Hypocretin (orexin) faciligas rekompencon per mildigado de kontraŭreventaj efikoj de ĝia kotransmeta dinorfino en ventra tegmenta areo (2014)

John W. Muschamp,^a,1 Jonathan A. Hollander,^b Jennifer L. Thompson,^c George Voren,^b Linda C. Hassinger,^a Sara Onvani,^a Theodore M. Kamenecka,^b Stephanie L. Borgland,^c Paul J. Kenny,^b kaj William A. Carlezon, Jr.^a

Informo de aŭtoro ► Kopirajto kaj Permesila informo ►

Hipokretino (oreksino) kaj dinorfino estas neŭromanĝuloj, kiuj ludas gravan rolon en regulado de influo kaj motivado. La oroksino estas maltrankviliga por rekompenco kaj estas implikita en serĉado de drogoj, dum dinorfino medias negativan humoron kaj estas implikita en depresivaj ŝtatoj. Konsiderante tiujn kontraŭajn efikojn, raportoj, ke ambaŭ peptidoj estas esprimitaj en la samaj neŭronoj kaj estas korekteblaj, estas kontraŭintensivaj. Ĉi tie, ni montras, ke orexino kaj dinorfino estas kunekzemplitaj ene de la samaj sinaptaj veziketoj kaj ke ĉi tiu kolocalización havas profundan influon sur rekompenco, medikamentado kaj impulsema simila konduto. La fakto, ke oreksino kaŝas la kontraŭpresivajn efikojn de dinorfino depresivaj, ŝanĝas signife kiel ni vidas la funkcian rolon de orekso en la cerbo.

Hypocretin (orexin) kaj dynorphin estas neuropeptidoj kun kontraŭaj agoj pri motivigita konduto. La oroksino estas implicita en statoj de ekscito kaj rekompenco, dum dinorfina estas implikita en depresivaj ŝtatoj. Ni montras, ke malgraŭ iliaj kontraŭaj agoj, ĉi tiuj peptidoj estas enpakitaj en la samaj sinaptaj veziketoj en la hipotalamo. Interrompo de oreksina funkcio malakrigas la rekompencajn efikojn de stimulo flanka hipotalamo (LH), forigas kokosindan impulsiĝemon, kaj reduktas mem-administradon de kokaino. Akompananta interrompo de dynorphin-funkcio inversigas tiujn kondutajn ŝanĝojn. Ni ankaŭ montras, ke orexino kaj dinorfino havas kontraŭajn agojn pri ekscitebleco de ventralaj tegmentaj areoj (VTA) dopaminaj neŭronoj, elstara celo de oreksin-enhavantaj neŭronoj, kaj ke intra-VTA-orexin-antagonismo kaŭzas malpliiĝon de kokain-mem-administrado kaj LH memestimulado. tio renversas per dinorfino antagonismo. Niaj trovoj identigas unikan ĉelan procezon per kiu oreksino povas kaŝi la rekompencajn sojlojn-efikojn de korelita dinorfino kaj tiel agi laŭ permissaj manieroj por faciligi rekompencon.

Orexin kaj Dynorphin Estas Cotransmitters.

Ni konfirmis kunekziston de orexino kaj dinorfino ene de la samaj neŭronoj de la muskola flanka, perifornika kaj dorsomedia hipotalamo uzante fluoreskan mikroskopon (18) (Figo. 1A). La ekzisto de neŭronoj, kiuj esprimas multoblajn elsendilojn, estis priskribitaj en aliaj cerbaj cirkvitoj kaj eble reprezentas la neŭran bazon por filtrado de mekanismoj, per kiuj liberigo de kunekzemitaj neŭrotransmisiloj okazas ĉe diferencaj pafaj tarifoj (19). Uzante EM, ni trovis, tamen, ke orexino kaj dinorfino estas kolocalizados ene de la samaj sinaptaj veziketoj. Plej multaj kazoj de kovado estis observitaj en nemielinizitaj, varikaj aksonalaj procezoj, kie trovita imunelmarkado en aŭ proksime de veziketoj. En la neŭronaj ĉelaj korpoj, signifa markado estis asociita kun la kompleksa Golgi, dum neniu troviĝis en najbaraj kernoj (Figo. 1 B kaj C). Dendritoj ankaŭ enhavis vezikul-asociitan markadon por ambaŭ peptidoj, sugestante eblan eliĝon de ĉi tiuj dissendiloj. Malgranda numero de profiloj microestructurales kaptis fina staciojn de akonoj kun etiquetado por ambaŭ péptidos lokitaj en grandaj veziketoj (∼100 nm) lokitaj ekstere de la zono de liberigo de sinapsis nesimetriaj (Figo. 1 B kaj C), havigante subtenon al la konkludo ke oreksino kaj dinorfino funkcias kiel kotransmisoroj kaj ke, en normalaj kondiĉoj, ili estas liberigitaj kune anstataŭ diferenciale kiel funkcio de ĉelfajra ofteco.

 

Fig. 1.

Orexin kaj dynorphin estas cotransmisores en neŭronoj de la hipotalamo. (A, Far Left) Bril-kampa fotomicrografo montras la areon de hipotálamo ekzamenita por orekso (ruĝa) kaj dinorfino (verda) imunoreactividad. (A, Ekstrema Rajto) Kunigita du-kanala bildo ...

Rekompencaj Sojloj-Elevadores Efikoj de Minorina Blokado Estas Malvalidigita de Dynorphin Blockade.

Por esplori la funkcian signifon de ĉi tiu unika modelo de dissendilo esprimo, ni ekzamenis ĉu perturboj en orexino kaj dinorfino signalado povas tuŝi kompleksajn kondutojn kiuj reflektas normalan kaj aberran motivadon. En C57BL / 6 musoj trejnitaj por efektivigi intracranian memestimuladon (ICSS) plifortikigitaj kun flanka hipotalamo (LH) stimulado (20), blokado de OX₁Rs per N- (2-metil-6-benzoxazolil) -N ″ -1,5-naftiridin-4-ilea ureo (SB334867) dum la malpeza fazo kaŭzis dozon-dependajn pliiĝojn en rekompencaj sojloj (Figo. 2A; unudirektaj ripetitaj mezuroj ANOVA por Dozo: F_3,12 = 4.44, P <0.02). Pliiĝoj en ICSS-sojloj reflektas traktad-induktitajn reduktojn en la fruktodona efiko de la stimulo, deprimiĝema signo indika de malpliigita sentemo al rekompenco (20). Ĉi tiu efiko ne estis kaŭzita de sedacio aŭ aliaj specifaj kondutaj difektoj, ĉar ICSS-respondaj indicoj ne estis influitaj (Figo. 2B; unudirektaj ripetitaj mezuroj ANOVA por Dozo: F_3,24 = 0.33, P > 0.80).

 

Fig. 2.

Rekompenciĝantajn sojlajn efikojn de oreksa blokado renversiĝas per dynorphin-blokado. (A) Blokado de oreksina signalado ĉe OX₁R de SB334867 (0-30 mg / kg, ip) levas rekompencajn sojlojn en la ICSS-testo, indikante malkreskitan rekompencon. Ĉi tiu efiko ...

Altiĝoj en rekompencaj sojloj kaŭzitaj de SB334867 estis malhelpitaj per pretraktado kun nor-binaltorfimino (norBNI) [dudirekta ripetata mezurojn ANOVA por Medikamento (inter temoj faktoro) × Dozo SB (ene de faktoroj) interago: F_3,24 = 3.98, P <0.01], kiu produktas longdaŭran blokadon de dinorfinaj agoj ĉe KORoj (10). Ĉi tiuj datumoj sugestas, ke la perdo de orexin-signalado montras latentajn kontraŭvenajn efikojn de korelita dinorfino. Nur la administrado de norBNI ne malpliigis rekompencajn sojlojn. Kvankam ĉi tiu efiko povas esti rilatita al la unikaj farmacodinamikoj de norBNI kaj aliaj prototipa KOR-antagonistoj (10), i eble ankaŭ indikas, ke estas redundo en procezoj, kiuj modulas la agadon de certaj rekompensaj cirkvitoj, aŭ ke fazaj pliiĝoj en oreksina tono sole (sen opozicio al korelencita dinorfino) estas nesufiĉaj por peri rekompensignalon de la stimula loko en la flanka hipotalamo. Ĉi tiuj konkludoj unue ŝajnas malkongruaj kun la laboro de aliaj, kiuj ekzamenis SB334867 sur ICSS-sojlon dum la malhela fazo (21). Tamen, ekzistas konsiderindaj pruvoj, ke malpliiĝo de oreksina funkcio povas havi konsekvencojn dependantajn ĉu bestoj estas testataj dum sia malpeza aŭ malluma fazo. Ekzemple manĝaĵo kaj akvo konservas siajn rekompencantajn efikojn en orexin KO-musoj kiam testado estas farata dum la malhela fazo sed ne dum la malpeza fazo (22), la tempo ĉe kiu ni plenumis ĉiujn niajn kondutajn testojn.

Por lokalizi la efikojn de sistemaj SB334867 kaj norBNI-administrado sur ICSS, aparta kohorto de musoj estis enplantita per LH-stimulaj elektrodoj kaj VTA-gvidaj kanuloj. Microinfuzio de SB334867 en VTA kaŭzis konsiderindajn pliiĝojn en rekompencaj sojloj, indikante malkreskitan rekompencon. Kvankam intra-VTA norBNI sole ne havis efikon al ICSS sojloj, ĝi blokis la sojlo-levantaj efikoj de posta SB334867-infuzaĵo (Figo. 2C; unudirekta ripetata mezurojn ANOVA por Drogo: F_3,9 = 10.98, P <0.01). Kvankam intrakraniaj drogaj infuzaĵoj emis produkti modestajn reduktojn en maksimumaj respondoj kompare kun ĉieaj drogaj injektoj, ĉi tiuj efikoj ne atingis statistikan signifon (Figo. 2D; unudirekta ripetata mezurojn ANOVA por Drogo: F_3,9 = 1.03, P = 0.112).

Impulseco Reguligita de Transdono de Orexin kaj Dynorphin.

Impulsemo karakterizas deficito en la forigo de rekompencaj kondutoj, kun altaj niveloj de impulsemo estante komuna trajto de multaj psikiatriaj malsanoj (23). Medikamentoj de misuzo, inkluzive de kokaino, povas ankaŭ provoki pliiĝojn de impulsemo, kiu estas supozata, ke ĝi pelas la disvolviĝon de toksomanio.24). Konsiderante la ŝlosilan rolon por korelitita orexino kaj dinorfino en la kontrolo de sentemo al la rekompencanta efiko de LH-stimulado en la ICSS-testo, ni supozis, ke interagoj inter ĉi tiuj du neuropeptidoj povas influi bazan impulsemon kaj kaŭzitajn deficitojn de kokaino en ĉi tiu konduto. Impulseco povas esti kvantigita en ronĝuloj per mezurado de antaŭtempaj respondoj en la tasko de seria reaga tempo de 5-elekta (5-CSRTT) (25), best-modelo analoga al la kontinua efikeca testo uzata por studi atenton en homoj. Antaŭtempa respondado en ĉi tiu testo tendencas esti malalta en normalaj kondiĉoj kaj estas pliseverigita de medikamentoj levantaj DA-transsendon (26). Ni uzis la 5-CSRTT por ekzameni la kontribuon de la sistemo de orexina-dinorfinoj al spontanea kaj kokain-induktita impulsema konduto. Se administrita sole, SB334867 plue reduktis la jam malaltan nombron de spontaneaj antaŭtempaj respondoj (Figo. 3A; F_3,21 = 4.89, P <0.01). Ĉi tiuj reduktoj okazis en la foresto de efikoj sur responda precizecoF_3,21 = 1.45, P = 0.25), pellet-reakirata latencia (F_3,21 = 0.91, P = 0.44), aŭ la nombro de stimula provoj kompletigitaj (F_3,21 = 1.46, P = 0.25), indikante, ke ili ne ŝuldiĝis al degradita atentemo aŭ motoraj kapabloj. Administrado de norBNI, aliflanke, inversigis la efikojn de SB334867 sur trofrue respondante (Figo. 3B; F_3,18 = 0.45, P = 0.71), sugestante, ke neopozita dinorfina transdono estas kritika en mediacio de ĉi tiuj kontraŭpulsiaj efikoj. Nur aŭ en kombinaĵo kun SB334867, norBNI produktis neniun efikon al mezuroj de respondeca precizeco (F_3,18 = 0.66, P > 0.58), latenteco (F_3,18 = 3.09, P > 0.06), aŭ la nombro de stimulaj provoj finitaj (F_3,18 = 2.38, P > 0.10). Antaŭtraktado kun SB334867 ankaŭ malhelpis la duoblan pliigon de antaŭtempa reago induktita de kokaino (Figo. 3C; F_6,24 = 5.84, P <0.01). Ĉi tiuj datumoj pruvas, ke oreksina neŭrotransmisio povas reguligi impulsan konduton sub kaj bazaj kaj kokain-stimulitaj kondiĉoj laŭ dinorfina sentema maniero.

 

Fig. 3.

Movado de impulsemo reguligita de ekvilibro de orexino kaj dinorfino. (A) SB334867 mildigas antaŭtempajn respondojn en la 5-CSRTT-rata modelo de motora impulsemo. Mezuroj de precizeco, latentaĵo por preni la manĝon buleton, kaj nombro da provoj preterlasitaj estis ...

Dynorphin asocias reduktitan memmastrumadon de kokaino en OX₁R-Null-Musoj.

Vundebleco al dependeco estas signife pliigita en impulsemaj individuoj, kaj hipotezoj kreskigas en impulsemo de kokaino, kiuj kontribuas al la apero de dependeco.23, 27). Plie, oreksin-transdono kaj dynorphin-transdono estis sendepende implikitaj en reguligado de la rekompencaj efikoj de kokaino kaj aliaj medikamentoj de misuzo (28-32). Ni hipotezis, ke interagoj inter orexino kaj dynorphin-transdono povas rekte kontroli drogprilaboradon. Por esplori ĉi tiun eblon, ni ekzamenis iv-kokin-memadministradon en genetike modifitaj musoj mankantaj OX₁Rs (OX)₁R^{- / -}). Musoj de ĉi tiu genotipo montras signife pli malaltan memadministradon de kokaino tra larĝa gamo de dozo (0.1-1 mg / kg por infuzaĵo) sed montras senŝanĝan respondon pri manĝaĵaj rekompencoj sub la samaj plifortigaj horaroj (33), sugestante ke reduktoj en kokainkaptaĵo ne estas sekundaraj al deficitoj en kondutada agado. Plie, OX₁R^{- / -} musoj montras normalajn kurzojn de mem-administrado de kokaino dum la proksimume tri komencaj sesioj de aliro al kokaino sed tiam rapide montras malkreskojn en preno de kokaino.33). Ni konfirmis ĉi tiun fenotipon je dozo de 0.3 mg / kg por infuzaĵo, indikante tiun signaladon per OX₁Rs havas kritikan rolon en establado kaj konservado de kokainaj memadministraj kondutoj [Figo. 4; mezuroj ripetitaj ANOVA, genotipo (inter subjektoj faktoro) × traktado de drogoj (ene de subjektoj faktoro): F_1,12 = 12.91, P <0.01]. Same kiel antaŭtraktado kun norBNI restarigis normalan ICSS kaj impulseman konduton ĉe musoj donitaj SB334867, ĝi ankaŭ parte restarigis mem-administradon de kokaino en OX₁R^{- / -} musoj, havantaj unikan ekzemplon en kiu konduta deficito produktita de genetika ablacio en la funkcio de unu neŭrokomanda sistemo estas savita per blokado de alia. Ĉi tiuj trovoj sugestas tion en OX₁R^{- / -} musoj, la senoponaj agoj de dinorfinoj mildigas la rekompencajn trajtojn de kokaino, kaj tiel malpliigas memadministradon de la drogo. Kurioze, en OX₁R^{+ / +} (kontrolo) musoj, norBNI neatendite reduktis kokainan memadministradon. Unu ebla klarigo por ĉi tiu efiko estas, ke dinorfino liberigita de neoroksinaj neŭronoj, kiel la tiel nomataj "rektaj" striatonigraj mezaj spongaj neŭronoj, havas la kontraŭajn efikojn al la kokaina konsumado kaj povas fakte faciligi la rekompencajn efikojn de kokaino. La ekzisto de du loĝantaroj de KOR-oj kun kontraŭaj roloj en kokainkompenso ankaŭ klarigus kial norBNI nur parte inversigis la deficitojn en kokainkaptema konduto detektita en la OX.₁R-kO-musoj. Alternative, KOR-antagonismo reduktas la aversajn aŭ stresajn efikojn de retiriĝo de kokaino (34), kiuj kontribuas al drogaj modeloj (17). Ĉiuokaze, ĉi tiuj datumoj sugestas, ke la depresivaj efikoj de dinorfino superas en foresto de sendifekta orexino-signalado, produktante reduktojn en la rekompencaj efikoj de kokaino, dum la efikoj de oreksino faciligas la rekompencajn efikojn de kokaino, etendante sian daŭron en manko de kokaino. Dinorfinaj signaloj.

 

Fig. 4.

Reduktita mem-administrado de kokaino en OX₁R-KO-musoj estas restarigitaj per KOR-blokado. Malfacilaĵo de orexin-signalado ĉe OX₁R per genetika forigo de ĉi tiu ricevilo reduktas iv memadministradon de kokaino (0.3 mg / kg por infuzaĵo). Ĉi tiu deficito estas parte ...

Orexin kaj Dynorphin Povas Praktiki Ekvilibrigita Kontraŭa Efektoj sur Excitability de VTA DA Neŭronoj.

Cerebrulaj strukturoj, kiuj ricevas enigojn de hipotalamaj orexino kaj dinorfinaj neŭronoj, estas eble elmontritaj al ambaŭ peptidoj, kaj tiel submetitaj al iliaj kontraŭaj efikoj al neŭrona eksciteco (35, 36). La mezuro al kiu la efikoj de unu peptido superas tiujn de la alia probable dependas de multaj faktoroj, inkluzive de la relativa abundeco de ĉiu peptido, longviveco en la eksterĉela spaco, kaj ricevila esprimo en malsamaj loĝantaroj de celaj neŭronoj, same kiel interagoj inter la receptoroj kaj iliaj intraĉelaj signaladaj mekanismoj en postsinaptaj ĉeloj. Impulsemo kaj kokainkompenso estas reguligitaj, almenaŭ parte, per DA neŭronoj en la VTA (26), elstara celo de hipotalamaj oreksinaj ĉeloj (37). Plie, infuzio de oreksino en la VTA plibonigas drogoserĉadon (6). Por taksi la relativajn kontribuojn de ĉiu peptido al la agado de neŭronoj de VTA, ni faris elektrofiziologiajn registrojn de DA ĉeloj en tranĉaĵoj de cerbaj musoj C57BL / 6 eksponitaj al orexino kaj dynorphin sole aŭ kune. Kiel anticipite, kiam aplikite aparte, oreksino estis uniforme ekscitema, dum dinorfino produktis nur inhibiciajn efikojn (Figo. 5 A kaj B; F_2,50 = 18.95, P ≤ 0.01). En la loĝantaro de DA neŭronoj registritaj, plej reagis al saturadaj koncentriĝoj de ambaŭ peptidoj, kvankam malgranda malplimulto estis selekteme reagas nur al orexino aŭ dinorfino (Figo. 5B). Notinde, kiam ambaŭ peptidoj estis aplikitaj al la du-respondemaj neŭronoj (n = 10), ne estis pura efiko sur la pafpunkto (Figo. 5A), sugestante ke la kontraŭaj efikoj de ĉiu peptido ĉe saturaj koncentriĝoj efike nuligas unu la alian post koreleaseo. Kvar el la 10 neŭronoj montris preferatan inhibicion de dinorfino malgraŭ la ĉeesto de oreksino, dum unu ĉelo estis preferate ekscitita (> 1.5-obla ŝanĝo) de oreksino malgraŭ la ĉeesto de dinorfino (Figo. 5 A kaj C). Entute, kvankam pli da ĉeloj reagas al oreksino ol al dinorfino, tiuj ĉeloj, kiuj reagis al ambaŭ peptidoj, havis neniun netanĝan ŝanĝon en pafado kiam orexino kaj dinorfino estis plenditaj, sugestante ke la kontraŭaj influoj de ĉiu peptido estis ekvilibrigitaj en la aro de VTA DA. neŭronoj studitaj.

 

Fig. 5.

Orexin kaj dynorphin praktikas ekvilibran sed kontraŭajn efikojn al neŭronoj VTA DA. (A, Maldekstra) Tegita orexino kaj dinorfino rezultigas neniun netanĝeblan ŝanĝon de la pafo de VTA DA neŭronoj (n = 10). Aplikata sole, dinorfino estis inhibicia kaj orekso estis ekscitanta. ...

Por klarigi plue la eblajn interagojn inter oreksino-dinorfinoj en neŭronoj de VTA-DA sentemaj al ambaŭ orexino kaj dinorfino, ni provis, alternative, pliigi la inhibiciajn efikojn de ban-aplikita dinorfino per kuracado kun SB334867 (Fig. S2A; F_5,25 = 2.13, P <0.01) aŭ plibonigi la ekscitajn efikojn de ban-aplikita oreksino per kuracado kun norBNI (Fig. S2B; F_3,27 = 5.48, P <0.01). En ambaŭ eksperimentoj, OX₁R kaj KOR-blokado ne sukcesis produkti ĉi tiujn efikojn, sugestante, ke SB334867 kaj norBNI ne efikas per nespecifaj agoj. Pli grave, ĉi tiuj datumoj sugestas, ke la tono de ĉiu peptido in vitro estas nesufiĉa por esti influita per aplikado de et-molekulaj antagonistoj kiel SB334867 kaj norBNI. Ĉi tiu rezulto kongruas kun antaŭa laboro indikante ke ekzocitozo de grandaj, peptid-enhavaj veziketoj tipe okazas nur ĉe altaj daŭrantaj pafaj frekvencoj kiuj ne normale ĉeestas en tranĉaĵoj.38).

Kontroli, ke norBNI ne influis konduton per "ekster-celaj" agoj rekte ĉe OX₁Rs, ni poste ekzamenis la efikojn de ĉi tiu antagonisto en OX₁R signalado. Specife, ni uzis fluorometrikan plakaĵan leganton (FLIPR) analizo por determini la kapablon de bane aplikata oreksino A, SB334867 aŭ norBNI indukti intracelularajn kalibrojn en kleraj ĉeloj CHO esprimantaj homan OX₁Rs. Kvankam oreksino A produktis la atendatajn pliiĝojn en intracelula kalcio (EC)₅₀ = 0.01 μM) kaj SB334867 dependigas de dozo ĉi tiun efikon (EC₅₀ = 0.035 μM), norBNI malsukcesis produkti iujn ajn efikojn sur aŭ bazlinia aŭ orexin-A-elvokitaj pliiĝoj en intracelula kalcio. Ĉi tio sugestas, ke la efikoj de norBNI sur VTA-DA fiziologio estas nur pere de proponitaj signaloj de KOR kaj la kuracilo ne havas rektan efikon ĉe OX.₁R (39) (Fig. S3 A-C).

Interagoj de Orexin-Dynorphin en VTA Reguligas Kokainan Mem-administradon.

Niaj elektrofiziologiaj studoj montras, ke dinamikaj interagoj inter orexino kaj dinorfino reguligas VTA-DA-agadon, kaj ke VTA-neŭronoj verŝajne servas kiel ŝlosila substrato por la efikoj de la orexin-dinorfinaj sistemoj sur motivigitaj kondutoj. Por testi ĉi tiun hipotezon rekte, ni ekzamenis la efikojn de intra-VTA-infuzaĵo de SB334867 pri iv-kokain-mem-administrado en ratoj. Kompare kun intra-VTA veturila infuzaĵo, intra-VTA SB334867 kaŭzis rimarkindan redukton de kokaina konsumado blokita de norBNI (Figo. 6; unudirekta ANOVA: F_3,24 = 11.56, P <0.01), sugestante, ke senopiniaj dinorfinaj agoj ene de ĉi tiu cerba areo mildigas rekompencon de kokaino. Ĉi tiuj rezultoj ŝajnas varii kun tiuj, kiuj pruvis la foreston de intra-VTA SB334867 pri mem-administrado de kokaino en malmulta penado fiksita proporcio 1 (FR1) horaroj de plifortigo (40). Tamen, pluraj raportoj montris, ke ĉar tasko postulas pliiĝon, SB334867 estas pli efika por redukti drogojn.2, 33). Ĉar ratoj en ĉi tiu eksperimento plenumis pli altan penadon FR5-horaron, la nunaj trovoj kongruas kun ĉi tiu literaturo. Ĉi tiuj datumoj provizas rektajn pruvojn, ke la kontraŭa naturo de oreksino kaj dinorfino sur VTA-DA-neŭroneca fiziologio povas praktiki signifajn efikojn sur rekompensaj kondutoj.

 

Fig. 6.

Interagoj de oroksino-dinorfinoj en VTA medias drogadon. La memadministrado de kokaino estas reduktita per SB334867 intra-VTA (3 μg por flanko), dum ĉi tiu efekto renversas per pretraktado kun norBNI (10 mg / kg, ip) (n = 9). ***P < ...

Bestoj.

La plenkreskaj musoj CXNMXBL / 57J (6 semajnoj; Jackson Laboratory) uzitaj en EM eksperimentoj estis grupigitaj (tri ĝis kvin por kaĝo); tiuj uzitaj por ICSS estis loĝigitaj sole post kirurgio. Plenkreskaj viroj (8 g) Sprague-Dawley-ratoj (Charles River Laboratories) estis uzataj en la eksperimentoj pri mem-administrado 350-CSRTT kaj kokaino kaj estis loĝigitaj en grupoj de kvar. La plenkreskaj musoj CXNXXXU / 5J (postnaciaj tagoj 57-6) uzitaj por la elektrofiziologiaj eksperimentoj estis grup-loĝigitaj (tri ĝis kvin por kaĝo). La OX19^{- / -} musoj kaj ties OX1^{+ / +} La kompanoj de lito (aĝo de 6) uzitaj por la studoj de memregado estis akiritaj de la Laboratorio Jackson kaj estis transiritaj pli de sep generacioj al musoj C57BL / 6. Ĉi tiuj musoj enhavis grupon (du po kaĝo). Ĉiuj bestoj estis enhavataj sub temperaturo-kontrolita kondiĉoj en 12-h-malpezaj / malhelaj cikloj, kaj kondutaj testoj okazis 4-5 h en la malpezan ciklon; manĝaĵo kaj akvo estis disponeblaj ad libitum krom se alie indikite. Proceduroj estis faritaj laŭ la Naciaj Sanaj Institutoj Gvidilo por la Prizorgado kaj Uzo de Laboratoriaj Bestoj (50) kaj estis aprobitaj de la Instituciaj Komitatoj pri Zorgoj kaj Uzo de McLean Hospital, la Universitato de Brita Kolumbio, kaj Scripps-Florido.

Immunohistoquímica kaj Mikroskopio.

Fluoresceco kaj arĝent-plibonigita oro imunabelabelado por orekso A aŭ prodinorfina estis faritaj sur sekundaj muskoloraj sekcioj laŭ antaŭaj raportitaj procedoj (51), kaj prilaborita laŭ normaj EM-protokoloj. Neoverlapping-regionoj de imunabeligita ŝtofo tiam estis hazarde selektitaj kaj fotitaj por kvantoro de partikloj uzante ImageJ-softvaron (Naciaj Institutoj de Sano) (SI Materialoj kaj Metodoj, Immunohistoquímica kaj Mikroskopio).

Elektrofiziologio.

Pikitaj pipetoj (3-5 MΩ) estis plenigitaj per 143-mM-glukonato, 10-m Hepes, 0.2-mM-EGTA, 2-mM-MgATP, 0.3-mM-NaGTP (kun pH de 7.2), kaj 270-280 mM-mOsmol. Datumoj estis akiritaj ĉe 20 kHz kaj filtritaj je 2 kHz uzante programon PClamp 10.0 (Molecular Devices). Post akirado de tut-ĉela agordo, ĉeloj estis fiksitaj per tensio ĉe −70 mV kaj serio de tensoraj ŝtupoj (250 ms, de −60 al −130 mV en 10-mV-paŝoj) estis aplikitaj por detekti hiperpolarigon (I_h) fluoj. I_h estis difinita kiel la ŝanĝo de fluo inter ∼30 ms kaj 248 ms post kiam la tensia paŝo estis aplikita. Enhava aktiveco de neŭronoj de VTA DA estis mezurata en aktuala-krampo. Eksperimentoj komenciĝis kiam stabila balotada rapideco estis atingita; substratoj tiam estis petitaj por 5-min kaj poste forvaporiĝis per artefarita ceraŭspina likvaĵo. La lastaj 3-minutoj de ĉiu 5-min-segmento estis uzataj por datumanalizo. Dynorphin A (1-17; 200 nM) kaj orexin A (100 nM) estis akiritaj de amerika peptido kaj dissolvitaj en distilita akvo. Ĉi tiuj koncentriĝoj estis trovitaj antaŭe praktiki saturantajn efikojn sur la ĉela aktiveco de VTA.5, 52). Thiorphan (1 μM) kaj bestatino (10 μM) estis akiritaj de Sigma-Aldrich, dissolvita en distilita akvo, kaj aplikitaj kune kun dinorfino A (SI Materialoj kaj Metodoj, Elektrofiziologio).

Analizo FLIPR.

OX₁R-agado estis taksita mezurante intracelulajn kalcio-nivelojn per FLIPR-analizo kiel priskribita antaŭe.53) (SI Materialoj kaj Metodoj, Fluorometric Imaging Plate Reader Assay).

ICSS.

Musoj estis enmetitaj kun monopolaraj stimulaj elektrodoj aŭ kanuleoj (PlasticsOne) sub ketamino / xilazino (80 kaj 10 mg / kg, respektive, ip; Sigma) direktitaj stereotakte al la LH (18) kaj / aŭ kontraŭpersonan VTA [de bregma: anteroposterior (AP), −3.2 mm; mediolateral (ML), −0.5 mm; dorsoventa (DV), −4.7 mm de la malmola]. Post 7-d periodo de reakiro, musoj estis trejnitaj por respondi por cerbaj stimuloj kiel priskribite antaŭe18). La plej malalta frekvenco, kiu subtenis (sojlon), estis kalkulita uzante minimumajn kvadratajn liniojn de plej bona analizo. Kiam musoj plenumis stabilajn kriteriojn por ICSS-sojloj (± 10% super 5 sinsekvaj tagoj), efikoj de drogaj traktoj estis mezuritaj. SB334867 (Scripps Florido) aŭ DMSO-veturilo ricevis dum alternaj tagoj uzante Hamilton-injektilon (0.1 mL / kg ip), kaj sojloj estis tuj kalkulitaj en 15-min-testaj sesioj. La norBNI (10 mg / kg ip; Sigma) ricevis en salaĵo (10 mL / kg) 48 h antaŭ la komenco de ICSS-testado.

La 5-CSRTT.

Ratoj estis manĝ-limigitaj (al 85% de libera nutra pezo) kaj trejnitaj en komputil-kontrolitaj funkciantaj ĉambroj loĝigitaj ene de ventumitaj, son-mildigaj kabinetoj (Med Associates), kaj 5-CSRTT-proceduroj efektivigitaj kiel priskribite (25). SB334867 (en DMSO, 0.1 mL / kg) kaj / aŭ kokaino (en salaĵo, 1 mL / kg; Sigma) estis donita per ip injekto 10 min antaŭ ol testi, kiel en aliaj eksperimentoj, kaj norBNI ricevis almenaŭ 48 antaŭ la komenco de testado (SI Materialoj kaj Metodoj, la 5-Elekto Seria Reakcia Tempo Tasko).

IV-Fara Mem-administrado.

Ratoj kaj musoj estis anestezitaj kun miksaĵo de isoflurano (1-3% vol / vol) vapora oksigeno kaj kirurgie preparita kun Silastic (VWR Scientific) kateteroj en la jugula vejno laŭ establitaj procedoj (54). Tuj post enmetado de katetero en la ratoj, duflankaj rustorezistaŝtalaj gvidaj kanonoj (23-mezurilo, 17 mm longa) estis enplantitaj en la VTA (de bregma: AP, 5.3 mm; ML, ± 0.7 mm; DV, −7.5 mm de dura ). Testado kun SB334867 aŭ norBNI dum 60-minutaj ĉiutagaj kunsidoj estis farita post kiam stabila kokaina konsumado estis atingita (<20% -vario en respondado dum 3 sinsekvaj tagoj; SI Materialoj kaj Metodoj, IV-Fara Mem-administrado).

Statistikoj.

Datumoj estas esprimitaj kiel meznombro ± SEM. Por ICSS-eksperimentoj, dudekaj ripetaj mezuroj ANOVA uzis por kompari rimedojn inter SB334867-traktita kaj norBNI + SB334867-traktitaj kondiĉoj. Unudirektaj ripetaj mezuroj ANOVA kun Newman-Keuls post hoc testoj kutimis kompari rimedojn ene de SB334867 kaj norBNI + SB334867-kondiĉoj. Unudirektaj ripetaj mezuroj ANOVA kaj Newman-Keuls-testoj ankaŭ estis uzitaj por kompari rimedojn en ĉiuj 5CSRTT-eksperimentoj. Duokiraj ripetaj mezuroj ANOVA uzis por kompari rimedojn inter kuracaj grupoj en eksperimentoj pri mem-administrado de kokaino kun OX₁R-kO-musoj. Unudirektaj ripetaj mezuroj ANOVA kaj Newman-Keuls-testoj estis uzitaj por kompari meznombrajn respondojn al orexino kaj dinorfino de VTA DA neŭronoj. Unudirektaj ripetaj mezuroj ANOVA- kaj Newman-Keuls-testoj ankaŭ estis uzitaj por kompari rimedojn de kokainokuirado en ratoj traktitaj kun SB334867 kaj norBNI. Diferencoj estis konsideritaj signifaj se P <0.05.

Ni dankas doktoron Garrett Fitzmaurice pro helpemaj komentoj pri la manuskripto kaj Miranda S. Gallo kaj Melissa Chen por helpo en datuma kolekto. Ĉi tiu laboro estis subtenata de subvencioj de Naciaj Sanaj Institutoj F32-DA026250 kaj K99-DA031767 (al JWM), F32-DA024932 kaj K99-DA031222 (al JAH), R01-DA023915 (al. PJK) kaj R01-MH063266 (al WAC) ) kaj per subvencio de malkovro de Naturaj Sciencoj kaj Inĝenieristika Esplorado (al SLB).

Deklaro pri konflikto-intereso: WAC tenas patenton (Usona Patento 6,528,518; Atribuanto: McLean Hospital) rilata al la uzo de kappa-opioidaj antagonistoj por la kuracado de depresiaj malordoj. Ĉiuj aliaj aŭtoroj deklaras neniujn konkurencajn financajn interesojn.

Ĉi tiu artikolo estas PNAS Rekta Submetiĝo.

Vidu Komentaron ĉe paĝo 5765.

Ĉi tiu artikolo enhavas subtenajn informojn rete ĉe www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1315542111/-/DCSupplemental.