Dopamina D2-riceviloj en dikfunkciaj rekompencoj kaj rekompencaj manĝoj en obesaj ratoj (2010)

Komento: Ĉi tiu studo montras, ke kiam besto ricevas senliman aliron, forta natura plifortigilo (tre stimula manĝaĵo) povas kaŭzi malkreskon de riceviloj D2. Ĉi tiu malpliiĝo estis vidata en preskaŭ ĉiuj ratoj, kaj okazis sufiĉe rapide. Kiam "tre bongusta" manĝaĵo estis forigita, la ratoj rifuzis manĝi normalan manĝaĵon. La ratoj daŭre furiozis (kiam ili povis) malgraŭ parigi elektrajn ŝokojn kun la "tre bongusta" manĝaĵo.

• Plena Studo

Nat Neurosci. 2010 majo; 13(5): 635-641. Publikigita rete 2010 March 28. doi:  10.1038 / nn.2519

abstrakta

Ni trovis, ke disvolviĝo de obezeco kuniĝis kun apero de progresema malboniĝanta deficito en respondoj de neŭralaj rekompencoj. Similaj ŝanĝoj en homeostazo induktita de kokaino aŭ heroino estas konsiderataj kiel gravaj por ekigi la transiron de neformala al deviga drogo. Sekve, ni detektis compulsivo-similan manĝokonduton en obezaj sed ne malgrasaj ratoj, mezuritaj kiel agrabla nutraĵa konsumo, kiu estis rezistema al interrompo de averso kondiĉita stimulo. Striata dopamino D2-receptoroj (D2R) estis subregulaj en obezaj ratoj, kiel estis raportite en homoj dependaj al medikamentoj. Krome, prokrasto de lentivirusoj de striataj D2R rapide akcelis la evoluon de dependaj-rekompencaj deficitoj kaj la ekfunkcion de simila manĝo serĉanta en ratoj kun etendita aliro al plaĉa alta-grasa manĝo. Ĉi tiuj datumoj montras, ke troa konsumado de agrabla manĝaĵo ekfunkciigas respondojn neuroadaptativas en dependeco en cirkvitoj de rekompenco de cerbo kaj pelas la evoluon de deviga manĝo. Komunaj hedonaj mekanismoj tial povas esti bazitaj sur la obezeco kaj drogodependeco.

Enkonduko

Manĝado estas influita de plezuro kaj rekompenco, kaj akiri manĝokompenson povas potence instigi konsumon1, 2. Tamen la hedonaj mekanismoj kontribuantaj al obezeco restas malbone komprenataj. En hiperfagaj homoj kun denaska leptina manko, agado en la dorsa kaj ventra striato, kiuj estas kernaj eroj de cerbaj rekompencaj cirkvitoj, kreskas rimarkinde kiel respondo al bildoj de manĝaĵo3, kaj leptina anstataŭiga terapio mildigas ambaŭ striatan agadon kaj mem-raportitan "ŝaton" de manĝaĵoj3 . Ĉi tio sugestas, ke la striato gravas en hedonaj aspektoj de manĝa konduto. Lastatempe montriĝis, ke aktivigo de la striato kiel respondo al tre bongustaj manĝaĵoj estas malakra ĉe grasaj individuoj kompare kun maldikaj kontroloj4. Cetere, hipofunkcio de la dorsa striato kaj longdaŭra plipeziĝo estas plej okulfrapa ĉe individuoj kun la alelo TaqIA de la gena lokuso DRD2-ANKK1, kio rezultigas malpliigitan striatan D2R-esprimon kaj montriĝas predispoziciajn individuojn al substancaj dependecaj malordoj4, 5 Ĉi tiuj kaj similaj observoj kondukis al la propono, ke deficitoj en rekompenca prilaborado povas esti grava riska faktoro por la disvolviĝo de obezeco, kaj ke grasaj individuoj eble devige konsumas plaĉajn manĝaĵojn por kompensi rekompencan hiposentemon6. Precipe estas neklare, ĉu mankoj en rekompenca prilaborado estas konstituaj kaj antaŭas obezecon, aŭ ĉu troa konsumo de plaĉa manĝaĵo povas kaŭzi rekompencan misfunkcion kaj per tio kontribui al dieto-induktita obezeco.

Difinanta karakterizaĵo de individuoj kun pezaj pezoj kaj obezoj estas, ke ili daŭre manĝas malgraŭ la konataj negativaj sociaj kaj sociaj konsekvencoj. Efektive, multaj sobrepezaj individuoj esprimas deziron limigi sian manĝokonsumon, tamen luktas por kontroli ilian konsumadon kaj multfoje konsumas preter sia energio-postulo7, 8. Evoluo de manĝokonduto sensenta al negativa rezulto estas analoga al la deviga drogo-konduto vidata ĉe homaj drogemuloj, kiu simile estas nehavebla al negativaj konsekvencoj. Ĉi tie ni esploris la efikojn de etendita aliro al bongusta dika dieto pri la sentemo de certaj rekompensaj sistemoj en ratoj. Ni ankaŭ ekzamenis la ligon inter dieto-induktita hedona disregulación kaj la apero de compulsiva manĝo serĉado. Fine, ni esploris la rolon de striataj D9R en ĉi tiuj respondecaj kondutoj de dependeco.

Similaj mankoj al rekompenco de dependeco en ratoj obesos

Por testi la efikojn de limigita aŭ plilongigita aliro al plaĉa dika dika dieto, ni preparis virajn Wistar-ratojn (300-350 g) kun dupolusa stimula elektrodo en la flanka hipotalamo kaj trejnis ilin dum 10-14 tagoj en diskreta provo. nuna-sojla cerba stimula rekompenca proceduro (BSR) ĝis stabilaj rekompencaj sojloj estis establitaj4. En la BSR-procedo, ratoj respondas vigle por akiri rekompencan elektran mem-stimulon per la interna stimula elektrodo, kun la minimuma stimula intenseco, kiu subtenas konduton de mem-stimulo nomata rekompenca sojlo10. Ĉar rekompencaj sojloj restas stabilaj kaj senŝanĝaj dum longaj tempoj sub bazaj kondiĉoj, ĉi tiu procedo provizas senteman mezuron de la respondemo de cerbaj rekompencaj sistemoj. Post starigo de stabilaj BSR-sojloj (difinitaj kiel <10% -vario en sojloj tra tri sinsekvaj kunsidoj), ni asignis ratojn al tri grupoj, kiuj ne montris diferencojn en mezaj korpaj pezoj aŭ rekompencaj sojloj inter grupoj. La tri grupoj ricevis diferencan aliron al "manĝejo-stila" dieto konsistanta el bongusta energidensa manĝaĵo facile havebla por homa konsumo (vidu Retajn Metodojn). Ratoj havis 0 h (nur-manĝeblaj ratoj; n = 9), 1 h (restriktitaj aliroj; n = 11) aŭ 18-23 h (plilongigitaj ratoj; n = 11) aliron al la dieto tage dum 40 sinsekvaj tagoj. Oni scias, ke kafejaj dietoj kaŭzas dieto-induktitan obezecon en ratoj11. Ĉiuj ratoj ankaŭ havis ad libitum aliron al norma laboratorio-manĝaĵo, kun rekompencaj sojloj, plipeziĝo kaj kaloria ingestaĵo registritaj ĝenerale.

Pezo pliigis signife en ratoj kun etendita aliro al la kafejo-dieto kompare kun la grupoj kun sola limo aŭ limigita aliro (Fig. 1a). Pezo ankaŭ tendencis pliiĝi en la reta aliro ratoj kompare al chow-nur ratoj, sed ĉi tiu efekto ne atingis statistika signifo. La evoluo de obezeco en etendaj aliraj ratoj estis proksime asociita kun plimalboniĝo de deficito en cerba rekompencfunkcio, reflektita en iom post iom levitaj BSR-sojloj (Fig. 1b). Ĉar neniuj diferencoj en respondaj latentoj por BSR estis observitaj inter la tri grupoj (suplementa figuro 1), deficito en konduta spektaklo ne povas klarigi ĉi tiun observon. Similaj mankoj en funkcio de cerbo-rekompenco estis raportitaj en ratoj kun etendita sed ne limigita aliro al endovenaj kokainaj aŭ heroinaj memadministradoj12, 13, 14. Tiel, etendita aliro al bongusta alta grasa nutraĵo povas indukti dependecon-similan deficiton en cerba rekompencfunkcio, konsiderata grava fonto de instigo kiu povas konduki troaŭtaĵon kaj kontribui al la disvolviĝo de obeseco1, 6.

Figuro 1: Pezo gajno kaj rekompenco misfunkcio en ratoj kun etendita aliro al kafejo dieto.

(a) Meza (± sem) plipeziĝo en ratoj nur restriktitaj kaj alireblaj kaj alireblaj (aliro × taga interago: F39,702 = 7.9, P <0.0001; * P <0.05 kompare kun nur-grupo, post hoc-testo). (b) Meza (± sem) procenta ŝanĝo de bazaj rekompencaj sojloj (aliro × tempo-interago: F78,1092 = 1.7, P <0.0005; * P <0.05 kompare kun nur-grupo, post-hoc-testo).

Kiam ni ekzamenis detale la manĝokonduton (Fig. 2), ni trovis, ke la ĉiutaga konsumo de kalorioj estis simila inter ratoj nur-manĉaj kaj limigitaj (Fig. 2a, d). Kontraŭe, la totala kaloria konsumado en ratoj kun etendita aliro estis preskaŭ duoble pli granda ol tiu de malpermesitaj aliraj kaj bruselaj ratoj (Fig. 2a, d). Kvankam la limigitaj aliraj kaj nuraj katoj ratoj konservis proksimume la saman ĉiutagan kalikan konsumadon (Fig. 2a, d), limaj aliraj ratoj akiris nur ~ 33% de siaj ĉiutagaj kalorioj el Chow (Fig. 2b, d), indikante ke ili disvolvis binge-similan manĝokonduton kaj konsumis ~ 66% de sia ĉiutaga konsumo de kalorioj dum sia 1-h-alira kunsido al la kafejo dieteto15 (Fig. 2d). Etend-aliraj ratoj akiris nur malgrandan frakcion (~ 5%) de ilia totala kaloria enspezo de chow (Fig. 2b); ili konsumis preskaŭ nur ekskluzive la manĝon de kafejo (Fig. 2d). La ŝanĝo en dietaj preferoj en la limigitaj- kaj etendaj aliraj grupoj ankaŭ reflektiĝis en rimarkinda pliiĝo de grasa konsumado kompare kun ĉaskurantaj ratoj (Fig. 2c kaj Suplementa Bildo. 2). Konsekvence kun antaŭaj raportoj, 16, tendenco de konsumado de la kafejo estas malpliigita kun la tempo en la etendaj aliraj ratoj. Ĉi tio povas reflekti la evoluon de toleremo al la manĝebleco de la manĝaĵoj provizitaj kiel parto de la kafejo dieteto tra la tempo. Tamen, la prefero por la manĝokvazo kontraŭ standarda manĝo restis konstante alta en ĉi tiuj ratoj (suplementa figuro 3). Ĉi tiuj datumoj montras, ke plilongigita sed ne limigita aliro al bongusta dika dieto kaŭzas toksomanion al rekompencoj deficitoj, troaĝado kaj perdo de homeostata energia ekvilibro. Male, limigita aliro al plaĉa manĝaĵo kaŭzas ekscesajn konsumajn modelojn, sed ne perturbas homeostatan energian ekvilibron nek cerban rekompencon. Tamen, estas eble ke limigita aliro al la kafejo dieteto por pli ol 40 sinsekvaj tagoj induktus signifan pezokvanton kaj interrompon de cerba rekompencfunkcio.

Figuro 2: Skemoj de konsumado en ratoj kun etendita aliro al kafejo dieto.

(a) Meza (± sem) ĉiutaga kaloria ingestaĵo en ratoj kun nur restoraciaj, limigitaj aliroj kaj etenditaj aliroj (aliro: F1,324 = 100.6, P <0.0001; tempo: F18,324 = 7.8, P <0.0001; aliro × tempa interagado: F18,324 = 4.6, P <0.0001; * P <0.05 kompare kun nur-manĝa grupo, post hoc-testo). (b) Meza ĉiutaga kaloria ingestaĵo (± sem) de manĝaĵo (aliro: F2,504 = 349.1, P <0.0001; tempo: F18,504 = 5.9, P <0.0001; aliro × tempa interago: F36,504 = 3.52, P <0.0001; * P <0.05 kompare kun nur-manĝa grupo, post hoc-testo). (c) Meza ĉiutaga kaloria ingestaĵo (± sem) de graso (aliro: F2,486 = 118.7, P <0.0001; tempo: F18,486 = 8.8, P <0.0001; aliro × tempa interago: F36,486 = 6.2, P <0.0001; * P <0.05 kompare kun nur-manĝa grupo, post hoc-testo). (d) Komparo de averaĝa (± sem) totala kaloria konsumado, kaj kalorioj konsumitaj ekskluzive de manĝaĵo, dum la tuta 40-taga periodo de aliro (aliro: F2,54 = 25.0, P <0.0001; kaloria fonto: F2,54 = 1235.2, P <0.0001; aliro × kaloria fontinteragado: F2,54 = 485.7, P <0.0001; *** P <0.001 kompare kun totalaj kalorioj en nur-manĝa grupo, ### P <0.001 kompare kun totalaj kalorioj en la sama grupo de ratoj, post hoc-testo).

Post 40 tagoj, ratoj ne plu rajtis aliri la plaĉan dieton, sed daŭre havis ad libitum aliron al norma laboratorio. Ni taksis rekompencajn sojlojn kaj manĝokonsumon ĉiutage dum ĉi tiu devigita 'abstinenca' periodo. La altoj en rekompencaj sojloj daŭris almenaŭ 2 semajnojn en la etenditaj ratoj kiam ili ne plu havis aliron al la plaĉa dieto (Fig. 3a). Ĉi tio kontrastas kun la relative pasemaj (~ 48 h) deficitoj en rekompenca funkcio raportitaj ĉe ratoj suferantaj abstinadon de memadministrita kokaino13. Ankaŭ estis konsiderinda malpliigo de kaloria ingestaĵo (Fig. 3b) kaj iom-post-ioma malpliigo de korpa pezo (Fig. 3c) ĉe etenditaj ratoj, kaj laŭ pli malgranda mezuro ĉe restriktitaj aliroj, dum ĉi tiu abstinenca periodo, konforme al antaŭaj raportoj11, 15. Post 14 d da abstinado, ratoj estis mortigitaj kaj elektrodaj lokoj estis determinitaj per krezila viola makulo (Fig. 3d).

Figuro 3: Persistaj rekompencoj misfunkcio kaj hipofagoj dum abstinado en ratoj kun etendita aliro al kafejo.

(a) Meza procenta ŝanĝo de bazaj rekompencaj sojloj (± sem) dum abstinado de plaĉa alta grasa dieto (aliro: F2,112 = 3.7, P <0.05; tempo: F4,112 = 2.3, P> 0.05; * P <0.05 kompare kun nur-grupo, post hoc-testo). (b) Averaĝa kaloria ingestaĵo (± sem) en la lasta tago de aliro al la dika dika bazo (bazlinio) kaj dum la 14 tagoj de abstinado kiam nur norma manĝaĵo estis disponebla (aliro: F2,168 = 41.7, P <0.0001 ; tempo: F6,168 = 65.6, P <0.0001; aliro × tempa interago: F12,168 = 38.3, P <0.0001; * P <0.05 kompare kun nur-manĝa grupo, post hoc-testo). (c) Ŝanĝo en averaĝa korpa pezo (± sem) kompare kun korpa pezo en la lasta tago de aliro al la alta grasa dieto (baza linio) kaj dum la 14-a de abstinado kiam nur norma manĝaĵo estis disponebla (aliro: F1,126 = 37.2, P <0.0001; tempo: F7,126 = 3.1, P <0.01; aliro × tempo-interago: F7,126 = 40.9, P <0.0001; * P <0.05 kompare kun nur-grupo, post-hoc-testo). (d) Histologia rekonstruo de la loko de BSR-stimulantaj elektrodoj en la flanka hipotalamo de nur-manĝaĵoj (trianguloj), alirlimigita (kvadratoj) kaj etenda aliro (cirkloj) ratoj.

Striatalaj D2R en obezaj ratoj: rolo en rekompencoj deficitoj

Ni sekve provis la hipotezon, ke trokonsumo de bongusta manĝaĵa dieto povus redukti striatan D2R-densecon, kontribuante al la disvolviĝo de toksomanio-kompensa hiposentemo. Nova kohorto de ratoj kun nur restoracio, kun aliro limigita kaj kun aliro plilongigita estis permesita aliro al la manĝo de kafejo ĝis estis statistike signifa pliigo de korpa pezo en la ratoj kun aliro plilongigita kompare kun la grupo nur kun manĝaĵoj (P <0.05 ; Fig. 4a). Striata esprimo de la laŭdire tre glikosilata (~ 70 kDa) membran-ligita formo de la D2R estis pli malalta ĉe la etenditaj aliroj ol ĉe la restriktitaj aŭ nur-manĝataj ratoj (Fig. 4b; vidu Interretajn Metodojn). Kiam ni dividis la ratojn en ĉiu alira grupo en du subgrupojn surbaze de meza disiĝo de korpopezoj (malpezaj aŭ pezaj), ni trovis klaran inversan rilaton inter korpa pezo kaj stria D2R-esprimo (Fig. 4a, c). Ni detektis neniujn statistike signifajn malpliiĝojn en esprimo de la unglikosilataj nematuraj (~ 39 kDa) kaj meze glikosilataj citoplasmaj (~ 51 kDa) formoj de la D2R (Suplementa Fig. 4) 17, indikante, ke stria D2R-esprimo ĉe etenditaj aliroj estas probable reguligita per post-transskribaj mekanismoj.

Figuro 4: Pezo-akiro estas inverse rilata al striatalaj D2R-niveloj.

(a) Nur-manĝaj, limigitaj aliroj kaj etenditaj ratoj estis subdividitaj en du grupojn laŭ alira kondiĉo surbaze de meza disiĝo de korpopezoj: malpeza (L) aŭ peza (H). (b) La tuta stria komplekso estis kolektita de ĉiuj ratoj kaj D2R-niveloj en ĉiu grupo mezurita per okcidenta blotado. La membrano-asociita D2R-bando estis solvita je 70 kDa, kaj la kontrolo pri ŝarĝo de proteinoj montriĝas sube (β-aktino, 43 kDa). Plenlongaj imunoblotoj estas montritaj en Suplementa Figuro 12. (c) Relativaj kvantoj de D2R en la striato de nur-manĝeblaj, limigitaj aliroj kaj etenditaj aliroj estis kvantigitaj per densitometrio (F2,6 = 5.2, P <0.05, ĉefa efiko de aliro; * P <0.05 kaj ** P <0.01 kompare kun nur-ĉ-L-grupo).

Poste, por testi la funkcian gravecon de redukto de la dieto induktita en stria D2R al cerba rekompencofunkcio, ni desegnis kaj validigis lentiviran vektoron por liveri mallongan harpinglan interferantan RNA (shRNA) por detrui D2R (Lenti-D2Rsh; Fig. 5 kaj suplementa figuro 5). Rekompencaj sojloj komencis pliiĝi je ratoj traktitaj kun Lenti-D2Rsh preskaŭ tuj post permeso de etendita aliro al la kafejo, dum sojloj de rekompenco restis nemodifitaj en etenditaj aliraj ratoj traktitaj per malplena lentiva vektoro (Lenti-kontrolo) dum relative mallonga periodo de aliro al la kafejo manĝo (14 d; Fig. 6a). La latentadoj de respondo ne estis ŝanĝitaj en ambaŭ grupoj de ratoj, montrante, ke ĉi tiu efiko ne estis malĉefa de deficito en taskoprezento (suplementa figuro 6). Rekompencaj sojloj ankaŭ ne ŝanĝiĝis en ratoj traktitaj per Lenti-D2Rsh aŭ Lenti-kontrolo, kiuj havis aliron al manĝaĵo nur dum la sama periodo (Fig. 6b).

Sojloj restis konstante levitaj dum ekstra 15 d abstinado kiam ĉiuj ratoj havis aliron nur al normala ĉifono (suplementa figuro 7). Nuligado de striatala D2R tial pliigis vundeblecon al dieto-induktita rekompenca hipofuncio sed ne ŝanĝis la bazlinian agadon de cerbaj rekompensaj sistemoj.

Figuro 5: Meznombro de lentivirusoj de esprimo striatala D2R.

(a) Grafika reprezento de la striataj areoj, en kiuj Lenti-D2Rsh estis troesprimita. Verdaj cirkloj en la maldekstra striata hemisfero reprezentas la lokojn, ĉe kiuj celis virusajn infuzaĵojn. Verda makulo en la dekstra striata hemisfero estas reprezenta imunokemia makulo por verda fluoreska proteino (GFP) el la cerbo de rato Lenti-D2Rsh. (b) Reprezenta imunobloto de la malpliigita esprimo D2R en la striato de ratoj Lenti-D2Rsh. Plenlongaj imunoblots estas montritaj en Suplementa Figuro 13. (c) Relativaj kvantoj de D2R en la striato de ratoj Lenti-control kaj Lenti-D2Rsh, kvantigitaj per densitometrio (* P <0.05 kompare kun la grupo Lenti-control, post hoc-testo ). (d) Infekto de gliaj ĉeloj en la striato per la vektoro Lenti-D2Rsh ne estis detektita. Verda makulo estas GFP de viruso; ruĝa estas la astrocita markilo glia fibrila acida proteino (GFAP); ĉelaj kernoj estas reliefigitaj per DAPI-makulado en bluo. Blankaj sagoj indikas lokalizitan areon de gliozo trovita nur ĉe la loko de virusa injekto en la striato kaj ne en la ĉirkaŭaj histoj, en kiuj la viruso disvastiĝis. Eĉ en ĉi tiu areo, neniu el la astrocitoj estas GFP-pozitiva. La flavaj sagoj en la pligrandigita bildo reliefigas la tipajn GFP-negativajn astrocitojn, kiuj estis detektitaj. (e) Altaj niveloj de neurona infekto en la striato de la vektoro Lenti-D2Rsh. Verda makulo estas GFP de viruso; ruĝa estas la neurona nuklea markilo NeuN; ĉelaj kernoj estas reliefigitaj per DAPI-makulado en bluo. La flavaj sagoj en la pligrandigita bildo reliefigas GFP-pozitivajn kaj NeuN-pozitivajn neŭronojn en la striato. (f) Pli altgrandiga bildo de virne infektita (GFP-pozitiva) neŭrono en la striato de ratoj Lenti-D2Rsh, kiu montras la tipajn morfologiajn trajtojn de mezaj dornaj neŭronoj.

Figuro 6: Kolapso de striatal D2R pliigas vundeblecon por rekompenci misfunkcion en ratoj kun etendita aliro al kafejo.

(a) Meza (± sem) procenta ŝanĝo de bazaj rekompencaj sojloj en ratoj Lenti-control kaj Lenti-D2Rsh, kiuj etendis aliron al la manĝejo de manĝejo dum 14 sinsekvaj tagoj (viruso: F1,156 = 5.9, P <0.05; tempo: F13,156 = 2.2, P <0.05; interago de viruso × tempo: F13,156 = 2.2, P <0.05; # P <0.05, interaga efiko). (b) Meza (± sem) procenta ŝanĝo de bazaj rekompencaj sojloj en ratoj Lenti-control kaj Lenti-D2Rsh, kiuj havis nuran aliron. (c) Averaĝa (± sem) kaloria konsumado de ratoj dum 14 tagoj da manĝaĵo nur aŭ plilongigita aliro (aliro: F2,28 = 135.6, *** P <0.0001). (d) Meza (± sem) plipeziĝo dum 14 d de manĝaĵo nur aŭ plilongigita aliro (aliro: F2,28 = 96.4, P <0.0001; *** P <0.001, ĉefa efiko de aliro).

Ni trovis, ke kaloria konsumado (Fig. 6c) kaj pezokreado (Fig. 6d) estis similaj en la Lenti-D2Rsh kaj respondaj Lenti-kontrolaj grupoj sub ĉask-nuraj aŭ etenditaj aliraj kondiĉoj (suplementaj Bukloj. 8 kaj 9). Tiel, striatala D2R-renverso ŝanĝis nek preferon por la kafejo manĝo nek totala kaloria konsumado kiam la agrabla manĝo estis libere havebla por konsumo.

Manĝo deviga en rokoj obezaj: rolo por striateca D2R

Ni poste testis la hipotezon, ke kompensa manĝo povus aperi ĉe ratoj kun plilongigita aliro al la manĝo de kafejo kaj ke deficitoj en striata D2R-signalado povus kontribui al ĉi tiu efiko. Nova kohorto de nur-manĝeblaj, limigitaj aliroj kaj etenditaj aliroj estis permesita aliro al la manĝejo per> 40 d ĝis statistike signifaj pezaj pliiĝoj okazis en la etenditaj ratoj (P <0.05 kompare kun nur-manĝaj ratoj; datumoj ne montrita). Ĉiuj tri grupoj de ratoj tiam rajtis nur 30 minutojn aliri ĉiutage al la manĝejo de manĝejo dum 5-7 tagoj en operanta ĉambro ĝis stabila konsumado estis atingita (difinita kiel <10% variado en ĉiutaga konsumado). Duono de la ratoj en ĉiu alira stato tiam estis elmetitaj al malpeza (kondiĉita stimulo) parigita kun liverado de piedŝokoj (punita grupo), dum la ceteraj ratoj en ĉiu grupo estis elmetitaj al la signalvorto en la foresto de pieda ŝoko (senpuna grupo) ). Dum la testtago, ni ekzamenis la efikojn de cue-malpeza ekspozicio sole sur plaĉa manĝa konsumo (Fig. 7; vidu Interretajn Metodojn). Ni trovis, ke averaĝa kaloria ingestaĵo dum la 30-min-bazaj kunsidoj estis pli alta en la ratoj kun nuraj kaj restriktitaj aliroj ol en la ratoj kun plilongigita aliro (Fig. 7a, b). Ĉi tio sugestas, ke la nur-manĝeblaj kaj restriktitaj aliroj ratoj al la plaĉa manĝaĵo dum la intermitaj 30-minutaj aliraj kunsidoj, reflektitaj en la fakto, ke ĉi tiuj ratoj konsumis ~ 40-50% de sia ĉiutaga kaloria konsumado, tipe ~ 100 kCal, dum ĉi tiuj kunsidoj (Fig. 7a, b). Kontraŭe, etenditaj alirratoj ŝajnas rezistemaj al disvolvi ĉi tiun ekscesan manĝokonduton, eble ĉar ilia historio de preskaŭ senlima aliro al la plaĉa manĝaĵo dum> 40 sinsekvaj tagoj establis manierojn, kiuj estis relative neflekseblaj ŝanĝi. En la testtago, ni observis neniujn statistike signifajn efikojn de repuŝa malpeza ripeto sur manĝaĵa konsumo en la senpunaj ratoj de la grupoj kun nur restriktitaj aŭ restriktitaj aliroj kompare kun konsumado dum la baza linio (Fig. 7a). La signalvorto sole tial ne havis motivan elstaraĵon. En punitaj ratoj, la ŝok-parigita signalvorto signife malpliigis bongustan manĝokvanton en la nur-manĝaĵaj kaj restriktitaj aliroj. Tamen, la signalvorto havis neniun efikon al bongusta manĝaĵo en la etenditaj ratoj, montrante, ke ilia konsumo estis nesentema al aversivaj mediaj signaloj antaŭdirantaj malfeliĉon. Bazlinia konsumado de energio en la etenditaj aliraj ratoj estis pli malalta ol tiu en la aliaj grupoj. Tamen, ĉar manĝokvanto dum similaj tempoperiodoj estis multe pli malalta (Fig. 7d), estas neverŝajne, ke ĉi tio reprezentas 'plankan efikon', kiu konfuzas niajn rezultojn. Kune niaj datumoj subtenas la ideon, ke sindeviga manĝa konduto povas aperi ĉe etenditaj ratoj en maniero analoga al la sindeviga kokaino-prenado vidita ĉe ratoj kun historio de etendita aliro al la drogo18.

Figuro 7: Compulsivo-kiel respondo por plaĉa manĝo.

(a) Averaĝa (± sem) plaĉa dieta konsumo en senpunaj ratoj dum la 30-min-bazaj kunsidoj kaj en la testo, kiam ratoj estis elmetitaj al neŭtrala kondiĉita stimulo, kiu antaŭe ne estis parigita kun malutila piedŝoko (aliro: F2,20 = 5.2, P <0.05; #P <0.05 kompare kun nuraj ratoj). (b) Averaĝa (± sem) plaĉa dieta konsumo en punitaj ratoj dum la 30-min-bazaj kunsidoj kaj en la testo, kiam ratoj estis elmetitaj al kondiĉita stimulo, kiu antaŭe estis parigita kun malutila piedŝoko (aliro: F2,21 = 3.9 , P <0.05; cue: F1,21 = 8.6, P <0.01; aliro × cue-interago: F2,21 = 4.7, P <0.05; * P <0.05 kompare kun konsumado dum la baza kunsido, #P <0.05 kompare kun nur manĝeblaj ratoj). (c) Averaĝa (± sem) plaĉa dieta konsumo dum la 30-min-bazliniaj kunsidoj kaj en la testtago en ratoj Lenti-control kaj Lenti-D2Rsh, kiuj antaŭe havis nur manĝan aŭ plilongigitan aliron al manĝejo de kafejo (cue: F1,26, 29.7 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <30 kompare kun konsumado dum la bazaj kunsidoj, post hoc-testo). (d) Averaĝa (± sem) manĝaĵa konsumo dum la 2-min-bazaj kunsidoj kaj en la testtago en ratoj Lenti-control kaj Lenti-D1,26Rsh, kiuj antaŭe havis nur manĝaĵon aŭ plilongigis aliron al manĝaĵa dieto (cue: F44.9 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <XNUMX kompare kun konsumado dum la bazaj kunsidoj, post hoc-testo).

Fine, ni ekzamenis la efikojn de la kondiĉigita stimulo kun puno sur manĝokvanto en la ratoj Lenti-kontrolo kaj Lenti-D2Rsh, kiuj antaŭe havis aliron nur por manĝi aŭ plilongigitan aliron al la manĝejo (ratoj el Fig. 6). Ni trovis, ke baza manĝa manĝebla manĝo dum la 30-min-bazaj kunsidoj estis simile alta (~ 40 kCal) en ĉiuj kvar grupoj (Fig. 7c). Krome, totala ĉiutaga manĝa konsumo (en la hejma kaĝo) estis simila inter ĉiuj kvar grupoj de ratoj dum la kondiĉoj kaj dum la testo (Suplementa Fig. 10). La 14 d de antaŭa aliro al la manĝo de kafejo do ne sufiĉis por bloki ekscesan manĝokonduton simile al tiu vidita en ratoj, kiuj havis> 40 d etenditan aliron al la manĝo de kafejo (Fig. 7a, b). La aversa cue-malpeza stimulo interrompis plaĉan manĝaĵon en ratoj Lenti-control kaj Lenti-D2Rsh, kiuj antaŭe havis nur manĝan aliron (Fig. 7c). Simile, la aversiva kondiĉigita stimulo interrompis plaĉan manĝaĵon en la Lenti-kontrolaj ratoj, kiuj antaŭe havis 14 d etenditan aliron al la manĝejo. Kontraŭe, la aversiva kondiĉita stimulo havis neniun efikon sur bongusta manĝa konsumo en la ratoj Lenti-D2Rsh, kiuj antaŭe havis 14 d plilongigitan aliron al la manĝejo (Fig. 7c). BSR-sojloj restis signife levitaj en ĉi tiuj ratoj kiam registritaj 48 h post la testo, dum sojloj restis stabilaj kaj senŝanĝaj en la aliaj tri grupoj de ratoj.

(Suplementa Bildo. 11). Kontroli, ke rezisto al kondiĉita stimulo-induktita subpremado de manĝebla manĝo en la Lenti-D2Rsh-etenditaj aliraj ratoj ne estis malĉefa al difektoj en klasikaj kondiĉoj, ni provis la efikojn de la aversita kondiĉita stimulo je konsumado de malpli palatema norma ŝink en ĉiuj kvar grupoj de ratoj. Kontraste al la miksaĵa konsumado de agrabla manĝo, ni trovis ke ĉiuj kvar grupoj de ratoj konsumis malmultan kapsikon (~ 2 kCal) dum la 30-minaj bazaj sesioj (Fig. 7d) kaj ke la manĝokutono estis interrompita en ĉiuj kvar grupoj de simila grando dum ekspozicio al la averso kondiĉita stimulo (Fig. 7d). Ĉi tiuj datumoj montras, ke detruado de striaj D2R akcelis signife la aperon de compulsivo-simila manĝado de plaĉa manĝaĵo, sed nur en ratoj kun historio de etendita aliro. Plie, ĉar compulsiva manĝo estis detektita nur en Lenti-D2Rsh-ratoj, kiuj havis levitajn BSR-sojlojn, dieto-induktita rekompenca hipofuncio povas esti necesa precedenco al la apero de deviga manĝaĵo.

diskuto

Facileco de aliro al manĝebla alta grasa manĝo estas konsiderata grava media faktoro de risko por obeseco19. Ni trovis, ke etendita aliro al tre agrabla kafejetala dieto rezultis en troo kaj pezokupo kune kun iom post iom levantaj BSR-sojlojn en ratoj. Ĉi tiu efiko sur BSR-sojloj povas esti klarigita per laŭgrade malpliigante respondo de cerbaj rekompensaj cirkvitoj, interpreto konsekvenca kun la fakto ke manĝa limigo kaj malplipeziĝo povas pliigi 20, dum akutaj troaj nutraĵoj povas pasive malkreski. Ĉi tiu trovo reprezentas etendon de laboro montranta, ke akuta troa nutraĵo de ratoj tra intragastriza nutra tubo, NUMX, kaj gastra distordo aŭ intravena glukagona infuzaĵo, kiu imitas postprandan sation, NEXX, 21, malpliigas respondon por rekompensi laterajn hipotalajn BSR kaj pliigas aversion-similajn respondojn al la stimulo21. Antaŭaj laboroj ankaŭ montris, ke ripete forrajtantaj ratoj tra intragastraj tuboj ĝis ilia pezo kreskis je ~ 22 g simile malkreskas indicoj de respondo por BSR, efiko kiu persistas ĝis korpa pezo normigis 23. Kiel en ĉi tiuj trovoj en ratoj, reagado en katoj por laterala hipotalama BSR estis malhelpita per antaŭa manĝo al satigado 24, montrante ke interagoj inter cerba rekompencfunkcio kaj metabola stato estas konservitaj kaj tiel probable okazas ankaŭ en homoj. Facileco de aliro kaj sekvo manĝado de kafejetaj dietoj ĉe homoj estas konsiderata grava media kontribuanto al la nuna obeseco-epidemio en okcidentaj socioj. Niaj datenoj montras, ke premiita hipofuncio ekestas en ratoj, kiuj voleme manĝas pli bongustan kafejetan dieton simila al tiu konsumita de homoj kaj ke ĉi tiu efiko iom post iom malpligrandiĝas dum ili akiras pli da pezo. Notinde, ĉiuj ratoj kun rekompenciĝaj altecoj ≥25% havis BSR-elektrodojn situantajn ene de ~ 200 μm de la friziko dorsolaterale. La sentiveco de rekompencaj neŭronoj en ĉi tiu areo estas pliigita de manĝa limigo en maniero kiu estas sentema al la graso-derivita hormono leptino, kaj ĉi tiu cerba regiono estas konsiderata grava substrato por manĝo rekompencita. La cerbaj cirkvitoj, kiuj reguligas manĝaĵajn hedonikojn, estas do malhelpataj per afiŝado de allogaj signaloj, kiuj antaŭdiras satecon, kongrue kun lastatempaj homaj bildigaj studoj, kiuj montras, ke distraĵa distordo23 kaj la tripotenca faktora peptido YY26-19 (PYY) 20 modulas la aktivecon de regionoj de la cerbo. implikita en kompensoproceso. Aldone, rekompensaj sistemoj ankaŭ malhelpas troan pezokvanton. Lastatempaj raportoj indikas, ke cirkulanta leptino, ŝlosila reguliga de energia ekvilibro, povas penetri en cerbajn ŝtofojn kaj malhelpi la agadon de rekompenscircitojNUMX, 500, 27, 28.

Rekompencaj deficitoj en sobrepeso-ratoj povas reflekti kontraŭadaptajn malpliiĝojn en la baza linio-sentemo de cerbaj rekompencaj cirkvitoj por kontraŭstari ilian trostimulon per plaĉa manĝaĵo. Tia dieto-induktita rekompenca hipofunkcio povas kontribui al la disvolviĝo de obesidad per pliigo de la instigo konsumi dietojn 'obesogenajn' kun rekompenco por eviti aŭ mildigi ĉi tiun staton de negativa rekompenco6, 32. Ĉi tio povus kaŭzi la hipofagion, kiun ni observis en plilongigita aliro ratoj kaj malplialtagrade en restriktitaj alirratoj kiam la bongusta manĝaĵo estis retirita kaj nur la malpli bongusta manĝaĵo estis havebla. Tia scenaro ankaŭ kongruas kun datumoj de studoj pri homaj cerbaj bildoj, en kiuj malakrigita aktivigo de la striato responde al tre plaĉa manĝo, precipe ĉe individuoj kun genetikaj polimorfismoj pensataj malpliigi striatan D2R-esprimon, estas asociita kun longdaŭra plipeziĝo4. Estis neklare, ĉu tia rekompenca hiposentemo ĉe grasaj individuoj manifestiĝas antaŭ la disvolviĝo de obezeco kaj rilatas nur al genetikaj faktoroj ('sindromo de rekompenca manko') aŭ ĉu tromanĝado povas kaŭzi interrompon en rekompenca prilaborado. Niaj datumoj pruvas, ke plilongigita aliro al bongustaj alt-energiaj manĝaĵoj kaj postaj tro manĝantaj rektaĵoj rekompensas sentemon kaj povas do reprezenti gravan hedonan mekanismon, kiu antaŭenigas la disvolviĝon de obezeco. Simila rekompenca misfunkcio al tiu raportita ĉi tie ĉe grasaj ratoj ankaŭ estas detektita ĉe ratoj kun historio de plilongigita aliro al intravejna kokaino aŭ heroina memadministrado, sed ne ĉe tiuj kun historio de limigita aliro12, 13, 14. Krome, la transiro de hazarda ĝis sindeviga serĉado de drogoj estis proponita rezulti de provo mildigi la konstantan staton de malpliigita rekompenco induktita de ĉi tiu drogo-induktita rekompenca misfunkcio12, 32, 33. Tiel niaj datumoj indikas, ke obezeco kaj drogmanio povas dividi subajn hedonajn mekanismojn.

La malreguligo de striatala D2R-esprimo estas rimarkinda neuroadaptive respondo al troa konsumado de agrabla manĝo. Fakte, reduktoj en stria D2R-denseco vidiĝas en individuoj de sobrepeso4, 34 kaj roduloj35, 36. Male, individuoj kun anorexia nervo levis striatan D2R37, kaj perdo de pezo en obezoj post bariatria kirurgia interveno estas asociita kun levita striatala D2R-denseco28. La polimorfismo de la genoj alelo nomita TaqIA A1-alelo rezultigas malpliiĝon de striatala D2R-denseco, kaj individuoj gastigantaj ĉi tiun alelon estas tro-reprezentitaj en malabundaj populacioj. La TaqIA alelo ankaŭ pliigas vundeblecon al alkoholo, opiozoj kaj psikomotora stimulado addiction4. Reduktoj en striatala D38R-denseco okazanta aŭ per konstituciaj genetikaj faktoroj aŭ sekve de troaĵo povas tial kontribui al la neŭobiologiaj mekanismoj de obezeco. Ni trovis, ke striataliveloj de la izoformo 2 kDa D70R, pensitaj por reflekti la membranan D2R, estis inverse rilataj al korpa pezo en ratoj de la nuraj ĉaskaptistoj, limigitaj aliraj grupoj kaj etenditaj aliroj (Fig. 2). Nuligo de striatala D4R-esprimo, plej elstara en la dorsolateral-striatum (Fig. 2), kaŭzis, ke BSR-sojloj kreskas preskaŭ tuj post eksponiĝo al la kafejo. Malpliiĝoj en striatala D5R-esprimo tial rapide akcelis la ekaperon de rekompenshipofunkto en ratoj kun etendita aliro al tre bongusta manĝaĵo, rezulto kongrua kun homaj cerbaj bildaj datumoj, kiuj indikas, ke deficito en striateca D2R-denseco kontribuas rekompensi hipofunkton en obezaj individuoj2.

Tri trajtoj de la ratoj Lenti-D2Rsh ankaŭ notindaj. Unue, kvankam striatal D2R-derompaĵo kombinita kun etendita aliro al la agrabla dieto rezultis en levado de BSR-sojloj, estis neniuj diferencoj en kaloria konsumado aŭ pezo en tiuj ratoj kompare al kontrolaj ratoj. Ĉi tio povus reflekti tiun fakton, ke ratoj nur havis aliron al la manĝoĉambro; pli longaj periodoj de aliro povus rezultigi pli altan pezon tra la tempo, simile al la pli alta susceptibilidad al pezo vidita ĉe homoj kun deficito en striataj D14R-signaloj2. Tamen, la avantaĝo de limigi aliron al la manĝo-manĝo al nur 4-d estas, ke la detruaj ratoj kun etendita aliro estis la sola grupo kiu montris levitajn BSR-sojlojn, kaj tio permesis al ni taksi la eblan rolon de rekompenca hipofuncio en la evoluo de compulsiva manĝado (vidu sube). Due, BSR-sojloj restis stabilaj kaj senŝanĝaj en la frapantaj ratoj, kiuj havis aliron al kubaĵo nur. Ĉi tio indikas, ke reduktita striatala D14R-esprimo sole ne estis sufiĉa por indukti rekompensan hiposensibilecon; anstataŭe, ĝi ŝajnis interagi kun trookonsumo de agrabla manĝo por akceli la aperon de ĉi tiu stato de reduktita rekompenco sentemo. Aliaj adaptajn respondojn en cerbaj rekompensaj cirkvitoj tial povus estigi rekompensan hiposensibilidad en ratoj kun etendita aliro al la kafejo. Konsiderante ĉi tion, ni rimarkas, ke la agonisto D2R-bromocriptino reduktas cirkulajn nivelojn de leptin2, kaj leptino malhelpas manĝadon almenaŭ parte per inhibicio de la striataj regionoj kiuj kontrolas hedonajn respondojn al manĝaĵoNNX, 39, 3. Tiel, estas eble ke malreguligo de striatala D30R en respondo al kreskanta korpa pezo pliigas leptinan signaladon kaj tiel plialtigas la inhibiciajn efikojn de ĉi tiu adipokino sur cerbaj rekompensaj sistemoj. Fine, ni rimarkas, ke ni celis niajn lentivirajn vektorojn al la dorsolateral-striatumon. Ĉi tio estis ĉefe pro teknikaj kialoj, ĉar flanka lokigo de kanuleoj por liveri virusan en la striaton ebligis al ni ankaŭ akomodi la loĝantan hipotalaman stimulantan elektrodon por BSR-limo. Tiel, estas eble ke celado de D31R por forfalo en aliaj areoj de la striato, precipe la dorsomediaj kaj ventraj areoj (kerno accumbens kerno kaj ŝelo), povus havi levitajn BSR-sojlojn eĉ se mankas la bongusta dieto.

La dorsolatera striato estis tre implikita en stimula-responda kutima lernado, kiel ĝi reflektas en la disvolviĝo de konsuma konduto, kiu estas nesentema al malplivalorigo per antaŭa nutrado al satigo aŭ parigo kun malutilaj stimuloj40. Celante ĉefe la dorsolateral striatum, ni eble detruus populaciojn de D2R, kiuj reguligas la vundeblecon de la rato al la disvolviĝo de sindeviga manĝo. Konforme al rolo por striataj D2Rs en sindevigaj kondutoj, la alelo TaqIA de la homa geno DRD2 – ANKK1-geno - kiu rezultigas malaltan striatan D2R-densecon5, malakrigas strian aktivigon responde al bongusta manĝaĵo4 kaj altigas vundeblecon al obezeco4 - ankaŭ estas asociita kun deficitoj en lernado eviti agojn kun negativaj konsekvencoj41. Perdo de inhibicia kontrolo pri konduto, kiu povas havi negativan rezulton, estas karakterizaĵo de kaj obezeco kaj drogmanio, en kiuj konsumaj kondutoj daŭras malgraŭ negativaj sociaj, sanaj aŭ financaj konsekvencoj. Koka-manĝa konduto ĉe ratoj kun historio de vasta drogokonsumo povas fariĝi nefleksebla kaj imuna al interrompo de aversiva kondiĉita stimulo, kiu antaŭdiras negativan rezulton (piedŝoko) 18. Simile, musoj, kiuj antaŭe havis aliron al bongusta dika dieto, pasigos pli da tempo en aversiva medio (hele lumigita) por akiri la bongustan manĝon ol musoj, kiuj ne spertis la dieton42. Ni trovis, ke bongusta manĝa konsumo en ratoj kun plilongigita aliro al la manĝo de manĝejo estis simile nesentema al aversiva kondiĉita stimulo. Konsekvence kun rolo por striataj D2R-oj en ĉi tiu efiko, sindeviga manĝo troviĝis en la strataj D2R-frapaj ratoj, kiuj antaŭe havis 14 d-plilongigitan aliron al la manĝo de kafejo sed ne en la grupoj de kontrolo. De neŭrocirkvita perspektivo, plilongigita aliro al bongusta manĝaĵo povus deĉenigi plastikecon en kortikostriataj vojoj, tiel farante bestojn pli vundeblaj al la disvolviĝo de kompensaj kondutoj, kun deficitoj en striata D2R-signalado pliboniganta ĉi tiun procezon. Efektive, reduktita striata D2R-denseco en grasaj individuoj estas rilatigita kun reduktita metabolo en antaŭfrontaj kaj orbitofrontaj kortikaj areoj43, kiuj efikas inhibician kontrolon pri konduto44.

Notinde, simila konsumado de agrabla manĝaĵo estis detektita nur en la mortiga rato, kiu antaŭe etendis aliron al la kafejo, ne en kontrolaj ratoj, kiuj etendis aliron al la kafejo, dum la sama periodo, nek en renomaj ratoj. nur-alirilo. La ĉefa diferenco inter la knockdown ratoj kun antaŭa etendita aliro kaj al la aliaj grupoj estis iliaj konstante levitaj BSR sojloj. Ĉi tio povus reflekti komunajn neŭobiologiajn originojn de rekompenca hipofuncio kaj la apero de compulsivo-simila manĝo, kiuj estas temporalmente koincidantaj sed sendependaj fenomenoj. Alternative, dieto-induktita rekompena hipofuncio povus funkcii kiel substrato por negativa plifortikigo kiu faciligas la evoluon de compulsiva-simila manĝo14, 32, 33. Kio ajn estas la subaktivaj mekanismoj, niaj trovoj montras, ke la toksaj kompulsivaj respondoj por agrabla manĝo povas aperi en obezaj ratoj, kaj indikas, ke deficito en striatala D2R-signalado pliigas vundeblecon al la disvolviĝo de ĉi tiu konduto.

Resume, ni trovis ke troa stimulo de sistemoj de rekompenco de cerbo per troa konsumo de manĝebla, densa manĝo induktas profundan staton de rekompenco hiposensibilidad kaj la disvolviĝo de simila manĝo. Ĉi tiuj reagoj en la kondutoj desadaptadas en ratoj obesas probable ŝprucas de la deficitoj induktitaj de la dieto en la señalización striatal D2R. Overconsumption de medikamentoj de fitrakto simile malpliigas striatal D2R denseco, induktas profundan staton de rekompenco hipofunción kaj deĉenigas la aperon de compulsive-simila drogaj kondutoj. Niaj eltrovoj sekve subtenas antaŭan laboron4, 19, 42, 45, 46, 47 indikante, ke obezeco kaj drogodependeco eble naskiĝas de similaj neuroadaptivaj respondoj en certaj rekompensaj cirkvitoj.

metodoj

Ratoj.

Masklaj Wistar-ratoj pezantaj 300-350 g komence de la eksperimentoj estis akiritaj el Charles River. Sur alveno, ratoj estis loĝigitaj individue laŭ konstanta temperaturo dum 12-h-malpeze-malluma ciklo (lumas ĉe 2200 h). Oni permesis al ratoj aliri libere al norma laboratorio kaj akvo dum la eksperimento. Ĉiuj procedoj estis aprobitaj fare de la Institucia Komitato pri Animal-Zorgoj de Scripps Florido, kaj ratoj estis traktitaj laŭ la gvidlinioj prezentitaj de la Naciaj Sanaj Institutoj pri la principoj de bestaj prizorgoj.

Kirurgiaj proceduroj.

Ratoj preparitaj per BSR-stimulaj elektrodoj unue estis anestezitaj per enspiro de 1-3% isoflurano en oksigeno kaj poziciigita en stereotoksika kadro (Kopf). Bipolaj BSR-elektrodoj (11 mm longa) estis enplantitaj en la malantaŭa flanka hipotalamo (anteroposterior, −0.5 mm de bregma; meznivelaj, ± 1.7 de mezaj linioj; dorsoventra, 8.3-mm de daŭro; incisiva stango estis adaptita al 5 super la interaural linio ) 47. Ratoj kiuj ricevas virininjektojn ankaŭ estis preparitaj per duflankaj gvidaj kanuloj (23-mezurilo, 14 mm longa) super la striato (anteroposterior, 2.8 mm de bregma; meznivelaj, ± 3.1 de mezaj linioj; dorsoventra, −2.4 mm de dura) 48 kaj plenigitaj kun 14-mm stylets. Kvar neoksideblaj kraniaj ŝraŭboj kaj dentala akrila tenis la elektrodon kaj kanuleojn surloke. La kirurgia vundo estis traktita per aktuala antibiotiko unufoje por 12 h por 5 d post la kirurgio. Ratoj permesis al 7-10 d resaniĝi post kirurgio kaj tiam estis trejnitaj en la BSR-sojlaj procedoj.

Proceduro de BSR.

Ratoj estis trejnitaj por respondi por BSR-stimulado laŭ diskreta-kurenta-sojlaj procedoj similaj al tiuj priskribitaj aliloke10, 14. Mallonge, aktualaj niveloj de BSR variis laŭ alternaj descendaj kaj suprenirantaj serioj en paŝoj 5-μA. En ĉiu testa sesio, kvar alternaj malsuprenirantaj / suprenirantaj serioj estis prezentitaj. La sojlo por ĉiu serio estis difinita kiel la mezpunkto inter du sinsekvaj nuna intensecoj por kiuj ratoj reagis en almenaŭ tri el la kvin elprovoj, kaj du sinsekvaj aktualaj intensecoj por kiuj ratoj ne respondis en tri aŭ pli el la kvin provoj. La totala sojlo de la sesio estis difinita kiel la meznombro de la sojloj por la kvar individuaj serioj. Ĉiu testa sesio daŭris proksimume 30 dum minimuma tempo. Stabilaj BSR-sojloj estis difinitaj kiel ≤10% variado en sojloj super 5 sinsekvaj tagoj, kutime establitaj post 10-14 d de trejnado. La responda latencia por ĉiu testo sesio estis difinita kiel la meza respondo latenta de ĉiuj provoj dum kiuj pozitiva respondo okazis.

Viral pakado kaj livero.

Mallonga harpingla RNA estis liverita kaj konstituite esprimita per la vR-sistemo pRNAT-U6.2 / Lenti (GenScript). Viraj eroj estis preparitaj laŭ la protokolo de la fabrikanto. Mallonge, ĉeloj HEK 293FT estis transfektitaj per vektoro enhavanta la ŝARN-enigaĵon (5′-GGATCCCGCGCAGCAGTCGAGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCTCGACTGCTGCGCTTTTTTCTCACACTCGAG-3 ′) aŭ la malplenan vektoron, plus ViraPower Packaging Mix (Invitrogen) anstataŭe de 72 h (24 h). Supernatant tiam estis kolektita kaj koncentrita per ultracentrifugado (76,755g, Beckman Coulter SW 32 TI-rotoro., 90 min., 4 ° C) kaj virusa titolo estis determinita per fluoreskec-aktivigita ĉela ordigo laŭ la instrukcioj de la fabrikanto. Viruso estis alikvotita kaj stokita en lumprotektitaj skatoloj je −80 ° C ĝis uzo.

Ratoj kun stabilaj BSR-sojloj ricevis duflankajn viralinjojn ĉe tri lokoj en la striato de ĉiu cerba hemisfero (2 μl por injekto, 1 μl min − 1, 1 min inter injektoj, entute ses injektoj per rato). Ratoj estis permesitaj almenaŭ 2-3 d reakiro de intrastriatal injektoj antaŭ ol BSR sojlo taksado estis rekomencita. Ĉiutaga BSR-sojlo-takso daŭris por 33-d post kiam virvizaj injektoj certigis ke maksimuma stia D2R-renverso estis atingita antaŭ permesi al ratoj aliri al la kafejo. Ekzistis neniuj diferencoj en BSR-sojloj inter la Lenti-kontrolo kaj Lenti-D2Rsh-ratoj dum tiuj 33 d (datenoj ne montritaj).

Imunoblotado.

Ratoj estis murditaj proksimume 1 h post sia regula planita aliro al la kafejo, kaj cerboj estis rapide forigitaj. Cerbo-sekcioj de ~ 1-2 mm dikeco estis preparitaj uzante koronalan cerban matricon (1-mm-tranĉa intervalo; Plasto Unu) sur glacbloko, kaj histotondoj de dorsa striato (bregma: ~ 2.2 al −0.26 mm) estis prenitaj. Batalkoloraj punĉiloj rapide kolektiĝis, fermiĝis kaj konserviĝis ĉe −80 ° C ĝis uzo. Individuaj specimenoj estis degeligitaj sur glacio kaj egalaj kvantoj de striateca histo estis kunigitaj surbaze de pezo-dependa meza dividado de aliraj grupoj (7-10-ratoj per akvejo). Ŝtofo estis resuspendita en 500 µl glacia RIPA bufro (Thermo Scientific) enhavanta natran ortovanadaton, fosfatasejn koksajn inhibitorojn 1 kaj 2 (Sigma-Aldrich), leupeptin kaj pepstatin antaŭ homogenigo. Tekizitaj lizatoj estis boligitaj por 10-min en provaĵa bufro kaj ŝarĝitaj sur 4% -20% aŭ 10% Tris-glikina SDS-ĝeloj (Invitrogen). Proteino estis transdonita al nitrocelulose-membranoj, blokita por 1 h ĉe ~ 23-25 ° C (5% sengrasa seka lakto kaj 0.2% Tween-20 en PBS, pH 7.4), kaj kovita en primara antikorpon dumnokte ĉe 4 ° C. La jenaj primaraj antikorpoj diluiĝis en bloka solvo: D2R-muskla monoclonal (Santa Cruz, 1: 100) aŭ β-actina muskla monoclonal (Santa Cruz, 1: 200). Kemiolumineska ECL-reakciilo estis aldonita post kovado de rafaj peroksidaj-konjugacitaj duarangaj antikorpoj (Amersham, 1: 2,000). La matura membrano-asociita formo de D2DR (~ 70 kDa) 17, 49 estis normaligita al protein-ŝarĝa kontrolo (β-actino; 43 kDa) kaj kvantigita per densitometrio uzante NIH Image J-programon.

Analizo inmunoquímico.

La ratoj estis anestezitaj kaj transĉerŝe perfuzitaj kun 4% paraformaldehído en PBS (pH 7.6). Cerboj estis forigita, postfiksita subite kaj stokita en sakarozo (30% solvo en PBS, pH 7.4) por almenaŭ 72 h. La sekcioj de frostaj histoj (30 μm dikeco) estis kolektitaj de mikrotomo kaj blokita (3% BSA, 5% normala kapra serumo kaj 0.3% Triton X-100 en PBS) por 1 h ĉe ~ 23-25 ° C. La jenaj primaraj antikorpoj estis aldonitaj al la bloka solvo kaj kovataj dum la nokto ĉe 4 ° C: koksaj policlonaj al GFP (Abcam, 1: 1,000); kuniklo monoclonal al GFAP (Millipore, 1: 1,000); muso monoclonal al NeuN (Millipore, 1: 1,000). Sekcioj estis kovataj per fluoreska-tinkturo-konjugitaj malĉefaj antikorpoj ĉe ~ 23-25 ° C: kontraŭ-koko-488-nm-tinkturo (Jackson ImmunoResearch, 1: 1,000), kontraŭ-kuniklo-594-nm tinkturo (Invitrogen, 1: 1,000 ), kaj kontraŭ-musa-594-nm tinkturo (Invitrogen, 1: 1000). Sekcioj estis muntitaj kun Vectashield-muntadaj amaskomunikiloj enhavantaj DAPI (Vektoraj Laboratorioj) kaj kovrilo. Bildoj estis uzataj per mikroskopo de fluorescencia Olympus BX61 (objektivo × 2) aŭ mikroskopo confocal de Olympus (objektivoj × 10 kaj × 100).

Proceduro de nutrado.

Ratoj estis loĝigitaj individue sur paperaj litaĵoj (alfa almohadeloj; Paŝtistaj Fakoj Artikoloj) por malebligi manĝaĵajn produktojn esti malpurigita per lozaj materialoj. La manĝokvazo konsistis el lardo, kolbasoj, fromaĝa kuko, funebra kuko, frostado kaj ĉokolado, kiuj estis individue pesitaj antaŭ esti havebla al la ratoj. La manĝeroj pri manĝoĉambro estis liveritaj en malgrandaj metalaj ujoj. Ĉiuj manĝaĵoj, inkluzive de normala laboratorio-kadavraĵo, estis denove pesitaj post kiam la nutra sesio finiĝis. Kaloria konsumado de la diversaj makronutriuloj estis kalkulita uzante la nutran informon provizitan de la fabrikanto.

Forigo-induktita subpremado de manĝokonduto.

Manĝigaj proceduroj okazis en son-mildigitaj operantaj ĉambroj identaj laŭ dimensioj al tiuj uzataj en la BSR-eksperimentoj. Ratoj estis metitaj en operacian ĉambron kaj havis aliron al la manĝejo aŭ manĝaĵo dum 30 min. La manĝaĵoj estis liveritaj en malgrandaj metalaj ujoj. Ĉiuj manĝaĵoj estis pesitaj antaŭ kaj post manĝadsesioj, kiuj estis aranĝitaj dum la normala manĝigperiodo de la ratoj. Chow-konsumo estis taksita per konsumo de 45-mg-manĝaj buletoj identaj laŭ komponaĵo al chow provizita en la hejmaj kaĝoj de ratoj. Ratoj tiam rajtis 30-minutan aliron ĉiutage al la manĝaĵa dieto ĝis stabila konsumado estis atingita (difinita kiel <10% variado en ĉiutaga konsumado), postulante 5-7 tagojn. Post stabiligo de bongusta manĝaĵo dum ĉi tiu baza linio, ratoj en ĉiu alira stato estis asignitaj al du grupoj: punitaj (tiuj, kiuj ricevis piedŝokon) kaj senpunaj (ne ricevis piedŝokon). Ratoj estis tiam submetitaj al kvar kondiĉaj kunsidoj dum sinsekvaj tagoj en la sama operanta ĉambro, en kiu ili antaŭe havis aliron al la plaĉa manĝo. Dum la 30-min-kondiĉaj kunsidoj, ekbruligita lumo (kondiĉita stimulo) estis aktivigita dum 10 min, malŝaltita dum 10 min, kaj poste reŝaltita dum 10 min. Punitaj ratoj ricevis piedŝokon nur dum prezento de la lumo (0.5 mA dum 1.0 s; 10 stimuloj kun ~ 1-minutaj intervaloj). La senpunaj ratoj ricevis la signalon kiel sammaniere, sed sen liverado de piedŝoko. En la testtago, la tagon post la fina prepariteca kunsido, ratoj en la punitaj grupoj ricevis intermitan piedŝokon (entute kvin stimuloj) parigitaj kun aktivigo de la signallumo dum 5 min. La senpunaj ratoj denove estis eksponitaj al la signalvorto en la foresto de piedŝoko. Post la 5-minuta punperiodo, al ĉiuj ratoj estis permesita aliro al la bongusta manĝaĵo por 30-min-sesio kun la kondiĉigita stimulo aktive intermite (10-min-ekbruligita lumo, 10-min-brila lumo malŝaltita, 10 min-kuna lumo ŝaltita).

Statistikaj analizoj.

Bazlinia rekompencaj sojloj estis difinita kiel la meza sojlo valoro por la 5 d antaŭ aliro al la kafejo-dieto por ĉiu subjekto. Rekompencaj sojloj esprimis kiel la procentan ŝanĝon de la baza sojlo. Datumoj pri procento de bazaj sojlaj valoraj valoroj, pezo, konsumo de kalorioj kaj kaloria konsumo el graso estis analizitaj per du-faktoroj, ripetaj mezuroj analizo de varianco, kun aliro (nur brusto, limigita aliro aŭ etendita aliro), fonto de kalorioj ( dieto normala por kafejo aŭ kafejo), viruso (Lenti-kontrolo aŭ Lenti-D2Rsh) kaj signo (parigita aŭ neparlata kun puno) kiel la inter-submetataj faktoroj kaj tempo kiel la entjera faktoro. Kiam konvene, ĉefaj efikoj en la analizo de varianco estis plue analizitaj de Bonferroni post hoc testoj. Ĉiuj statistikaj analizoj estis faritaj per programaro pri GraphPad Prism.

Referencoj

Referencoj

Korespondado al:

· Paul J Kenny ([retpoŝte protektita])