-kb-fragmento estis forigita de la plasmido kaj purigita, sekvita de pronuklea injekto de la transgeno por generi la transgenajn musojn. Ekzameni la espriman profilon de la transgeno sub la reguliga kontrolo de la 1.2-kb -transportanto p35 en vivoduobla transgena muso (Tgp35; p35 - / -) estis plue generita per uzado de du-paŝa reprodukta strategio per kiu la Tgp35-muso estis regenerita en endogena p35-nula fono. La aliaj musmetodoj uzitaj en ĉi tiu studo inkluzivis p35 +/–, p35 - / -, Cdk5 +/–, kaj transgenan muson kun neŭrona sobreexpresión de Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Genotipoj de ĉi tiuj musoj estis determinitaj per realigo de analizo Southern blot aŭ PCR de genoma DNA izolita de la vosto-biopsioj. Musoj estis enhavitaj sub 12-h-malpeza / 12-h malhela ciklo. Ĉiuj zorgoj estis plenumitaj laŭ la normoj de Nacia Instituto pri Sano pri la prizorgado kaj uzo de laboratoriaj kaj eksperimentaj bestoj.
Analizo Southern Southern. Genomika DNA-eltirita el vostokaptiloj estis digestita per eĥoRI kaj SpeMi, elektroforeita sur 0.9% agaroza ĝelo, kaj transdonita al nilona membrano. La membrano hibridis kun hazardaprimitaĵo 32P-etikedita sondas je 42 ° C subite. La sondado 485-bp por genotipado de musoj p35 knockout (p35 - / -) kaj Tgp35 estis generita de PCR uzante la sekvaj partidores: 5′-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 ′ kaj 5′-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3 ′. La hibridigita membrano estis lavita dufoje en 2 × SSC / 0.1% SDS ĉe 42 ° C por 10 min, kaj dufoje en 0.1 × SSC / 0.1% SDS ĉe 65 ° C por 20 min, kaj eksponita al ikso-radioj.
Traktado de drogoj. Kokaino (Sigma) estis dissolvita en sterila salo. Bestoj estis ip-injektitaj kun kokaino (15 mg / kg) aŭ egala sala volumo ĉe la aĝo de 3-monatoj kaj mortigitaj per senkapigo en malsamaj tempopunktoj (15, 30, 60 kaj 120 min) post la injekto. Cerboj estis rapide forigitaj kaj malvarmaj en glacia malvarma PBS. La striaj estis tiam disiĝitaj kaj submetitaj al norda aŭ okcidenta blot-analizo. Por imuno-histokemia analizo, striataj sekcioj estis akiritaj de musoj 2 h post la injekto.
Analizo de Norda maketo. Totala ARN estis eltirita de la striata kun TRIzol-reaga (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) kaj submetata al Northern blot-analizo kiel priskribita (18). Por detekto de c-fos mRNA, 189-bp fragmento de muso c-fos cDNA estis uzata kiel enketo kiel priskribita (19). La niveloj de c-fos mRNA estis kvantumitaj per mezurado de la optika denseco de la specifa bando uzante bildan analizan sistemon kun nih-bildaj programoj, Versio 1.62.
Analizo de Western Blot. Striatalaj ŝtofoj estis sonigitaj per 1% SDS kaj kuiris por 10 min. La proteina koncentriĝo en ĉiu specimeno estis determinita per BCA-proteina analizo (Pierce). Egalaj kvantoj de proteino estis apartigitaj per SDS / PAGE antaŭ ol estis translokigitaj al nitrocelulosa membrano. La membranoj estis blokitaj en 1 × PBS kun 5% senkremigita lakto kaj 0.05% Tween 20 kaj kovataj per primaraj antikorpoj tranokte en 4 ° C. Kovado kun peroxidasa-konjugita anti-musa aŭ kunikla IgG (Sigma) estis farita ĉe ĉambra temperaturo por 60 min. Signalo estis detektita per plifortigo de kemiluminesko (Pierce), kaj la optikaj densecoj de la bandoj estis kvantumitaj kiel priskribita supre.
Cdk5 Kinase-analizo. Striaraj lizatoj estis preparitaj per liza bufro konsistanta el 50 mM Tris · HCl, pH NOMX / 7.4 mM NaCl / 50 mM EDTA / 5% Tritono X-1 / 100mMDTT / 1 mM fenilmetilsulfonil fluoro / 1 μg / ml aprotinin / 1 μg / ml leupeptin / phosphatase inhibitors (fosfatasa inhibitoro miksaĵo I kaj II, Sigma). La lisatoj estis imunoprecipititaj kun aŭ kontraŭ-Cdk1 (C-5) aŭ kontraŭ-p8 (C-35) antikorpoj. La inmunoprecipitados Cdk19 preparis por la kovado de 5 μl de la lisado (responda al 300 μg de proteino) kun antikorpo anti-Cdk300 (5 μg) de la nokto al 3 ° C sekvita de plia kovado kun 4 μl de perloj de agarosa proteino Al (25). % Papo en la liza bufro; Santa Cruz Biotechnology) por 50 h ĉe 3 ° C. Por la preparo de p4-imunoprecipitaĵoj, 35 μl de la lisato (responda al 500-mg da proteino) estis kovata de kontraŭ-p1-antikorpo (35 μg) kiel priskribita supre. La imunoprecipitaĵoj estis lavitaj dufoje kun la liza bufro kaj dufoje kun kinaza bufro konsistanta el 3 mM Tris · HCl, pH 50 / 7.4 mM MgCl2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, resuspendita en 60 μl de la kinaza bufro. La kinaza agado estis mezurita per uzado de histono H1 kiel substrato (18).
Immunohistoĥemio. Musoj estis anestezitaj per ip injektoj de avertin (250 mg / kg, Fluka) kaj perfuzitaj transkore kun 0.1 M fosfato de natrio, pH 7.4, sekvita de Streck Tissue Fixative (Streck Laboratorioj, La Vista, NE), neinterlikta fiksaĵo. Dissekciitaj cerboj estis plue fiksitaj en la sama fiksita nokto ĉe 37 ° C. Tiam, cerboj estis enigitaj en parafinon, tranĉitaj en 5-μm-dikajn korukajn sekciojn kaj submetitaj al imunohistohemo per avidin-biotin-peroxidasa kompleksa tekniko (Vector Laboratorioj) kun diaminobenzidino kiel substrato. La sekcioj estis kovitaj per afineco purigita policlonal antikorpon kontraŭ c-fos subite je 4 ° C. La makuleca specifeco estis taksita per neago de la primara antikorpo.
rezultoj
Generacio de Transgenaj Musoj kun Neŭrona troigo de p35. La transgeno uzata por atingi pliigitan neŭronan esprimon de p35 konsistis el la 6-kb fragmento de la klonita muso p35-geno enhavanta la 1.2-kb-promocion kaj la tutan kodigan sekvencon de p35 (Figo. 1 A). La genotipoj de musoj estis determinitaj per analizo de Southern blot per uzado de sondilo desegnita por distingi musojn p35 - / kaj Tgp35 de sovaĝaj musoj.Figo. 1 A kaj B). Por ekzameni la transgenan esprimon sub la kontrolo de la 1.2-kb-a p35-reklamilo, ni generis duoblajn transgenajn musojn (Tgp35; p35 - / -) en kiuj p35-esprimo estis movita nur de la transgeno. La p35-esprimo en Tgp35; p35- / - musoj estis observitaj nur en la cerboFigo. 1C), kie la spaca esprimo estis simila al tiu de sovaĝaj musoj (Figo. 1D). Manko de p35 montrita rezultigas eksternorman strukturan strukturon en la cerba kortekso kaj en hipocampo de musoj.10). Tamen, la musoj Tgp35; p35 - / - montris kompletan savon de la fenotipo p35 - / - cerbo (Figo. 1E). Ĉi tiuj datumoj indikis, ke la 1.2-kb p35-reklamanto kontrolis la esprimon de la transgeno kun simila esprima profilo al tiu de p35 de la endogena p35-geno.
La P35-Proteina Nivelo Estas Tarifo-Limiganta por la Supren-Reguligo de Cdk5-Agado. Ni ekzamenis la gen-dozajn efikojn de la genoj kodantaj p35 kaj Cdk5 pri proteina esprimo en striataj eltiroj de musoj p35 - / -, p35 +/–, sovagtaj, Tgp35, Cdk5 +/– kaj TgCdk5 en la aĝo de 3-monata. La niveloj de p35 kaj Cdk5-proteino bone rilatis kun la genodezoj, respektive (Figo. 2 A kaj B). Musoj Tgp35 montris pligrandigon de N1.6-obla nivelo de proteino p35 kompare kun sovaĝaj-musaj musoj, dum niveloj de Cdk5-proteinoj ne tuŝis la malsamaj niveloj de p35-proteino. Musoj TgCdk5 montris ≈1.9-obla pliiĝon en nivelo de proteino Cdk5 kompare kun sovaĝaj musoj, dum niveloj de p35-proteinoj ne tuŝis la malsamaj niveloj de Cdk5-proteino. Por ekzameni la efikojn de malsamaj kvantoj de p35-proteino ĉe Cdk5-agado, Cdk5 estis imunoprecipitita de striatakaj eltiraĵoj kun kontraŭ-Cdk5-antikorpoj kaj kinaza agado. Same, por ekzameni la efikojn de malsamaj kvantoj de Cdk5-proteino sur kinaza aktiveco, p35 estis imunoprecipitita de striatal-eltiraĵoj kun kontraŭ-p35-antikorpo, kaj kinaza agado estis mezurita. La aktiveco de Cdk5 bone rilatis kun la nivelo de proteino p35 sed ne kun la nivelo de proteino Cdk5.Figo. 2 C kaj D). Ĉi tiuj rezultoj indikis, ke la kvanto de p35-proteino estas ritm-limiga faktoro por agado de Cdk5. Ni do uzis musojn Tgp35 por esplori la efikojn de pliigita aktiveco de Cdk5 sur signalon de dopamina striatala.
Kokosa-Indukita Fosforilado de DARPP-32 ĉe Thr-34 Estas Malaltigite en Tgp35-Musoj. La funkcio de DARPP-32 dependas de ĝia fosforilacia stato ĉe multoblaj lokoj (20). PKA fosforiligas DARPP-32 ĉe Thr-34, dum Cdk5 fosforigas DARPP-32 ĉe Thr-75. Tiel, ni ekzamenis la fosforilan staton de DARPP-32 en striataj eltiroj de sovaĝaj-tipaj kaj Tgp35-musoj. La nivelo de fosfo-Thr-75 DARPP-32 estis pli alta en musoj Tgp35 (Figo. 3A; 1.6 ± 0.2-obla super la valoro de sovaĝaj musoj. Ni poste taksis la efikojn de pliigita aktiveco de Cdk5 sur signalon de dopamina striatala. Ni ekzamenis la koka-induktitan PKA-aktivigon en musoj Tgp35 per analizo de la stato de fosforilado de DARPP-32 ĉe Thr-34. La nivelo de fosfo-Thr-34-DARPP-32 pliiĝis en sovaĝaj musoj 15 min post la kokaina injekto.Figo. 3B; 1.8 ± 0.2-obla super la baza nivelo). Tamen, la efiko de kokaino sur Thr-34-fosforilado de DARPP-32 estis mildigita en musoj Tgp35 (1.2 ± 0.3-obleco super la baza nivelo). Ĉi tiuj rezultoj indikis, ke pliigo de agado de Cdk5 mildigis la aktivigon de PKA-induktita de kokaino probable tra la fosforilado DARPP-32 ĉe Thr-75 (6, 12). Ankaŭ eblas, ke pliiĝo en presinapta Cdk5-agado kaŭzas malpliiĝon de dopama liberigo, kaj ke ĉi tio kontribuas al la reduktita efiko de kokaino. Notinde, ununura injekto de kokaino ne influis la nivelojn de p35 kaj Cdk5-proteino same kiel la kinaza aktiveco.Figo. 3 C kaj D). Ĉi tio kontraste al antaŭa studo, en kiu kronika ekspozicio al kokaino montris reguligi la esprimon de p35 kaj Cdk5 (6).
Suprenregulado de Cdk5-agado Malaltigas la Aktivigon de Kokaina Aktivigo de ERK1 / 2. Lastatempaj pruvoj indikas, ke aktiviĝo de receptoroj de dopamino en la striato ankaŭ aktivigas aliajn signalajn akvofalojn, inkluzive de la ERK-vojo (21, 22), kiu havas gravan rolon en la konduta respondo al kokaino (23). Ni tial ekzamenis ĉu Cdk5-agado povus influi la kokainon-induktitan aktivigon de la ERK-vojo. Aktivigo de la vojo ERK estis observata post injekto de kokaino en striataj eltiroj de sovaĝaj musoj, kiel evidenta per pliigita fosforilado de MEK1 / 2 ĉe Ser-217 kaj Ser-221 (1.5 ± 0.2-obleco super la baza nivelo) kaj de ERK1 / 2 ĉe Thr-202 kaj Tyr-204 (ERK2-fosforilado: 1.5 ± 0.2-obla super la baza nivelo) (Figo. 4 A kaj B). Tamen, la aktivigo de kokaino de MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-obla super la baza nivelo) kaj de ERK1 / 2 (ERK2-fosforilado: 1.2 ± 0.2-obleco super la baza nivelo) estis mildigita en Tgp35-musoj (Figo. 4 A kaj B). Plie, la bazaj niveloj de fosfo-ERK1 / 2 estis pli malaltaj en musoj Tgp35 (0.8 ± 0.2-obla sub la valoro de sovaĝaj musoj), dum ĉi tiu tendenco ne estis statistike signifa. Ĉi tiu lasta rezulto povus esti atribuita al Cdk5-dependa fosforilado de MEK1 ĉe Thr-286, rezultanta en malkresko de la kataliza agado (24). Por taksi ĉi tiun eblon, ni ekzamenis la staton de fosforilado de MEK1 ĉe Thr-286 kaj trovis ke pli altaj niveloj de fosfo-Thr-286 MEK1 ĉeestis striatal-eltirojn de Tgp35-musoj (Figo. 4C; 1.3 ± 0.1-obla super la valoro de sovaĝaj musoj. Plue, la fosforilata stato de MEK1 ĉe Thr-286 ne estis ŝanĝita per ununura injekto de kokaino, kongrue kun la trovo ke Cdk5-agado ne estis trafita de la kuracado (Figo. 3D).
Disvastiĝo de dopamina signalado al la kerno estas malpliigita per pliigita agado Cdk5. La aktivigo de kokaino de multoblaj signalaj akvofaloj implikantaj PKA kaj ERK kondukas al posta aktivigo de la transkripta faktoro CREB en la nukleo tra ĝia fosforilado ĉe Ser-133 (22, 25). Por esplori, ĉu la Cdk5-mediaciitaj inhibaj efikoj sur PKA- kaj ERK-aktivigaj akvofaloj povas konverĝi al CREB-fosforilado en la nukleo, ni ekzamenis la fosforilan staton de CREB ĉe Ser-133 en striataj ekstraktoj de sovaĝaj kaj Tgp35-musoj. La baza nivelo de phospho-CREB estis pli malalta en musoj Tgp35 (0.7 ± 0.1-obla valoro de sovaĝaj musoj) (Figo. 5). Responde al injekto de kokaino, la nivelo de fosfo-CREB kreskis en la striato de sovaĝaj musoj (1.5 ± 0.1-obleco super la baza nivelo), sed ĉi tiu respondo al kokaino mildiĝis en musoj Tgp35 (1.2 ± 0.1- faldi super la baza nivelo) (Figo. 5).
Fosforilado de CREB ĉe Ser-133 plialtigas sian transskriban agadon per cAMP-responda elemento en la reklama regiono de certaj genoj, inkluzive de la c-fos geno (26). Ni do ekzamenis la indukton de c-fos en la striato de sovaĝaj tipoj kaj Tgp35-musoj post kokaina injekto. En sovaĝaj tipaj musoj, la nivelo de c-fos mRNA kreskis al pinto valoro (1.8 ± 0.2-obla super la baza nivelo) 30 min post injekto de kokaino, kaj poste revenis al la baza nivelo de 120 min post la injekto.Figo. 6 A kaj B). Tamen, la niveloj de c-fos mRNA estis ≈30% pli malaltaj en Tgp35-musoj ol en sovaĝaj musoj ĝis 30 min post la injekto.Figo. 6 A kaj B). La pli malgranda indukto de c-fos en Tgp35-musoj estis plue konfirmita de imunohistokemiaFigo. 6 C-F). Kokaina administrado pliigis c-fos imunoreattivon, forte en la dorsomedial-dorsocentral-partoj de la striato kaj malforte en la flankaj partoj, en sovaĝaj kaj Tgp35-musoj. Tamen, la pliiĝo de kokain-induktita nombro de c-fos-imunopozitivaj ĉeloj estis precipe mildigita en la striato de Tgp35-musoj (Figo. 6G). Kune, ĉi tiuj rezultoj indikis, ke kokain-mediada plibonigo de signalaj signaloj de dopia striato al la nukleo estis malhelpita en musoj Tgp35, probable rezulto de pliigita agado de Cdk5.
diskuto
Cdk5 kaj ĝia aktivulo p35 estis identigitaj kiel celaj genoj reguligitaj de kronika ekspozicio al kokaino. (6). Ni raportas ĉi tie pruvojn, ke pliigita Cdk5-agado, kiel rezulto de supre-reguligo de p35 anstataŭ Cdk5-supra regulado, kondukas al mildigo de signalado de dopamino per kokain-mediado en stria neŭronoj. Ekzameni la konsekvencojn de la supren-reguligita esprimo de aŭ Cdk5 aŭ p35 sur striatala dopamina signalado, du transgenaj muslinioj, TgCdk5 kaj Tgp35-musoj, estis analizitaj. Ni trovis ke Cdk5-agado estis reguligita laŭ proporcio kun pliigita nivelo de p35-proteino sed ne estis influita de pliigita nivelo de Cdk5-proteino. Nia antaŭa raporto ankaŭ montris, ke la aktiveco de Cdk5 en TgCdk5-muskolo estis pli malalta ol en sovaĝa muso-cerbo kiam la agado estis mezurita per uzado de Cdk5-imunoprecipitaĵoj (17), sugestante, ke troega esprimo de Cdk5 rezultigas pliigitan nivelon de monomerika Cdk5 se p35-nivelo ne kreskas. Ĉi tiuj rezultoj indikis, ke la nivelo de p35-proteino estas ritm-faktoro por Cdk5-agado.
La musoj Tgp35 montris plej malgrandan inducción tiel de la fosforilación de CREB kiel de c-fos en la estriado post akra injekto de kokaino, sugestante ke la respondo estriada al la kokaino estis detenita de la kresko de la aktiveco de Cdk5. La mildigo de signalado de dopamino mediacita de kokaino en musoj Tgp35 probable estis atingita per la Cdk5-mediada inhibicio de multoblaj signalaj akvofaloj implikantaj DARPP-32, PKA kaj ERK. Enhavo de kokaino pliigis PKA-fosforiladon de DARPP-32 ĉe Thr-34 en sovaĝaj musoj, dum ĉi tiu respondo mildiĝis en musoj Tgp35. PKA-fosforilado de DARPP-32 ĉe Thr-34 pruvis malhelpi la aktivecon de proteina fosfatazo 1 (PP1), la enzimo respondeca pri la malfosforilado de Ser-133 de CREB (27). Tiel, PP1-agado ne estus antagonigita per la vojo DARPP-32 / PP1 en musoj Tgp35.
Aktivigo induktita de kokaino de ERK1 / 2 ankaŭ malpliiĝis en musoj Tgp35. Ekzistas pluraj apartaj mekanismoj per kiuj Cdk5 povus malhelpi la kokainan indukton de ERK1 / 2. Unue, dependa Cdk5-dependa fosforilado de DARPP-32 ĉe Thr-75 povus deteni PKA, kondukante al posta inhibo de iu ajn PKA-mediaciita MEK1 / 2-aktivigo, kiu estas bezonata por ERK1 / 2-aktivigo. Lastatempa studo ankaŭ trovis, ke fosforilado de DARPP-32 ĉe Thr-34 estas bezonata por aktivigo de ERCA1 / 2 per media kokaĵo per multoblaj vojoj implikantaj nerektan reguladon de MEK-aktivigo kaj ankaŭ reguladon de striat-riĉigita fosfatazo, tirozino. fosfatazo kiu agas rekte sur ERK1 / 2 (28). Subteno por ĉi tiu ebleco estas sugestita de la trovo ke kokain-induktita fosforilado de MEK1 / 2 ĉe Ser-217 kaj Ser-221 estis abolita en Tgp35-musoj. Alia probabla vojo estas per Cdk5-dependa fosforilado de MEK1 ĉe Thr-286, kiu rezultigus malkreskon de ĝia kataliza agado kaj kondukos al inhibicio de ERK1 / 2-agado (24).
Inhibicio de Cdk5-agado en la striato montris plibonigi kondutajn efikojn de kronika kokaintrovo ĉe bestoj (6). Konsekvenca kun la hipotezo, ke supren-reguligo de la aktiveco de Cdk5 povas kontribui al neurona adapto por kontraŭi la efikojn de ripeta kokaina administrado (6), ni trovis, ke la Cdk5-mediaciita fosforilado de DARPP-32 kaj MEK1 kontribuis al mildigo de aktivigo de ERK1 / 2 induktita de kokaino, rezultante en la malpli da indukto de CREB-fosforilado kaj c-fos en la striato. Niaj rezultoj subtenas la ideon, ke pliigo de la aktiveco de Cdk5, kiel rezulto de pliigo de regulado de p35, povas ŝanĝi genan esprimon en la striato post kronika ekspono al kokaino. Ĉi tio povas okazi per ŝanĝoj en la agadoj de la transkriptaj faktoroj kiel CREB kaj c-fos. Tiel, la Cdk5-aktivigilo p35, pro ĝiaj rapidecaj efikoj al Cdk5-agado, povas kontribui al longdaŭraj ŝanĝoj en neŭrona funkcio subakve al kokaino..
Dankojn
Ni dankas D-rojn. Mary Jo Danton, Philip Grant, kaj Sashi Kesavapany por kritika legado de la manuskripto. Ĉi tiu laboro estis subtenita de Naciaj Institutoj de Sano Grant Z01DE00664-05 (al ABK), Usona Publika Sanitara Servo Grant DA10044, kaj subvencioj de la Simons Fundamento, la Peter J. Sharp Foundation, kaj la Picower Fundamento (al PG).
Notoj
Mallongigoj: Cdk5, ciclina-dependa kinaso 5; ERK, eksterĉela signal-reguligita kinazo; DARPP-32, dopamina kaj regulita fosfoproteino AMPc, molekula maso 32 kDa; PKA, AMP-dependa kinaso; MEK, ERK-kinezo; CREB, proteino liganta elementon cAMP.
Referencoj
;
