چکیده
دگرگونی دندریتیک های ناشی از روان درمانی بر روی نورون های dopaminoceptive در nucleum accumbens (NAcc)، به عنوان یک واکنش عصبی سازگار مطرح شده است که با رفتارهای معتاد کننده طولانی مدت ارتباط دارد. NAcc عمدتا متشکل از دو زیرمجموعه های متمایز از نورون های کروی متوسط می باشند که بیانگر سطوح بالا یا گیرنده های دوپامین D1 یا D2 می باشند. در مطالعه حاضر، تراکم استخوانی ستون فقرات دندریتیک پس از درمان مزمن کوکائین در نورونهای نوری متوسط متوسط اندازه گیري شده با D1 یا D2 مورد بررسی قرار گرفت. این مطالعات استفاده از موش های ترانس ژنیک که EGFP را تحت کنترل پروموتر گیرنده D1 یا D2 (Drd1-EGFP یا Drd2-EGFP) بیان کردند. پس از روزهای درمان X-NUMX از درمان کوکائین و روزهای خروج 28، تراکم ستون فقرات در هر دو نورون Drd2-EGFP و Drd1-EGFP مثبت افزایش یافت. با این حال، افزایش تراکم ستون فقرات تنها در Neurons Drd2-EGFP مثبت 1 روز پس از خارج شدن از دارو حفظ شد. به طور قابل توجهی، افزایش بیان ΔFosB نیز در نورونهای Drd30-EGFP- و Drd1-EGFP-مثبت پس از 2 پس از ترک اعتیاد مشاهده شد، اما تنها در Neuron مثبت Drd2-EGFP مثبت پس از 1 از زمان ترک مواد مخدر. این نتایج نشان می دهد که افزایش تراکم ستون فقرات مشاهده شده پس از درمان مزمن کوکائین تنها در نورون های حاوی گیرنده D30 پایدار است و بیان ΔFosB با تشکیل و یا حفظ ستون های دندریتیک در D1 و همچنین نورون های حاوی گیرنده D1 در NAcc
مسیر دوپامینرژیک mesolimbic از نورون ها در ناحیه tentment ventral ایجاد می شود که هسته accumbens (NAcc)، غضروف بویایی، قشر prefrontal و amygdala (1)، در حالی که نورونهای دوپامینرژیک نگروستریاتات در موریتی نیررا (پارس کامپکتا) یک تصویر صعودی به ستون فقرات پشتی (2) داروهای روانگردان باعث افزایش غلظت سیناپسی دوپامین در NAcc: کوکائین، با مسدود کردن جذب دوپامین از شکاف سیناپسی و آمفتامین، با ترویج انتشار دوپامین از پایانه های عصبی (3-5) تجویز تکراری و متداول از داروهای روانپزشکی منجر به پاسخ های رفتاری افزوده (حساسیت) به اثرات تحریک حاد این داروها می شود.6-8) اکثر خطوط شواهد نشان می دهد که تغییرات انطباقی در منطقه تکتونال شکمی- سیستم NAPS dopaminergic برای تغییرات پلاستیک وابسته به تجربه که مبتنی بر رفتار ناشی از مواد مخدر است، مرکزی هستند.
علاوه بر دوپامین، گلوتامات برای توسعه حساسیت رفتاری در پاسخ به داروهای روانگردان مورد نیاز است (9, 10) نورونهای کروی متوسط (MSNs) در استریاتواژنتیک، طرح های گلوتاماترژی هیجان انگیزی از قشر پیشانی، که سیناپس بر روی سر ستون های دندریتیک است، دریافت می کنند. MSN ها همچنین هدف اصلی آکسونهای دوپامینرژیک هستند که سیناپس بر روی گردن های ستون فقرات (1, 11, 12) بنابراین، ستونهای دندریتی در MSNs نشان دهنده بخش سلولی است که در آن انتقال دوپامینرژیک و گلوتاماترگیک در ابتدا یکپارچه می شود.
دوپامین در دو زیرمجموعه گیرنده اصلی، subfamily D1 (زیرات) D1 و D5 و زیرشاخه D2 (D2، D3، و D4 زیر) (13) در مطالعات تشریحی پشتی پشتی، مطالعات آناتومیکی نشان داده است که NSS استرینایگالر دارای سطوح بالایی از گیرنده های D1 (همراه با ماده P و دینورفین) است، در حالی که MSNS striatopallidal عمدتا بیانگر گیرنده های D2 (همراه با آنکفاالین) (14-17) پیش بینی های NAcc پیچیده تر از ستون فقرات پشتی است؛ با پوسته و قسمت های اصلی NAcc که به زیرمجموعه های متمایز پالیدوم شکمی و منطقه تکتونمان شکمی و substantia nigra18) در حالی که گیرنده های D2 و انکفاالین در طرح های به پالیدوم شکمی بسیار ابراز می شود، گیرنده های D1 و ماده P به طور مساوی در طرح ها به پالیدوم شکمی و منطقه تکتونال شکمی (19) مطالعات آگونیست ها و آنتاگونیست های انتخابی برای گیرنده های D1 یا D2 نشان داد که هر دو گیرنده D1 و D2 برای تغییرات رفتاری وابسته به روان درمانی (20-25) با این حال، نقش این گیرنده ها متفاوت است. به عنوان مثال، تحریک گیرنده های D1 باعث کاهش جذب کوکائین ناشی از تزریق پودر کوکائین و نشانه های زیست محیطی مربوط به کوکائین می شود، در حالی که تحریک گیرنده های D2 باعث تسکین واکنش های ناشی از کوکائین (26-28).
اختلالات رفتاری مرتبط با اعتياد روانگردان بسيار طولانی است. بنابراین، علاقه زیادی به شناسایی تغییرات ناشی از داروهای طولانی مدت در سطح مولکولی و ساختاری در مدارهای عصبی تنظیم شده توسط دوپامین و گلوتامات (29-32) بدیهی است که در معرض قرار گرفتن در معرض بلند مدت کوکائین یا آمفتامین افزایش تعداد شاخه های دندریتیک و ستون های MSNS در NAcc (33-35) این تغییرات ساختاری ثابت شده است تا ماه ≈1-3.5 پس از آخرین قرارگیری دارو (30, 35) و پیشنهاد شده است که تغییرات طولانی مدت در پلاستیک سیناپسی مرتبط با قرار گرفتن در معرض روانی ایجاد شود.
هدف از مطالعه حاضر، بررسی تغییرات ساختاری کوکائین ساختاری ستونهای دندریتیک در زیر جمعیت های MSNS انباشته شده است که بیانگر گیرنده های D1 یا D2 می باشند. در این مطالعات ما از موش های ترانس ژنیک باکتری کروموزوم مصنوعی (BAC) استفاده می کنیم که EGFP را تحت کنترل پروموتر گیرنده دوپامین D1 (Drd1-EGFP) یا D2 (Drd2-EGFP)36) نتایج نشان می دهد که اگر چه افزایش چگالی ستون فقرات در ابتدا در MSNs حاوی گیرنده D1 و MSNs حاوی گیرنده D2 رخ می دهد، تراکم ستون فقرات تغییر یافته تنها در نورون های حاوی گیرنده D1 پایدار است. علاوه بر این، ما تغییرات مشابهی را در بیان فاکتور رونویسی ΔFosB پیدا می کنیم، که نشان می دهد ΔFosB ممکن است در تشکیل و / یا نگهداری ستون های دندریتیک در D1 و همچنین نورون های حاوی گیرنده D2 در NAcc دخیل باشد.
نتایج
تجزیه و تحلیل MSNs در Drd1-EGFP و Drd2-EGFP BAC موش های ترانسژنیک.
الگوی طرح MSNS از استریاتوم پشتی و درشت در موشهای تراریخته Drd1-EGFP یا Drd2-EGFP BAC از طریق تجزیه و تحلیل بیان GFP (36) بیان دیفرانسیل GFP در MSNs از striatum پشتی به طور کلی به آنچه که در گیرنده های D1 یا D2 درون زا است، مطابقت دارد (36) ما علاوه بر تحليل ديفرانسيل GFP در NAcc در موش Drd1-EGFP يا Drd2-EGFP (شکل 1a و b) گرچه ≈58٪ از نورون ها در NAcc بیانگر GFP در موش Drd1-EGFP (شکل 1a)، ≈48٪ از نورون ها در NAcc بیان GFP در موش Drd-2-EGFP (شکل 1b) MSNs نشان دهنده 90-95٪ از تمام نورون ها در NAcc (12, 37) گیرنده های D1 فقط در MSNS بیان می شوند و گیرنده های D2 در MSNs و در اینترنورون های کولینرژیک بیان می شوند که نشان دهنده 1-3٪ از نورون های استریاتیت (37) با در نظر گرفتن این عوامل، نتایج نشان می دهد که حداقل ≈10-15٪ از MSNs در NAcc احتمالا برای بیان گیرنده های D1 و D2 است.
تجزیه و تحلیل اسپاین های دندریتیک در موش Drd1-EGFP و Drd2-EGFP.
بیان GFP در موش Drd1-EGFP و Drd2-EGFP برای غربال کردن سلول های عصبی بدن مفید بود. با این حال، سیگنال GFP در دندریت ها و ستون های دندریتیک بسیار ضعیف بود تا تجزیه و تحلیل آنها پس از ایمن سازی با آنتی بادی های ضد GFP انجام شود. به تازگی برای تحویل بالستیک مولکولی رنگهای فلورسنت استفاده شده است تا بتوان مردم را به روش سریع و کارآمد (38) نورونهای کامل را می توان با استفاده از این تکنیک برچسب گذاری کرد، و این روش به نظر می رسد با رنگ آمیزی گلجی کوکس قابل مقایسه است. برای تجزیه و تحلیل مورفولوژی دندریتیک نورون در NAcc، با استفاده از یک تفنگ ژنی با لیزر فلوئورسانس لیپوفیلیک 1,1'-diotadecyl-3,3,3، 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) با استفاده از تفنگ ژنی برچسب گذاری شد. یک نمونه از MSN مضر DiI نمایش داده شده است شکل 1c. در شرایطی که مورد استفاده قرار می گرفت، ما به طور کلی نورون های علامت دار بدون هیچ گونه دندریت همپوشانی از دیگر نورون های برچسب دار مشاهده کردیم. در بزرگنمایی بالاتر، مورفولوژی دندریتی دقیق، از جمله دندانهای دندریتیک، می تواند مشاهده شود (شکل 1d).
سپس با استفاده از ترکیبی از برچسب DiI و ایمونوهیستوشیمی برای GFP در هر دو Drd1-EGFP یا Drd2-EGFP موشهای ترانس ژنیک استفاده شد که با استفاده از یک غلظت کم مواد شوینده برای نفوذپذیری بافت امکان پذیر بود (نگاه کنید به مواد و روش ها) با مقایسه دقیق رنگ دایلی و بیان GFP در هسته سلولهای MSNs، می توانیم Neiron های DiI- و GFP مثبت یا DiI مثبت و GFP منفی را در Drd1-EGFP (شکل 2a) یا Drd2-EGFP (شکل 2b) موش. برای مطالعات زیر، مورفولوژی دندریتیک را فقط در نورون های DiI- و GFP مثبت از موش Drd1-EGFP یا Drd2-EGFP بررسی کردیم.
نتایج درمان مزمن کوکائین موجب افزایش تراکم ستون فقرات در MSNs Accumbal بیان شده در هر دو Drd1-EGFP یا Drd2-EGFP.
موش Drd1-EGFP یا Drd2-EGFP به مدت چهار هفته متوالی با کوکائین (30 mg / kg) و یا سالین تزریق شد (نگاه کنید به مواد و روش ها) دو روز (2WD) و یا 30 روز (30WD) پس از آخرین درمان مواد مخدر، مغز برای برچسب گذاری DiI و ایمونوهیستوشیمی به عنوان شرح داده شده در بالا پردازش شده است. یک مطالعه قبلی نشان داد که درمان مزمن با آمفتامین باعث افزایش تراکم ستون فقرات در دندانه های دندانی اما نه پروگزیمال دندان های MSNS در NAcc35) بنابراین ما تجزیه و تحلیل خود را به دندریت های دندانی محدود کردیم (یعنی کسانی که شاخه های دوم یا سوم هستند)، از جمله مناطق ترمینال. هنگامی که در 2WD تجزیه و تحلیل شد، تراکم ستون فقرات در MSNs Drd1-EGFP مثبت (128٪ از گروه شور) (شکل 3a و c) و به میزان کمتر در نورونهای Drd2-EGFP مثبت (115٪ از گروه شور) (شکل 3 b و d) پس از 30WD تراکم ستون فقرات در نورونهای Drd1-EGFP مثبت (118٪ از کنترل شور) (شکل 3 a و c) اما در نورونهای Drd2-EGFP مثبت (شکل 3 b و d).
مورفولوژی ستونهای دندریتیکی از لحاظ طول و عرض سر ستون فقرات متغیر است. از این رو، ما در بخش 2WD از کوکائین، طبقهبندی دندریتیک را به چهار طبقه ستون فقرات (قارچ، قارچ، نازک و فلوپودیا) طبقهبندی کردیم (داده نشده است). تراکم نوع قارچ (119.7 ± 4.0٪، P <0.01) و خارهای نازک (120.0 ± 3.4٪ ، P 0.01/1 <) با درمان کوکائین در MSN های Drd182.4-EGFP مثبت افزایش یافت ، در حالی که تراکم کلفت (21.6/XNUMX ± XNUMX٪ ، P 0.05/122.5 <) و خارهای قارچ (5.0/XNUMX ± XNUMX/XNUMX٪) P <0.01) در MSN های Drd2-EGFP مثبت افزایش یافت. هیچ افزایش قابل توجهی در خارهای لک دار در سلولهای عصبی Drd1-EGFP مثبت یا خارهای نازک در سلولهای عصبی Drd2-EGFP مثبت وجود ندارد.
مزمن کوکائین موجب بیان ΔFosB در Drd1-EGFP- یا DrD2-EGFP-Positive MSNs در NAcc می شود.
ΔFosB یکی از اعضای خانواده Fos از عوامل رونویسی است. در حالی که مصرف حاد کوکائین موجب القاء سریع و موقت چند ایزوفرم Fos در NAcc می شود، مکرر مصرف کوکائین باعث افزایش سطح ΔFosB می شود. افزون بر این، افزایش بیان ΔFosB در هفته ها یا ماهها پس از قطع داروها در NAcc همچنان ادامه دارد و پیشنهاد شده است که در تنظیم طولانی مدت تنظیم بیان ژن، حتی پس از مصرف دارو (29, 39, 40).
برای بررسی القاء ΔFosB در NAcc از موش Drd1-EGFP یا Drd2-EGFP پس از درمان کوکائین، ما بیان FosB و GFP با برچسب دوگانه (شکل 4 و جدول 1) آنتی بادی anti-FosB تمام اشکال FosB را تشخیص می دهد، اما ما فرض می کنیم که افزایش immunostain نشان دهنده ΔFosB (see مواد و روش ها برای بحث بیشتر) در موش های درمان شده با شور، 16٪ از نورون های Drd1-EGFP مثبت و 15٪ از نورون های Drd2-EGFP مثبت نشان دهنده ایمنی فعال فعال FosB با شدت نسبتا ضعیف (شکل 4 a و b و جدول 1) درمان مجدد کوکائین به دنبال 2WD موجب افزایش قابل توجهی در تعداد نورون های Drd1-EGFP-مثبت شد که بیانگر ΔFosB (55٪ از نورون های مثبت GFP) (شکل 4c و جدول 1) افزایش کمتر، اما هنوز هم قابل توجهی در بیان ΔFosB در نورون های Drd2-EGFP مثبت (25٪ از نورون GFP مثبت) (شکل 4d و جدول 1) همانند تغییرات در تراکم ستون فقرات، افزایش بیان ΔFosB در نورون های Drd1-EGFP مثبت (46٪ از نورون های مثبت GFP مثبت)، اما در Neuron مثبت Drd2-EGFP مثبت (15٪ از نورون GFP مثبت) پس از 30WD (شکل 4 e و f و جدول 1) توجه داشته باشید که بیان ΔFosB افزایش یافته در شکل 4f در نورونهای Drd2-EGFP منفی وجود دارد.
بحث
اعتقاد بر این است که سازگاری طولانی مدت در انتقال دهنده های عصبی دوپامینرژیک، رفتارهای اعتیاد آور داروهای روانگردان را پایه ریزی می کند. به طور خاص، افزایش افزایش چگالی ستون فقرات دندریتیک MSNS در NAcc بر این باور است که با سازماندهی مجدد اتصالات سیناپسی (30) NAcc عمدتا متشکل از دو زیرمجموعه مجزا از MSNs است که سطح بالایی از گیرنده های D1 یا D2 دوپامین را بیان می کنند. در مطالعه حاضر، پس از درمان مزمن كوكائین، در ستون فقرات D1 یا DNSNUMX كه حاوی MSNS در D2 است، در گروه NAcc بررسی شده است. نتایج بدست آمده نشان می دهد که با وجود افزایش تراکم ستون فقرات در ابتدا در MSNs حاوی گیرنده D1 و MSNs حاوی گیرنده D2 رخ می دهد، تراکم ستون فقرات تغییر یافته تنها در نورون های حاوی گیرنده D1 پایدار است. علاوه بر این، ما یک الگوی مشابه تغییرات در بیان عامل فاکتور رونویسی ΔFosB در DNSNUMX و گیرنده D1 حاوی MSNS پیدا می کنیم.
این مطالعات از موش های ترانس ژن BAC که GFP را در زیرمجموعه های خاص MSNs تحت کنترل پروموتر گیرنده D1 یا D2 بیان می کنند، استفاده می کنند. علاوه بر این، ما یک روش دوبعدی را که ترکیبی از ایمونوهیستوشیمی برای GFP را با استفاده از الگوریتم های سلول های عصبی با استفاده از DiI ترکیب کردیم، توسعه دادیم. مطالعات قبلی با استفاده از روش Golgi-Cox برای تحلیل اثر روانگردان بر تراکم ستون فقرات (34)، و روش DiI که در اینجا استفاده می شود، نتایجی را که کمی قابل مقایسه است، ارائه می دهد. ما روش دوبعدی را توسعه دادیم زیرا رنگ آمیزی گلجی با ایمونوهیستوشیمی سازگار نیست. ايمونويزاسيون معمولا نياز به پرايمبيلاسيون بافت را با مواد شوينده اي دارد که فرآيندي است که به طور معمول منجر به محلولي رنگ هاي ليپوفيلي از غشاء مي شود (38) با این حال، در مطالعات فعلی، ایمن سازی GFP نیازی به غلظت زیاد مواد شوینده برای نفوذپذیری بافت نداشت و بنابراین می توانست در ترکیب با برچسب رنگ لیپوفیلیک استفاده شود. روش دوبعدی ما معمولا برای مطالعه تغییرات ساختاری در ستون فقرات دندریتیک مفید است، مثلا زمانی که برای تجزیه و تحلیل خطوط موش های ترانس ژنیک BAC که GFP در جمعیت خاصی از نورون ها در قشر بیان می شود (36).
گرچه هنوز هم تا حدودی بحث برانگیز است، معتقد است که گیرنده های D1 و D2 عمدتا به صورت آناتومیک به طور مستقیم به نورون های طرح ریزی ستریا ناتوری (striatonigral) و غیر مستقیم (striatopallidal) جدا می شوند (17, 41) تعریف اولیه مکان بندی GFP در موش Drd1-EGFP و Drd2-EGFP با این نتیجه گیری سازگار بود (36) علاوه بر این، تجزیه و تحلیل ما از تعداد نورون های GFP مثبت در NAcc از Drd1-EGFP و Drd2-EGFP موش صحت دارد با این نتیجه که ≈50٪ از MSNs فقط گیرنده های D1 را بیان می کنند که ≈35-40٪ تنها گیرنده های D2 را بیان می کنند، و ≈10-15٪ همگام سازی دو گیرنده D1 و D2 را نشان می دهد. این ارزش بیان همزمان مشابه با مطالعات استریاتوم پشتی است که تجزیه و تحلیل پچ-گیره های ترکیبی Neurons single striatal با تکنیک های RT-PCR برای جداسازی و تقویت mRNA ها (≈17٪ بیان همزمان enkephalin و ماده P) (42) لازم به ذکر است که مطالعات ما در حال حاضر به مسئله بیان گیرنده های D3، D4 و D5 نمی پردازد و همچنین در مورد سطح پایین بیان بیان کننده گیرنده های D1 در MSNS که بیانگر سطح بالایی از گیرنده های D2 و یا برعکس است، نمی پردازد.
در چندین مطالعه قبلی، موضع گیری عصبی از بیان Fos ناشی از روان درمانی و نقش گیرنده های D1 و D2 (43-45) این مطالعات به این نتیجه رسیدند که القاء Fos و ΔFosB بوسیله فعال سازی گیرنده های D1 متصل می شوند. با این حال، موضع گیری سلولی بیان Fos تحت تاثیر قرار محیط زیست که در آن داروهای روانی تحریک کننده ()46, 47) به عنوان مثال، آمفتامین یا کوکائین که در قفس خانگی تولید می شود، ژنهای سریع اولیه (از جمله FOS) را به طور عمده در سلولهای P-مثبت قرار می دهند که ژنهای D1 را به هم متصل می کنند. در مقابل، این داروها می تواند بیان FOS را در هر دو MSNS حاوی گیرنده D1 و D2 منجر شود در محیط جدید. پروتکل مورد استفاده در مطالعات فعلی ما شامل جفت گیری تزریق دارو با قرار گرفتن در معرض یک محیط جدید نیست. با این حال، ما نمی توانیم برخی از استرس وابسته به زمینه را که مسئول بیان بیان αFosB در MSNs حاوی گیرنده D2 است، رد کنیم.
یک ویژگی قابل توجه از نتایج کنونی، الگوی موازی افزایش تراکم ستون فقرات و بیان ΔFosB بود. افزایش تراکم ستون فقرات و بیان ΔFosB در ابتدا در MSNs بیان شده Drd1-EGFP و Drd2-EGFP رخ داد. با این حال، این تغییرات فقط در نورونهای گیرنده D1 پایدار بودند. یک توضیح احتمالی برای مشاهده که تراکم استخوانی ستون فقرات و بیان ΔFosB در مدت کوتاهی در نورونهای حاوی گیرنده D2 یافت می شود این است که در بخش کوچکی از MSNs که همگام سازی گیرنده های D1 و D2 دوپامین را نشان می دهد. بنابراین، طبیعت گذرا از این افزایش می تواند با اثرات آنتاگونیستی فعال سازی گیرنده D2 در مسیرهای سیگنالینگ وابسته به D1 (48) علاقه مند است که تغییرات در تراکم ستون فقرات و بیان ΔFosB برگشت پذیر باشند، که ممکن است منعکس کننده توانایی مسیرهای سیگنالینگ وابسته به گیرنده D2 برای تأثیر بر ثبات ΔFosB باشد.
مشاهدات که تغییرات موازی در بیان ΔFosB و تراکم ستون فقرات وجود دارد، سازگار با ایده است که ΔFosB در تشکیل اولیه و نگهداری بعد از ستون دندریتیک در نورون های حاوی گیرنده D1 در NAcc درگیر است. بیان ΔFosB توسط مسیر سیگنالینگ وابسته D1 / DARPP-32 / PP1 در MSNs کنترل می شود (49) مطالعات متعددی نشان داده است که ΔFosB نقش مهمی در فعالیت های جبرانی و فعال سازی حرکتی بیماران روانی (39)، احتمالا با تأثیر بر بیان ژنهای متعدد که شامل گیرنده های نوروترانسمیتر، پروتئین های سیگنال دهنده و پروتئین های دخیل در تنظیم مورفولوژی عصبی (50) با این حال، مکانیزم های مولکولی خاصی در شکل گیری ستون فقرات ناشی از کوکائین مزمن در حال حاضر شناخته شده نیست. مطالعات قبلی ما نشان داده است که تزریق intraaccumbal از مهار کننده Cdk5 roscovitine موجب کاهش کوکائین ناشی از تراکم ستون فقرات (51) علاوه بر این، Cdk5 یک ژن هدف نهایی برای ΔFosB است و در تغییرات سازگاری جبرانی مرتبط با درمان مزمن کوکائین (52) بنابراین، تغییر در فسفریلاسیون وابسته به Cdk5 مکانیسم قابل قبولی است که پایه تشکیل ستون فقرات ناشی از کوکائین و / یا پایداری ستون فقرات است. PAK (53)، β-كاتنين (54)، PSD-95 (55) و اسپینوفیلین (56) زیربنایی برای Cdk5 هستند و همه در تنظیم مقاربت مفاصل ستون فقرات (57-60) بدست آوردن ویژگی های بیشتر این و دیگر زیربناهای Cdk5 در ستون فقرات، امیدواریم در مورد مکانیزم هایی که در تنظیم شکل گیری ستون فقرات توسط روانگردان ها وجود دارد، روشن شود.
مواد و روش ها
حیوانات
موش هایی که یک ژن EGFP را تحت کنترل گیرنده های D1 یا D2 دوپامین می کنند، توسط پروژه ترانس ژن Gensat BAC (36) موش های ترانسژنیک مورد استفاده در این مطالعه 4-5 هفته ها بودند و در زمینه سوئیس و وبستر بودند. موش ها در چرخه نور / تاریکی 12: 12-h نگهداری می شدند و در گروه های 2-5 با غذا و آب موجود در دسترس قرار می گرفتند. تمام پروتکل های حیوانی مطابق با راهنمای موسسات ملی بهداشت برای مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی بود و توسط کمیته مراقبت از حیوانات و موسسات موسسه تحقیقاتی راکفلر تأیید شد.
درمان دارویی
گزارش شده است که درمان مزمن کاکائو (30 mg / kg در روز) باعث افزایش شدید چگالی ستون فقرات MSNS در هسته و پوسته NAcc از موش صحرایی می شود، اما دوز پایین تر (15 mg / kg) افزایش تراکم ستون فقرات تنها در پوسته (61) بنابراین ما دوز بالاتر کوکائین را برای ایجاد تغییرات ساختاری در هر دو قسمت NAcc استفاده کردیم. موش ها یک تزریق (ip) 30 mg / kg کوکائین-HCl (یا سالین) هر روز برای روزهای متوالی 5 دریافت کردند و پس از آن روزهای تزریق آزاد 2 دریافت شد و این روش برای هفته های متوالی 4 تکرار شد. تزریق در قفس خانه انجام شد. 2WD یا 30WD، مغز ماوس برای برچسب گذاری DiI و / یا ایمونوهیستوشیمی پردازش شد.
برچسب زدن Ballistic با فلورسنت Dye DiI.
موشها با پنتوباربیتال سدیم mg / kg 80 بیهوشی و با پروتئین با پروتئین 5 میلی لیتر PBS فورسپس شدند و سپس پرفیوژن سریع با ml 40٪ paraformaldehyde در PBS (4 ml / min) به طور کامل انجام شد. مغزها به سرعت از جمجمه خارج شده و بعد از 20٪ paraformaldehyde به مدت 4 دقیقه تنظیم می شوند. برش های مغزی (10 μm) با تحویل بالستیک دی اوری فلورسنت (پروتئین مولکولی) که در Ref. 38. روش ترکیبی DiI labeling-immunohistochemistry با غلظت کم مواد شوینده ساخته شده است. بخش های مارپیچ DiI با 0.01٪ Triton X-100 در PBS برای 15 دقیقه permeabilized و سپس در 0.01٪ Triton X-100 و 10٪ سرم نرمال بز در PBS برای 1 h به منظور به حداقل رساندن برچسب ناسازگار اختصاص داده شد. سپس بافت 1٪ Triton X-0.01 و آنتی بادی ضد GFP (Abcam، Cambridge، MA) با 100٪ 2٪ در دمای اتاق، شسته شد و در یک رقیق 1: 1,000 از FITC- آنتیبادی ثانویه کنجوج شده (Probes مولکولی). بخش ها بر روی اسلاید های میکروسکوپ قرار داده شده و با محفظه نصب قرار می گیرند. روش برچسب زنی ballistic اجازه تجزیه و تحلیل دقیق از ساختار ستون فقرات دندریتیک را داده است و نتایج به دست آمده با استفاده از روش اشباع Golgi-Cox در دانه های موش (34) با این حال، در مقایسه با مطالعات قبلی، ما به ندرت ستون های دو سر را در نورون های رنگ آمیزی DiI مشاهده می کنیم. این تفاوت ممکن است به دلیل حساسیت روش های رنگ آمیزی یا تغییرپذیری موش (این مطالعه) نسبت به بافت موش (34).
ایمونوهیستوشیمی
حیوانات بیهوش شده و پرسیده می شوند همانطور که در بالا توضیح داده شد. مغزها بر روی 4٪ پارا فرمالدهید در 4 ° C برداشته شدند و در طول شب ذخیره شدند. مغزها به سدیم 30٪ در محلول PBS برای حفاظت از گندم منتقل شدند. بخش کرونال (12 μm) بر روی میکروتوم انجماد (Leica) برش داده شد و سپس برای ایمونوهیستوشیمی پردازش شد. سپس قطعات مغزی در 0.3٪ Triton X-100 در PBS برای 15 دقیقه و دو بار در PBS شستشو داده شد. این بخش ها در 10٪ سرم نرمال بز در PBS برای 1 ساعت در 37 ° C قرار گرفتند و در یک شب در 1 ° C در معرض آنتی بادی های اولیه (رقیق شده در 4٪ سرم نرمال بز بزور در PBS) و سپس در PBS شستشو داده شد و با ثانویه آنتی بادی ها برای 1 ساعت در 37 ° C. از آنتی بادی های زیر استفاده شد: خرگوش ضد پان FosB (SC-48، 1: 500؛ Biotechnology Santa Cruz)، موش ضد NeuN (Chemicon)، ضد GFP خرگوش، IgG ضد خرگوش کنترلی FITC و Rhodamine- ضد IgG موش (مولکول پروب). برای برچسب گذاری سه گانه (ΔFosB، NeuN و GFP)، بخش مغز ابتدا با آنتی بادی anti-pan FosB و آنتی بادی anti-NeuN immunocontained شد و سپس با آنتیبادی های ثانویه (IgG ضد خرگوش کنوداود رودامین و IgG ضد موش صحرایی سینوسی ) بخش های مغز دو رنگی برای ایمن سازی GFP با استفاده از فن آوری Zenon labeling (Zenon Alexa Fluor 488، Molecular Probes) بیشتر مورد پردازش قرار گرفتند. آنتی بادی anti-pan-FosB به ترمینال N FosB افزایش یافت و ΔFosB و FosB کامل (62) بر اساس مطالعات قبلی که نشان داد که ΔFosB اما FosB یا سایر آنتی ژن های مرتبط با Fos به طور ثابت پس از درمان کوکائین مزمن بیان می شود، ما فرض می کنیم که افزایش طولانی مدت در ایمنی فعال، نشان دهنده بیان پایدار ΔFosB است. با این حال، هویت سیگنال FosB ایمنوراسیون مشاهده شده در موشهای درمان شده با شور در ناشناخته است. تجزیه و تحلیل آماری در جدول 1 دانش آموز مورد استفاده قرار گرفت t آزمون.
تجزیه و تحلیل ستون فقرات دندریتیک.
MSNS های شخصی در NAcc برای تجزیه و تحلیل ستون فقرات بر اساس چند معیار انتخاب شدند. (i) حداقل یا بدون همپوشانی با سایر سلول های برچسب دار وجود دارد تا اطمینان حاصل شود که فرآیندها از سلول های مختلف محرمانه نیست. (ii) حداقل سه دندریت اولیه برای سلول هایی که برای تجزیه و تحلیل مورد استفاده قرار می گیرند مورد نیاز است. (III) دندریت های دیستال (دندریت های ترمینال یا نزدیک به دندریت ترمینال) مورد بررسی قرار گرفتند. دندریت از هر دو MSN در هسته و پوسته NAcc مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. اگرچه ما MSN های کم مهره (نوع خاردار II) را مشاهده کردیم ، اما ما فقط MSN های خار ستون فقرات (نوع I خاردار) را تحلیل کردیم. برای محاسبه تراکم ستون فقرات ، طول دندریت (با طول> 20 میکرومتر) با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال (Zeiss LSM 510) با لنز غوطه وری روغن (40 ×) ردیابی شد. تمام تصاویر دندریت ها در عکس های مختلف گرفته شده است z سطوح (0.5-1 μm) برای بررسی مورفولوژی ستونهای دندریتیک. تمام اندازه گیری ها با نرم افزار تجزیه و تحلیل تصویر متامورف (Universal Imaging، Downingtown، PA) ساخته شد. تجزیه و تحلیل آماری از آزمون Kolmogorov-Smirnov استفاده کرد.
پیشانی از دندریت ها به چهار نوع بر اساس طول آنها طبقه بندی شده اند که در Refs شرح داده شده است. 63 و 64. برجستگی های کلاس 1 که به آن برجستگی های لک نیز گفته می شود ، طول آنها کمتر از 0.5 میکرومتر بود ، فاقد سر بزرگ ستون فقرات بود و به نظر نمی رسد گردن داشته باشد. کلاس 2 یا خارهای قارچی شکل بین 0.5 تا 1.25 میکرومتر طول داشتند و با گردن کوتاه و سر بزرگ ستون فقرات مشخص می شدند. کلاس 3 یا ستون فقرات نازک ، بین 1.25 تا 3.0 میکرومتر متغیر بوده و دارای گردن های ستون فقرات کشیده با سرهای کوچک است. کلاس 4 یا پسوندهای فیلوپدیال ، برجستگی های رشته ای بلندی بود که فاقد سر ستون فقرات بود.
تشکر و قدردانی
این کار توسط خدمات عمومی بهداشت Grant DA10044 ایالات متحده (به PG و ACN) و بنیاد سیمونز، بنیاد پیتر جی شارپ، بنیاد پیکورور و بنیاد کریبی حمایت شد.
اختصارات
- NAcc
- هسته accumbens
- MSN
- نورون کبدی متوسط
- BAC
- کروموزوم مصنوعی باکتریایی
- Drd1
- گیرنده Dopamine D1 رانده شده توسط پروموتر
- Drd2
- گیرنده Dopamine D2 رانده شده توسط پروموتر
- دی
- 1,1'-diotadecyl-3,3,3 '، 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate
- 2WD
- 2 روز پس از آخرین درمان دارویی
- 30WD
- 30 روز پس از آخرین درمان دارویی.
منابع
;