Diabetologio. 2017; 60 (8): 1502 – 1511.
Eldonita en linio 2017 Majo 20. doi: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1abstrakta
Celoj / hipotezo
Oglutado de dietaj grasoj kaŭzas obezecon en homoj kaj ronĝuloj. Lastatempaj studoj ĉe homoj kaj ronĝuloj pruvis, ke toksomanio al grasoj dividas komunan mekanismon kun toksomanio al alkoholo, nikotino kaj narkotado koncerne misfunkcion de cerbaj rekompencaj sistemoj. Oni emfazis, ke alta grasa dieto (HFD) mildigas dopaminan D2-receptoron (D2R) signalantan en la striatumo, pivota reguligilo de la cerba rekompenca sistemo, rezultigante hedonan suferadon. Ni antaŭe raportis, ke la bruna rizo-specifa bioaktiva γ-oryzanol mildigis la preferon por HFD per hipotalamo. Ni do esploris la eblecon, ke γ-oryzanol modulus funkciadon de la cerba rekompenca sistemo en musoj.
metodoj
Viroj C57BL / 6J musoj nutritaj de HFD estis buŝe traktitaj kun γ-oryzanol, kaj striaj niveloj de molekuloj implikitaj en D2R-signalado estis taksitaj. Oni ekzamenis la efikon de γ-oryzanol sur DNA-metilado de la iniciatinto de D2R kaj postaj ŝanĝoj en preferoj por dieta graso. Krome, la efikoj de 5-aza-2′-deoxycytidine, potenca inhibilo de DNA-metiltransferasoj (DNMToj), sur manĝa prefero, D2R-signalado kaj la niveloj de DNMTs en la striatumo estis esploritaj. La malhelpaj efikoj de γ-oryzanol sur la aktiveco de DNMTs estis enzimatie taksitaj in vitro.
rezultoj
En striato de musoj nutris HFD, la produktado de D2Roj malpliiĝis per pliigo de metilado de DNA de la iniciatema regiono de la D2R. Parola administrado de γ-oryzanol malpliigis la esprimon kaj aktivecon de DNMToj, tiel restarigante la nivelon de D2Rs en la striatumo. Farmacologia inhibicio de DNMT-oj per 5-aza-2′-deoxycytidine ankaŭ plibonigis la preferon por dieta graso. Konsentite kun ĉi tiuj trovoj, enzimataj in vitro-provoj pruvis, ke γ-oryzanol inhibicias la agadon de DNMTs.
Konkludoj / interpreto
Ni pruvis, ke γ-oryzanol plibonigas hipermetiladon de HFD-induktita de HFD de la iniciatema regiono de D2R en la striato de musoj. Nia eksperimenta paradigmo emfazas γ-oryzanol kiel promesan kontraŭobezian substancon kun la apartaj posedaĵoj de esti nova epigenetika modulanto.
Elektronika suplementa materialo
La interreta versio de ĉi tiu artikolo (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) enhavas suplementan materialon, sed reviziitan, aperigitan de rajtigitaj uzantoj.
Enkonduko
Overeado ĉe obesaj individuoj dividas, almenaŭ parte, komunajn mekanismojn kun toksomanio al alkoholo, nikotino kaj narkotiko [1]. Tiel kiel la hipotalama kaj hormona regulado de la apetito, la cerba rekompenca sistemo, precipe dopamina ricevilo-signalado, estas proksime rilata al toksomania aŭ hedonika nutra konduto [2]. Antaŭa studo ĉe ratoj montris, ke frapado de la stria dopamina D2-ricevilo (D2R) de lentivirus-mediata mallonga hararo enmiksi RNA rapide induktis toksomaniulajn rekompencajn mankojn kaj devigan similan manĝaĵon serĉantan [3]. Pro la reduktita D2R-denseco, la dorsal-striatumo malpli respondas al manĝaĵa rekompenco kompare kun malgrasaj kontrolgrupoj en obesaj homoj kaj ronĝuloj [3-5]. Konforme al ĉi tiu nocio, la TaqIA alelo de la ANKK1 gena lokuso (kodita DRD2 / ankyrin-ripeto kaj kinasa domajno enhavanta 1), kiu malpliigas striatal D2R-produktadon, estas asociita kun obesa fenotipo en homoj [6], dum la efikoj de perdo de pezo post biatra kirurgio estas asociitaj kun levita striatala D2R-denseco [7]. Ĉi tiuj datumoj forte sugestas la gravecon de striata D2R kiel nova terapia celo por la kuracado de obesidad. Tamen, iuj drogoj, kiuj estis disvolvitaj, kiuj agis sur la cerba rekompenco-sistemo, kaŭzis konsiderindajn adversajn efikojn, inkluzive gravajn psikiatriajn problemojn, rezultigante ilian eventuale retiriĝon de klinikoj [8].
Epigenetikaj modifoj estas kritikaj ne nur por disvolviĝo kaj diferencigo, sed ankaŭ ĉar ili ekestas rezulte de mediaj ŝanĝoj, inkluzive de dieto kaj vivstilo [9]. DNA-metilado estas ĉefa epigenetika evento por stabileco de gena esprimo [9]. En ratoj, patrina ekspozicio al alta dika dieto (HFD) intergeneracie ŝanĝas DNA-metiladon ene de la centra rekompenca sistemo en la naskado, kondukante al superkonsumo de HFD fare de la idoj [10]. Precipe, DNA-metiltransferasoj (DNMToj) ludas kritikajn rolojn en la regulado de nutra konduto kaj fizika aktiveco [10, 11], sugestante ke DNMTs povus esti promesplenaj terapiaj celoj por la terapio de obezeco-diabeta sindromo. Grave, iuj naturaj manĝ-derivitaj substancoj, inkluzive de kafeika acido kaj epigalocatechin, estas konataj agi kiel DNMT-inhibidores [12, 13].
Lastatempe ni montris, ke la bioaktiva, bruna rizo-specifa komponanto γ-oryzanol, miksaĵo de ferulic-acido ester kaj pluraj fitosteroloj, mildigas la preferon por dieta graso per malpliigo de hipotalama endoplasma retikulo (ER) streso [14]. Ĉe musoj kaj kunikloj, buŝe administrita γ-oryzanol estis rapide ensorbita el la intesto kaj distribuita ĉefe al la cerbo [15, 16]. Kunigante ĉi tiujn trovojn, naturaj manĝ-derivitaj produktoj agantaj sur la centra nerva sistemo povus esti alternativo al sekure plibonigi malplibonigan manĝan konduton en obezeco. En ĉi tiu kunteksto, ni testis la hipotezon, ke γ-oryzanol ŝanĝus statuson de metilado de DNA en la cerba rekompenca sistemo, rezultigante mildigon de la prefero por HFD en musoj.
metodoj
bestoj
Sep-semajnaj viraj musoj C57BL / 6J akiritaj de Charles River Laboratories Japan (Kanagaŭa, Japanio) estis loĝigitaj (3-4 por kaĝo) en specifaj patogen-liberaj kondiĉoj je 24 ° C sub 12 h / 12 h lumo / malhela ciklo. Post semajno da alklimatiĝo, 8-semajnaj musoj pezpezis kaj dividiĝis en du aŭ tri grupojn por sperti ĉiun eksperimenton. La musoj rajtis senpagan aliron al manĝaĵoj kaj akvo. Ĉiuj bestaj eksperimentoj estis aprobitaj de la Etika Komitato pri Besta Eksperimento de la Universitato de Riukio (n-roj 5352, 5718 kaj 5943).
Administrado de γ-oryzanol kaj 5-aza-2′-deoxycytidine
Por taksi la preferon por HFD, γ-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries, Osako, Japanio) estis administrita al 8-semajna-musoj per gavage dum la manĝaĵa elekto-testo kiel antaŭe priskribita [14, 17]. Por la aliaj eksperimentoj, HFD (D12079B; Research Diets, Nov-Brunsviko, NJ, Usono) enhavanta 0.4% γ-oryzanol estis fabrikita kiel buletoj. La komponantoj de la dieto estas montritaj en elektronika suplementa materialo (ESM) Tabelo 1. Post 12 semajnoj da manĝado, histo estis kolektita de la striato kaj hipotalamo. La ĉiutaga konsumado de γ-orzanol, taksita laŭ la averaĝa manĝaĵo de la musoj, estis ĉirkaŭ 320 μg / g korpopezo. La dozoj de γ-orzanol estis determinitaj kiel antaŭe priskribite [14]. La 5-aza-2′-deoksicitidino (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, Sankta Luiso, MO, Usono) estis intraperitoneal injektita (0.25 μg / g korpopezo) tri fojojn semajne dum 12 semajnoj [18].
Takso de prefero por dieta graso
Por taksi preferojn por dietaj grasoj, manĝaĵaj provoj disponigis elekton inter chow kaj HFD (D12450B kaj D12451; Esploroj de Dietoj) kiel antaŭe priskribitaj [14]. La komponentoj de dieto estas montritaj en ESM-Tabelo 1. Mallonge, la musoj rajtis senpagan aliron al Chow kaj HFD. Konsumoj de manĝaĵo kaj HFD estis mezuritaj ĉiusemajne kaj analizitaj por ŝanĝoj en prefero por dieta graso. HFD-prefero estis kalkulita laŭ la formulo: HFD-prefero = [(HFD-konsumado / totala manĝaĵo) × 100].
Sekvencado de bisulfito por metilado de DNA
DNA estis purigita per DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Tokio, Japanio). La DNA-solvo estis miksita kun freŝe preparita 3 mol / l NaOH, kovata al 37 ° C dum 15 min kaj aldonita al 5.3 mol / l ureo, 1.7 mol / l natria bisulfito kaj 4.9 mmol / l hidrokvinono. La solvo estis submetita al 15 cikloj de denaturigo je 95 ° C dum 30 sekoj kaj inkubacio je 50 ° C dum 15 minutoj [19]. La traktita DNA kun bisulfito estis purigita uzante MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) kaj amplifita per PCR uzante KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR-Kit (KAPA Biosystems, Woburn, MA, Usono) kaj printempiojn ĉirkaŭ la loko CpG de la iniciatinta regiono de D2R . La unuarangaj sekvencoj estis kiel sekvas: antaŭenprimi, 5′-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 ′; reverso, 5′-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 ′. Tuj poste, la adaptaj sekvencoj estis aldonitaj kaj purigitaj per Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, Usono). Specimenoj tiam estis kunigitaj kaj ŝarĝitaj al GS Junior (Roche Diagnostics, Tokio, Japanio) por sinsekvo laŭ la protokolo de la fabrikanto. La nivelo de metilado estis esprimita kiel la procento de metilataj citosinoj en ĉiuj restaĵoj de citosinoj.
Provo de DNMT-agado
La enzimata akcia provo de DNMT estis farita uzante EpiQuik DNA Methyltransferase Assay Kit / Inhibition Assay Kit (Epigentek Group, Brooklyn, NY, Usono) kaj EPIgeneous Methyltransferase Assay kit (Cisbio Japan, Chiba, Japanio) laŭ la protokoloj de la fabrikanto.
Taksi la inhibician agadon de ĉiu komponaĵo sur DNA-metilado, la formado de S-adenosil-l-homocisteino (SAH) estis mezurita ĉe la ĉeesto de ĉiu komponaĵo (20 μmol / l por ekzamenado de analizoj), S-adenosil-metionino (SAM; 10 μmol / l) kaj DNMT-substrato (4 ng / μl) je 37 ° C dum 90 min. Por taksi la kinetikon Michaelis-Menten, DNMT1 (20 μmol / l) estis kovata per γ-oryzanol, SAM (5 μmol / l) kaj la indikita koncentriĝo de poli dI-dC je 37 ° C dum 90 min. DNMT3a (100 μmol / l) kaj DNMT3b (100 μmol / l) estis kovataj per γ-orzanol, SAM (5 μmol / l) kaj la indikita koncentriĝo de poli dG · dC ĉe 37 ° C dum 120 min. La provoj estis faritaj kvaroble. Eltirita proteino (0.75 mg / ml) estis kovata per SAM (5 μmol / l), poli dI-dC (5 μg / ml), kaj poli dG · dC (5 μg / ml) je 40 ° C dum 120 min, kaj SAH-formado estis mezurita.
Enspezo pri estrogen-rilata ricevil-γ
La ebla antagonisma agado de γ-orzanol sur la estrogena rilata ricevilo-γ (ERRγ) estis taksita per la Homa Estrogen-Rilata Receptoro Gamma Raportisto-Analiza Sistemo (INDIGO Bioscience, State College, PA, Usono) laŭ la protokolo de la fabrikanto. Nelonge, ne-homaj mamulaj raportistaj ĉeloj konstitucie esprimantaj aktivan ERRγ estis elmetitaj al la indikitaj koncentriĝoj de ĉiu komponaĵo dum 24 h triope.
Okcidenta blotado
Ĉi tio estis farita kiel antaŭe priskribita [20] kun antikorpoj kontraŭ D2R (1: 500, kuniklo), dopamina transportilo (DAT; 1: 500, kuniklo), tirosina hidroksilazo (TH; 1: 1000, kuniklo) (AB5084P, AB1591P kaj AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, Usono), signal-transduktilo kaj aktivigilo de transskribo 3α (STAT3α; 1: 1000, kuniklo), DNMT1 (1: 1000, kuniklo), DNMT3a (1: 1000, kuniklo) (n-roj. 8768, 5032 kaj 3598; Cell Signaling Technology, Tokio, Japanio), DNMT3b (1 μg / ml, kuniklo), ERRγ (1: 1000, kuniklo) kaj β-aktino (1: 10,000, muso) (ab16049, ab128930 kaj ab6276; Abcam, Kembriĝo, MA, Usono).
Kvanta reala tempo PCR
Gena esprimo estis ekzamenita kiel antaŭe priskribita [14]. mRNA-niveloj normaligis al Rn18oj (18S rRNA). La listoj uzataj por la kvantaj realtempaj PCR-analizoj estas resumitaj en ESM-Tabelo 2.
Statistika analizo
Datumoj estas esprimitaj kiel meznombro ± SEM. Unudirekta ANOVA kaj ripetmezura ANOVA sekvita de multnombraj komparaj testoj (metodo Bonferroni-Dunn) estis uzataj, se aplikeblaj. Studenta t testo estis uzita por analizi diferencojn inter du grupoj. Diferencoj estis konsideritaj signifaj je p <0.05.
rezultoj
Farmakologia inhibicio de DNMToj per 5-aza-dC mildigis la preferon por dieta graso en musoj
En musoj nutritaj de HFD, metilado de DNA en la iniciatema regiono de D2R en la striatumo estis signife pliigita kompare kun musoj nutritaj per chow-dieto (Fig. (Fig.1a) .1a). Aliflanke, hipotalama DNA-metilado en la iniciatema regiono de D2R estis ŝajne pli alta ol tiu en la striatumo sub dieca chow (p <0.01) (Fig. (Fig.1a, 1a, f) kaj ne estis ŝanĝita de la HFD (Fig. (Fig.1f) .1f). En musoj nutritaj de HFD, la pliigita DNA-metilado en la iniciatema regiono de D2R en la striato estis normaligita per kuracado per 5-aza-dC, potenca DNMT-inhibilo (Fig. (Fig.1a) .1a). Kontraŭe, DNA-metilado en la iniciatema regiono de D2R en la hipotalamo ne estis signife ŝanĝita per traktado kun 5-aza-dC (Fig. (Fig.1f) .1f). En la striato de virseksaj musoj de 20 semajnoj nutritaj kun HFD dum 12 semajnoj, mRNA kaj proteino-niveloj de D2R signife malpliiĝis (Fig. XNUMX). (Fig.1b, 1b, k, l). En kontrasto, niveloj de dopaminaj D1-riceviloj (D1Rs, koditaj per Drd1), kiuj agas kontraŭe al D2Rs sur adenilil-ciklaso kaj cAMP-mediata intracelula signalado, estis senŝanĝaj (Fig. (Fig.1c) .1c). Plue, ne estis ŝanĝo en la niveloj de aliaj molekuloj rilataj al signalado de D2R, kiel TH kaj DAT ĉe la mRNA kaj / aŭ proteina nivelo (Fig. (Fig.1d, 1d, e, k, m). Aliflanke, neniuj ŝajnaj ŝanĝoj estis observitaj en la hipotalamo, inkluzive de D2R (Fig. (Fig.1g – m) .1g – m). Notinde, proteinaj niveloj de D2R kaj TH en hipotalamo estis multe pli malaltaj ol tiuj en la striatumo (Fig. (Fig.1l, 1l, m), eble reflektanta la relativan gravecon de dopamina ricevilo signalanta en la cerba rekompenca sistemo kompare kun la hipotalamo.
Por ekzameni, ĉu DNA-metilado en la iniciatema regiono de D2R ŝanĝus la preferon por dieta graso, la nutra konduto de 5-aza-dC-musoj estis analizita. Kiel atendite, 5-aza-dC signife pliigis mRNA kaj proteinajn nivelojn por D2R en la striato de HFD-nutritaj musoj (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l). Aliflanke, estis neniu efiko sur niveloj de Drd1, Th kaj Slc6a3 (kodanta DAT) en la striato, aŭ sur niveloj de Drd2, Drd1, Th kaj Slc6a3 en la hipotalamo (Fig. (Fig.1c – e, 1c – e, g – m). Dum veturil-traktitaj musoj preferis la HFD, prefero por la HFD estis signife malpliigita en 5-aza-dC-traktitaj musoj (88% de la valoroj por veturil-traktitaj musoj) (Fig. (Fig.1n) .1n) Sekve, kuracado kun 5-aza-dC reduktis la gajnon en korpa pezo (Fig. (Fig.11o).
γ-oryzanol malpliigas nivelojn de DNMTs en striato de HFD-nutritaj musoj
Kiel ni antaŭe raportis [14], parola administrado de γ-oryzanol al masklaj musoj per gavage signife malpliigis la preferon por HFD (93% de la valoroj por veturil-traktitaj musoj) (Fig. (Fig.2a), 2a), rezultigante ŝajnan mildigon de korpa pezo (Fig. (Fig.2b) .2b). Ni do esploris la eblan efikon de γ-oryzanol sur epigenetika modulado de D2Roj en la striato.
En mamuloj, estas tri gravaj DNMToj - DNMT1, 3a kaj 3b. DNMT1 funkcias por konservi metiladon de DNA, dum DNMT3a kaj 3b ludas rolon en faciligado de nova metilado de DNA [21]. Por esplori la eblan efikon de γ-oryzanol en DNMTs in vivo, ni taksis nivelojn de DNMToj en la cerbo de HFD-nutritaj musoj. Kvankam la HFD per si havis neniun efikon al mRNA kaj proteinaj niveloj de DNMTs aŭ en la striatumo aŭ la hipotalamo, suplemento kun γ-oryzanol signife malpliigis nivelojn de DNMTs en la striatum sed ne en la hipotalamo (Fig. (Fig.2c – e, 2c – e, g – i, k – n). Ĉi tiuj datumoj levas la eblecon, ke γ-oryzanol povus reguligi nivelojn de DNMTs laŭ striatum-specifa maniero. Simile, 5-aza-dC signife malpliigis mRNA-nivelojn de DNMT3a kaj 3b prefere en la striatum (ESM Fig. 1a – d).
Surbaze de antaŭa studo montranta, ke la mRNA-nivelo de DNMT1 estis pozitive reguligita, almenaŭ parte, de la nuklea ricevilo ERRγ [22], ni ekzamenis la eblan efikon de γ-oryzanol sur ERRγ-agado. En ne-homaj mamulaj ĉeloj konstitucie esprimantaj aktivan ERRγ, 4-hidrokso tamoxifeno, potenca inversa agonisto de ERRγ, rimarkinde malpliigis ERRγ-aktivecon. Rimarkinde, γ-oryzanol parte malpliigis ERRγ-aktivecon (proksimume 40%-redukto de la denaska valoro) (Fig. (Fig.3a) .3a). Grave, ERRγ estis tre esprimita en la striato sed ne en la hipotalamo (Fig. (Fig.3b – d) .3b – d). Kontraŭe al la situacio por la striato, γ-oryzanol signife pliigis proteinajn nivelojn de DNMT1 nur en la hipotalamo (Fig. (Fig.2k, 2k, l). Ĉi tiuj rezultoj povus esti klarigitaj, almenaŭ parte, per nia trovo, ke STAT3α, pozitiva reguligilo de DNMT1-nivelo [23], estis abunde esprimita en la hipotalamo sed ne en la striatumo (Fig. (Fig.33e – g).
Por plue taksi la efikon de γ-oryzanol sur la aktiveco de DNMTs in vivo, la formado de SAH, kromprodukto de DNA-metilado kaj ankaŭ potenca inhibilo de DNMToj, estis taksita en γ-oryzanol-musoj nutritaj de HFD. Estis neniuj signifaj ŝanĝoj en SAH-formado en la striato aŭ la hipotalamo inter HFD-nutritaj kaj chow-nutritaj musoj (Fig. (Fig.2f, 2f, j). Videble, γ-oryzanol signife malpliigis SAH-formadon en la striatumo (Fig. (Fig.2f) 2f) sed ne en la hipotalamo (Fig. (Fig.2j), 2j), sugestante, ke γ-oryzanol subpremu la agadon de DNMToj laŭ striatum-specifa maniero en HFD-nutritaj musoj.
Enzimaj analizoj pri inhibitoriaj ecoj de γ-oryzanol por DNMToj in vitro
Ni poste taksis la efikon de γ-oryzanol sur la agado de DNMTs in vitro. Oni analizis la inhibajn potencojn de γ-oryzanol, ferulica acido, 5-aza-dC, haloperidol (reprezentanto de D2R-antagonisto), quinpirolo (reprezentanto de agonisto D2R) kaj SAH kontraŭ DNMToj. Kiel pozitiva kontrolo, SAH forte mildigis la agadojn de DNMToj laŭ dozo-dependa maniero (Fig. (Fig.4a – f) .4a – f). Kiel atendite, haloperidol kaj quinpirolo montris neniun efikon al la agadoj de DNMTs (ESM Fig. 2). Videble, γ-oryzanol signife inhibis la agadojn de DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol / l), 3a (IC50 = 22.3 μmol / l) kaj 3b (maksimuma inhibicio 57%) (Fig. (Fig.4d – f) .4d – f). Kontraŭe, la malhelpa agado de ferulika acido, metabolito de γ-oryzanol, estis multe pli malalta ol tiu de γ-oryzanol (Fig. (Fig.44d – f).
Ni plue esploris la inhibiciajn ecojn de γ-oryzanol sur DNMTs. La formado de SAH estis mezurita por taksi la inhibician agadon de γ-oryzanol sur DNMTs in vitro. Datumoj pri SAH-formado dum DNMT-mediata DNA-metilado indikas saturablan padronon de Michaelis-Menten-kinetiko ambaŭ por la ĉeesto kaj foresto de γ-oryzanol (Fig. (Fig.4g – i) .4g – i). En DNMT1-mediata DNA-metilado, Eadie-Hofstee-analizo pruvis, ke γ-oryzanol montris neniujn efikojn sur la V maks de SAH-formado (veturilo, 597 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 619 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 608 pmol / min), dum γ-oryzanol ŝajne pliigis la K m (veturilo, 0.47 μg / ml; γ-orzanol 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (Fig. (Fig.4j) .4j). Ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke γ-oryzanol malhelpas DNMT1 almenaŭ parte konkurenciva maniero. Aliflanke, por DNMT3a- kaj 3b-mediata DNA-metilado, γ-oryzanol malpliigis la V maks de formado de SAH (DNMT3a: veturilo, 85.3 pmol / min; γ-orzanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b: veturilo, 42.3 pmol / min; γ -oryzanol 2 μmol / l; 28.0 pmol / min, γ-oryzanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / min) kaj, simile, la K m por ĉi tiu reago (DNMT3a: veturilo, 0.0086 μg / ml; γ-orzanol 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: veturilo, 0.0122 μg / ml; γ- orzanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (Fig. (Fig.4k, 4k, l). Ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke γ-oryzanol inhibas DNMT3a kaj 3b almenaŭ parte ne konkurencive.
γ-oryzanol pliigas nivelojn de D2R en striato de HFD-nutritaj musoj
Ni poste testis la eblecon, ke γ-oryzanol pliigos striitan enhavon D2R per inhibicio de DNMToj. En HFD-nutritaj musoj, parola administrado de γ-oryzanol signife malpliigis striatan DNA-metiladon en la iniciatema regiono de la D2Roj (Fig. (Fig.5a), 5a), dum ĝi ne faris ĉi tion en la hipotalamo (Fig. (Fig.5f) .5f). Konforme al ĉi tiuj trovoj, mRNA kaj proteinaj niveloj de D2R estis reciproke pliigitaj (Fig. (Fig.5b, 5b, g, k, l). Simile al la datumoj pri kuracado kun 5-aza-dC (Fig. (Fig.1), 1), estis neniuj ŝajnaj efikoj sur la RNA kaj proteinaj niveloj de Drd1, Th kaj Slc6a3 (DAT) en la striato, kaj neniuj efikoj al niveloj de Drd1, Th kaj Slc6a3 en la hipotalamo (Fig. (Fig.5c – e, 5c – e, h – k, m).
Antaŭaj studoj montris, ke niveloj de D2R kaj DNMT1 estas reguligitaj de ER-streso kaj inflamo almenaŭ parte per NF-κB [17, 24, 25]. Ni do ekzamenis la nivelojn de ER-streĉaj kaj inflamaj rilataj genoj. Kiel antaŭe pruvite [26], HFD pliigis esprimon de la genoj kodantaj TNF-α (Tnfa), monocita kemiopractora proteino-1 (MCP-1) (Ccl2), C / EBP-homologa proteino (Pikilo), ER-lokalizita DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) kaj la splita formo de X-skatola liganta proteino 1 (Xbp1s) en la hipotalamo sed ne en la striatumo (Fig. (Fig.6) .6). Notinde, suplementado de la HFD kun γ-oryzanol malpliigis signife la pliigitan esprimon de Ccl2, Pikilo, Dnajb9 kaj Xbp1s ekskluzive en la hipotalamo sed ne en la striato (Fig. (Fig.66).
diskuto
La ĉefa trovo en la nuna studo estas, ke γ-oryzanol funkcias kiel potenca DNMT-inhibilo en la striato de musoj, tiel mildigante, almenaŭ parte, la preferon por HFD per epigenetika modulado de striatala D2R. En striato de HFD-nutritaj musoj, niveloj de D2R estis signife malpliiĝintaj, dum tiuj de D1R, TH kaj DAT ne estis ŝanĝitaj (Fig. (Fig.1b – e, 1b – e, k – m). Ĉi tiuj datumoj konformas al la nocio, ke malregula stria D2R ludas kritikan rolon en la percepto de manĝaĵa rekompenco dum HFD, kaŭzante hedonan troan konsumon de HFD en obesaj bestoj [3]. En la aktuala studo, kuracado de HFD-nutritaj musoj kun 5-aza-dC signife pliigis nivelojn de striata D2R (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l) eble per redukto de DNA-metila nivelo en la iniciatema regiono de D2R (Fig. (Fig.1a), 1a), kaj sekve mildigis la preferon por dieta graso (Fig. (Fig.1n) .1n) Ĉi tiu trovo ankaŭ subtenas kritikan rolon de striaj D2R-oj en la percepto de manĝaĵa rekompenco dum HFD.
Nia in vitro-provo montris, ke la inhibicia agado de γ-oryzanol kontraŭ DNMTs estis ŝajne pli forta ol tiu de ĝia metabolita ferulica acido (Fig. (Fig.4d-f), 4d – f), sugestante la gravecon de la kompleta strukturo de γ-oryzanol por ĝia inhiba ago sur DNMToj. En HFD-nutritaj musoj, niaj studoj sugestas, ke, post buŝa administrado, γ-oryzanol atingas la cerbon kiel kompleta strukturo kaj malpliigas la nivelojn kaj agadojn de DNMT-oj prefere en la striatum, kun konsekvenca malkresko de metilado de DNA en la iniciatema regiono de D2R en la striatumo. Plue, niaj in vitro-studoj pruvis, ke γ-oryzanol funkcias kiel parta antagonisto kontraŭ ERRγ, kiu servas ĉefe kiel pozitiva regulilo por produktado de DNMT1 [22], kaj sekve malpliigis la agadon de DNMT1 (Fig. (Fig.3a) .3a). Rimarkinde, ERRγ estis tre esprimita en la striatumo sed ne en la hipotalamo en musoj (Fig. (Fig.3b) .3b). Ĉi tiuj datumoj sugestas, ke γ-oryzanol havas la potencialon malpliigi la mRNA-nivelon de DNMT1, almenaŭ parte, per la inhibicio de ERRγ. Kontraste al striatum, γ-oryzanol ne montris neniun efikon al la nivelo de D2R en hipotalamo de HFD-nutritaj musoj (Fig. (Fig.5g, 5g, k, l).
Aliflanke, ni pruvis, ke γ-oryzanol signife pliigis nivelojn de DNMT1 en la hipotalamo sed ne en la striatumo (Fig. (Fig.2k, 2k, l). Montriĝis, ke STAT3 pliigas la enhavon de DNMT1 en malignaj T-limfomaj ĉeloj [23]. Notinde, ni antaŭe pruvis, ke γ-oryzanol signife pliigis STAT3-fosforilacion induktitan de leptino en hipotalamo de HFD-nutritaj musoj [14]. Oni ankaŭ devas rimarki, ke STAT3α estis esence esprimita en la hipotalamo sed ne en la striato en la musoj (Fig. (Fig.3e – g) .3e – g). Ĉi tiuj datumoj tentas nin konjekti, ke la ŝajna diferenco en efiko de γ-oryzanol sur niveloj de DNMT1 inter hipotalamo kaj striato povus esti atribuita, almenaŭ parte, al la regiona specifa enhavo de STAT3α kaj ERRγ en la cerbo de musoj ( Fig. (Fig.3b – g) .3b –g). Kolektive, ŝajnas esti reciproka ŝablono de esprimo de ERRγ kaj STAT3α inter la striatum kaj la hipotalamo en musoj. Surbaze de niaj rezultoj, tial estas akcepteble spekuli, ke en striato, kie ERRγ-produktado abundas, γ-oryzanol eble prefere malpliigos la mRNA-nivelon kaj enziman agadon de DNMT1 kiel negativan reguligilon de ERRγ. En kontrasto, en la hipotalamo, kie STAT3α-produktado regas, γ-oryzanol eble prefere pliigas nivelojn de DNMT1.
Lastatempa studo pruvis, ke mildigo de striata D2R-signalado induktita de HFD malreguligas nutran konduton [3], sugestante la ebla graveco de inhibo de striaj DNMToj por la traktado de obesidad. Aliflanke, antaŭa studo pruvis eblon, ke la statuso de DNA-metilado de la geno 4 de la melanocortina receptoro esprimita en specifaj hipotalamaj kernoj povis moduli transgenerajn formojn de obezeco en agouti fareblaj flavaj musoj [27]. Kvankam pliaj studoj estas garantiataj por elucidi la subajn mekanismojn, ĉi tiuj studoj sugestas la gravecon de DNA-metilado de histo, geno kaj sekvenco en la fiziopatologio de HFD-induktita obezeco.
Lastatempe ni raportis, ke HFD pliigis la nivelon de D2R en la pankreataj insuloj de musoj [17, 24]. Estas verŝajne, ke tia pliigo estas mediaciita, almenaŭ parte, per ER-streso kaj inflamo per NF-κB, ĉar estas pluraj NF-κB-respondaj elementoj en la iniciatema regiono de D2R [17, 24]. Plue, lastatempa studo montris, ke TNF-α kaj IL-1β pliigas la nivelon kaj aktivecon de DNMT1 en adiposa histo de HFD-nutritaj musoj [25]. Grave, la nuna studo pruvis, ke HFD induktis ER-streĉon kaj inflamon prefere en hipotalamo sed ne en la striatumo (Fig. (Fig.6) .6). Enprofundaj mekanismoj de histila, regiona, kaj eja specifa DNA-metilado kaj demetilado en nia eksperimenta paradigmo devas atendi plian esploron.
Kune kun nia antaŭa raporto montrante, ke γ-oryzanol mildigas la preferon por HFD per hipotalamo reguligo de ER-streso ĉe musoj [14], γ-oryzanol ankaŭ reprezentas unikan posedaĵon de plibonigado de kaj hedonaj kaj metabolaj malreguligoj de nutra konduto. Ĉar iuj drogoj kontraŭobeaj, kiuj estas disvolvitaj, estas konataj kaŭzi kritikajn adversajn efikojn [8], natura manĝaĵa alproksimiĝo al la cerba rekompenca sistemo antaŭvidas trakti obezecon-diabetan sindromon sekure [16]. En ĉi tiu paradigmo, γ-oryzanol estas promesanta kandidato pri kontraŭobezeco kun aparta propraĵo de esti epigenetika modulatoro.
Dankoj
Ni dankas al S. Okamoto (Universitato de Ryukyus, Japanio) pro recenzado de la manuskripto. Ni dankas M. Hirata, H. Kaneshiro, I. Asato kaj C. Noguchi (Universitato de Ryukyus, Japanio) pro sekretaria helpo.
mallongigoj
| 5-aza-dC | 5-aza-2′-deoxycytidine |
| D1R | Dopamina D1-ricevilo |
| D2R | Dopamina D2-ricevilo |
| DAT | Dopamina transportilo |
| DNMT | DNA metiltransferase |
| ER | Endoplasma retikulo |
| ERR | Estrogen-rilata ricevilo |
| HFD | Alta grasa dieto |
| SAH | S-Adenosil-l-homocisteina |
| SAM | S-Adenosil-metionino |
| STAT3α | Signala transdonilo kaj aktivigilo de transskriba 3α |
| TH | Tyrosine hydroxylase |
Notoj
Disponeblo de datumoj
Datumaroj generitaj kaj / aŭ analizitaj dum la nuna studo estas haveblaj de la responda aŭtoro laŭ raciaj petoj.
financado
Ĉi tiu laboro estis subtenita parte de Grants-in-Helpo de Japana Societo por Akcelado de Scienco (JSPS; KAKENHI Grant Numbers 15K19520 kaj 24591338), la Konsilio por Scienco, Teknologio kaj Novigado (CSTI), Interministeria Strategia Noviga Antaŭeniga Programo (SIP) "Teknologioj por krei nov-generacian agrikulturon, arbaron kaj fiŝkaptadon", la Lotte Fundamento, la Japana Fundamento por Aplikata Enzimologio, la Organizo pri Nova Evoluiga Energio kaj Industria Teknologio (NEDO), la Projekto por Formado de Vida Scienca Reto (Farmacia Kampo ) (Okinawa Gubernio, Japanio) kaj la Projekta Projekto de Medicina Klusterigo de Gubernio Okinawa, Japanio, kune kun subvencio de la Gubernio Okinawa por promocio de altnivela medicino (Gubernio Okinawa, Japanio).
Dualeco de intereso
La aŭtoroj deklaras, ke ne ekzistas duala intereso asociita kun ĉi tiu manuskripto.
Kontribuita deklaro
CK kaj HM desegnis la esploradon. CK kaj TK faris la eksperimentojn kaj analizis la datumojn. TK, CS-O, CT, MT, MM kaj KA kontribuis al interpretado de datumoj. CK kaj HM verkis la manuskripton. Ĉiuj aŭtoroj kontribuis al interpretado de datumoj. Ĉiuj aŭtoroj aliĝis revizii la manuskripton kaj aprobis ĝian finan version. HM estas la garantiulo de ĉi tiu laboro, havis plenan aliron al ĉiuj datumoj kaj prenas plenan respondecon pri la integreco de datumoj kaj precizeco de datuma analizo.
Piednotoj
Elektronika suplementa materialo
La interreta versio de ĉi tiu artikolo (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) enhavas suplementan materialon, sed reviziitan, aperigitan de rajtigitaj uzantoj.
Referencoj
;
