Reguligo de DeltaFosB-stabileco per fosforilado (2006)

J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.

Uleria PG, Rudenko G, Nestler EJ.

fonto

Sekcio de Psikiatrio, Centro por Baza Neŭroscienco, Universitato de Teksasa Sudokcidenta Medicina Centro, Dallas, Teksaso 75390-9070, Usono.

abstrakta

La transskriba faktoro DeltaFosB (ankaŭ nomata FosB2 aŭ FosB [mallonga formo]) estas grava mediatoro de la longtempa plastikeco induktita en cerbo per kronika elmontro al pluraj specoj de psikoaktivaj stimuloj, inkluzive de drogoj de misuzo, streĉado kaj elektrokonvulsivaj prenoj. . Aparta trajto de DeltaFosB estas, ke, unufoje induktita, ĝi persistas en cerbo dum relative longaj periodoj en foresto de plia stimulo. La mekanismoj sub kiuj ĉi tiu ŝajna stabileco tamen restis nekonataj. Ĉi tie, ni pruvas, ke DeltaFosB estas relative stabila transskriba faktoro, kun duonvivo de proksimume 10 h en ĉelkulturo. Plue, ni montras, ke DeltaFosB estas fosfoproteino en cerbo kaj ke fosforiligo de tre konservita serina restaĵo (Ser27) en DeltaFosB protektas ĝin kontraŭ proteazoma degenero. Ni provizas plurajn liniojn de provoj sugestante, ke ĉi tiu fosforilado estas mediaciita de kazeina kinase 2. Ĉi tiuj trovoj konsistigas la unuajn pruvojn, ke DeltaFosB estas fosforiligita kaj pruvas, ke fosforilado kontribuas al ĝia stabileco, kio estas la kerno de sia kapablo medii longdaŭrajn adaptojn en cerbo.

Enkonduko

La faktoro de transskribo ΔFosB, nomata ankaŭ FosB2 aŭ FosB [mallonga formo], estas variaĵo de ĉifona tranĉa terminaro de C de la tuja frua geno fosb (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu kaj Nathans, 1991; Yen et al., 1991). Same kiel plenlonga FosB, ΔFosB havas DNA-ligan bazan domajnon kaj leucinan zipo, tra kiu ĝi malpliiĝas kun Jun-proteinoj por formi aktivajn protein-1 (AP-1) transkripciojn, kiuj reguligas la esprimon de multaj genoj (Morgan kaj Curran, 1995; Rylski kaj Kaczmarek, 2004). Malgraŭ manko de parto de la transaktiva domajno trovita en la fina stacio C de FosB, ΔFosB funkcias kiel potenca transkripta aktivulo kaj subpremanto en kulturitaj ĉeloj kaj en la cerbo (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu kaj Nathans, 1991; Chen et al., 1997; McClung kaj Nestler, 2003; Kumar et al., 2005).

ΔFosB estas induktita al altaj niveloj laŭ regiona specifa maniero en cerbo post kronika, sed ne akra, eksponiĝo al diversaj psikoaktivaj stimuloj, inkluzive de streso, certaj lezoj, antipsikotaj kaj antidepresaj drogoj, drogoj de misuzo kaj naturaj rekompencoj. (Hope et al., 1994b; Hiroi kaj Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Bing et al., 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Andersson et al., 2003; Colby et al., 2003; Peakman et al., 2003; Perrotti et al., 2004; Zachariou et al., 2006). La indukto de ΔFosB rilatis rekte al la funkciaj efikoj de pluraj el ĉi tiuj stimuloj sur la cerbo. La persisto de ΔFosB eĉ en foresto de plia stimulo distingas ĝin de ĉiuj aliaj faktoroj de transkripcio de Fos-familio, kiuj estas induktitaj rapide en respondo al akraj stimuloj, kadukiĝas al bazaj niveloj ene de kelkaj horoj, kaj ĝenerale montras desensibilizadon post kronika stimulado (Hope et al., 1992; Daunais et al., 1993; Persico et al., 1993; Hiroi kaj Graybiel, 1996; Perrotti et al., 2004). Ĉi tio igas FosB alloga kandidato por mediacii iujn el la daŭraj ŝanĝoj en gena esprimo, kiuj baziĝas sur la stabilaj neŭronaj adaptoj kaŭzitaj de iuj kronikaj stimuloj.

Ĉar la plilongigita ĉeesto de ΔFosB okazas en la foresto de plia indukto de ĝia ARNm (Chen et al., 1995), ni konjektis, ke male al plenlonga FosB kaj ĉiuj aliaj Fos-familiaj proteinoj, kiuj estas neintence malstabilaj, ΔFosB eble estas nekutime stabila transskriba faktoro (Hope et al., 1994b; Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001; McClung et al., 2004). Plie, imunoblotting analizo de akra- kontraŭ kronika-stimulita cerba histo sugestis, ke ΔFosB ŝajne M_r (molekula maso) de ∼33 kDa en la akra kondiĉo al ∼35-37 kDa dum kronika kuracado (Hope et al., 1994a; Chen et al., 1995). Ĉar ekzistas neniu indico pri la ekzisto de pliaj mRNAoj, kiuj povus kodi por ĉi tiuj diversaj izoformoj, ni plu konjektis, ke ΔFosB estas posttradukte modifita kaj ke eble tio kontribuas al ĝia nekutima stabileco. Ĝis nun tamen oni ne raportis pri biokemiaj analizoj de la turno aŭ posttradukaj modifoj de ΔFosB. La celo de ĉi tiu studo estis determini ĉu ΔFosB estas fosfoproteino kaj ĉu fosforilado ludas rolon en ĝia stabileco.

Antaŭa SekcioSekva Sekcio

Materialoj kaj metodoj

Mamulaj ĉelaj linioj kaj konstruoj de DNA.

PC12-ĉeloj (Clontech, Mountainview, CA) estis kultivataj en alta glukoza DMEM enhavanta l-glutaminon (L-Gln) kaj suplementitajn kun 5% fetala bovina serumo (FBS), 10% ĉevala serumo (ambaŭ el Invitrogen, Carlsbad, CA) , 100 U / ml penicilino, kaj 100 μg / ml streptomicino (ambaŭ el Sigma-Aldrich, Sankta Luiso, MO). HeLa ĉeloj (American Type Culture Collection, Manassas, VA) estis kultivitaj en alta glukoza DMEM enhavanta L-Gln kaj suplementita kun 10% FBS, penicilino kaj streptomicino. Ambaŭ ĉelaj linioj estis konservitaj ĉe 37 ° C en humida 5% CO₂ atmosfero.

Por la transiraj transfektoj kun DNA, PC12 aŭ HeLa-ĉeloj estis plantitaj sur ses-putajn platojn (tegitajn kun kolageno I por PC12-ĉeloj) tiel ke ili atingis 90-100% -konfluon la sekvan tagon kaj tiam estis transformitaj per Lipofectamina 2000 (Invitrogeno). En iuj eksperimentoj (vidu Figs. 1⇓⇓⇓⇓⇓-7), ΔFosB estis esprimita transitive en PC12-ĉeloj per infekto kun rekombinanta herpeto simplex-viruso (HSV).

CFosB kaj FosB cDNA estis akiritaj de niaj propraj pTetop-konstruoj (Chen et al., 1997), kaj subklonita al pcDNA3.1-vektoro (Invitrogen). Ĉi tiuj konstruaĵoj pcDNA3.1-ΔFosB / FosB estis uzataj por esprimo en mamulaj ĉeloj kaj kiel ŝablono por rete direktita mutagenezo. Rekombinanta HSV-ΔFosB estis preparita kiel priskribite antaŭe (Neve et al., 1997), kaj la preparado havis titolon de ∼1 × 10⁸ pfu / ml.

Puls-ĉasaj eksperimentoj.

Proksimume 24 h post infekto / transfekto, ĉeloj (PC12 aŭ HeLa) en ses putoj estis lavitaj du ĝis tri fojojn kun 2 ml de PBS kaj inkubitaj je 37 ° C por ∼1 h en 2 ml da Cys / Met-libera DMEM. (Invitrogeno) suplementita kun 5% dializita FBS (Hyclone, Logan, UT) por forigi intracelulajn naĝejojn de Met kaj Cys. Al la fino de ĉi tiu periodo de "malsato", oni aldonis drogojn (se oni devus trakti ĉelojn), kaj la ĉeloj estis etikeditaj (pulso) kun 12-25 μCi de ³⁵S Miksaĵa Laborado de Proteinoj (PerkinElmer, Wellesley, MA) por ∼1 h ĉe 37 ° C por etikedi ĉiujn ĵus sintezitajn proteinojn. La radiomarkilo tiam estis forigita lavante la ĉelojn du ĝis tri fojojn kun 2 ml de PBS, kaj la ³⁵S-markitaj proteinoj estis sekvataj (ĉasi) anstataŭigante la medion per "malvarma" (neradiaactiva) mediumo suplementita kun 5% FBS kaj rikoltante la ĉelojn en diversaj tempopunktoj. Ĉelaj traktadoj estis daŭrigitaj dum la ĉaso. Ĉiuj figuroj de ĉi tiuj eksperimentoj montras similajn komencajn kvantojn de la diversaj proteinoj por optimumigi komparojn de iliaj turnoprocentoj.

Bestoj kaj kronika elektrokonvulsiva kaptita traktado.

Viraj Sprague Dawley-masklaj ratoj (200 – 300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) estis traktitaj unufoje ĉiutage per elektrokonvulsivaj kaptiloj (ECS) por 7-9 d. ECS plenumis kiel priskribite antaŭe (Hope et al., 1994a) uzante an Ugo Basile (Comerio VA, Italio) ECS-unuo kun la jenaj agordoj: frekvenco, 100-pulsoj / s; pulso kun, 0.5 ms; daŭra ŝoko, 1.0 s; kaj aktuala, 75 mA. Sham-kontrolaj bestoj estis traktitaj paralele per aplikado de la aŭd-klipaj elektrodoj sen ia elektra kurento.

³² P metabola etikedado.

Por la etikedado de cerbaj tranĉaĵoj, ratoj estis malkombinitaj, la cerbo rapide disekciĝis, kaj frontaj kortikaj tranĉaĵoj de 300 μm estis pretigitaj per DSK-mikrosigilo (Ted Pella, Redding, CA). La tranĉaĵoj estis inkubitaj en plastajn tubojn en 2 ml da artefarita CSF-fosfata mankaĵo de fosfato (ACSF) kaj konservitaj ĉe 30 ° C sub konstanta milda bobelo kun O₂/ CO₂ miksaĵo (Hemmings et al., 1989). La tranĉaĵoj (du tranĉaĵoj por tubo) estis markitaj kun 1.3 mCi por 8-10 h en ĉeesto aŭ foresto de okadaika acido (100 ng / ml). Ĉe la fino de ĉi tiu kovrado, la tranĉaĵoj estis enŝovitaj almenaŭ tri fojojn per malvarma ACSF kaj poste homogenigitaj per sonigo en 250 μl de malvarma radioimmunoprecipita provo (RIPA) bufro [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v ) Igepal, 0.5% (p / v) natria deoxikolato, 0.1% (p / v) SDS, 1 mm EDTA] suplementita antaŭ uzado kun SDS ĝis 0.6%, proteasa inhibitora kokido por mamulaj ĉeloj (uzata ĉe 5 μl / ml; Sigma-Aldrich), fosfatase-inhibitoraj koko I kaj II (uzataj ĉe 1: 100; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF, kaj 2% glicerol. Homogenatoj tiam estis boligitaj dum 15 min kaj malplenigitaj per centrifugado ĉe 15,000 × g por 15 min. Koncentriĝo de proteinoj en la rezultantaj supernatantoj estis taksita uzante la proteinan teston BCA (Pierce, Holmdel, NJ).

Por la ³²P-etikedado de kulturitaj ĉeloj, ∼24 h post infekto / transfekto, la ĉeloj estis lavitaj du ĝis tri fojojn kun fosfat-libera mediumo kaj inkubitaj en ĉi tiu mediumo por ∼1 h. Post ĉi tiu malsata periodo, 0.2-0.3 mCi de ³²PH₃PO₄ (PerkinElmer) estis aldonitaj al ĉiu puto, kaj ĉeloj estis etikeditaj por 4-12 h depende de la speco de eksperimento (vidu Figojn. 1-7 por specifoj). La ĉeloj tiam estis lavitaj tri fojojn per PBS kaj lisitaj sur glacio por 15 min kun 50 μl de suplementa RIPA-bufro. La lisatoj estis kolektitaj per skrapado kaj estis pasigitaj 10-fojojn tra 25-ga kudrilo por tondi DNA, boligitaj por 10-min, kaj centrifugitaj ĉe 15,000-rpm por 15-30-min ĉe 4 ° C. La malplenigitaj lisatoj (supernatantoj) estis translokigitaj al nova tubo kaj BCA-proteina testado (Pierce) estis farita. Ĉiuj figuroj de ĉi tiuj eksperimentoj montras similajn kvantojn de totala sovaĝa tipo (WT) kaj S27A osFosB-proteinoj por optimumigi komparojn de iliaj relativaj fosforilaj niveloj.

Kemiaĵoj kaj ĉelkulturaj traktadoj.

Okadaika acido (OA; Sigma-Aldrich) dissolviĝis en etanolo kaj uzata je fina koncentriĝo de 100 ng / ml. 5,6-Dichloro-1-β-d-ribofuranosil-benzimidazolo (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) estis dissolvita en dimetil sulfoksido (DMSO; Sigma-Aldrich) kaj uzata en ĉelkulturo je fina koncentriĝo de 50 μm. Spermo (Sigma-Aldrich) dissolviĝis en akvo kaj uzata ĉe fina koncentriĝo de 200 μm. Calphostin-C (Biomol) estis dissolvita en DMSO kaj uzita ĉe 0.2 μm, dum phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA; Promega, Madison, WI) estis dissolvita en DMSO kaj uzita ĉe 0.1 μm. miristoilated-autocamtide-2-rilata inhibitora peptido (m-AIP; Biomol) estis dissolvita en akvo kaj uzita ĉe fina koncentriĝo de 1 kaj 10 μm. La larĝ-spektra proteino kinasa inhibidores H-7 kaj H-8 (Biomol) estis dissolvitaj en akvo kaj uzataj ĉe fina koncentriĝo de 150 kaj 200 μm respektive. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) kaj epoxomicino (Peptidoj Internacia, Louisville, KY) estis ambaŭ dissolvitaj en DMSO kaj uzataj ĉe fina koncentriĝo de 12.5 kaj 7.5 μm respektive. En ĉiuj eksperimentoj, DMSO (veturilo) estis aldonita al ĉeloj laŭbezone por konservi konstantan kvanton de DMSO tra traktadoj. Por ³²P-etikedaj eksperimentoj, la drogoj estis aldonitaj tuj antaŭ la etikedo kaj konservitaj por la resto de la etikeda periodo. Por pulso-ĉasaj eksperimentoj, drogoj estis aldonitaj en la momento de Cys / Met "malsato", konservitaj tra la periodo de etikedado, kaj poste aldonitaj al la ĉasa medio. La inhibidores de la proteasoma estis spicitaj ĉiun 3-4 h dum la tuta postkuro por kompensi la rapidan turnadon de ĉi tiuj peptidoj.

ΔFosB-imunoprecipitado, imunoblotado, kaj aŭtradiografio.

Por imunoprecipitaĵoj, lisatoj estis diluitaj 1: 5 kun simpla RIPA por malsuprenigi la SDS-koncentriĝon al 0.1% antaŭ antaŭenigi imunoprecipitadon (IP). Por limigi nespecifan ligadon, la lisatoj unue estis demetitaj per imunoprecipitado kun neinmuna IgG kaj proteino G-Sepharose (Sigma-Aldrich) dum almenaŭ 4 h. ThenFosB tiam estis imunoprecipitita el la demetitaj lisatoj uzante kaprinan poliklonalan antikorpon, kiu rekonas internan epitopon ĉeestantan kaj en FosB kaj ΔFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ĉe 0.5-1 μg IgG per 10 μg de lysate-proteino. (50 – 300 μg da tuta proteino) en tuta volumo de 0.5 ml. IPoj estis milde miksitaj je 4 ° C sur rotoro dum almenaŭ 8 h kaj tiam aldoniĝis 15 µl da proteino G-Sepharose kaj miksiĝis IP-oj dum almenaŭ 4 h. IP-oj estis pelitaj per ŝpinado ĉe 3000 × g dum 3-5 min ĉe 4 ° C, lavita tri fojojn kun 0.5 ml da malvarma ebenaĵo RIPA kaj du fojojn kun malvarma PBS enhavanta 0.1% Tween 20. IPoj tiam resuspenditaj en 0.5 ml da malvarma PBS, transdonitaj, pelitaj en novan tubon, kaj imunoprecipititaj proteinoj tiam eluviĝis per la aldono de 15-25 µl de 2 × reduktante la specimenon de proteino Laemmli. Ĉi tiu IP-protokolo rezultigis la specifan kaj efikan precipitaĵon de preskaŭ ĉiuj ΔFosB en la lisato. La imunoprecipititaj proteinoj estis submetitaj al SDS-PAGE ŝarĝante la tutan IP sur 12.5% Tris-HCl Criterion-ĝelo (Bio-Rad, Hercules, CA), kaj tiam transdonitaj al PVDF aŭ nitrocelulozo. Post translokado, la membrano estis sekigita per aero ³²P- kaj ³⁵S-radiomarkitaj proteinaj bandoj estis observitaj per aŭtradiografio uzante autoradiografian filmon Kodak (Rochester, NY), same kiel per fosforimagado uzante Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager. Totala (nefosforilata kaj fosforilata) ΔFosB en ĉelaj lisatoj aŭ cerbaj homogenoj estis detektita per imunobligado de aŭ la imunoprecipitata proteino (uzante la saman membranon uzatan por detekti la ³²P-markita proteino), aŭ de egalaj kvantoj de lizata / homogena proteino submetita al SDS-PAGE kaj transdonita al PVDF aŭ nitrocelulozo. La membrano unue estis blokita incubante ĝin kun 1% (w / v) nefatigita seka lakto (Bio-Rad) en PBS suplementita kun 0.1% (v / v) Tween 20 (Sigma) por 1 h ĉe 25 ° C. La membrano tiam estis imunoblotita dum la nokto ĉe 4 ° C kun nia propra antiklama antikorpo de kuniklo kontraŭ-FosB generita kontraŭ aminoacidoj 1-16 de FosB / ΔFosB (uzata ĉe 1: 10,000). Post primara inkubacio, membranoj estis lavitaj kvar fojojn por 5 min kun blokada bufro, kaj poste inkubitaj je 25 ° C por ∼1 h kun kapra kontraŭ-rabista IgG konjugaciita al peroksida dioksido (uzata ĉe 1: 5000 en blokado de bufroj, de Vektoro Laboratorioj, Burlingame, CA). Membranoj tiam estis lavitaj tri fojojn por 10 min kun blokada bufro kaj unu fojon por 5 min kun PBS. Entute proteinFosB-proteinaj bandoj estis videblaj sur Kodak MR-filmo per plibonigita kemiluminescenco (Pierce) kaj / aŭ per detekto de fluoreskeco per la ECL-Plus-reagentoj (Amersham Biosciences) kaj la Storm PhosphorImager.

Troa elpremo kaj purigo de rekombinaj ΔFosB de insektaj ĉeloj.

ΔFosB estis tro ekspresita en Sf9-insektaj ĉeloj kiel N-fina hexa-His-etikedita proteino (N-His (6) ΔFosB) uzante la Bac-al-Bac-baculovirus-espriman sistemon (Invitrogen) kaj sekvante la instrukciojn de la fabrikanto. Mallonge, la ΔFosB cDNA (restaĵoj 2-237) antaŭita de la afina N-fina stacio MGHHHHHHAG estis subklonita en la vektoro pFASTBacTM1, kiu estis uzita por generi baculovirus rekombinan. Sf9-ĉeloj estis infektitaj kun rekombinanta viruso, kaj N-His (6) ΔFosB estis purigita de ĉelaj lisatoj per pluraj kromatografiaj paŝoj inkluzive de afina kromatografio uzante nikel-kolumnon (Qiagen, Valencio, CA), anionŝanĝon uzantan monokolonon Q (Amersham Biosciencoj), kaj amplekso-ekskludo uzante ĝel-filtran kolumnon (Amersham Biosciences).

In vitro studoj pri fosforilado

In vitro Fosforilaj reagoj por tempa kurso kaj stokekiometria analizo estis faritaj en volumo de 30 μl enhavanta 10 μm-substraton (N-His (6) ΔFosB aŭ pozitivan kontrolan substraton), 250 μm ATP, kaj 1 μCi / μl [γ-³²P] ATP, la bufro liverita de la kinasa fabrikanto, kaj unu el la jenaj kinaseoj: CK2 (20 ng / μl; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / μl; Upstate), PKC (1.6 ng / μl; Calbiochem) aŭ p70S6K (2.5 mU / μl; Altnivela). Tempa kurso-reagoj estis faritaj forigante 5 μl-alikotojn de la reakcia solvo ĉe la difinitaj tempopunktoj kaj aldonante egalan volumenon de 4 × reduktante la buksan specimenon de proteino Laemmli. Kinetikaj parametroj de Michaelis-Menten por la reago de CK2 estis determinitaj sub empiriaj difinitaj linearaj konstantaj statoj. Ĉi tiuj reagoj estis faritaj dum 15 min en volumo de 10 μl enhavanta enzimon 2 ng / μl, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [γ-³²P] ATP, kaj N-His (6) ΔFosB-koncentriĝoj kiuj iras de 2.5-30 μm. Ĉiuj reagoj estis faritaj je 30 ° C en akvo-bano. Post SDS-PAĜO kaj tinktado de la ĝelo kun Bio-Sekura Coomassie (Bio-Rad), la ĝelo estis sekigita, kaj ³²P-fosfata aliĝo estis taksita per fosforimimiga analizo (vidu sube, Datum-kvantigo, kalkuloj kaj statistikoj).

Du-dimensia fosfopeptida mapo kaj fosfoamino-acida analizo.

Ambaŭ ĉi tiuj analizoj estis faritaj kiel priskribite de Ploegh kaj Dunn (2000). Mallonge, sekigu ĝelajn fragmentojn ³²P-etikedita ΔFosB (ĉu de en vitro reagoj aŭ de imunoprecipitoj de metabolize etiketitaj ĉeloj), estis ĉizitaj, rehidratigitaj, lavitaj kaj submetitaj al provoza digestado. La supernatanto enhavanta la provajn digestajn produktojn liofilizis kaj la liofilato lavis plurajn fojojn kaj resumis en 10 μl de bufro de elektroforesis, pH 1.9. Specimeno (3 μl) estis ekvidita sur celuloza maldika tavola kromatografio (TLC) plato (Analtech, Newark, DE) kaj apartigita en unu dimensio per elektroforesis kaj la alia dimensio suprenirante TLC. La fosforopeptidaj mapoj estis videbligitaj per aŭtradiografio kaj fosforimagado. Por analizo de fosfamamino acidaj, 2 μl de la provaj digestoj, kiuj estis reuzitaj en elektroforeza bufro, estis plue malplenigitaj per HCl-hidrolizo je 105 ° C por 25 min en 3 m HCl sub N.₂ atmosfero. La reago haltis per sesfoja diluo en akvo, kaj la miksaĵo estis liofilizita. La liofilato resuspendiĝis en 5 µl de bufro de elektroforesis, pH 1.9, kaj ekvidis sur celuloza TLC-plato kune kun fosfo-Ser, -Thr, kaj -Tyr normoj. Elektroforezo estis farita pli ol duono de la longo de la TLC-plato uzante bufron de elektroforesis, pH 1.9, kaj tiam la telero estis translokigita en la bufron pH 3.5, kaj la elektroforezo estis plenumita ĝis kompletigo. La fosfoamino-acidaj normoj videblis disverŝante la TLC-platon kun solvo de 1% (v / v) nahidrina en acetono, kaj la ³²Specimenoj de aminoacido markitaj P estis videbligitaj per aŭradiografio kaj fosforimagado.

siRNA-induktita CK2α frapado.

Ni uzis RNA-interfermetodon por selekte detrui la nivelojn de CK2 (Di Maira et al., 2005). PC12-ĉeloj estis plantitaj sur plakojn de ses putoj kun kolageno I por atingi la lu70-80% -konfluon la sekvan tagon, kiam ili estis transsenditaj transitive kun 20 nm (fina koncentriĝo) de aŭ ne-disvastiganta siRNA aŭ siRNA direktitaj al la mRNA de la kataliza α-subuneco de Rato CK2, uzante 5 μl de la transfekta agento SilentFectin (Bio-Rad) kaj sekvante la instrukciojn de la fabrikanto. Proksimume 24 h poste, ĉeloj estis transsufiĉe transfektitaj kun plasmido ΔFosB, kiel dirite supre. Proksimume 24 h poste (∼48 h post transfluo de siRNA), ĉeloj estis submetitaj al ³²P metabola etikedado aŭ pulso-ĉasa analizo kiel priskribite supre. La sekvaj kvar CK2α siRNAoj estis uzataj kun similaj rezultoj: 5′P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ′, 5′P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3 ′, 5′P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUUXUMUUUUXUUMXUMUUMXUMUUMUA Kiel negativa kontrolo, ni uzis Silentisto negativa kontrolo #3 siRNA de Ambion (Austin, TX). La amplekso de CK2-frapado estis kontrolita per imunoblotado uzante kontraŭ-CK2-plurkolonikan antikorpon (katalogo # 06-873 de Upstate) dum la nokto ĉe diluvo 1: 1000. β-Tubulin estis uzata kiel ŝarĝa kontrolo kaj detektita kun monoklona antikorpo (katalogo # 05-661 de Upstate) dum la nokto ĉe diluo 1: 20,000.

Loko direktita de mutagenezo.

Mutacio de Ser27 al Ala aŭ al Asp plenumiĝis uzante Quick Change Site Directed Mutagenesis-kiton (Stratagene, La Jolla, CA) kaj sekvante la instrukciojn de la fabrikanto. Por enkonduki la Ser27-mutaciojn en la muso proteinFosB-proteino, la jenaj mutagenezaj primeroj estis uzataj. Ser27 al Ala: (reverto) 5′GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 ′. Ser27 al Asp (antaŭdirekto) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 ′. La mutaciitaj bazoj estas aŭdacaj, kaj la kodono Ser27 estas italigita.

Bioinformatiko.

Eblaj fosforilaj lokoj kaj kinases por ΔFosB estis serĉitaj submetante la musan proteinan sekvencon al specialigitaj datumbazoj inkluzive de ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost et al., 2004), kaj NetPhosK (Blom et al., 2004).

Kvantaj datumoj, kalkuloj kaj statistikoj.

La kvanto de proteino ĉeestanta en la PVDF aŭ nitrocelulosa membrano estis kvantigita uzante Storm PhosphorImager kaj la akompanan ImageQuant-programon (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). En la ĉelkulturo kaj cerba tranĉa fosforiliga studo, la valoroj akiritaj por la ³²P-markita proteino tiam estis dividita laŭ la valoroj akiritaj por entute ΔFosB, kaj esprimita kiel rilatumo. En la en vitro studoj pri fosforilado, kvanto de ³²P-markita ΔFosB por mol de ΔFosB (stokiometrio) estis kalkulita kiel priskribite antaŭe (Sahin et al., 2004). Ĉiuj mezuradoj estis prenitaj ene de la lineara gamo de la uzata instrumento. Kinetaj parametroj estis kalkulitaj per la modelo Michaelis-Menten, per kiu V = V_maks[S] / ([S]+K_M) kaj V_maks = k₂[E_Tuta]. La duonvivo (t_1/2) de ΔFosB kaj FosB estis taksitaj el la puls-ĉasaj intrigoj (uzante la ne-linian regreson, kiu plej bone konvenis la datumpunktojn) kaj respondas al la tempo, kiam la kvanto de restanta proteino estas 50% de la originalo. En ĉiuj figuroj, la rezultoj montras reprezentajn almenaŭ du ĝis tri sendependajn eksperimentojn. En ĉiuj grafikaĵoj, la datumoj montritaj estas mezumoj ± SEMoj (3 ≤ n ≤16). La statistika signifo de diferencoj estis taksita per neparenco t testo, korektita por multnombraj komparoj, kaj la asteriskoj indikas p ≤ 0.05.

Antaŭa SekcioSekva Sekcio

rezultoj

ΔFosB estas nekutime stabila transskriba faktoro

Kvankam ni spekulis antaŭe, ke ΔFosB estas relative stabila transskriba faktoro (Nestler et al., 2001) ĝis nun ne estis realigita rekta analizo de la turnoprofilo de la proteino. Por trakti ĉi tiun demandon, ni faris eksperimentojn de puls-ĉasoj uzante PC12-ĉelojn, kiuj estis vaste uzataj kiel neŭtona-ĉela linio, en kiuj ΔFosB estis esprimita transitive per infekto kun virus herpes simplex rekombinante (HSV-ΔFosB). Lastatempe sintezitaj proteinoj estis metaboligitaj kun ³⁵S-Met / Cys, kaj la degela padrono de ³⁵S-etikedita ΔFosB (³⁵S-ΔFosB) estis kontrolita imunoprecipitante ĝin el ĉelaj lisatoj akiritaj en diversaj tempopunktoj post forigo de la radiomarkataj aminoacidoj. Analizo de la imunoprecipitoj per SDS-PAGE kaj aŭtoreradiografio malkaŝis, ke la duonvivo de ΔFosB en PC12-ĉeloj estas ∼10 h (Figo. 1). Ĉi tiuj trovoj montras, ke la duonvivo de ΔFosB estas pli alta ol tiu de plej induciblaj transskribaj faktoroj (vidu Diskuto), inkluzive de plenlonga FosB, kies duonvivo en ĉelkulturo estis raportita esti ∼90 min (Dobrazanski et al., 1991; Carle et al. 2004). Krome, ĝi valoras rimarki, ke la degenero de ΔFosB ne konvenas al eksponenta eksponenta dekadenca kurbo, sed prefere ĝi estas bifazika, komencante kun pli malrapida degela indico. Ĉi tio sugestas la ekziston de pli ol unu ΔFosB-speco kaj / aŭ pli ol unu degrada vojo.

Rigardu pli grandan version:

• En ĉi tiu paĝo
• En nova fenestro

• Elŝuti kiel PowerPoint Slide

Figuro 1.

ΔFosB estas nekutime stabila transskriba faktoro. La duonvivo de ΔFosB estas ∼10 h en ĉelkulturo. ΔFosB estis esprimita en PC12-ĉeloj per infekto kun HSV-ΔFosB aŭ transira transfekto kun plasmido enhavanta plasFosB, kaj ĉeloj estis submetitaj al puls-ĉasaj eksperimentoj kiel priskribite en Materialoj kaj Metodoj. Ekvivalentaj rezultoj estis akiritaj sendepende de la metodo uzata por subpremi ΔFosB. La figuro montras la tempan kurson (kaj reprezentan aŭradiogramon) de ΔFosB-degelo. La datumoj indikitaj estas la mezumo ± SEM de almenaŭ 15 individuaj datumpunktoj akiritaj de almenaŭ kvin sendependaj eksperimentoj. Por komparo, la raportita duonvivo de plenlonga FosB estas indikita.

ΔFosB estas fosfoproteino en cerbo

Ni hipotezis, ke posttradicia modifo de ΔFosB povus kontribui al ĝia ŝajna stabileco. Ĉar fosforiligo estis montrita moduli la aktivecon de transskribaj faktoroj laŭ multaj manieroj, inkluzive de ilia stabileco (por revizio, vidu Desterro et al., 2000; Whitmarsh kaj Davis, 2000), ni esploris ĉu ΔFosB estas fosfoproteino. Tiucele, expressionFosB-esprimo estis induktita en rato-cerbo uzante kronikan ECS, traktadon konatan por indiki altajn nivelojn de ΔFosB, aparte en fronta kortekso (Hope et al., 1994a). Unu tagon post la lasta ECS-kuracado, kiam ΔFosB-niveloj restas altaj, maldikaj frontaj kortikaj tranĉaĵoj estis preparitaj kaj metaboligitaj etikeditaj kun ³²P-ortofosfato. Paralela aro de tranĉaĵoj ne estis radiomarkita, kaj ĉi tiuj estis uzataj por detekti totalajn ΔFosB-nivelojn. Post imunoprecipitado kun specifa kontraŭ-FosB / ΔFosB-antikorpo kaj apartigo de la imunoprecipitaj proteinoj per SDS-PAGE, fosforilata ³²P-markita ΔFosB estis detektita per aŭtradiografio, dum totala ΔFosB estis detektita per imunoblotado. Ĉi tiu analizo malkaŝis, ke ΔFosB estas fosforilata en cerbo, kiel pruvis specifaĵo ³²P-markita bando de ∼35 kDa ĉeestanta en la cerbaj specimenoj kronike traktitaj, sed ĝi estas preskaŭ nedetruebla en la tristaj kontroloj (Figo. 2A). Ĉi tio konformas al la fakto, ke, forestante kronikan stimuladon, bazaj niveloj de ΔFosB estas tre malaltaj. La specifeco de la imunoprecipita reago estas ilustrita per la manko de signalo en la neimuna IgG-precipitaĵo.

Rigardu pli grandan version:

• En ĉi tiu paĝo
• En nova fenestro

• Elŝuti kiel PowerPoint Slide

Figuro 2.

ΔFosB estas fosfoproteino en cerbo. A, ΔFosB estas fosforilata en cerbo. Endogena ΔFosB estis induktita en rato cerbo per kronika ECS-traktado kiel priskribita en Materialoj kaj Metodoj. Frontalaj kortikaj tranĉaĵoj estis metaboligitaj kun ³²PH₃PO₄ dum pluraj horoj. Post homogenigo de la tranĉaĵoj, ΔFosB estis imunoprecipitata, kaj fosforilata ΔFosB (³²P-ΔFosB) estis detektita per aŭtomataradiografio (supra panelo). Tuta ΔFosB en neradioaktivaj imunoprecipitaĵoj estis detektita per imunoblotado (funda panelo). Kiel negativaj kontroloj, oni montras la imunoprecipitadon de malhelp-traktita besto kaj neimuna IgG. B, Kandidataj fosforilaj lokoj kaj kinases kun respondaj prognozaj poentoj por la musa ΔFosB-proteina sekvenco estis akiritaj per bioinformata analizo. La kandidataj retejoj kun la plej altaj prognozaj partituroj estas reliefigitaj en la proteina sinsekvo kaj listigitaj en la tabelo. La DNA-baza (baza) domajno kaj leucina zipo estas aŭdacaj en la proteina sinsekvo. C, D, ΔFosB-fosforilado estas pliigita per la O / Ser-Thr-fosfatasa inhibidor OA. C, ³²P-ΔFosB-niveloj en imunoprecipitaĵoj de frontaj kortikaj tranĉaĵoj etiketitaj en la foresto (Ctr) aŭ ĉeesto de 100 ng / ml OA (grafeo kaj supra panelo) estis detektitaj per aŭtradiografio. La funda panelo montras entute ΔFosB detektita en imunoprecipitaĵoj de nebeligitaj tranĉaĵoj per imunoblotado. D, PC12-ĉeloj estis infektitaj kun HSV-ΔFosB aŭ HSV-LacZ (vektoro) kaj metaboligitaj etikeditaj per ³²PH₃PO₄ en la foresto (Ctr) aŭ ĉeesto de 100 ng / ml OA. ³²P-ΔFosB-niveloj en imunoprecipitaĵoj estis detektitaj per autoradiografio (grafeo, supra panelo). La malsupra panelo montras entute ΔFosB detektita en ĉelaj lisatoj per imunoblotado.

Kiel unua paŝo por elĉerpi kiajn kinaseojn kaj retejojn partoprenas en fosforilación osFosB, ni submetis ĝian aminoacidan sekvencon al pluraj bioinformaj analizoj. Ĉi tio malkaŝis, ke kvankam ΔFosB enhavas neniujn Tyr-fosforilajn kandidatajn lokojn, ĝi enhavas plurajn Ser / Thr kinase-konsentajn ejojn, inkluzive de tri lokoj de CaMKII, tri lokoj de CK2, kaj du PKC-ejojn kun tre altaj prognozaj fosforilaj poentaroj (Figo. 2B). Se, kiel antaŭvidite per bioinformatiko, ΔFosB estas nur fosforilata sur restaĵoj de Ser aŭ Thr, tiam ĝia fosforilado devas esti signife modulita per la aktiveco de Ser / Thr-fosfataseoj. Por testi ĉi tiun hipotezon, ni etikedis frontajn kortikajn tranĉojn ³²P-ortofosfato en ĉeesto aŭ foresto de OA, ser / Thr-proteina fosfatasa inhibilo. Kiel montrite en figuro 2C, OA kaŭzis grandan (∼2.5-faldon) pliiĝon en ³²P-ΔFosB. Ĝi ankaŭ kaŭzis malgrandan kreskon en totalaj ΔFosB-niveloj, kio kongruas kun antaŭaj raportoj ligantaj la karcinogenajn efikojn de OA al ĝia kapablo indukti plurajn tujajn fruajn genojn inkluzive de proteinoj FosMiller et al., 1998; Choe et al., 2004). La neta rezulto estas signifa totala kresko (∼60%) en fosforiligitaj ΔFosB-niveloj.

Ni tiam esploris, ĉu en PC12-ĉeloj, kiuj pli taŭgas al eksperimenta manipulado, ΔFosB montris fosforilan ŝablonon similan al la vidita en cerbo. Ni esprimis ΔFosB en PC12-ĉeloj per infekto kun HSV-ΔFosB kaj metabolize etikedis la ĉelojn kun ³²P-ortofosfato en ĉeesto aŭ foresto de OA. La sukcesa esprimo kaj imunoprecipitado de la proteino de HSV-ΔFosB-infektitaj ĉeloj estas montritaj de la ĉeesto ambaŭ en la imunobloto (Figo. 2D, malsupra panelo) kaj la aŭtradiografo (supra panelo) de ∼35 kDa bando, forestanta en la vektoraj infektitaj ĉeloj. Kiel observite en cerbo, OA kaŭzis malgrandan kreskon de entute ΔFosB-niveloj sed multe pli altan (proksimume duoble) pliigon en ³²P-ΔFosB, rezultigante signifan (∼50%) netan kreskon en ΔFosB-fosforilado. Plue, konforme al la bioinformaj prognozoj, kuracado de PC12-ĉeloj kun Tyr-fosfatase-inhibilo ne rezultis en signifaj ŝanĝoj en ³²P-ΔFosB-niveloj (datumoj ne montritaj). Kune, ĉi tiuj trovoj malkaŝis, ke ΔFosB estas fosforilata sur Ser kaj / aŭ Thr-restaĵoj en cerbo kaj en PC12-ĉeloj kaj konfirmis ĉi-lastan esti bona ĉela kultur-sistemo en kiu plue studi la fosforilajn kaj degradajn profilojn de ΔFosB.

CK2 sed ne PKC aŭ CaMKII-fosforilatoj ΔFosB en vitro

Kiel priskribite supre, analizo de acidFosB-aminoacida sekvenco malkaŝis altajn prognozajn poentojn por fosforilaj lokoj de CK2, PKC, kaj CaMKII. Por determini kiu el ĉi tiuj kinases povas fosforiligi ΔFosB, ni realigis serion de en vitro reakcioj de fosforiligo uzante purigitajn kinases kaj purigitan rekombinan ΔFosB. Kiel montrite en figuro 3A, el la tri kandidataj kinases, nur CK2 fosforilata ΔFosB laŭ signifa maniero. Krome, pluraj aliaj kinaseoj estis provitaj (ekz. GSK3 kaj p70S6K) sed malsukcesis signife fosforilatigi ΔFosB (datumoj ne montritaj). Plia karakterizado de la reago de CK2 per analiza kurso de tempo malkaŝis, ke ĉi tiu kinasa povas katalizi la aliĝon de ∼0.5 mol de fosfato po mol de ΔFosB (Figo. 3B). La fakto, ke CK2 povas fosforiligi ΔFosB en vitro al konsiderinda stokiometrio (∼50%) estas sugestia fiziologie grava reago. Ni tiam studis la kinetikon de ĉi tiu reago per inkubado de CK2 en ĉeesto de kreskantaj kvantoj de purigitaj ΔFosB, kaj ni determinis, ke CK2-fosforilatoj ΔFosB kun V_maks de 5.8 pmol · min^-1 · Μg^-1 de enzimo, a? K_M de 18.4 μm, kaj a k_kato de 0.2 / s (Figo. 3C). La valoroj akiritaj por ĉi tiuj kinetikaj parametroj plue subtenas la fiziologian gravecon de ĉi tiu reago. Ekzemple, la K_M de CK2 por DARPP32, unu el ĝiaj plej konataj substratoj, estas 3.4 μm, kaj la k_kato estas ∼0.3 / s (Girault et al., 1989); la K_M por ATP-gamoj de ∼10-40 μm (Cochet et al., 1983; Silva-Neto et al., 2002), kaj tio por kazeino varias de ∼10 – 50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin et al., 1987). Kune, ĉi tiuj datumoj indikas, ke ΔFosB estas bona fida substrato por CK2 en vitro.

Rigardu pli grandan version:

• En ĉi tiu paĝo
• En nova fenestro

• Elŝuti kiel PowerPoint Slide

Figuro 3.

CK2 sed ne PKC aŭ CaMKII-fosforilatoj ΔFosB en vitro. La aŭtoreradiografo (supra panelo) montras la fosforilatan produkton, kaj la ĝemelita Coomassie (funda panelo) montras entute ΔFosB ĉeestan en la reago. A, Purigita rekombinanto ΔFosB estis submetita en vitro fosforiligo de diversaj kandidataj kinases (el kiuj tri estas montritaj). B, Tempa kurso kaj stokiometriaj analizoj indikas, ke CK2 povas fosforiligi ΔFosB en vitro kun estoikoometrio de ∼50%. C, Kinetika analizo de la reago de CK2 rivelis, ke ΔFosB estas bona fido en vitro substrato. La lineareco de la reago estas montrita en duobla-reciproka intrigo (fundo), sed la kinetikaj parametroj estis derivitaj de la kurbo de Michaelis-Menten (supro).

CK2 modulas la fosforiladon kaj stabilecon de ΔFosB en sendifektaj ĉeloj

Por taksi la fiziologian gravecon de fosforilación mediata de CK2 de ΔFosB, ni efektivigis komparan fosfoteptidan mapadon per en vitro fosforilata kaj PC12-ĉelo-fosforilata ΔFosB. Post SDS-PAĜO kaj elela gel ³²P-ΔFosB (el la en vitro reagoj aŭ de imunoprecipitato ³²P-markitaj ĉeloj), la proteino estis digestita per trypsino, kaj la rezultantaj fosfopeptidoj estis submetitaj al dudimensia apartigo. Ĉi tiu analizo malkaŝis, ke la ĉefa fosfopeptido el la reago CK2 komigris kun unu el du gravaj fosfopeptidoj el ΔFosB fosforilataj en PC12-ĉeloj (Figo. 4A), dum la fosfepeptidoj rezultantaj el la reago PKC aŭ CaMKII (datumoj ne montritaj) ne. Ekzistis dua ΔFosB-fosfepteptido ĉe la mapo el PC12-ĉeloj, sed pro la nekapablo de iu el kinases ni testis generi similan fosfopeptidon en vitro, ni nuntempe ne scias, ĉu ĉi tiu dua fosfepeptido enhavas fosforilan lokon malsaman ol la alia fosfopeptido aŭ ĉu ĝi reprezentas apartan provan peptidon enhavantan la saman fosforilan retejon.

Rigardu pli grandan version:

• En ĉi tiu paĝo
• En nova fenestro

• Elŝuti kiel PowerPoint Slide

Figuro 4.

CK2 modulas la fosforiladon kaj stabilecon de ΔFosB en sendifektaj ĉeloj. A, CK2 sed ne PKC ŝajnas fosforiligi ΔFosB en ĉeloj. Du-dimensiaj fosfopeptidaj mapoj de ΔFosB fosforiligitaj per CK2 aŭ PKC en vitro aŭ per sendifektaj PC12-ĉeloj. La sagoj montras kombinon de la peptido CK2-fosforilata sed ne de la PKC-fosforilata kun unu el la osphFosB-fosfepeptidoj akiritaj de PC12-ĉeloj. B, PhFosB-fosforilado en PC12-ĉeloj estas pliigita traktante ĉelojn kun la potenca CK2-aktiviga spermo (SP) kaj malpliiĝas per traktado kun la inhibilo de CK2 DRB. En kontrasto, ΔFosB-fosforilado en PC12-ĉeloj ne estis tuŝita de traktado nek kun PKC-aktivigilo (PMA) nek kun la PKC-specifa inhibilo calphostin-C (Tiza). Reprezenta aŭradiogramo (supra panelo) kaj imunobloto (malsupra panelo) estas montritaj. C – F, Efiko de CK2-agado sur ΔFosB-stabileco. La ciferoj montras la tempan kurson (kaj reprezentan aŭradiogramon) de ΔFosB-degenero. PC12-ĉeloj transitorie esprimantaj ΔFosB estis submetitaj al puls-ĉasaj eksperimentoj faritaj en la foresto aŭ ĉeesto de la DRB-CK2-inhibilo (C), la aktivulo spermine CK2 (D), aŭ la larĝ-spektra kinasa inhibilo H-8 (E), kiu estis uzata por kontroli la nespecifajn efikojn de DRB. F, Efiko de frapado de la kataliza subuneco de CK2 sur ΔFosB-stabileco. PC12-ĉeloj estis transfektitaj kun ne-disvastiĝanta siRNA (Ctr) aŭ siRNA celanta raton CK2α kaj 24 h poste transfektitaj kun plasmido ΔFosB. La supra panelo bildigas imunoblotojn de tut-ĉelaj lisatoj montrante la efikon de la CK2 siRNA sur CK2 kaj ΔFosB-proteinaj niveloj. La responda imunobloto por β-tubulino estas montrita kiel ŝarĝa kontrolo.

Por plue trakti la fiziologian gravecon de CK2 kiel ΔFosB kinase, ni traktis ΔFosB-esprimantajn PC12-ĉelojn per du drogoj, kiuj modulas CK2-agadon. Kiel montrite en figuro 4B, PhFosB-fosforiligo malpliiĝis per traktado de PC12-ĉeloj kun la ĉel-permeabla CK2-inhibilo DRB (Meggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995), kaj pliiĝis per traktado kun la poliamina spermino, konata kiel potenca CK2-aktivigilo (Cochet kaj Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983). En kontrasto, traktado de PC12-ĉeloj kun PKC-inhibitoro calphostin-C (Kobayashi et al., 1989; Tamaoki et al., 1990) aŭ la PKC-aktivigilo PMA (Schmidt kaj Hecker, 1975; Beh et al., 1989) ne rezultigis signifajn ŝanĝojn en ΔFosB-fosforilado. Kaze de PMA, la malgrava (kaj ne grava) kresko je ³²P-ΔFosB povus kalkuli per pliigo de entute levelsFosB-niveloj kaŭzitaj de ĉi tiu drogo; fakte, oni raportis, ke forbolaj esteroj indikas esprimon de pluraj proteinoj de la familio de Fos, inkluzive de FosB (Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). Plue, kuracado de ĉeloj kun la specifa ĉel-permeable CaMKII-inhibilo m-AIP (Ishida kaj Fujisawa, 1995; Stevens et al., 1999) ankaŭ ne rezultis en malpliigita ΔFosB-fosforilado (datumoj ne montritaj). Kune, ĉi tiuj rezultoj konformas al niaj en vitro trovoj kaj indikas, ke nerompitaj ĉeloj ΔFosB estas probable fosforilata de CK2 sed ne PKC aŭ CaMKII. La fakto ke CK2-inhibicio ne tute malhelpas ΔFosB-fosforiladon indikas la ekziston de pliaj fosforilaj lokoj en la proteino.

Ni poste ekzamenis, ĉu CK2 ludas rolon en la turniĝo de ΔFosB kaj per tio en ĝia stabileco. Tiucele, ni efektivigis puls-ĉasajn eksperimentojn uzante cellsFosB-esprimajn ĉelojn PC12 traktatajn per CK2-inhibilo aŭ CK2-aktivigilo uzata en la fosforiliga studo. Kiel montrite en figuro 4C, kuracado de ĉeloj kun CK2-inhibitoro DRB havis signifan efikon sur la turno-rapideco de ΔFosB, evidentigita per la ŝanĝo en formo de ĝia degela kurbo, de bifazika al kurbo pli proksima al tiu de eksponenta kadukiĝo. Aliflanke, la ĉeesto de CK2-aktiviga spermo kaŭzis gravan malpliiĝon de la degela indico de ΔFosB, kio kondukis al amasiĝo de la proteino dum la unuaj horoj de la ĉaso (Figo. 4D).

Kiel okazas kun multaj kinaseaj aktivuloj kaj inhibidores, spermino kaj DRB povas havi metabolajn efikojn ekster la modulado de CK2-agado. Fakte, DRB pruvas inhibici la asociitan kinaseon de la transkripciiga faktoro IIH (TFIIH) (Yankulov et al., 1995), kiu rezultigas inhibicion de RNA-polimerasa II-mediata transskribo. Ĉar ĉi tiu efiko povus koncepte influi la stabilecon de ΔFosB, ni analizis la efikon de la inhibito de larĝa spektra kinasa H-8 (Hidaka kaj Kobayashi, 1992) sur ΔFosB-turno ĉe koncentriĝo (200 μm) konata inhibi kinase-asociitan TFIIH sed ne CK2 (Yankulov et al., 1995). Kiel montris figuro 4E, kuracado kun H-8 ne influis la indicon de turno de ΔFosB. Similaj rezultoj estis akiritaj kun H-7, alia larĝa spektra kinasa inhibilo, uzata ĉe koncentriĝo, kiu malhelpas kinase-asociitan TFIIH sed ne CK2 (datumoj ne montritaj). Ĉi tiuj datumoj plue subtenas la interpreton, ke la redukto de ΔFosB-stabileco kaŭzita de DRB plej probable atribuas al inhibo de CK2.

Por plue establi la rolon de CK2 en turnoverFosB-turno, ni esploris la konsekvencojn de frapado de CK2 per siRNA. Ni plenumis ĉi tiujn eksperimentojn uzante PC12-ĉelojn, kiuj unue estis transfektitaj kun kontrolo (neplenigo) siRNA aŭ siRNA, kiu celas la mRNA de la kataliza subuneco de rato CK2 (CK2α) kaj 24 h poste transfektita kun ΔFosB. Kiel montrite en figuro 4F, transfekcio kun la CK2α siRNA efike kaj specife frapis CK2α-proteinajn nivelojn sen tuŝado de ΔFosB-niveloj (supra panelo). Puls-ĉasa analizo malkaŝis, ke frapado de CK2 rezultigis signifan kreskon de turnoverFosB-turnokosto kiel evidentigita per la pli rapida degenero de la proteino. La malhelpo de CK2-agado (ĉu tra DRB-traktado aŭ siRNA) pliigas la turnon de ΔFosB kaj rezultigas la malaperon de la malrapida ero de la bifazaj kurbo, dum CK2-aktivigo plibonigas la malrapidan fazon de la kurbo, provizas fortan subtenon por la ideo ke CK2 ludas rolon en reguligado de ΔFosB-stabileco.

CK2-fosforilatoj ΔFosB sur Ser27

Por komenci identigi la (j) lokojn (s) sur ΔFosB fosforiligitaj de CK2, ni faris fosfo-aminoacidan analizon de rekombinaj ΔFosB fosforiligitaj de CK2 en vitro kaj de ΔFosB fosforilitaj en PC12-ĉeloj. Ĉi tiuj eksperimentoj malkaŝis, ke ambaŭkaze la sola fosfamino-aminoacido detektita estis fosforo-Ser (Figo. 5A). Ĉi tiu trovo, kune kun la stokeichiometrio akirita por la CK2 en vitro reakcio de fosforilado (∼50%) (Figo. 3B) kaj la ĉeesto de nur unu signifa punkto en la mapo de fosfepteptikaj CK2 (Figo. 4A), sugestas, ke CK2-fosforilado de ΔFosB estas probable limigita al sola serina restaĵo. Ĉi tiu konkludo kongruas kun la analizo de fosforilaj konsentaj retejoj (Figo. 2B), kiu antaŭdiris nur unu kandidaton serine, t.e., Ser27, por CK2. Taksonomia analizo malkaŝis, ke Ser27 estas tre konservata per evoluo inter familianoj de Fos (Figo. 5B), sugestante ke ĝi povus porti gravan fiziologian funkcion.

Rigardu pli grandan version:

• En ĉi tiu paĝo
• En nova fenestro

• Elŝuti kiel PowerPoint Slide

Figuro 5.

CK2 Fosforilataj ΔFosB sur Ser27. A, Analizo de fosfamamina acido de CK2-fosforilata (en vitro) kaj PC12 ĉel-fosforiligitaj ΔFosB montrante ke, en ambaŭ kazoj, la ĉefa restaĵo fosforilata estas serino. B, Kruci-speca analizo de FosB / ΔFosB-aminoacida sekvenco rivelis altan konservadon de Ser27 inter Fos-familianoj de homo ĝis zebra fiŝo (malhela elstaraĵo). Tamen, la acida restaĵo ĉe pozicio + 3, necesa por la konsento-ejo de CK2, ne konserviĝas (malpeza resumo). C, HeLa-ĉeloj estis transsufiĉe transfektitaj per sovaĝa tipo ΔFosB (WT) aŭ ΔFosB enhavanta punktan mutacion por anstataŭigi Ser27 kun Ala (S27A). Ĉeloj estis metaboligitaj kun ³²PH₃PO₄ kaj traktita per veturilo aŭ per spermatozo (SP) por aktivigi CK2. Reprezenta aŭradiogramo (supra panelo) kaj imunobloto (malsupra panelo) de la akiritaj immunFosB-imunoprecipitaĵoj estas montritaj. La imunoprecipito de moko-transfektitaj ĉeloj (vektoroj) estas montrita.

Por determini ĉu Ser27 estas fosforilata en ΔFosB, ni mutigis ĉi tiun restaĵon al Ala, kaj analizis la konsekvencojn sur la fosforila statuso de la proteino. Tiucele, ni uzis HeLa-ĉelojn (transireblajn kun pli alta efikeco) por esprimi transitive ĉu WT aŭ S27A-mutanton ΔFosB. Proksimume 24 h post transfekcio, la ĉeloj estis metaboligitaj kun ³²P-ortofosfato, kaj tut-ĉelaj lisatoj estis preparitaj. Sekvante imunoprecipitadon kaj SDS-PAGON, ³²P-ΔFosB estis detektita per aŭtomataradiografio kaj entute ΔFosB per imunoblotado. Kiel montrite en figuro 5C (funda panelo), ΔFosB ne estis detektita en la vektor-transfektitaj ĉeloj, dum ĉeloj transfectitaj kun WT aŭ S27A-mutanto ΔFosB esprimis sukcese la proteinon. Ni trovis, ke la S27A-mutacio kaŭzis gravan (∼30%) redukton en ³²P-ΔFosB-niveloj (Figo. 5C, supra panelo kaj grafeo), indikante ke en vivantaj ĉeloj, ΔFosB estas fosforilata sur Ser27. Por peni konstati, ĉu en ĉeloj Ser27 estas efektive fosforilata de CK2, ni komparis la kapablon de la spermato CK2-aktivulo moduli la fosforiladon de WT kaj S27A ΔFosB. Kiel ni jam observis antaŭe en ĉeloj PC12 (Figo. 4B), kuracado de HeLa-ĉeloj kun spermino signife pliigis fosforiligon de la proteino WT. La fakto ke ĉi tiu efiko estis signife malpliigita per la S27A-mutacioFigo. 5C) subtenas la interpreton, ke Ser27 en ΔFosB estas fiziologia substrato por CK2.

Fosforilado de Ser27 reguligas stabilecon de ΔFosB

Eksciinte, ke la stabileco de ΔFosB malpliiĝas kiam CK2 estas malhelpita kaj plibonigita kiam CK2 estas aktivigita (Figo. 4), kaj ke CK2 fosforilas ΔFosB sur Ser27 (Figo. 5), ni antaŭdiris, ke malebligi fosforiligon de ĉi tiu retejo devas malstabiligi la proteinon. Pulse-ĉasaj eksperimentoj faritaj kun HeLa-ĉeloj transitive esprimantaj aŭ WT aŭ S27A-mutanton ΔFosB rivelis, ke kiel antaŭvidite, la S27A-mutacio rezultigis signifan kreskon de la indico de degradado de ΔFosB, kaj samtempe malpliiĝon de la duona vivo de la proteino. (Figo. 6A). Ni tiam esploris, ĉu ĉi tiu reguliga mekanismo ankaŭ okazas en la pli neŭron-simila PC12-ĉela linio. Ĉi tiuj eksperimentoj malkaŝis, kiel ni observis en HeLa-ĉeloj, la S27A-punkto-mutacio kaŭzas draman malkreskon en la duona vivo de ΔFosB en PC12-ĉeloj (de ∼11 al ∼4 h) (Figo. 6B). La fakto, ke ĉi tiu malstabiligo similas al tiu kaŭzita de inhibo aŭ malakcelo de CK2 (Figo. 4) liveras plian subtenon por la ideo, ke CK2-mediaciita fosforiligo de Ser27 reguligas la stabilecon de ΔFosB. Pliaj evidentecoj por la reguliga rolo de Ser27-fosforilado sur ΔFosB-proteina turno estis akiritaj per fosfomimetika mutacio Ser27 al Asp (S27D). La S27D-mutacio estas konsiderata fosfomimetika, ĉar ĝi lokas grandan grupon negative (ŝarboxil) ŝarĝita ĉe aminoacido 27 kaj tiel parte imitas la fosforiladon de Ser27. Kiel montrite en figuro 6C, la S27D-mutacio kaŭzis la kontraŭan efikon de la S27A-mutacio kaj rezultigis proteinon signife pli stabilan ol la proteino WT. Simile al la efiko akirita post CK2-aktivigo (Figo. 4D), la S27D-mutacio rezultigis la amasiĝon kaj tiel pliigis ΔFosB-nivelojn dum la unuaj horoj de ĉasado.

Rigardu pli grandan version:

• En ĉi tiu paĝo
• En nova fenestro

• Elŝuti kiel PowerPoint Slide

Figuro 6.

Fosforilado de Ser27 reguligas la stabilecon de ΔFosB. A, C, Puls-ĉasa analizo montranta la efikon de Ser27-fosforilado sur la turnoprocento de ΔFosB. La degela profilo kaj laŭtaksaj duonvivoj de sovaĝa tipo ΔFosB (WT), la Ser27 al Ala-mutanto (S27A), kaj la fosfomimetika Ser27 al Asp-mutaciulo (S27D) estas montritaj. La samaj trovoj estis akiritaj en HeLa-ĉeloj (A) kaj ĉeloj PC12 (B, C).

Ser27-fosforiligo stabiligas ΔFosB malhelpante ĝian proteasoman degeneron

Por komenci eluzi la mekanismon per kiu fosforiligo de Ser27 stabiligas ΔFosB, ni ekzamenis la kapablon de la inhibicioj de proteasoma MG132 (Palombella et al., 1994; Tsubuki et al., 1996) kaj epoxomicino (Hanada et al., 1992; Kim et al., 1999) por moduli la degeneron de WT kaj S27A-mutanto ΔFosB. Puls-ĉasaj eksperimentoj estis faritaj uzante PC12-ĉelojn infektitajn kun rekombinanta HSV esprimanta aŭ WT aŭ S27A ΔFosB kaj traktitajn kun DMSO aŭ unu el la du proteazomaj inhibidores. Ĉi tiuj eksperimentoj malkaŝis, ke kvankam la degrada indico de la proteino WT estas relative sensenta al la ĉeesto de ambaŭ el la inhibiciuloj de proteasoma (Figo. 7A), tiu de la S27A-mutaciulo estas sentema al ĉi tiuj drogoj (Figo. 7B). Ĉi tio indikas, ke male al la proteino WT, la mutanto S27A estas celo de proteasoma degradado. Efektive, kuracado de ĉeloj kun MG132 aŭ epoxomicino plene inversigis la efikon de S27A-mutacio sur la degela indico de ΔFosB, evidentigita per pliigo de la duonvivaĵo de S27A-mutaciulo de ∼4 ĝis ∼9 h por MG132 kaj al ∼ 12 h por epoxomicino (Figo. 7B). Kune, ĉi tiuj trovoj indikas, ke fosforiligo de ΔFosB sur Ser27 protektas la proteinon kontraŭ proteazoma degenero kaj tial estas esenca por ĝia nekutima stabileco.

Rigardu pli grandan version:

• En ĉi tiu paĝo
• En nova fenestro

• Elŝuti kiel PowerPoint Slide

Figuro 7.

Fosforiligo de Ser27 stabiligas ΔFosB malhelpante ĝian proteasoman degeneron. A, B, Puls-ĉasa analizo kun HSV-infektitaj PC12-ĉeloj montrantaj la degradan profilon kaj laŭtaksajn duonvivojn de sovaĝa tipo typeFosB (A) aŭ S27A ΔFosB (B) en la foresto aŭ ĉeesto de ambaŭ el du proteasomaj inhibidores [MG132 kaj epoxomicino (Epoxo)]. Rimarku la fakton, ke nek drogoj havas gravan efikon sur la rotacio de sovaĝa tipo ΔFosB, dum traktado de ĉeloj kun inhibo de proteasoma rezultigis la stabiligon de S27A ΔFosB. C, Modelo por la rolo de Ser27-fosforilado en la kapablo de ΔFosB mediacii longtempan cerban plastikecon. Fojo induktita, parto de ΔFosB stabiligas cerbon per la fosforilado mediata de CK2 de S27. Ĉi tio rezultigas ĝian amasiĝon, kiu siavice rezultigas longdaŭrajn ŝanĝojn en gena esprimo. Ĉi tiuj stabilaj ŝanĝoj en gena esprimo kontribuas al stabilaj kondutaj adaptiĝoj. Al la inversa, la defosforilación de S27 de la fosfatases Ser / Thr PP1 kaj / aŭ PP2A rezultas en malstabiligo de la proteino kaj ĝia prilaborado per la proteazoma maŝinaro.

Antaŭa SekcioSekva Sekcio

diskuto

En la nuna studo, ni montras, ke ΔFosB havas duonvivon de ∼10 h en ĉelkulturo, kio igas ĝin stabila kompare kun plenlonga FosB kaj plej multaj induktaj transskribaj faktoroj, kies duonvivoj en ĉelkulturo povas esti tiel mallongaj. kiel kelkaj minutoj kaj malofte superas 3 h (Hann kaj Eisenman, 1984; Dobrazanski et al., 1991; Roberts kaj Whitelaw, 1999; Ferrara et al., 2003; Hirata et al., 2004). Krome, ni trovas ke ΔFosB estas fosforilata en cerbo kaj ke ĝia fosforilado estas sentema al la okadaa acido de la inhibilo PP1 / PP2A. Niaj studoj pri ĉela kulturo pruvas, ke la stabileco de ΔFosB estas modulita de CK2, kun pli alta agado de CK2 stabiliganta la proteinon. Fine, niaj trovoj sugestas, ke CK2 fosforilas ΔFosB sur tre konservita N-fina serino (S27) kaj pruvas, ke fosforiligo de S27 protektas ΔFosB de proteasomal-degenero. Ni do proponas modelon, per kiu fosforiligo de ΔFosB sur S27 de CK2 estas kritika reguliga mekanismo de turno de ΔFosB (Figo. 7C). Tia fosforil-mediata stabiligo de ΔFosB estas funkcie grava, ĉar pliigitaj niveloj de ΔFosB en apartaj cerbaj regionoj pruviĝis rekte regi multajn neuronajn genojn. en vivo kaj praktiki potencajn kondutajn efikojn en bestaj modeloj de pluraj neuropsikiatriaj malsanoj (vidu Enkonduko).

Kvankam fosforilado estas rapida kaj revertebla maniero reguligi la transkriptan agadon de certaj transkripcifaktoroj, kiel ekzemple CREB (cAMP-responda elemento liganta proteinon) (Bohmann, 1990), moduli la degradadon de transskribaj faktoroj provizas eĉ pli potencan (malpli facile reverteblan) formon de regulado (Desterro et al., 2000). Transskribaj faktoroj kies funkcia agado estas reguligita je la nivelo de ilia degenero inkluzivas NFκB (Desterro et al., 2000), c-Myc (Sears et al., 1999), kaj c-Fos (Ferrara et al., 2003), inter aliaj. En multaj kazoj, la fosforilación estas ŝlosila regulilo de la stabileco de transskriba faktoro, kiel pruvis c-Fos (Okazaki kaj Sagata, 1995; Tsurumi et al., 1995), Fos-rilata antigen-1 (Fra-1) (Vial kaj Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe et al., 2001), c-junio (Fuchs et al., 1996), JunB (Fuchs et al., 1997), ATF2 (Fuchs et al., 2000), kaj p53 (Buschmann et al., 2001). Niaj studoj aldonas ΔFosB al ĉi tiu listo de transskribaj faktoroj, kies funkcia agado estas reguligita per ĝia fosforilata dependa stabileco.

CK2 estas ĉiea kaj konstitue aktiva Ser / Thr kinazo, kiu havas> 300 laŭdirajn substratojn identigitajn ĝis nun kaj estas implikita en multnombraj biologiaj procezoj, inkluzive de ĉela morto kaj postvivado (Litchfield, 2003; Unger et al., 2004), ĉelaj streĉaj respondoj (Yanagawa et al., 1997; Kato et al., 2003), kaj DNA-riparo kaj remodelado de kromatino (Barz et al., 2003; Krohn et al., 2003). Pli ol triono de la putaj substratoj de CK2 estas proteinoj implikitaj en la regulado de gena esprimoMeggio kaj Pinna, 2003). Fakte, CK2 pruviĝis esti elstara nuklea kinase (Krek et al., 1992) (por revizio, vidu Yu et al., 2001) kaj interagi kun la bZIP-domajnoj de pluraj transskribaj faktoroj (Yamaguchi et al., 1998). CK2-mediaciita fosforilado ankaŭ estis montrita moduli la degeneron (ĉu plibonigante aŭ malpliigante ĝin) de multaj proteinoj, inkluzive de IkB (Schwarz et al., 1996), PTEN (Torres kaj Pulido, 2001), lenso-konnekso (Yin et al., 2000), kromatino-asociita proteino HMG1 (Wisniewski et al., 1999), kaj pluraj transskribaj faktoroj kiel HMGB (Stemmer et al., 2002), Myf-5 (Vintro et al., 1997), kaj c-Myc (Channavajhala kaj Seldin, 2002). CK2 estas plej abunda en cerbo (Alcazar et al., 1988; Girault et al., 1990), kaj ĝia aktiveco estis implikita en multaj aspektoj de cerba funkcio, inkluzive de neŭrona postvivado (Boehning et al., 2003), diferencigo (Nuthall et al., 2004), ion-kanala funkcio (Jones kaj Yakel, 2003; Bildl et al., 2004), kaj longtempa potencigo kaj neŭrona plasteco (Diaz-Nido et al., 1992; Lieberman kaj Mody, 1999; Reikhardt et al., 2003).

Malgraŭ ĉi tiu kreskanta evidenteco pri la rolo de CK2 en la regulado de neurona funkcio, oni scias malmulte pri tio, kio regas ĝian aktivecon. CK2 estas pensita konstitucie aktiva, kun regulado pri sia kapablo fosforiligi specifajn substratojn dependante plejparte de ŝanĝoj en ĝia intracelula lokalizo (ekz., Citosol vs kerno) (Ahmed kaj Tawfic, 1994; Yu et al., 1999). Ĉi tiuj informoj levas gravan demandon pri kiaj signaloj necesas por indukti ΔFosB-amasiĝon en cerbo post kronika stimulado (Figo. 7C). Unu postulo estas ripeta aktivigo de la fosB geno kaj indukto de ΔFosB mRNA (Chen et al., 1995). Niaj datumoj indikas, ke CK2-fosforilado de ΔFosB estas kritika por ĝia stabileco, sugestante, ke eble dua signalo povas esti bezonata por la longtempaj efikoj de ΔFosB sur gena esprimo, nome, signalo, kiu stimulas la fosforiladon de proteino per CK2. Ĉi tio povus impliki la aktivigon de CK2 per iu nekonata mekanismo aŭ ĝia translokigo al la kerno. Alternative, CK2-fosforiligo de ΔFosB eble konstituas, tiel ke asFosB-proteino tradukiĝas en respondo al ĉiu stimulo, parto de ĝi fosforilata kaj tiel stabiligita, tiel ke kun ripeta stimulo ĝi akumuliĝas al altaj niveloj en tuŝitaj neŭronoj.

Niaj trovoj montras, ke CK2 kaj S27 probable ne estas la sola kinase kaj retejo respondecaj pri lFosB-fosforilado, ĉar nek inhibicio de CK2 nek S27A-mutacio kapablis tute malebligi ΔFosB-fosforiladon. Samkiel la fakto, ke la S27A-mutacio rezultigas 30%-redukton de fosforo-ΔFosB argumentas, ke S27 estas ĉefa fosforiliga loko sur la proteino. Ni esploras tamen aliajn putativajn kinases kaj fosforilajn ejojn sur ΔFosB. Finfine, ankaŭ estos grave analizi la fosforiladon de S27 kaj iujn aliajn fosforilajn lokojn en ΔFosB en cerbo. en vivo post diversaj specoj de kronika stimulado, ekzemple per uzo de amasa spektrometrio aŭ fosfospecifaj antikorpoj.

Kiel menciite supre, S27 en ΔFosB estas tre konservita tra evoluo kaj inter aliaj proteinoj de la familio Fos. Tamen la konsenta ejo por CK2 ne estas: kiel montrite en figuro 5B, nur FosB / ΔFosB (kaj la xenologa Zebrafiŝo), sed ne c-Fos aŭ Fra-2, havas acidan restaĵon ĉe + 3, ŝlosila determinilo de fosforilación CK2 (Marin et al., 1986; Meggio et al., 1994). Tiel, la manko de CK2-fosforilado sur S27 eble klarigas kial aliaj proteinoj de la familio Fos ne estas tiel stabilaj kiel ΔFosB. Tamen ĉi tio ne klarigas, kial plenlonga FosB, kiu havas la saman CK2-konsenton-ejon kiel ΔFosB, ne estas same stabiligita. Ni ne scias ĉu plentra FosB estas fosforilata de CK2 sur ĉi konservita restaĵo. La solaj raportoj de FosB (Skinner et al., 1997) kaj c-Fos (Okazaki kaj Sagata, 1995; Chen et al., 1996) fosforiligo priskribas lokojn en la C-fina regiono de ĉi tiuj proteinoj, kiu forestas en ΔFosB. La potenciala fosforiligo de plenlongaj FosB kaj aliaj Fos-familiaj proteinoj de CK2 postulas rektan esploron. Tamen, eĉ se ili estas fosforilataj, oni scias, ke la aliaj proteinoj de la familio Fos enhavas motivojn ĉe sia finaĵo C, kiuj celas la proteinojn por rapida degenero (Papavassiliou et al., 1992; Jariel-Encontre et al., 1997; Acquaviva et al., 2002). Ekzemple, pruviĝis, ke etendo de ∼21-restaĵoj ĉeestantaj en la finaĵo C de ĉiuj proteinoj de la familio Fos, sed forestanta en ΔFosB, funkcias kiel malstabiliga domajno por c-Fos (Acquaviva et al., 2001). Ni trovis, ke kvankam ĉi tiu vico simile malstabiligas plenlongan FosB (Carle et al., 2004), la foresto de ĉi tiu regado en ΔFosB tute ne enkalkulas ĝian stabiligon. Anstataŭe, la kombinaĵo de la foresto de ĉi tiu C-termina domajno kaj Ser27-fosforilado ŝajnas plene klarigi la proksimume kvinoblan diferencon de stabileco inter ΔFosB kaj FosB.

Kvankam la degradado de la proteinoj de la familio de Fos estas kompleksa kaj ne plene komprenata, la proteasoma degradado ŝajnas esti la ĉefa vojo engaĝita (Salvat et al., 1999; Acquaviva et al., 2002; Ferrara et al., 2003). Datumoj prezentitaj ĉi tie, en kiuj proteazomaj inhibidores ne ŝanĝas signife la indicon de ΔFosB-degradado, argumentas ke, male al aliaj proteinoj de Fos-familio, ΔFosB elvokas la proteazomon 26S, kaj ĉi tio ludas centran rolon en ĝia stabiligo. Ni do proponas skemon, per kiu la plibonigita stabileco de ΔFosB estas atribuebla al la kombinaĵo de du ĉefaj faktoroj: (1) la foresto de C-fina stacio malstabiliga domajno kaj (2) la fosforiligo de S27 de CK2.

En resumo, la aktuala studo liveras mekanikan komprenon pri kial ΔFosB, produkto de la tuja frua geno fosB, estas, male al ĉiuj aliaj familianoj Fos, relative longe vivata proteino. Kvankam oni pensas, ke aliaj proteinoj de la familio Fos medias kun rapida stimulo-transkripta kuplado (Morgan kaj Curran, 1995), la relativa stabileco de ΔFosB donas al ĝi la kapablon mezuri pli longdaŭrajn transskribajn ŝanĝojn induktitajn de kronika stimulado. Ĉi tio subtenas la vidon, ke ΔFosB funkcias kiel daŭra molekula ŝaltilo en cerbo, iom post iom konvertante akrajn respondojn al kronikaj adaptiĝoj. Identigo de Ser27-fosforilado kiel centra mekanismo por la stabileco de ΔFosB malfermas novajn vojojn por la disvolvo de rimedoj por reguligi la funkcion de ΔFosB kaj tiel moduli ĝiajn longtempajn efikojn sur neŭra kaj konduta plastikeco.

Antaŭa SekcioSekva Sekcio

Piednotoj

• Ricevis novembro 21, 2005.
• Revizio ricevis februaron 21, 2006.
• Akceptita April 2, 2006.

• Ĉi tiu laboro estis subtenita de Nacia Alianco por Esploro pri Schizophrenia kaj Depression Young Investigator Award al PGU, Nacia Instituto pri Drug Abuse (NIDA) Nacia Esplora Servo-Premio al PGU, kaj subvencioj de la Nacia Instituto pri Mensa Sano kaj NIDA al EJN Ni. dankon al d-ro James Bibb pro lia helpo kun la en vitro Fosforiligo atestas, D-ro Ming-Hu Han pro sia helpo kun la preparado de cerbaj tranĉaĵoj uzataj por metaboligi etikedadon, kaj D-ro Rachael Neve pro ŝia helpo pri la enpakado de la rekombinaj HSV-oj.
• Nuna adreso de G. Rudenko: Vivscienca Instituto kaj Fako de Farmakologio, Universitato de Miĉigano, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
• Korespondado estu adresita al Eric J. Nestler, 5323 Boulevard Harry Hines, Dallas, TX 75390-9070. Retpoŝto: [retpoŝte protektita]

Antaŭa Sekcio

Referencoj

1. ↵

Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) Identigo de C-fina tripeptida motivo implikita en la kontrolo de rapida proteasomala degenero de c-Fos proto-oncoproteino dum la G (0) -a-S-fazo-transiro. oncogene 20:7563-7572.

CrossRefMedlino

2. ↵

Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) Multnombraj degradaj vojoj por proteinoj de la familio Fos. Ann NY Acad Sci 973:426-434.

Medlino

3. ↵

Ahmed K, Tawfic S (1994) Mekanismo de intracelula regulado de proteina kinase CK2: rolo de stimula mediata subnuklea asocio. Ĉela Mol Biol Res 40:539-545.

Medlino

4. ↵

Alcazar A, Martin E, Lopez-Fando J, Salinas M (1988) Plibonigita puriga proceduro kaj ecoj de kazeina kinase II de cerbo. Neurochem Res 13:829-836.

CrossRefMedlino

5. ↵

Andersson M, Westin JE, Cenci MA (2003) Tempa kurso de striatala DeltaFosB-simila imunoreaktiveco kaj prodynorfin-ARNm-niveloj post ĉesigo de kronika dopaminomimetika traktado. Eur J Neurosci 17:661-666.

CrossRefMedlino

6. ↵

Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W (2003) Ĝeneral-esprimaj ekranoj indikas tutmondan rolon por proteino kinase CK2 en remodelado de kromatino. J Ĉelo Sci 116:1563-1577.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

7. ↵

Beh I, Schmidt R, Hecker E (1989) Du izozimoj de PKC trovitaj en HL-60-ĉeloj montras diferencon en aktivado per la phorbol-ester TPA. FEBS-Lito 249:264-266.

Medlino

8. ↵

Bildl W, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) Proteina kinase CK2 estas kunigita kun malgrandaj konduktaj Ca (2 +) - aktivigitaj K + kanaloj kaj reguligas kanalon. Neŭrono 43:847-858.

CrossRefMedlino

9. ↵

Bing G, Wang W, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Jin L, Zhang W, Bing R, Hong JS (1997) Longperspektiva esprimo de Fos-rilata antigeno kaj traira esprimo de delta FosB asociita kun kaptiloj en la rato hipokampo kaj striato. J Neurochem 68:272-279.

Medlino

10. ↵

Blom N, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) Antaŭdiro de post-traduka glicosilado kaj fosforiligo de proteinoj el la aminoacida sinsekvo. Proteomiko 4:1633-1649.

CrossRefMedlino

11. ↵

Boehning D, Luno C, Sharma S, Hurt KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) Neŭrotransmisio de karbona monoksido aktivigita per fosforiligo de CK2 de heme-oksigenase-2. Neŭrono 40:129-137.

CrossRefMedlino

12. ↵

Bohmann D (1990) Transskriba faktoro-fosforiligo: ligo inter signal-transdukto kaj regulado de gena esprimo. Kancerĉeloj 2:337-344.

Medlino

13. ↵

Buschmann T, Potapova O, Bar-Shira A, Ivanov VN, Fuchs SY, Henderson S, Fried VA, Minamoto T, Alarcon-Vargas D, Pincus MR, Gaarde WA, Holbrook NJ, Shiloh Y, Ronai Z (2001) Jun-NH2-fina kinasa fosforilado de p53 sur Thr-81 gravas por p53-stabiligo kaj transkripciaj agadoj en respondo al streĉo. Mol Cell Biol 21:2743-2754.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

14. ↵

Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) Foresto de konservita Fos-familio C-fina domajno kontribuas al la unika stabileco de deltaFosB. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.

15. ↵

Channavajhala P, Seldin DC (2002) Funkcia interagado de proteino kinase CK2 kaj c-Myc en limfomagenozo. oncogene 21:5280-5288.

CrossRefMedlino

16. ↵

Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ (1995) Reguligo de delta FosB kaj FosB-similaj proteinoj per elektrokonvulsivaj prenoj kaj kokainaj traktadoj. Mol Pharmacol 48:880-889.

abstrakta

17. ↵

Chen J, Kelz MB, Espero BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Kronikaj fosaj rilatoj: stabilaj variantoj de ΔFosB induktitaj en cerbo per kronikaj traktadoj. J Neurosci 17:4933-4941.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

18. ↵

Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J (1996) Fosforiligo de c-Fos ĉe la C-finaĵo plibonigas ĝian transforman agadon. oncogene 12:1493-1502.

Medlino

19. ↵

Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) Okadaika acido de la proteina fosfatasa 1 / 2A pliigas CREF kaj Elk-1-fosforiladon kaj c-fos-esprimon en la rata striatum in vivo. J Neurochem 89:383-390.

CrossRefMedlino

20. ↵

Cochet C, Chambaz EM (1983) Proteinoj-fosforilaj proteinaj mediatoj de poliamino: ebla celo por intracelula poliamida ago. Molokula Endocrinol 30:247-266.

CrossRefMedlino

21. ↵

Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) Katalikaj kaj molekulaj ecoj de tre purigita G-kazeina kinase de bovina pulma histo. Biochim Biophys Acta 743:1-12.

Medlino

22. ↵

Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) Striatala ĉel-speca troa ekspreso de DeltaFosB plibonigas stimulon por kokaino. J Neurosci 23:2488-2493.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

23. ↵

Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) Kokaza memadministrado pliigas preprodinorfinon, sed ne c-fos, mRNA en rat striatum. NeuroReport 4:543-546.

Medlino

24. ↵

Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) Reguligo de transskribaj faktoroj per degradado de proteinoj. Ĉela Mol Viva Sci 57:1207-1219.

CrossRefMedlino

25. ↵

Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J (1992) Pliiĝo de citoplasma kazeina kinasa II-agado akompanas neŭritan elfluon post DNA-sinteza inhibicio en neŭoblastomaj ĉeloj NIA-103. J Neurochem 58:1820-1828.

Medlino

26. ↵

Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) Protein kinase CK2-fosforilatoj kaj reguligas Akt / PKB. Ĉela Morto Malsama 12:668-677.

CrossRefMedlino

27. ↵

Dobrazanski P, Noguchi T, Kovary K, Rizzo CA, Lazo PS, Bravo R (1991) Ambaŭ produktoj de la geno fosB, FosB kaj ĝia mallonga formo, FosB / SF, estas transkripciaj aktivigantoj en fibroblastoj. Mol Cell Biol 11:5470-5478.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

28. ↵

Ferrara P, Andermarcher E, Bossis G, Acquaviva C, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2003) La strukturaj determinantoj respondecaj pri proteasoma degradado de proteinoj c-Fos malsamas laŭ la esprimkondiĉoj. oncogene 22:1461-1474.

CrossRefMedlino

29. ↵

Fuchs SY, Dolan L, Davis RJ, Ronai Z (1996) Dependa de la fosforilación celanta cibun-ubiquitination de Jun N-kinase. oncogene 13:1531-1535.

Medlino

30. ↵

Fuchs SY, Xie B, Adler V, Fried VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) c-Jun NH2-finaĵaj kinases celas la ubikvitadon de iliaj asociitaj transskribaj faktoroj. J Biol Kem 272:32163-32168.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

31. ↵

Fuchs SY, Tappin I, Ronai Z (2000) Stabileco de la ATF2-transskriba faktoro estas reguligita per fosforilado kaj defosforilado. J Biol Kem 275:12560-12564.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

32. ↵

Girault JA, Hemmings HC Jr, Williams KR, Nairn AC, Greengard P (1989) Fosforilación de DARPP-32, fosfoproteino reguligita de dopamina kaj cAMP, de kazeina kinase II. J Biol Kem 264:21748-21759.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

33. ↵

Girault JA, Hemmings HC Jr, Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) Karakterizado en mamula cerbo de DARPP-32 serina kinase identa al kazeina kinase II. J Neurochem 55:1772-1783.

Medlino

34. ↵

Hanada M, Sugawara K, Kaneta K, Toda S, Nishiyama Y, Tomita K, Yamamoto H, Konishi M, Oki T (1992) Epoxomicin, nova antitumora agento de mikrobiana origino. J Antibiot (Tokio) 45:1746-1752.

Medlino

35. ↵

Hann SR, Eisenman RN (1984) Proteinoj koditaj de la homa c-myc-onkogene: diferenca esprimo en neoplastikaj ĉeloj. Mol Cell Biol 4:2486-2497.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

36. ↵

Hemmings HC Jr, Girault JA, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) ARPP-21, cikla AMP-reguligita fosfoproteino (S-ro = 21,000) riĉigita en cerbaj regionoj de dopamina-innervado. Aminoacida sinsekvo de la retejo fosforilata de cikla AMP en nerompitaj ĉeloj kaj kinetikaj studoj pri ĝia fosforilado in vitro. J Biol Chem 264:7726-7733.

37. ↵

Hidaka H, ​​Kobayashi R (1992) Farmakologio de inhibidores de proteinoj kinase. Annu Rev Pharmacol Toxicol 32:377-397.

CrossRefMedlino

38. ↵

Hirata H, Bessho Y, Kokubu H, Masamizu Y, Yamada S, Lewis J, Kageyama R (2004) Malstabileco de Hes7-proteino estas kerna por la somita segmenta horloĝo. Nat Genet 36:750-754.

CrossRefMedlino

39. ↵

Hiroi N, Graybiel AM (1996) Atipaj kaj tipaj neŭrotepikaj traktadoj induktas distingajn programojn de transskriba faktoro-esprimo en la striatumo. J Kom Neurolo 374:70-83.

CrossRefMedlino

40. ↵

Espero B, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Reguligo de tuja frua gena esprimo kaj AP-1-ligado en la rato-kerno akuzita de kronika kokaino. Proc Natl Acad Sci Usono 89:5764-5768.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

41. ↵

Espero BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) Kronika elektrokonvulsiva prenado (ECS) traktado rezultigas esprimon de longedaŭra AP-1-komplekso en cerbo kun ŝanĝitaj konsisto kaj karakterizaĵoj. J Neurosci 14:4318-4328.

abstrakta

42. ↵

Espero BT, Nye HE, Kelz MB, Mem DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Indukto de longdaŭra AP-1-komplekso kunmetita de ŝanĝitaj Fos-similaj proteinoj en cerbo per kronika kokaino kaj aliaj kronikaj traktadoj. Neŭrono 13:1235-1244.

CrossRefMedlino

43. ↵

Ishida A, Fujisawa H (1995) Stabiliĝo de calmodulin-dependa proteino kinase II tra la autoinhibitoria domajno. J Biol Kem 270:2163-2170.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

44. ↵

Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piechaczyk M (1997) Kompleksaj mekanismoj por degradado de c-fos kaj c-jun. Mol Biol Rep 24:51-56.

CrossRefMedlino

45. ↵

Jones S, Yakel JL (2003) Kazeina kinase ii (proteino kinase ck2) reguligas la serotoninan 5-ht (3) receptoron kanalfunkcion en ng108-15-ĉeloj. Neurokienco 119:629-634.

CrossRefMedlino

46. ↵

Kato T Jr, Delhase M, Hoffmann A, Karin M (2003) CK2 estas C-fina stacio IkappaB kinase respondeca pri NF-kappaB-aktivado dum la UV-respondo. Mol-Ĉelo 12:829-839.

CrossRefMedlino

47. ↵

Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ (1999) Esprimo de la transskriba faktoro deltaFosB en la cerbo kontrolas sentivecon al kokaino. naturo 401:272-276.

CrossRefMedlino

48. ↵

Kim KB, Myung J, Sin N, Skipoj CM (1999) Inhibicio de proteasoma de la epoxomicino kaj dihidroeponemikino kun naturaj produktoj: komprenoj pri specifaĵoj kaj potencoj. Bioorg Med Chem Lett 9:3335-3340.

CrossRefMedlino

49. ↵

Kobayashi E, Nakano H, Morimoto M, Tamaoki T (1989) Calphostin C (UCN-1028C), nova mikrobiana komponaĵo, estas tre potenca kaj specifa inhibidor de proteina kinase C. Komunumo de Biochem Biophys Res 159:548-553.

CrossRefMedlino

50. ↵

Krek W, Maridor G, Nigg EA (1992) Kazeino kinase II estas ĉefe nuklea enzimo. J Cell Biol 116:43-55.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

51. ↵

Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) Proteino kinase CK2 fosforiligas la proteinon SSRP1 de alta movebla grupo-domajno, induktante la rekonon de UV-damaĝita DNA. J Biol Kem 278:12710-12715.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

52. ↵

Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, Russo SJ, LaPlant Q, Whistler K, Neve RL, Self DW, Nestler EJ (2005) Kromatina remodelado estas ŝlosila mekanismo sub la kokain-induktita plastikeco en striato. Neŭrono 48:303-314.

CrossRefMedlino

53. ↵

Lieberman DN, Mody I (1999) Kazeino kinase-II reguligas NMDA-kanalan funkcion en hipokampaj neŭronoj. Nat Neurosci 2:125-132.

CrossRefMedlino

54. ↵

Litchfield DW (2003) Proteina kinase CK2: strukturo, regulado kaj rolo en ĉelaj decidoj de vivo kaj morto. Biochem J 369:1-15.

CrossRefMedlino

55. ↵

Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) Degradado de proteino c-Fos esprimita per N-metilo-d-partia acido en nukleaj frakcioj de murita hipokampo. Brain Res 905:34-43.

Medlino

56. ↵

Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI (1997) Absento de konstante altigita antigen-rilata 37 kDa fos-1 kaj AP-XNUMX-simila DNA-liganta agado en la cerbo de kainaj acid-traktitaj fosB nulaj musoj. J Neurosci 17:5407-5415.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

57. ↵

Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA (1986) Loko specifa de kazeina kinase-2 (TS) de rato-citosol de hepato. Studo kun modelaj peptidaj substratoj. Eur J Biochem 160:239-244.

58. ↵

McClung CA, Nestler EJ (2003) Reguligo de gena esprimo kaj kokaina rekompenco de CREB kaj DeltaFosB. Nat Neurosci 6:1208-1215.

CrossRefMedlino

59. ↵

McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: molekula ŝaltilo por longtempa adapto en la cerbo. Brain Res Mol Brain Res 132:146-154.

Medlino

60. ↵

Meggio F, Pinna LA (2003) Unu-mil-kaj-unu-substratoj de proteina kinase CK2? FASEB J 17:349-368.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

61. ↵

Meggio F, Donella-Deana A, Pinna LA, Moret V (1977) Fosforiligo de kazeinaj frakcioj de rathepata 'fosvitina kinazo.'. FEBS-Lito 75:192-196.

Medlino

62. ↵

Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) Autofosforilación de tipo 2-kazeina kinase TS ĉe ambaŭ ties alfa- kaj beta-subunuoj. Influo de malsamaj efikistoj. FEBS-Lito 160:203-208.

CrossRefMedlino

63. ↵

Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) Ribofuranosil-benzimidazolaj derivaĵoj kiel inhibicioj de kazeina kinase-2 kaj kazeina kinase-1. Eur J Biochem 187:89-94.

Medlino

64. ↵

Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) Substara specifeco de proteina kinase CK2. Ĉela Mol Biol Res 40:401-409.

Medlino

65. ↵

Miller C, Zhang M, He Y, Zhao J, Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Di Battista JA (1998) Transkripcia indukto de ciclooksigenase-geno 2 per okadaika acida inhibicio de fosfatasa agado en homaj kondrocitoj: ko-stimulado de AP-1 kaj CRE nukleaj ligantaj proteinoj. J Cell Biochem 69:392-413.

CrossRefMedlino

66. ↵

Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel AM (1996) Reto-nivelaj ŝanĝoj en esprimo de induciblaj Fos-Junaj proteinoj en la striatum dum kronika kokain-kuracado kaj retiriĝo. Neŭrono 17:147-156.

CrossRefMedlino

67. ↵

Morgan JI, Curran T (1995) Tuj-fruaj genoj: dek jaroj plu. Tendencoj Neurosci 18:66-67.

CrossRefMedlino

68. ↵

Nakabeppu Y, Nathans D (1991) Nature okaze detranĉita formo de FosB, kiu malhelpas Fos / Jun-transkriptan agadon. ĉelo 64:751-759.

CrossRefMedlino

69. ↵

Nestler EJ, Barrot M, Self DW (2001) Delta FosB: daŭra molekula ŝaltilo por toksomanio. Proc Natl Acad Sci Usono 98:11042-11046.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

70. ↵

Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) Enkonduko de la glutamata ricevilo subnombras 1 en motorajn neŭronojn in vitro kaj in vivo uzante rekombinan herpetan simplan viruson. Neurokienco 79:435-447.

CrossRefMedlino

71. ↵

Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) Fosforilación de serina 239 de Groucho / TLE1 de proteino kinase CK2 gravas por inhibicio de neurona diferencigo. Mol Cell Biol 24:8395-8407.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

72. ↵

Okazaki K, Sagata N (1995) La vojo de Mos / MAP kinase stabiligas c-Fos per fosforilado kaj pliigas ĝian transforman agadon en NIH 3T3-ĉeloj. EMBO J 14:5048-5059.

Medlino

73. ↵

Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T (1994) La ubiquitin-proteasoma vojo estas bezonata por prilaborado de la NF-kappa B1-pionira proteino kaj aktivigo de NF-kappa B. ĉelo 78:773-785.

CrossRefMedlino

74. ↵

Papavassiliou AG, Treier M, Chavrier C, Bohmann D (1992) Celita degenero de c-Fos, sed ne v-Fos, per fosforilata dependa signalo de c-Jun. scienco 258:1941-1944.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

75. ↵

Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E (2003) Inducibla, cerba regiono-specifa esprimo de reganta negativa mutanto de c-Jun en transgenaj musoj malpliigas sentivecon al kokaino. Brain Res 970:73-86.

CrossRefMedlino

76. ↵

Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) Indukto de DeltaFosB en rekompenc-rilataj cerbaj strukturoj post kronika streso. J Neurosci 24:10594-10602.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

77. ↵

Persico AM, Schindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR (1993) Esprimo de cerba transskriba faktoro: efikoj de akra kaj kronika amfetamino kaj injekto-streso. Brain Res Mol Brain Res 20:91-100.

Medlino

78. ↵

Ploegh HL, Dunn BM (2000) Post-traduka modifo: fosforilado kaj fosfatazoj. En: Aktualaj protokoloj en proteina scienco (Dunn BM, ed.) Pp. 13.01–13.02. New York: Wiley kaj Sons.

79. ↵

Pyerin W, Burow E, Michaely K, Kubler D, Kinzel V (1987) Katalitaj kaj molekulaj ecoj de tre purigita fosvitino / kazeina kinasa tipo II el homaj epiteliaj ĉeloj en kulturo (HeLa) kaj rilate al ekto-proteino kinase. Biol Chem Hoppe Seyler 368:215-227.

Medlino

80. ↵

Reikhardt BA, Kulikova OG, Borisova GY, Aleksandrova IY, Sapronov NS (2003) Statuso de la "proteina kinase CK2-HMG14" sistemo en aĝ-rilata amnezo en ratoj. Neurosci Behav Physiol 33:799-804.

Medlino

81. ↵

Roberts BJ, Whitelaw ML (1999) Degradado de la baza heliko-buklo-helico / Per-ARNT-Sim-homologia domajna dioxin-ricevilo per la ubiquitin / proteasoma vojo. J Biol Kem 274:36351-36356.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

82. ↵

Rost B, Yachdav G, Liu J (2004) La servilo PredictProtein. Nukleaj Acidoj Res 32:W321–W326.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

83. ↵

Rylski M, Kaczmarek L (2004) Ap-1 celoj en la cerbo. Fronto Biosci 9:8-23.

CrossRefMedlino

84. ↵

Sahin B, Kansy JW, Nairn AC, Spychala J, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA (2004) Molekula karakterizado de rekombinanta musa adenosin kinase kaj taksado kiel celo por proteina fosforilado. Eur J Biochem 271:3547-3555.

Medlino

85. ↵

Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piechaczyk M (1999) Ĉu multoblaj proteolitikaj vojoj kontribuas al degradado de proteinoj c-Fos, c-Jun kaj p53 en vivo? Mol Biol Rep 26:45-51.

CrossRefMedlino

86. ↵

Schmidt R, Hecker E (1975) Aŭtoksido de forbolaj esteroj sub normalaj stokadaj kondiĉoj. Kancero Res 35:1375-1377.

LIBERA Plena Teksto

87. ↵

Schwarz EM, Van Antwerp D, Verma IM (1996) Konstitucia fosforilado de IkappaBalpha per kazeina kinase II okazas prefere ĉe serina 293: postulo por degenero de senpaga IkappaBalpha. Mol Cell Biol 16:3554-3559.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

88. ↵

Sears R, Leone G, DeGregori J, Nevins JR (1999) Ras plibonigas stabilecon de proteino Myc. Mol-Ĉelo 3:169-179.

CrossRefMedlino

89. ↵

Silva-Neto MA, Fialho E, Paes MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) Cikla sendependa nukleotido-fosforiligo de vitellino per kazeina kinase II elpurigita el oocitoj de Rhodnius prolixus. Insekto Biochem Mol Biol 32:847-857.

CrossRefMedlino

90. ↵

Skinner M, Qu S, Moore C, Saĝo R (1997) Transkripta aktivado kaj transformado per FosB-proteino postulas fosforiligon de la karboxil-fina aktiva regado. Mol Cell Biol 17:2372-2380.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

91. ↵

Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) Proteina kinase CK2 malsame fosforiligas maizojn kromosomalajn altmovecajn grupojn B (HMGB)-proteinojn modulantajn sian stabilecon kaj DNA-interagojn. J Biol Kem 277:1092-1098.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

92. ↵

Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede W, Goris J (1999) Identigo de cyk, ciklina B2 kinase, kiel nova kalcio / trankvilulin-dependa proteino kinase II kaj ĝia rolo dum maturiĝo de Xenopus laevis oocito. Exp Ĉela Res 252:303-318.

CrossRefMedlino

93. ↵

Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) Reguligo de c-fos kaj c-jun-gena esprimo per lipopolisakarido kaj citokinoj en primaraj kulturitaj astrocitoj: efiko de PKA kaj PKC-vojoj. Arch Pharm Res 27:396-401.

Medlino

94. ↵

Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N, Ballesta JP (1995) Diferenca fosforilado de ribosomaj acidaj proteinoj el feĉo ĉelo per du endogenaj proteinoj kinaseoj: kazeina kinase-2 kaj 60S kinase. Acta Biochim Pol 42:357-362.

Medlino

95. ↵

Tamaoki T, Takahashi I, Kobayashi E, Nakano H, Akinaga S, Suzuki K (1990) Calphostin (UCN1028) kaj calphostin-komponaĵoj, nova klaso de specifaj kaj potencaj inhibidores de proteina kinase C. Adv Dua Mesaĝisto-Fosfoproteino Res 24:497-501.

Medlino

96. ↵

Torres J, Pulido R (2001) La tumora supresora PTEN estas fosforilata de la proteino kinase CK2 ĉe sia fina stacio C. Implikoj por PTEN-stabileco al proteasome-mediaciita degradado. J Biol Kem 276:993-998.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

97. ↵

Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kawashima S (1996) Diferenca inhibicio de kalpaino kaj proteasoma agadoj per peptidil aldehidoj de di-leŭcino kaj tri-leŭcino. J Biochem (Tokio) 119:572-576.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

98. ↵

Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki M, Okazaki K, Sagata N (1995) Degradado de c-Fos per la proteazomo 26S estas akcelita de c-Jun kaj multoblaj proteinoj kinases. Mol Cell Biol 15:5682-5687.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

99. ↵

Unger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmed K (2004) Proteino kinase CK2 kiel reguliganto de ĉela postvivado: implicoj por kancera terapio. Kuracaj Kancero-Drogaj Celoj 4:77-84.

CrossRefMedlino

100. ↵

Vial E, Marshall CJ (2003) Altigita ERK-MAP-kinasa aktiveco protektas la FOS-familian familion FRA-1 kontraŭ proteazomal-degradado en kolonaj karcinomaj ĉeloj. J Ĉelo Sci 116:4957-4963.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

101. ↵

Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) ΔFosB reguligas radojn. J Neurosci 22:8133-8138.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

102. ↵

Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) Reguligo de funkcio de transskriba faktoro per fosforilado. Ĉela Mol Viva Sci 57:1172-1183.

CrossRefMedlino

103. ↵

Vintra B, Kautzner I, Issinger OG, Arnold HH (1997) Du putativaj proteinoj kinase CK2-fosforilaj retejoj gravas por Myf-5-agado. Biol Chem 378:1445-1456.

Medlino

104. ↵

Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petry I, Schwanbeck R, Renner U (1999) Konstitucia fosforilado de la acidaj vostoj de la proteinoj 1 de alta movebla grupo de kazeina kinase II ŝanĝas ilian konformecon, stabilecon, kaj ligan specifecon de DNA. J Biol Kem 274:20116-20122.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

105. ↵

Yamaguchi Y, Wada T, Suzuki F, Takagi T, Hasegawa J, Handa H (1998) Kazeino kinase II interagas kun la bZIP-domajnoj de pluraj transskribaj faktoroj. Nukleaj Acidoj Res 26:3854-3861.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

106. ↵

Yanagawa T, Yuki K, Yoshida H, Bannai S, Ishii T (1997) Fosforilación de A170-stresa proteino per kazeina kinase II-simila agado en makrofagoj. Komunumo de Biochem Biophys Res 241:157-163.

CrossRefMedlino

107. ↵

Yankulov K, Yamashita K, Roy R, Egly JM, Bentley DL (1995) La inhibicia transkripta elongigo 5,6-dichloro-1-beta-d-ribofuranosylbenzimidazole inhibicias transskriban faktoron IIH-ligitan proteinan kinaseon. J Biol Kem 270:23922-23925.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

108. ↵

Yen J, Saĝo RM, Tratner I, Verma IM (1991) Alternativa splita formo de FosB estas negativa reguligilo de transkripta aktivado kaj transformado de Fos-proteinoj. Proc Natl Acad Sci Usono 88:5077-5081.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

109. ↵

Yin X, Jedrzejewski PT, Jiang JX (2000) Kazeina kinase II fosforilata lenso kunneksino 45.6 kaj estas implikita en ĝia degenero. J Biol Kem 275:6850-6856.

Abstrakta / LIBERA Plena Teksto

110. ↵

Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) Indukto de AP-1-transskribaj faktoroj dum T-ĉelaj aktivadoj per interleŭkinaj 1 kaj forbolaj esteroj. Ĉela Kresko Diferenca 3:677-684.

abstrakta

111. ↵

Yu S, Wang H, Davis A, Ahmed K (2001) Sekvoj de CK2-signalado al la nuklea matrico. Mol Cell Biochem 227:67-71.

CrossRefMedlino

112. ↵

Yu S, Davis AT, Guo C, Verda JE, Ahmed K (1999) Diferencia celado de proteino kinase CK2 al la nuklea matrico post transira ekspreso de ĝiaj subunuoj. J Cell Biochem 74:127-134.

CrossRefMedlino

113. ↵

Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) ΔFosB: esenca rolo por ΔFosB en la kerno akcenta en morfina ago. Nat Neurosci 9:205-211.

CrossRefMedlino

Artikoloj citantaj ĉi tiun artikolon

• Kondutaj kaj Strukturaj Respondoj al Kronika Kokaino Postulas Feedforward-Glubon Implikantan {Delta} FosB kaj Kalcio / Calmodulin-Dependa Proteino Kineso II en la Nuklea Akuŝilo Shell Journal of Neuroscience, 6 Marto 2013, 33(10):4295-4307
  • abstrakta
  • plena Teksto
  • Plena Teksto (PDF)
• Ŝlosila ekspremo de {Delta} FosB Reproduktas Kronikaj Levodopa-Induktitaj Involuntaj Movadoj Journal of Neuroscience, 26 May 2010, 30(21):7335-7343
• abstrakta
• plena Teksto
• Plena Teksto (PDF)
• abstrakta
• plena Teksto
• Plena Teksto (PDF)
• abstrakta
• plena Teksto
• Plena Teksto (PDF)
• abstrakta
• plena Teksto
• Plena Teksto (PDF)
• Transskribaj mekanismoj de toksomanio: rolo de {Delta} FosB Filozofiaj Transakcioj de la Reĝa Socio B: Biologiaj Sciencoj, 12 Oktobro 2008, 363(1507):3245-3255
• Daŭra vundebleco por rekomenci la metanfetaminon-serĉadon en glila ĉelo-derivita neurotrófica faktoro mutantaj musoj La FASEB-Ĵurnalo, 1 Julio 2007, 21(9):1994-2004
• La Aktiviga Proteino-1-Transkripta Faktoro en Respirativa Epitelio-Karcenogenezo Esploro pri Molekula Kancero, 1 Februaro 2007, 5(2):109-120