Proc Natl Acad Sci Usono A. Apr 29, 2014; 111 (17): 6455-6460.
Publikigita rete en Apr 15, 2014. doi: 10.1073 / pnas.1404323111
PMCID: PMC4036004
Neurokienco
Teruko Danjo,a Kenji Yoshimi,b Kazuo Funabiki,a Satoshi Yawata,a kaj Shigetada Nakanishia,1
Ĉi tiu artikolo estis citita de aliaj artikoloj en PMC.
signifo
Dopamina (DA) neŭronoj en la ventra tegmental areo (VTA) reagas al aversaj stimuloj plejparte per pasema silento. I restas neklare ĉu ĉi tiu reakcio rekte persvadas aversajn respondojn en kondutaj musoj. Ni ekzamenis ĉi tiun demandon optogenete kontrolante neŭronojn DA en la VTA kaj trovis, ke la inaktivigo de neŭronoj DA rezultis aversiva respondo kaj lernado. La kerno accumbens (NAc), la ĉefa produkta nukleo de VTA DA neŭronoj, estis konsiderita respondeca de ĉi tiu respondo, do ni ekzamenis kiu el la fundamentaj vojoj en la NAc estis kritika al ĉi tiu konduto uzante forfalon de D1 aŭ D2-ricevilo, kaj trovis ke la specifa vojo D2-ricevilo estis crucial por ĉi tiu konduto.
abstrakta
La transdono de dopamina (DA) de la areo ventral tegmental (VTA) estas fundamenta por kontroli tiel kondutoj gratificantes kiel aversivas. La pasema silento de DA-neŭronoj estas unu el la respondoj al aversaj stimuloj, sed ĝiaj konsekvencoj kaj neŭraj mekanismoj koncerne aversajn respondojn kaj lernadon grandparte restis.. Ĉi tie, ni raportas, ke optogenetika senaktivigo de neŭronoj de VTA DA senprokraste reguligis nivelojn de DA kaj induktis supren-reguladon de la neŭra agado en la nuklea akcumbeno (NAc)) kiel taksite de Fos-esprimo. Tlia optogenetika subpremo de DA-neŭrona pafado tuj elvokis aversajn respondojn al la antaŭe preferita malhela ĉambro kaj kondukis al averso-lernado al la optogenetike kondiĉita loko. Gravas, ke ĉi tiu loka aversio estis aboliciita per renverso de dopaminaj D2-receptoroj sed ne de tiu de D1-riceviloj en la NAc.. Silentiĝado de DA neŭronoj en la VTA estis tiel nemalhavebla por indukti aversajn respondojn kaj lernadon per dopaminaj D2-riceviloj en la NAc.
La mesolimbic dopaminergika sistemo ne nur ludas pivotan rolon en larĝa gamo de instigo kaj lernado (1-3), sed ĝia misfunkcio ankaŭ estis implikita en severaj neuropsikiatriaj malordoj kiel ekzemple en Parkinson, skizofrenio kaj drogomanio. La neŭronoj de dopamina (DA) en la areo tegmental ventral (VTA) reagas al stimuloj gratificantes por pafo fásica, kaj la ĉefa funkcio de ĉi tiu pafo estas teorizar por kodi "la eraro de antaŭdiro de rekompenco", la diferenco en la valoro inter la rekompenco antaŭvidita kaj la eraro. reala rekompenco4). Kontraste al la respondo al rekompensaj stimuloj, iliaj reagoj al aversaj stimuloj estas malproksimaj de homologaj; te, iuj DA-neŭronoj estas aktivigitaj responde al aversaj stimuloj, dum plej multaj aliaj reagas trankvile subpremante iliajn pafojn (5-9). Fakte, lastatempaj studoj montris, ke optogenetika aktivado de GABAergicaj neŭronoj kaj rezulta neaktivigo de DA neŭronoj subpremas konsumon kaj induktas aversan respondon (10, 11). Tamen ĝi plejparte restis neeltenebla pri kiuj mekanismoj en la neŭrokraj cirkvitoj estas esencaj por la akiro de averso-lernado post la inaktivigo de DA neŭronoj en la VTA kaj pri kiel kondutaj respondoj estas kontrolitaj al subpremado de rekompenco-konsumado kaj indukto de averso.
Amasigitaj pruvoj malkaŝis, ke la instiga kaj kognitiva lernado responde al pozitivaj kaj negativaj stimuloj estas plejparte reguligita de la neŭraj cirkvitoj inkluzive de la bazaj ganglioj (12), kiuj ricevas grandan kvanton de la dopaminergia projekcio de la meza cerbo. En la striato du fundamentaj neŭraj cirkvitoj konsistas el specifitaj mezgrandaj dornaj neŭronoj (MSN), ĉiu esprimante distingan tipon de DAa receptoro.13).
- Unu cirkvito estas la rekta vojo, konsistanta el la MSN-projekciaj rekte al la eliraj kernoj de la bazaj ganglioj, substantia nigra pars reticulata (SNr), kaj esence esprimante dopaminajn D1-receptorojn (D1R).
- La alia estas la nerekta vojo, konsistanta el la MSN-oj, kiuj projekcias nerekte tra la globo pallidus al la SNr kaj esence esprimas dopaminajn D2-receptorojn (D2R).
DA-signaloj de meza cerbo dinamike modulas ĉi tiujn du paralelajn vojojn laŭ la kontraŭa maniero per D1R kaj D2Rs, kaj ĉi tiu modulado supozas faciligi instigan lernadon (3, 14).
- Koncerne la rekompencajn stimulojn, supren-reguligitaj DA-niveloj induktitaj per rekompencaj signaloj estas konsideritaj por aktivigi la D1R kaj tiel ĉefe faciligas la rektan vojon en la nukleo accumbens (NAc).
- Aliflanke, la forigo de pafoj de neŭrono DA kiel respondo al aversaj stimuloj malpliigas DA-nivelojn en la NAc; kaj ĉi tiu reago supozeble specife antaŭenigas la signal-dissendon en la nerekta vojo tra aktivigitaj D2R.
Kvankam studoj uzantaj la farmakologiajn strategiojn kaj metodon de reversibila neŭroskana blokado (RNB) subtenis ĉi tiun mekanismon de regulado en la NAc15, 16), restis nekonate ĉu la forigo de la pafo de neŭrona DA sufiĉas por antaŭenigi la agadon de la nerekta vojo kaj poste indukti la forigon de konduto. En ĉi tiu nuna studo, ni traktis ĉi tiun problemon selektante inaktivigante DA-neŭronojn en la VTA per optogenete manipulanta hiperpolariganta Arch-proteino.17) kaj eksplicite montris, ke la subpremado de DA neŭronoj en la VTA sekve malpliigis DA-nivelojn en la NAc kaj induktis averseman reagon kaj lernadon. Plie, ni esploris la mekanismojn de la regulado de ĉi tiu reakcio kaj montris, ke ĉi tiu kontraŭleĝa reago estis specife kontrolita de D2R en la NAc.
rezultoj
Optogenetika Inactivación de DA Neŭronoj blokas Malhelan Ĉambran Preferon.
Por selektive malaktivigi pafojn de DA-neŭronoj, ni injektis Konstrukton de Adeno-asociita Cre-inducible kiu kodas Arch-eGFP [Kadro malfermita de legado (DIO) -Arch] (AAV-duobla floxed).17) unuflanke en la VTA de plenkreskaj musoj kun tirozino hidroxilasa (TH)18) kaj naturaj tipoj (WT) kompatas kaj metis optikan fibron super la VTA (Fig. S1 A kaj C). Du semajnojn post la kirurgio, Arch-eGFP estis detektita en la VTA.Fig. S1B). Ni provis la hiperpolarigan efikon de la Arch-proteino per elektrofiziologia registrado kaj mezuris la efikon de optika stimulo de la VTA de musoj TH-Cre injektitaj kun AAV-DIO-Arch. En vivaj elektrofiziologiaj registradoj de la VTA de anestezitaj musoj de TH-Cre malkaŝis, ke optika stimulo de putaj DA-neŭronoj malhelpis iliajn pafojn.Fig. S2), indikante ke la optika stimulado sufiĉe hiperpolarigis la membranpotencon de Arch-esprimantaj DA-ĉeloj kaj tiel malhelpis ilian spontanean pafadon.
Per uzado de ĉi tiuj musoj, ni poste ekzamenis ĉu la optika senaktivigo de DA neŭronoj en la VTA povus servi kiel aversa signalo por konduteca lernado. Musoj havas denaskan tendencon preferi malhelan medion (19). Ni desegnis kondutan aparaton en kiu musoj povis libere esplori la malhelan ĉambron kaj malfermi helan spacon (Figo. 1A). Post habituation, la WT-musoj restis prefere en la malhela ĉambro aŭ kun aŭ sen optika stimulo en la malhela ĉambro (Fig. S1D), certigante ke optika stimulo mem ne havis influon sur ilia malluma ĉambro-preferanta konduto. Ni planis la kondutan eksperimenton de bestoj por testi la efikon de optika senaktivigo de DA-neŭronoj sur ilia konduto (Fig. S1E). Post habituation kaj pretest, musoj estis kondiĉitaj per optike stimulante la DA neŭronojn en la VTA kiam ili restis en la malhela ĉambro. Eĉ dum la unua 5-minimuma kondiĉo, la TH-Cre-musoj restis ekster la antaŭe preferata malhela ĉambro kaj sinsekve evitis la malhelan ĉambron tra la kondiĉado (Figo. 1B). La musoj TH-Cre ne inversigis sian evitadon kontraŭ la malhela ĉambro kvankam ili ricevis neniun optikan stimulon ĉe la posttestado (Figo. 1C). Ĉi tiuj datumoj indikas, ke hiperpolarigo de neŭronoj DA ne nur induktis pasintan malŝparadon, sed ankaŭ servis kiel signo por averso-lernado kontraŭ la malhela ĉambro kaj ankaŭ montras, ke la inaktivigo de neŭronoj DA ludis rolon en ambaŭ transiraj aversaj kondutoj kaj daŭrigita averso-lernado.
Optogeneteca Malregulado de DA-Niveloj en la NAc.
Ni poste enketis ĉu la inaktivigo de DA-neŭronoj en la VTA efektive modifis la koncentriĝon de DA en sia ĉefa celcelo, la NAc. Ni mezuris DA-nivelojn en la NAc per rapida skana voltammetrio (FSCV) en anestezitaj TH-Cre musoj kiuj estis injektitaj kun AAV-DIO-Arch en sian VTA. La niveloj de DA en la NAc estis rapide levitaj per elektra stimulo de la VTA, kaj la elvokita DA-liberigo estis signife reduktita per samtempa optika stimulo de la VTA (Fig. S3). Ni tiam testis ĉu optika stimulado de VTA povus redukti la tonikan DA-nivelon en la NAc. En la samaj eksperimentaj agordoj, ni observis, ke la DA-nivelo en la NAc estis trankvila malpliigita per 20-oj de optika stimulo de la VTA.Figo. 2), kiu kongruas kun la raportita FSCV-reago kontraŭ la aversaj stimuloj (20). Ĉi tiuj datumoj montras ke optika stimulo de la VTA estis sufiĉe efika por inaktivigi la neŭronojn VTA DA kaj malpliigi la nivelon DA en la NAc dum la konduta eksperimento.
Up-Reguligo de Fos-Genesprimo per Optika Inaktivigo de DA Neŭronoj en la VTA.
La konduta ŝanĝo kaŭzita de kondiĉigita senaktivigo de DA neŭronoj en la VTA sugestis, ke optika stimulo rekte ŝanĝis neŭronan agadon kaj rezultis en ŝanĝo de konduto. Do ni poste esploris la regionojn en kiuj neŭrala agado estis levita per la kondiĉita senaktivigo de DA-neŭronoj per ekzamenado de la esprimo de Fos, tuja frua geno. Baldaŭ post kiam la kondiĉado estis farita en la malluma ĉambro testo, musoj estis rapide prilaboritaj por determini la kvanton de Fos-esprimo per kvanta en situ hibridiĝo-analizo.Figo. 3 kaj Fig. S4). La NAc, la regiono kiu ricevas grandan kvanton da dopaminergiaj projekcioj de la VTA, montris signife pliigitan kvanton de Fos-esprimo en la TH-Cre musoj (Figo. 3). Ĉi tiu suprenregulo ankaŭ estis detektita en la kontraŭ-flanka flanko de optika stimulo, kiu estis supozeble kaŭzita de malgranda kvanto de virinfekto en tiun flankon. Tamen, la supera regulado estis multe pli alta ĉe la flanka flanko ol ĉe la kontraŭ-flanka flanko de optika stimulo, sugestante, ke optika inaktivigo de DA neŭronoj rekte reguligis la neŭronan agadon de la NAc. La pliigita Fos-esprimo ankaŭ estis observita en aliaj cerbregionoj inkluzive de la vando, regionoj periventrikulaj de la striato, basolateral-amigdala (BLA), kaj flanka hipotalamo, sed ne en la flanka habeno aŭ mediala prefrontala kortekso (mPFC; Fig. S4). Ĉi tiuj rezultoj indikas, ke la regionoj aktivigitaj per optika senaktivigo de DA-neŭronoj ne estis limigitaj al la rektaj celaj regionoj de VTA DA neŭronoj, sed prefere inkludis la regionojn, kiuj povus esti nerekte aktivigitaj laŭ neŭrala cirkvito-dependa maniero. Ĉi tiu observado sugestas, ke optika senaktivigo de DA neŭronoj modifis cirkviton-ampleksan neŭronan agadon kaj ne nur povus elvoki kontraŭdiran reagon sed ankaŭ ekigi multajn aliajn cerbajn funkciojn kiel ekzemple angoro, timo kaj stresaj respondoj.21).
DA-signalado Tra D2R Estas Kritika por Optogenece Induktita Kondiĉita Loka Aversión.
La plimulto de dopaminergiaj signaloj de la VTA estas transdonitaj al la MSN-oj en la NAc tra DA-receptoroj, D1R kaj D2R. D1R estas preskaŭ ekskluzive esprimita en la substanco P (kodita de Tac1-geno) -eksprimantaj MSNoj, kaj D2R estas esence esprimita en la enkefalino (kodita de Penk geno) -eksprimante MSN; ĉiu tipo de MSN konstituas la rektajn kaj nerektajn vojojn, respektive, en la NAc3). Ĉar la afineco por DA estas multe pli alta por la D2R (nM-ordo) ol por la D1R (µM-mendo) (22, 23), redukto en DA-niveloj laŭsupoze rezultas en la senaktivigo de Gi- kuplita D2R sed ne havi rimarkindan efikon sur la D1R (3, 24), tiel plialtigante la neŭran agadon specife en la nerekta vojo. Plie, la Fos-aktivigo estis pli elstare observata en ĉeloj esprimantaj Penk- aŭ Drd2 (D2R) ol en la ĉeloj de Tac1- aŭ Drd1a (D1R) -eksprimante (Fig. S5). Surbaze de ĉi tiuj observoj, ni hipotezis ke DA-signalado tra D2R povus ludi gravan rolon en la observita aversa kondiĉado.
Por testi ĉi tiun hipotezon, ni efektivigis la tri-ĉambron kondiĉita loko-aversion (CPA) testoFig. S6). Ni preparis kondutan aparaton enhavanta du ĉambrojn kun preskaŭ identaj cirkonstancoj kaj unu malgranda koridoro. Ĉi tiu senantaŭga media kondiĉo en la CPA-testo ebligis al ni plue ekzameni, ĉu la inactivación de neŭronoj VTA DA kapablas indukti aversan reagon kaj lernadon, krom bloki la malluman ĉambropreferon. Kiam bestoj estis permesitaj movi libere ĉirkaŭ la tuta aparato, la plej multaj el ili restis en du ĉambroj sen ajna tipa konduteca diferenco ĉe pretest. La optika kondiĉado tiam estis farita per parado de optika stimulo kun unu fiksa ĉambro. Eĉ kiam iu el la ĉambroj estis uzata por la kondiĉado, la TH-Cre musoj konstante kaj signife evitis resti en la optike kondiĉita ĉambro dum la kondiĉado kaj posttest (Fig. S6 B-E). Statistika analizo validigis signifan redukton en restado de tempo de la TH-Cre musoj en la optike kondiĉita ĉambro ĉe la posttest kompare kun la restado de la WT-musoj (Fig. S6F).
Ni tiam provis specifi subĉipojn de DA-receptoroj engaĝitaj en ĉi tiu aversiva konduto specife subpremante ĉiun el la DA-receptoroj en la NAc (Figo. 4 kaj Fig. S7). Ni desegnis kaj validigis lentivirajn vektorojn enhavantajn mallongajn harpinglajn RNA (shRNA) specifajn por ĉiu DA-ricevilo kun konstitucia esprimo de mCherry. Tri semajnojn post injekto de la lentivirusoj en la NAc, fortika esprimo de mCherry estis lokalizita en la NAcFigo. 4B). La efika renverso de mRNA-esprimo de ĉiu ricevilo estis konfirmita per kvanta reala tempa analizo de PCR (Fig. S7A). Mezuri nivelojn de proteinoj per okcidenta flago ankaŭ rivelis, ke injekto de ĉiu el la lentiviroj selective reduktis sian celan proteinprodukton sen tuŝi la esprimon de la alia subtipo de DA-ricevilo (Figo. 4C kaj Fig. S7 B-G). La shD1R- kaj shD2R-esprimantaj lentiviroj malpliigis sian celproteikon nivelon al 46.2 ± 1.1% kaj 38.4 ± 4.9%, respektive, kompare kun la nivelo por la kontrola viruso (Figo. 4C). Ĉi tiuj rezultoj konfirmis, ke la lentiviraj vektoroj esprimantaj shRNA specifan por D1R kaj D2R selekteme kaj sufiĉe suprimis sian celan RNA-ojn kaj malplilongigis la kvanton de la respektivaj proteinaj produktoj. Ni ankaŭ konfirmis, ke la virus-mediata esprimo de mCherry ne estis detektita en la VTA, ekskludante la eblon ke la lentivirus-mediaciita shRNA rekte influis la VTA.
Uzante ĉi tiujn lentivirojn enhavantajn shRNA, ni provis kiu speco de DA-receptoro respondecis pri la aversitiva konduto induktita de optogenetika senaktivigo de DA neŭronoj. Ni injektis shRNA-entenantajn lentivirusojn aŭ kontrolas lentivirusojn en la duflankan NAc kune kun AAV-DIO-Arch en la maldekstran VTA de la musoj TH-Cre. La optika fibro ankaŭ estis enigita super la VTA (Figo. 4A). Kiam la tricamera CPA-testo estis farita tri semajnojn post kirurgio, la TH-Cre musoj injektitaj kun lenti: shD1R-mCherry ankoraŭ montris eksplicitan CPA kontraŭ la optika stimula-parita ĉambro komparebla al tiu de la TH-Cre musoj injektitaj kun la kontrola lentivirusoj (lenti: mCherry). Male, la TH-Cre musoj injektitaj kun lenti: shD2R-mCherry ne montris evidentan CPA dum kondiĉado (Figo. 4D). La ekskluziva lernada deficito de la TH-Cre musoj injektitaj kun lenti: shD2R-mCherry estis plue pruvita per analizo de aversiva lernado ĉe la posttest (Figo. 4E). Ĉi tiuj rezultoj montras, ke la aversivo-konduto al la loko kondiĉita de la inaktivigo de DA neŭrono estis specife elvokita per D2R, kaj ne tra D1R, en la NAc.
diskuto
En la striato, studoj malkaŝis tiun aktivigon de la Gs-coupled D1R faciligas ĝian pafadon, dum aktivigo de la Gi-kuketita D2R rezultigas subpremitan pafadon efikeco (25). AcLaŭ la specifeco de esprimo de DA-receptoroj, fazaj pafoj de DA neŭronoj ĉefe aktivigas la rektan vojon tra D1R, dum transira malkresko en pafadoj de neŭrono DA ĉefe antaŭenigas la nerekta vojo tra D2R. (3, 26). Surbaze de ĉi tiu mekanismo de regulado, estis proponite ke silentigo de DA-neŭronoj en respondo al aversaj stimuloj estas ĉefe traktata tra la nerekta vojo kaj rezultas aversive. (3). Lastatempaj studoj montris, ke blokado de la sinapta transdono de la nerekta vojo malhelpas la akiron de aversivo konduto kaŭzita de elektra ŝoko.15) kaj ke ĉi tiu difekto estas kaŭzita de la inhibicio de transdona signalo per D2R.16). Min aldone, la optogeneta suprenregulo de D2R-esprimantaj MSN en la nerekta vojo elvokas kondutan evitadon. (27). Tamen, ĉar DA-neŭronoj elmontras kaj plibonigitajn kaj subpremitajn pafojn responde al aversaj stimuloj kaj ĉar aliaj ŝok-rilataj informoj estas samtempe procesitaj en la cerbo, restas ankoraŭ esti klarigite ĉu silentigado de DA-neŭronoj povus rekte deĉenigi kontraŭan reagon kaj lernadon, kaj ĉu ĉi tiu reago estas reguligita per D2R-esprimantaj MSN en la nerekta vojo.
En ĉi tiu studo, ni uzis optogenetikan kontrolon de pafoj de DA-neŭrono en la du kondutaj testoj: la provo de malluma ĉambro kaj tri-ĉambra CPA-testo. Nia optogenetika manipulado montris efikan subpremon de pafadoj de DA-neŭrono en la VTA kaj malsuprenigado de DA-niveloj en la NAc.. Nia preciza optogenetika senaktivigo de pafadoj de neŭronoj de DA nur dum la periodo dum kiu la bestoj restis en la kondiĉita ĉambro elvokis eksplicite kontraŭdiran reagon kaj lernadon, montrante ke pasema silento-silentaĵo rekte kaŭzis pasivan evitadon. Cetere, ĉi tiu enketo klarigis, ke la prilaborado de signalo per D2R estas ŝlosila determinanto por la indukto de ĉi tiu aversiva reakcio kaj lernado.
Kvankam niaj datumoj montris, ke D1R ne efikis en la kondutaj eksperimentoj elvoki la CPA, pluraj studoj dokumentis, ke fazaj pafoj de DA neŭronoj necesas por timo-respondojn kaj aversan lernadon (28, 29). Ĉi tiu diferenco ŝuldiĝas al la eksperimenta agordo; te nia optogeneca alproksimiĝo ekskludis la eblecon de la signalado tra aktivigitaj DA-neŭronoj elvoki kontraŭdiran konduton, indikante, ke inactivating DA-neŭronoj sufiĉis por indukti aversajn kondutojn kaj lernadon. La funkcio kaj signal-prilaborado de la aktivigita DA-pafado elvokita de aversaj stimuloj havus malsamajn kontribuojn al aversaj kondutoj de tiuj studitaj ĉi tie kaj devas esti klarigitaj en la estonteco.
DA-neŭronoj ankaŭ projektas al diversaj aliaj regionoj inkluzive de mPFC, amigdalo, kaj hipokampo. Lastatempa studo indikis tion optogenetika aktivigo de flankaj habenaj neŭronoj projekciantaj al DA-neŭronoj en la VTA kapablas indukti aversajn kondutojn, kaj ĉi tiuj DA-neŭronoj ĉefe kaj specife celas al la mPFC (30), kvankam ilia optogeneta kondiĉo diferencas de tiu en nia nuna studo, ĉar ilia optogenetika stimulado daŭris dum tuta kondiĉa sesio. Ĉar la dopaminergia enigo al la MPFC estis raportita esti aktivigita ne nur de aversaj stimuloj sed ankaŭ de kronika streĉo.31, 32), estas eble ke ilia kontinua aktivigo de mPFC-projekciaj neŭronoj estus perceptitaj kiel signaloj de tre streĉa medio; kaj, kiel rezulto de akumulado de streĉaj kondiĉoj, la bestoj montros kontraŭan konduton al la kondiĉita ĉambro. Male, ni malhelpis pafadon de DA-neŭronoj nur dum la bestoj restis en la kondiĉita ĉambro. La rezultoj de niaj kondutaj eksperimentoj uzantaj kronikan kondiĉon indikis, ke subita subpremado de DA signalo estus perceptita kiel subita averso, kiu rezultis en ilia rapida aversivo respondo.
DA-neŭronoj ankaŭ projektas al la amigdalo, la regiono kiu plejparte kontribuas al la tima respondo. Efektive, la DA-signalado al la amigdalo estis implikita en la tima respondo kaj akiro de tima memoro (33, 34). En nia studo, etikedi DA neŭronojn en la VTA identigis aron de DA neŭronoj projekciantaj al la BLA, sed la amplekso de ĉi tiuj projekcioj estis multe pli malalta ol tiu projektanta al la NAc. Kvankam ni ne povis ekskludi subtilan efikon de _Ayy_-projekciita DA signalo sur nia observita aversiĝema konduto, la ĉefa efiko de nia optogenetika neaktivigo de DA neŭronoj devus esti sur la NAc, ĉar niaj eksperimentoj kun specifa detruo de la D2R en la NAc draste malpliiĝis la aversiva konduto. Estontaj esploroj traktantaj specifajn signalojn pri celo-specifaj DA necesas klarigi la efikojn de cirkvita modifo de DA neŭronoj sur aversaj stimuloj kaj timo kondiĉita.
Materialoj kaj metodoj
Temoj.
Tyrosine hydroxylase :: IRES-Cre (TH-Cre) frapaj musoj (EM: 00254) (18) estis akiritaj de la Eŭropa Arkivo Mutanta. Ĉiuj eksperimentaj bestoj estis transigitaj al la trunko C57BL / 6J por pli ol 10-generacioj. Musoj estis parigitaj kun la musoj C57BL / 6J WT kaj loĝigitaj kun norma 12-h-malpeze / 12-h malhela ciklo kaj donis manĝon kaj akvon ad libitum. Cre+ kaj Cre- musoj de la samaj portiloj (3-6-mo de aĝo) estis uzitaj por la eksperimentoj. Ĉiuj bestaj eksperimentoj estis aprobitaj de la bestkomisiono de Osaka Bioscience Institute sub la gvidlinioj de bestaj eksperimentoj.
Kondutaj Testoj.
Dum ĉiuj kondutaj testoj, musoj estis ligitaj kun optika fibro kaj permesis moviĝi tra la tuta aparato. La movado de musoj estis kontrolata tiel ke ili povis movi sin sen obstakloj eĉ kiam ili estis konektitaj kun optika fibro sur iliaj kapoj. La pozicio de muso estis detektita de videokamera ĉesigita super la konduta aparato kaj analizita de laŭmenda programo uzanta la programon de Labview.
Provo pri malluma ĉambro.
La kutimita konduta aparato uzita en la testo konsistis el malhela ĉambro (15 × 9.5 cm) kaj hela spaco (15 × 11 cm). La malhela ĉambro havis murojn, plankon kaj tegmenton, kiuj ĉiuj estis nigre koloritaj kaj havis enirejon (XNX cm longa) al la malfermita brila spaco. La malferma hela spaco estis simila al elipso kaj havis metalan kradan plankon kaj klarajn murojn sen tegmento. Antaŭ la testo, ĉiuj musoj estis kutimitaj por 4.5-min en la aparato. La testo konsistis el tri sesioj: en la frua duono de la tago 10 (pretest: 1 min), musoj rajtis esplori la tutan aparaton. De la malfrua duono de la tago 5 ĝis la tago 1 (kondiĉita: 4 min tuta), musoj ricevis optikan stimulon kiam ili restis en la malhela ĉambro. Tage 35, la malluma ĉambra prefero estis testita sen optika stimulo (posttest: 5 min; Fig. S1E).
Tri-ĉambra CPA-testo.
La laŭmeta triĉambra kondiĉita preferokolekto / CPA-aparato uzita en la testo konsistis el du ĉambroj (10 × 17 cm) kaj konekta koridoro. La testo konsistis el tri sesioj. Tago 1 (pretest: 15 min): Musoj rajtis libere esplori la tutan aparaton. Musoj, kiuj restis 1.5-oble pli longaj en unu ĉambro ol en la alia, estis ekskluditaj de la testo. Tagoj 2 kaj 3 (kondiĉita: 15 min ĉiun): Musoj ricevis optikan stimulon kiam ili restis en la malpezaj kameroj. La elekto de la malpezaj kameroj estis kontraŭpezita. Tago 4 (posttest: 15 min): La testo estis farita sub la samaj kondiĉoj kiel en la pretest (Fig. S6A).
En la kondiĉado-seanco, la optika stimulo haltis por 30 s kiam la musoj senĉese restis super 30-oj en la malhela ĉambro aŭ en la malpeza kamero por eviti recalentigon. Lasera potenco estis kontrolita por esti ĉirkaŭ 5 mW ĉe la pinto de la optika fibro en ĉiuj kondutaj testoj.
En Vivo-Rapida-Skana Cikla Voltametrilo.
FSCV-eksperimentoj estis faritaj uzante la metodon priskribitan en antaŭaj studoj (35-37). Musoj estis anestezitaj kun ketamino / xilazina miksaĵo kiel priskribite en SI Materialoj kaj Metodoj kaj metita en stereotoksan kadron. Optika fibro uzata por stimuli Ar-esprimantan neŭronojn situis proksime al la stimulanta elektrodo. La stimula optrode tiam estis metita en la VTA (de bregma: antaŭa-malantaŭa, −3.2 mm; flanka, 0.5 mm; kaj dorsala-ventra, 3.5 mm) kaj malaltigita je 0.25-mm intervaloj. Mikroelektrodo pri karbonfibro (300 µm longa) por voltametrismo registris en la NAc (de bregma: antaŭa-malantaŭa, 1.0 mm; flanka, 1.0 mm; kaj dors-ventra, 3.5 mm). Voltametriaj mezuroj estis faritaj ĉiun 100-ms aplikante triangulan ondformon (−0.4 V al + 1.3 V al −0.4 V kontraŭ Ag / AgCl, ĉe 400 V / s) al la karbon-fibra mikroelektrodo. Potenciestostato al mezuro uzis por izoli la formon de ondo kaj la amplificación de la fluo. DA liberigo estis elvokita per elektra stimulo de DA neŭronoj uzante 24-premasestimulación (100 µA, 5 ms daŭro, 30 Hz). Optika stimulado de DA-neŭronoj (532 nm, ∼5-mW-potenco ĉe la fibropinto) estis aplikita por 10-a komencanta 5-ajn antaŭ la komenco de elektra stimulo. Mikroelektroj de karbon-fibro estis kalibritaj en solvo kun konataj koncentriĝoj de DA (0.2 µM, 0.5 µM kaj 1.0 µM). Ĉiuj datumoj de voltametría estis analizitaj de programoj personecigitaj uzante la programaro Labview kaj Matlab. Redukto en DA-niveloj per optika stimulado estis solvita per ĉefkomponento-analizo, uzante la ŝablonon DA-ondformoj akiritaj de elektraj VTA-stimuloj por apartigi signalojn de dopamino (35, 36).
Statistika analizo.
Statistika analizo estis farita uzante GraphPad PRISM 5.0 (GraphPad Programaro). Datumoj estis analizitaj per ripetaj mezuroj ANOVA (Figs. 1B, , 4D,4DKaj Fig. S6 D kaj E) aŭ unudirekta ANOVA (Figs. 1C, , 3D,3D, 4 C kaj EKaj Figoj. S4 K-M, S6FKaj S7A), kaj post hoc analizoj estis faritaj uzante la Bonferroni-teston. Ĉiuj markoj / kolumnoj kaj stangoj reprezentis la mezan kaj ± SEM, respektive.
Aliaj eksperimentaj proceduroj inkluzivantaj viruso-preparadon kaj injekton, elektrofiziologian registradon kaj analizon imunohisto-kemian kaj mRNA estas detale priskribitaj en SI Materialoj kaj Metodoj.
Dankojn
Ni dankas al E. Boyden por la konstruo de Arch, R. Matsui teknikajn konsilojn pri lentivirusoj kaj purigado, kaj Y. Hayashi por teknika konsilo en la programado de datumanalizo. Ĉi tiu laboro estis subtenita de Research Grants-in-Aid 22220005 (al SN), 23120011 (al SY kaj SN), 24700339 (al TD), kaj 25871080 (al SY) de la Ministerio de Eduko, Kulturo, Sportoj, Scienco kaj Teknologio de Japanio kaj stipendio de Takeda Science Foundation (al SN).
Piednotoj
La aŭtoroj deklaras neniun konflikton de intereso.
Ĉi tiu artikolo enhavas subtenajn informojn rete ĉe www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSupplemental.
Referencoj
;
