Suficxeco de Mesolimbic Neŭronika Stimulado por la Progreso al Toksomanio (2015)

Enkonduko

Dependeco estas malsano, kiu evoluas plurfoje (Everitt et al., 2008; George et al., 2014). La diagnozo estas farita kiam distra uzo fariĝas deviga, persistante malgraŭ negativaj konsekvencoj. Dum ĉefa hipotezo pri toksomanio postulas, ke drogoj de misuzo kaŭzas la malsanon ĉar ili troe pliigas la koncentriĝon de dopamino (DA) en la cerbo, estas neklare ĉu ekigi ĉi tiun sistemon sufiĉas por peli la transirojn de distra uzo al toksomanio (Di Chiara kaj Bassareo, 2007, Volkow kaj Morales, 2015). La subtenaj pruvoj pri la DA-hipotezo pri drogo-plifortigo amasiĝis dum kelkaj jardekoj kaj dependas de la komenca efiko de drogoj. Ekzemple, dependigaj drogoj reduktas la sojlon por intrakrania memstimulo (ICSS) de la meza antaŭcerba pakaĵo, fibra vojo enhavanta interalie ascendan DA-projekcion de la mezcerbo (Stein, 1964, Crow, 1970, Kornetsky et al., 1979). Farmakologiaj kaj lezaj studoj tiam identigis la mezokortikolimban DA-sistemon kiel la originon de ĉi tiu cirkvito (Wise kaj Bozarth, 1982). Fine de la 1980-aj jaroj, rekta mezuro de la eksterĉela DA-koncentriĝo kun mikrodializo konfirmis, ke dependigaj drogoj dividis la propraĵon elvoki DA-pliiĝon en la NAc (Di Chiara kaj Imperato, 1988). Ĉi tio kondukis al la propono de me mechananisma klasifiko de kutimigaj drogoj (Lüscher kaj Ungless, 2006).

Oni scias multe malpli pri tio, kiel ĉi tiuj komencaj efikoj de drogmanio faciligas la transiron al toksomanio. DA-sendependaj mekanismoj estis konsideritaj ĉar dependigaj drogoj havas aliajn farmakologiajn celojn. Ekzemple, kokaino, krom malhelpi la DA-transportilon (DAT), ankaŭ ligas al SERT (serotonina transportilo) kaj NET (norepinepfrina transportilo) por malpliigi serotoninon kaj norepinefrinon, ekzemple, pliigante la koncentriĝon de ĉiuj ĉefaj monoaminoj (Han kaj Gu, 2006, Tassin, 2008). Similaj zorgoj povas validi por aliaj psikostimuloj. Cetere estas aserto, ke opiaĵoj estas, almenaŭ en la komenca fazo, DA sendependaj (Badiani et al., 2011, Ting-A-Kee kaj van der Kooy, 2012). La DA-hipotezo ankaŭ estis kontestita surbaze de genetikaj musaj modeloj, kie, post enmiksiĝo kun la DA-sistemo, iuj formoj de drog-adapta konduto ankoraŭ ŝajnis. Ekzemple, DAT-knokaŭtaj musoj memadministras kokainon (Rocha et al., 1998), kaj aboliciante sintezon de DA aŭ farmakologie (Pettit et al., 1984) aŭ genetike (Hnasko et al., 2007) malsukcesis malhelpi drogan memadministradon. aŭ kondiĉita lokprefero. Dum pli bona karakterizado de ĉi tiuj transgenaj musoj kaj generado de duoblaj monoaminaj transportiloj knokaŭtoj solvis iujn el ĉi tiuj problemoj (Rocha, 2003, Thomsen et al., 2009), la sufiĉeco de DA por ekigi kardinalajn ecojn de toksomanio estas nekonata. Por eviti aferojn de nespecifeco, ni tial decidis permesi musojn memstimuli VTA DA-neŭronojn per optogenetika aliro.

Lastatempaj studoj montris, ke aktivigo de DA-neŭronoj en la mezcerbo povas indukti preferon (Tsai et al., 2009) aŭ plifortigi instrumentan konduton (Adamantidis et al., 2011; Witten et al., 2011, Kim et al., 2012, Rossi et al., 2013, McDevitt et al., 2014, Ilango et al., 2014). Dum ĉi tiu selektema aktivigo de DA-vojoj konfirmas intra-kranajn memstimulajn (ICSS) studojn efektivigitajn antaŭ pli ol 30 jaroj por delimini la rekompencan sistemon (Fouriezos et al., 1978), ili mankas montrante la indukton de malfrua adapta konduto, kiu difinas dependecon, nek ili identigis la subajn neuronajn adaptojn. Ĉi tie ni uzis optogenetikan manipuladon ne nur por permesi rektan testadon de la sufiĉa kriterio por faza DA-signalado en komencado de plifortigo, sed ankaŭ por testi la transiron al toksomanio.

Frapanta konstato pri la postaj stadioj de la malsano estas, ke eĉ kun la plej dependigaj drogoj, nur parto de uzantoj fariĝas toksomaniulo (Warner et al., 1995, O'Brien, 1997). Homaj toksomaniuloj daŭrigos drogokonsumadon malgraŭ negativaj konsekvencoj (vidu la "Difino de Dependeco" de Usona Socio por Dependa Medicino, DSM5, Usona Psikiatria Asocio, 2013), tipe rilate al sociaj kaj psikologiaj malvenkoj, kiuj ofte malfruiĝas en la tempo. Simile, ĉe ronĝuloj proksimume unu el kvin bestoj, kiuj akiras memadministradon de kokaino, estas fine klasifikitaj kiel toksomaniuloj (Deroche-Gamonet et al., 2004; Kasanetz et al., 2010; sed vidu George et al., 2014). Persistemo de drogokvanto malgraŭ negativaj konsekvencoj ankaŭ povas esti modeligita ĉe ronĝuloj per enkonduko de simpla aversiva stimulo al la konsuma horaro. Dum la homa malsano estas pli kompleksa, asocii punon kun konsumo estas simpla modelo de kerna ero de toksomanio.

Ĉi tie, ni uzis mildan piedan ŝokon por taksi ĝian konsekvencon sur mem-administrado de kokaino, sukerozo kaj optogenetika mem-stimulo. Ni plue esploras, ĉu DA-neŭrona mem-stimulo povas provoki du toksomaniulajn kondutojn - serĉado de rekompenco kaj kompensiveco asociita al konsumo malgraŭ negativaj konsekvencoj - kaj karakterizas la neŭrajn plastikecon ligitajn al ĉi tiuj kondutoj.

rezultoj

Por kontroli DA-neŭronan aktivecon, ni injektis Cre-inducible adeno-asociitan viruson (AAV) kun duobla-floxed renversita malferma legada kadro (DIO) enhavanta ChR2 kunfandita al plibonigita flava fluoreska proteino (eYFP) (Atasoy et al., 2008, Brown et al., 2010) en la VTA de musoj DAT-Cre. Krome, optika fibro estis metita por celi la VTA (ChR2, vidu Eksperimentaj Proceduroj). Specifeco de la ChR2 esprimo estis konfirmita per kun-lokalizado de eYFP kun Tyrosine Hydroxylase (TH), enzimo bezonata por DA-sintezo (Figuro 1A). 

Unue, por establi la laseran stimulan protokolon, musoj estis metitaj en operacian keston, kie ili povis premi aktivan levilon, kiu deĉenigis kelkajn laserajn stimulojn diversajn (1, 2, 8, 32, 60 aŭ 120 eksplodoj) ĉiu du kunsidoj. Por kopii fazan pafadon (Hyland et al., 2002; Mameli-Engvall et al., 2006; Zhang et al., 2009) tipe induktita de natura rekompenco (Schultz, 1998), ni uzis eksplodan stimulon. Unu eksplodo konsistis el kvin laseraj pulsoj de 4 ms, je 20 Hz, kaj ripetiĝis dufoje po sekundo. Ni trovis, ke musoj adaptis sian levilpreman konduton kiel funkcio de eksplodoj per lasera stimulo, tiel kontrolante la tutan nombron de ricevitaj eksplodoj (Figuro 1B). Ĉi tiu konduto rememorigis memadministradon de dependigaj drogoj, kiam la dozo por infuzaĵo estis diversa (Piazza et al., 2000). Por la postaj eksperimentoj, ni elektis administri 30 eksplodojn per levilpremo, donante duon-maksimuman nombron da eksplodoj (Figuro 1B). Por imiti la malfruon de DA-kresko tipe observita kiam drogoj estas administritaj intravejne (Aragona et al., 2008), ni prokrastis la laseron-stimulon je 5 s kaj aldonis fulmantan signalon dum 10 s (Figuro 1C).

Dum 12 sinsekvaj tagoj, musoj rajtis memstimuli maksimume 80 fojojn en 2 horoj. Musoj rapide pliigis la rapidon de lasera stimulo, atingante 80 laserajn stimulojn (LS) antaŭ la fino de la unua horo de kunsido (Figuroj 1D kaj 1E). La distingo inter la aktiva kaj neaktiva levilo estis rapide akirita kaj la nombro de aktivaj levilaj premiloj pliigis sekve kun kreskantaj fiksaj rilatumoj (FR1, 2, 3) horaroj (Figuroj 1F kaj 1G). En kontrolaj eksperimentoj uzantaj DAT-Cre-musojn aŭ musojn, kiuj esprimis ChR2 en γ-aminobutiraj neŭronaj (GABA) neŭronoj (GAD-Cre + musoj, celi la inhibiciajn neŭronojn de la VTA), tarifoj de mem-stimulo estis malaltaj kaj kontinue malpliiĝis tra kunsidoj. Ĉi tio ankaŭ aplikis al du bestoj Cre + kie post hoc validado montris, ke la VTA ne estis infektita per ChR2-eYFP (ne montrita). Plie, neniu diskriminacio inter la aktiva kaj neaktiva levilo estis detektita (Ciferoj S1A kaj S1B).

Ni observis, ke DAT-Cre + musoj premis pli ofte sur la aktivan levilon ol postulite por la lasera stimulado. Fakte tiaj "senutilaj" aktivaj levilaj gazetaroj reprezentis pli ol 30% de ĉiuj aktivaj levilaj premiloj (Figuro S2A) kaj okazis - dum progresis sesioj - plejparte inter la malhelpado kaj lasera stimulo (Ciferoj S2B kaj S2C). Ĉi tiu unuopa konduto disvolvita dum akiro kaj eble reflektas impulsajn respondojn.

Kunigitaj, kreviga agado en VTA DA neŭronoj forte plifortigas levilan respondon.

Okazo de VTA DA Neuron Self-Stimulation de Kokaino

Por provi, ĉu memstimulado de neŭrono VTA DA dependas de la samaj cerbaj cirkvitoj celitaj de dependigaj drogoj por plifortigi konduton, ni injektis kokainon perperitoneal (ip) tuj antaŭ memstimulaj kunsidoj (senpaga aliro al lasero por 45 min, Figuro 2A). Ĉe bazlinio, bone trejnitaj bestoj premis ĉirkaŭ 400 fojojn por akiri 85 LS en 45 minutoj laŭ la FR3-horaro. Post kokaininjekto, la agado malpliiĝis signife laŭ dozo-dependeco al ĉirkaŭ 30 LS por 100 levilaj gazetaroj kun la plej alta dozo (Figuro 2B). Ĉi tiu fermado estis plej okulfrapa dum la unuaj 30 minutoj de la kunsido, reflektante la farmakokinetikon de la drogo (Figuro 2C). Ĉi tiu eksperimento indikas, ke plifortigo per optogenetika mem-stimulado kaj plifortigo per kokaino dividas subajn neŭrajn cirkvitojn.

Por plue kompari optogenetikan memstimulon kun dependigaj drogoj, ni sekve demandis, ĉu musoj refalos al memstimulo de neŭronoj de VTA DA post kelkaj semajnoj da retiriĝo. Ĉar serĉado de drogo-rilato estas establita modelo de refalo (Epstein et al., 2006; Soria et al., 2008; Bossert et al., 2013), ni metis musojn reen en la operacian ĉambron 30 tagojn post la lasta mem- kunsido de stimulo, kie aktiva levilpremo nun ekigis la signalon sen lasero-stimuladoFiguro 3A). Robusta serĉanta konduto, evidentigita per alta indico de aktivaj levilaj gazetaroj, evidentiĝis nur ĉe musoj kun esprimo de eYFP-ChR2 en neŭronoj VTA DA (DAT-Cre + sed ne DAT-Cre− musoj, Figuro 3B).

Antaŭaj studoj montris la kaŭzan ligon inter recidivo asociita kun recidivo kaj sinapta plastikeco elvokita de kokaino en subtipo da NAc-neŭronoj esprimantaj la DA D1R (Pascoli, Terrier et al., 2014). Sekve, por taksi ĉi tiun sinaptan plastikecon, ni generis musojn DAT-Cre kun krucaj Drd1a-tdTomato musoj por identigi la mezgrandan spinan neŭronon (MSNs) subtipon en la NAc. Anstataŭ la serĉanta testo, oni tranĉis tranĉaĵojn de la NAc kie D1R-MSNoj estis ruĝaj, kontraste kun verdaj fibroj de VTA DA neŭronoj infektitaj de flox-ChR2-eYFP (Figuro 3C). Tute-ĉelaj pecet-krampaj registradoj eks vivo rivelis rektigantan nunan tensian rilaton por AMPAR-elvokitaj postsinaptaj fluoj (AMPAR-EPSCs) kaj pliigita AMPAR / NMDAR-proporcio (Figuroj 3D kaj 3E), en la D1R-MSN sed ne en la D2R-MSN. Similaj trovoj antaŭe akiritaj post retiriĝo de kokaina memadministrado montriĝis por indiki la kombinitan enmeton de GluA2 mankanta kaj GluA2 enhavanta AMPARojn, ĉe apartaj enigoj sur D1R-MSN (Pascoli, Terrier et al., 2014).

Memstimulado malgraŭ Puno

Uzo de substancoj malgraŭ negativaj konsekvencoj estas alia kerna difina eco de toksomanio (vidu DSM5-difinon, Usona Psikiatria Asocio, 2013). Rat-modeloj estis establitaj (Deroche-Gamonet et al., 2004; Pelloux et al., 2007; Pelloux et al., 2015; Chen et al., 2013) kie elektra ŝoko enkondukita en la programon pri memadministrado de kokaino subpremas kokainon. konsumado ĉe iuj bestoj. Post 12 tagoj de komenca ekspozicio (akiro), musoj rajtis havi tri pliajn kunsidojn ĉe FR3 sed kun reduktita kunsido (60 min aŭ 40 rekompencoj maksimumo). Ĉi tiuj tri kunsidoj servis kiel bazlinio por la postaj kvar kunsidoj, kie ĉiu tria lasera stimulo estis parigita kun piedŝoko (500 ms; 0.2 mA) antaŭdirita de nova signalvorto (Figuro 4A). La intenseco kaj daŭro de la pieda ŝoko estis alĝustigitaj por tute subpremi levilan premadon por sakrosa rekompenco (vidu ankaŭ datumojn sube). La punenda horaro kaŭzis du kontraŭajn kondutajn respondojn (Figuro 4B). Iuj musoj rapide ĉesis respondi kiam la puno estis enkondukita (nomita "sentema"), dum aliaj daŭre respondis por akiri la maksimuman nombron da laseraj stimuloj kaj povas esti konsiderataj kiel "imunaj" al puno. La du amasoj de bestoj plene aperis ĉe la fino de la kvar punaj sesioj (Figuro 4C). "Rezistaj musoj" subtenis la numeron de laseraj stimuloj (malpli ol 20%-redukto) dum "sentemaj musoj" malpliigis mem-stimuladon je pli ol 80%. Kun ĉi tiuj kriterioj, nur unu besto (grizaj punktoj) ne povus esti asignita. Ĉi tiu observo pruvas, ke devigita kreviga agado elvokita per mem-stimulo de VTA DA-neŭronoj sufiĉas por indiki persistemon de konsumo malgraŭ negativaj konsekvencoj en frakcio de musoj. Kiel kontrolo, en sendependa grupo de musoj, kiuj estis establintaj reziston aŭ sentemon al la puno asociita kun mem-stimulo, nociceptado estis taksita uzante la vosto-flickestron. Neniu diferenco en la latenteco por retiri la voston mergita en varma akvo inter sentema kaj rezistema estis detektita (Figuro S3).

Ni poste demandis, post hoc, ĉu iu aparta ĉefaĵo dum la akira fazo de mem-stimulo povus antaŭdiri la reziston al puno. Sentemaj kaj imunaj musoj faris identan nombron da aktivaj kaj neaktivaj levilpremiloj dum bazaj kunsidoj, kaj ĉiuj musoj atingis la maksimumon de 80 LS (Ciferoj S4A kaj S4B), en simila tempo (Ciferoj S4A kaj S4C). Dum la frakcio de senutila aktiva levilpremo denove ne diferencis en la du subpopulacioj (Figuroj 4D kaj S4D), la nombro de senutilaj levilaj premiloj antaŭ la ekapero de la lasera stimulado fariĝis signife pli alta en imunaj musoj fine de la akiraj kunsidoj (Figuroj 4E kaj S4E). Ĉar ĉi tiu konduto disvolviĝis dum akiro, ĝi povas kontribui, kune kun denaska impulsemo (Economidou et al., 2009, Broos et al., 2012, Jentsch et al., 2014), establi la reziston al puno. Krome, progresema rilatproceso estis farita en la tago 11 por kvantigi la instigon por la optogenetika stimulo (Richardson kaj Roberts, 1996). Rezistemaj musoj montris rompopunkton ne statistike diferencan de sentemaj musoj (Figuro S4F).

Rezisto al Puno por Kokaino sed Ne por Sukrozo

Por provi ĉu la paradigmo de konsumo malgraŭ malutilaj konsekvencoj kune kun impulsa levilpremo ankaŭ povus antaŭdiri devigan konsumadon de dependiga drogo, nova kohorto de musoj spertis 12 tagojn da kokaina memadministrado. Eksperimentaj parametroj por akira memadministrado de kokaino estis fiksitaj al maksimume 80 infuzaĵoj de kokaino ene de 4 horoj dum akiro kaj al 40 infuzaĵoj ene de 2 horoj dum la tri bazaj kunsidoj antaŭ la kvar punaj kunsidoj (Figuroj 5A kaj S5A). Denove, du grupoj ekaperis post parigado de kokain-rekompenco kun elektraj kolizioj. Efektive, 5 el 22-musoj estis klasifikitaj kiel imunaj (malpli ol 20% malkresko de la bazlinio), dum 17 kvalifikiĝis kiel sentema (pli ol 80%-malkresko) kaj unu besto falis inter (13-infuzaĵoj en la tago 19) (Figuro 5B). Ni tiam serĉis kondutajn prognozojn de rezisto al puno. Inter la du grupoj, la nombro de infuzaĵoj, la rapideco de infuzaĵo, kaj la nombro de aktivaj aŭ neaktivaj levilaj premiloj ne diferencis (Ciferoj S5B – S5D), kaj la rompopunktoj estis similaj (Figuro S5E). Kio diferencis estis la evoluo de la dissendo en la tempo de la senutilaj premiloj sur la aktiva levilo. En la unuaj kvar sesioj, senutilaj levilpremoj regule malpliiĝis dum la tempoprogramoj en ambaŭ rezistemaj kaj sentemaj musoj, dum ĉe la fino de la akiro, nur sentemaj musoj subtenis ĉi tiun konduton (Figuroj 5C kaj 5D kaj S5F). Kontraŭe, imunaj musoj tendencis pliigi sian totalan nombron de senutilaj levilaj premilojFiguroj 5C kaj S5D), precipe en la lasta kvarono de la tempoperiodo (Figuro 5D). Kvankam kvalite simila al la observo antaŭe farita per la optogenetika stimulado de DA-neŭronoj (vidu supre), la alkroĉado de la senutilaj gazetaroj dum la frua tempoperiodo ne estis vidita kun kokaino, plej verŝajne pro la pli malrapida kinetiko kun kiu la drogo. pliigis DA-nivelojn. Tamen similaj konkludoj povus esti tiritaj surbaze de ĉi tiu unuopa evoluo de senutila levila disdonado dum la mallonga periodo antaŭ "la interna detekto de la DA-ondado." Niaj rimarkoj tiel sugestas, ke la distribuo de la senutilaj aktivaj leviloj antaŭdiras uzon de drogoj. malgraŭ negativaj konsekvencoj.

Fine ni ripetis la eksperimenton per musoj reklamitaj de libitum, kiuj povus levi premi por sukera rekompenco. Post kiam la puno estis enkondukita, ĉiuj musoj ĉesis memadministri la sukrozon (Figuro 5E), montrante, ke ĉi tiu horaro subpremis la konsumon de nepra natura rekompenco, sed permesis la detekton de komputa konsumado de toksiga drogo aŭ forta stimulo de neuronaj DA.

Kunigitaj, ĉi tiuj rezultoj pruvas, ke mem-stimulo de VTA DA sufiĉas por indukti kompulsivon, kiel montras la rezisto al puno en subaro de musoj (68%). Simile, post kokaino SA, iuj musoj fariĝis imunaj kontraŭ puno (23%), kio neniam estis la kazo post sukeroza SA (Figuro 5F).

Por indiki la cerban areon, kiu povas kontroli la decidon persisti en memadministrado malgraŭ negativaj konsekvencoj, ni unue kontrolis ĝeneralan "neuronalan agadon" kalkulante la nombron de neŭronoj, en kiuj la punsesio deĉenigis la esprimon de la tuja frua geno cFos en 15 malsamaj regionoj. Musoj estis intrakardie kun PFA 90 minutojn post la fino de la lasta punsesio. La grupoj de kontrolo inkluzivis naivajn bestojn, kaj ankaŭ musojn kunigitaj al sentemaj aŭ rezistemaj musoj por kontroli la eble konfuzan efikon de la kvanto de ricevitaj ŝokoj.

Dum en la plej multaj elektitaj regionoj, la nombro da cFos-pozitivaj neŭronoj estis plej alta en tranĉaĵoj el imunaj musoj kompare al naivaj musoj, aperis du specoj de respondoj, el kiuj la prelimbika kortekso (PL) kaj la flanka OFC. En la PL ni trovis similan kreskon de cFos-pozitivaj ĉeloj en imunaj musoj kaj iliaj jugaj kontroloj, dum en la OFC ĉi tiu kresko estis evidenta nur ĉe la imunaj kaj ne la respondaj juksitaj musoj (Figuroj 6A kaj 6B). Por kvantigi ĉi tiun diferencon, ĉiuj datumoj unue estis normaligitaj al esprimniveloj en naivaj bestoj. Tiam, la rilatumo estis kalkulita inter la rezistema super la sentema dividita de la jugo al la rezistema super la jugo al la sentema (Ratio_cfos = (R / S) / (YR / YS), Figuro 6B). Ĉi tiu proceduro identigis la cingulan kortekson, la OFC kaj VTA kiel la regionojn, kiuj estas aktivigitaj en imunaj sed ne en sentemaj musoj kaj kie estis malmulta diferenco en ambaŭ grupoj de jugitaj kontroloj (similaj malaltaj cFos-pozitivaj neŭronoj en jugitaj, fakte) . Trovi la VTA ne surprizas, ĉar ĝi estas la regiono de lasero-stimulitaj neŭronoj. Ĉi tio konformas al antaŭa raporto montranta, ke ChR2-stimulo deĉenigas cFos-aktivadon (Lobo et al., 2010, Van den Oever et al., 2013). Malalta proporcio_cfos estis trovita en regionoj kie la aktivigo estis simila en sentema kaj imuna (kiel CeA kaj PAG). La rilatumo_cfos ankaŭ malaltiĝis kiam la aktivigo estis paraleligita per alta diferenco en la jugo-kontroloj (kiel la PL, Figuro 6C por resuma rilatumo_cfos datumoj). Simila cFos-esprimo en rezistemaj kaj jugo-rezistemaj musoj estis tial plej verŝajne kaŭzita de la nombro de piedoŝuoj kaj malmulte rilatis al la rezisto al puno. Kunigitaj, la alta rilatumo_cfos en la OFC sugestas, ke neŭra aktiveco en ĉi tiu regiono estas asociita kun rezisto al puno kaj tial povas favori la transiron al toksomanio.

Por identigi la substraton de la pliigita neuronal agado en la OFC en la musoj rezistantaj al puno, ni preparis tranĉaĵojn de la PL kaj L-OFC 24 hr post la lasta punsesio por testi pri interna ekscitiĝemo. La du regionoj estis elektitaj pro sia tre klara ŝablono de c-Fos-esprimo en la antaŭaj eksperimentoj. La neurona eksciteco estis kvantigita kalkulante la nombron de agaj potencialoj (AP) provokitaj per la injekto de kreskantaj kvantoj de kurento (de 0 ĝis 600 pA) en tutĉelaj registradoj. Ĉi tiuj registradoj malkaŝis daŭran hipo-ekscitecon en piramidaj neŭronoj de la PL de imunaj musoj (kaj ilia jugita kontrolo) kompare kun sentemaj aŭ naivaj musoj (Figuro 7A). La ripoza membrana potencialo (RMP) de registritaj neŭronoj ne diferencis inter la eksperimentaj grupoj (Figuro 7B). Ĉi tiuj rezultoj forte sugestas, ke la ekscitebleco de neŭronoj en PL rekte rilatas al la nombro de ŝokoj ricevitaj, kaj eble ne kun la decido rezisti punon. Ĉi tiu plej verŝajne reflektas negativan retrospektan adapton ekigita de neuronal ekscitiĝo instigita de la piedaj skuoj la tagon antaŭe. Kontraŭe, neŭronoj de L-OFC estis pli eksciteblaj nur en imunaj musoj. Ekscitebleco de neŭronoj de jokitaj musoj ne diferencis ol ekscitebleco de neŭronoj de naivaj musoj, ekskludante efikon de la pieda ŝoko mem (Figuroj 7C kaj 7D). Ĉi tiu pliigita aktiveco de OFC-neŭronoj probable subas la esprimon de cFos kaj povas kaŭzi la reziston al puno.

Por provi kaŭzecon inter plibonigita OFC-neŭrona ekscitiĝo kaj rezisto al puno, ni esprimis la inhibician DREADD (projektaj riceviloj ekskluzive aktivigitaj de projektaj drogoj: CamKIIα-hM4D) en piramidaj neŭronoj de la OFC de musoj DAT-Cre + (Figuro 8A). En akraj tranĉaĵoj de la OFC, bana apliko de CNO (clozapine-N-rusto) induktis malrapidan eksteran fluon, plej probable mediaciitan de GIRK-kanaloj, kiu estis inversigita per bario (Ba²⁺), ne specifa blokilo de kaliaj kanaloj (Figuro 8B). La CNO ankaŭ movis dekstran kurbon de eniro / eligoFiguro 8C). La musoj DAT-Cre + infektitaj per AAV1 / CamKIIα-hM4D-mCherry en la OFC (Figuro 8D) akiris DA-neŭronan mem-stimulan paradigmon sekvitan de du sinsekvaj blokoj kun la punhoraro, la unua en ĉeesto de CNO kaj la dua sen CNO. La du blokoj estis interrompitaj de 6 tagoj sen puno (Figuro 8E). Fine de la unua punpunkto, en ĉeesto de CNO, nur 5 de 16-musoj estis imunaj (Figuro 8F, maldekstra panelo). Kontraŭe, sen OFC-inhibo, dum la dua periodo de puno, 14 el 16 estis klasifikitaj kiel "imunaj" (Figuroj 8F, dekstra panelo, kaj 8G). Alivorte, la frakcio de imunaj musoj estis signife pli malalta en ĉeesto de CNO kompare al la unua kohorto de 34-musoj antaŭe testitaj en la samaj kondiĉoj (inter-grupaj komparoj, Figuro 8H) kaj fariĝis simila al la unua kohorto sen CNO (ene de grupa komparo). Finfine, por la naŭ musoj, kiuj ŝanĝiĝis de sentema al imuna, CNO ne modifis la vostfluan latencon post mergado en varman akvon (Figuro 8Mi).

Prenita kune, ĉi tiu eksperimento pruvas, ke la agado de piramidaj neŭronoj de la OFC pelas la decidon daŭrigi mem-stimuladon malgraŭ negativaj sekvoj, kiuj reprezentas ŝlosilan trajton de la transiro al toksomanio en ronĝuloj.

diskuto 

Recentlyus proponita dependeca modelo distingas tri paŝojn en la progreso de la malsano: sporada distra drogo-uzo, sekvata de intensigita, daŭra, pliigita drogo-uzo kaj eventuale kompensa uzo asociita kun perdo de kontrolo (Piazza kaj Deroche-Gamonet, 2013; sed vidu George et al., 2014). Nia studo montras, ke stimulo de neŭronoj VTA DA sufiĉas por stiri ĉi tiun progresadon kun relative rapida tempa kurso.

Imitante naturan eksplodan ŝablonon, efika liberigo de DA estas elvokita en celaj regionoj de la VTA, kiel ekzemple la NAc (Bass et al., 2010). DA-niveloj en la NAc do probable regas la memstimulon, same kiel ronĝuloj mem administras la sekvan infuzaĵon de kokaino aŭ heroino post kiam la DA-koncentriĝo falas sub sojlon (Wise et al., 1995). Ĉi tio ankaŭ subtenas nian konstaton, ke kokaino, injektita ip, povas fermi memstimulon. Tiel, DA-neŭrona memstimulo tre similas drogan memadministradon, kvankam ĝia kinetiko estas certe pli rapida ol iu ajn farmakologia substanco, inkluzive kokainon, kiel sugestas la malsama indico de respondoj observita en la nuna studo.

Dum ni selekteme celas DA-neŭronojn de la VTA, ilia optogenetika mem-stimulo eble aktivigis grupojn de ĉeloj kun malsamaj fiziologiaj funkcioj. Ekzemple, ĵus sugestis, ke iuj DA-neŭronoj kodas por aversivaj stimuloj (Lammel et al., 2012; Gunaydin et al., 2014). Ĉi tiuj ĉeloj projekcias al mPFC, dum neŭronoj VTA DA projektantaj al flanka NAc-ŝelo peras pozitivan plifortigon (Lammel et al., 2012). Estus interese taksi mem-stimuladon kaj progresadon per selektema celado (Gunaydin et al., 2014). Ĉar nia manipulado aktivigis ĉiujn VTA DA-neŭronojn, same kiel kokaino agas sur ĉiuj DAT-esprimantaj neŭronoj, eblas imagi, ke iuj DA-neŭronoj funkciigus plifortigan lernadon dum aliaj DA-neŭronoj kondukus malemon. La neta efiko ankoraŭ estus plifortigo de la konduto; tamen la "malemaj neŭronoj" povus kontribui al la indukto de kontraŭula procezo (Koob, 2013, Wise kaj Koob, 2014).

Post devigita abstinado, re-ekspozicio al la kunteksto induktis serĉadon de la mem-stimulo, establita ronĝula modelo de drogo-refalo. Rimarkinde la suba neŭra plasteco ne distingiĝas de tiu observita post retiriĝo de kokaina memadministrado (Pascoli, Terrier et al., 2014). Ĉi tio aldonas studon, kiu antaŭe raportis identan sinaptan plastikecon en neŭronoj VTA DA elvokitaj per ununura kunsido de optika stimulo aŭ unua injekto de dependiga drogo (Brown et al., 2010). Aperas ŝablono de sinaptaj adaptiĝoj, ke c adapta konduto komuna al ĉiuj dependigaj drogoj.

Frapanta trajto de nia studo estas la dikotomio en la respondo al aversiva stimulo sufiĉe forta por interrompi konsumadon de neesenca natura rekompenco ĉe ĉiuj bestoj. En nia medio, rezistemaj musoj ne montris signife pli altan motivon por la rekompenco mem-liverita, kio kontrastas kun studo kun kokaino ĉe ratoj (Pelloux et al., 2007). La konduta antaŭdiro por rezisto al puno ĉe musoj tamen estis vana levilo premanta dum la 5-aj jaroj antaŭ la komenco de la DA-neŭrona stimulo. La malkapablo atendi ĝis rekompenca liverado do videblas kiel signo de impulsemo (Dalley et al., 2011, Olmstead, 2006, Everitt et al., 2008, Winstanley, 2011, Leyton kaj Vezina, 2014). Fascinis nin la konstato, ke impulsema prenado disvolviĝis nur post kelkaj kunsidoj de memstimulo. Ĉi tio levas la eblon, ke rezisto al puno (kaj per etenda vundebleco al toksomanio) eble ne estas tute denaska, sed disvolviĝas dum la komencaj fazoj al toksomanio. Se ĉi tio estas la kazo, tiam la dikotomio observita de ni kaj aliaj (Deroche-Gamonet et al., 2004) eble ne nur estas determinita de genetikaj faktoroj. Ĉi tio ankaŭ klarigus, ke simila frakcio de individuoj fariĝas toksomaniulo en genetike relative homogenaj musaj trostreĉoj kaj genetike certe pli diversaj homaj populacioj.

Se rezisto al puno malkaŝas la individuan vundeblecon por toksomanio, taksata supre 20% ĉe homoj eĉ kun kokaino (Warner et al., 1995; O'Brien, 1997; George et al., 2014), tiam la multe pli alta proporcio trovita ĉi tie povus reflekti la potencon de la rekta kaj selektema DA-neŭrona stimulo. Alivorte, selektema DA-neŭrona stimulo povas esti multe pli kutimiga ol iu ajn drogo. Ĉi tio povas esti klarigita per la neselektema agado de farmakologiaj substancoj. Ekzemple ĉe kokaino, monoaminoj krom DA eble efektive prokrastas la indukton de toksomanio. Efektive, serotonino povas kontraŭstari DA-dependajn adaptajn kondutojn kiel respondi por kondiĉita rekompenco, mem-stimulo kaj kondiĉita loka prefero (Wang et al., 1995; Fletcher kaj Korth, 1999; Fletcher et al., 2002) faciligante la asocion. de signalvortoj al aversivaj stimuloj (Bauer, 2015, Hindi Attar et al., 2012). Alternative, la diferenco povas esti en la diferenco de kinetiko inter optogenetika memstimulo kaj farmakologia indukto de eksterĉela DA-pliiĝo. Tia dependiga potenca variado ankaŭ povas ekzisti inter malsamaj drogoj de misuzo (George et al., 2014).

Kvankam ni ne povas formale ekskludi diferencojn en liberigo de DA kaj / aŭ relativa signalado por kontribui al establi punan reziston, ĉi tiu scenaro estas malverŝajna ĉar la histologia validigo de la infekto de bestoj en la studo montris. eYFP-ChR2 esprimo en la tuta VTA. Plie, la optogenetika stimula protokolo desegnita por saturi la liberigon de DA kondukis al mem-stimulo, kiu kulminis per malsimile distribuitaj valoroj por la romppunkto, reflektante la instigan instigon.

Alia surpriza rezulto estas, ke la nombro de elektraj piedŝokoj rilatas al la ekscitiĝo de la neŭronoj en la PL. Malpliigita ekscitiĝo de piramidaj neŭronoj kaj pliigita rilato AMPAR / NMDAR en piramidaj neŭronoj de la samaj ĉeloj estis observita ĉe "dependaj ratoj", tamen ĉi tiuj studoj ne kontrolis la efikon de elektraj ŝokoj per si mem (Kasanetz et al., 2010, Kasanetz et al., 2013, Chen et al., 2013). La malkunigo povas do esti klarigita per la duobla rolo de la mPFC en ambaŭ decidaj procezoj kaj tima integriĝo (Peters et al., 2009). Por la konversacio, ŝanĝo en eksciteco de piramidaj neŭronoj en la infralimbia kortekso rilatas al piedŝokoj (Santini et al., 2008). Ĉi tiu evidenteco ne ekskludas la eblon, ke mPFC ludas elstaran rolon por la decido pri konsumado. Tamen, nia cFos-analizo kaj observoj pri interna ekscitiĝo montras al la OFC kaj cingula kortekso. Krome, inhibicio de neurona eksciteco en la OFC kun DREADD malhelpis reziston al puno. Ĉi tiu kaŭza ligo reprezentas gravan paŝon por kompreni la ĉelajn mekanismojn respondecajn pri la transiro al toksomanio. Estontaj studoj necesos por testi ĉu ĉi tio validas ankaŭ por la tuta gamo de dependigaj drogoj.

Niaj trovoj kongruas kun konstatoj, ke misfunkcio de la OFC povas malhelpi decidon pri kosto-profito (Seo kaj Lee, 2010, Walton et al., 2010, Fellows, 2011) kaj povas kaŭzi sindevigajn kondutojn (Burguière et al., 2013 ). Ĉe homoj, drogmanio estis ligita al difektita decidado kaj ŝanĝita OFC-funkcio (Lucantonio et al., 2012; Gowin et al., 2013). Kune, la agado de OFC-neŭronoj aperas kiel ŝlosila determinanto por la transiro al sindeviga uzo de drogoj (Everitt et al., 2007). Ĉi tio ne malhelpas rolon de drog-elvokita plastikeco ĉe ekscitaj aferoj al MSN-oj observitaj ĉi tie kaj en aliaj studoj (Kasanetz et al., 2010). Estos interese pritaksi ĉu manipuladoj celantaj kontroli la ekscitiĝemon de la OFC influas motivadon en toksomaniuloj.

Ĉi tie ni proponas DA-neŭronan memstimulon kiel potencan modelon por studi la stadiojn kondukantajn al toksomanio. Ni reproduktas kernajn erojn de drogmanio, kiel refalo, sinapta plastikeco kaj persistemo de konsumo malgraŭ negativaj konsekvencoj. Kvankam la modelo certe ne taŭgas por studi efikojn specifajn por donita drogo (ekz. Kompari opioidon kun psikostimuloj), ĝi havas plurajn avantaĝojn. Ĝi permesas precizan tempan kontrolon de la rekompenca liverado, ĝi tre specife aktivigas nur la neŭronojn VTA DA, kaj laste sed ne malpli grave, ĝi donas la eblon studi musojn por multe pli longa tempo ol kun drogo memadministrado. Fokusante la difinan komunecon de kutimaj drogoj, la espero estas malimpliki la neŭrajn mekanismojn subajn ankaŭ dependajn formojn de dependeco (Alavi et al., 2012, Robbins kaj Clark, 2015) kaj tiel kontribui al ĝenerala teorio de la malsano. Optogenetikaj malsanaj modeloj tiel permesas decidan paŝon por ĝisfunda kompreno de la neurona misfunkcio implikita en malfruaj stadioj de toksomanio kaj gvidos novajn raciajn traktadojn por malsano nuntempe sen kuracilo.

VP, JT, kaj AH efektivigis la kondutajn eksperimentojn dum VP faris la elektrofisiologiajn registradojn kaj kunordigis la analizon. La studo estis desegnita kaj verkita de ĉiuj aŭtoroj.

La laboro estis subtenita de subvencioj de la Svisa Nacia Fondaĵo kaj de la progresinta subvencio ERC (MeSSI), Carigest SA, la Akademia Societo de Ĝenevo, kaj la Fondation Privée des Hopitaux Universitaires de Genève. JT estas MD-PhD-studento pagita de la Svisa Konfederacio.

Dokumento S1. Suplementaj Eksperimentaj Proceduroj kaj Ciferoj S1 – S6

Tabelo S1 Statistikaj Analizoj