Cdk5 فسفریلاتین Dopamine D2 گیرنده و ضعیف سیگنالینگ پایین (2013)

نظرات: به نظر می رسد نشان می دهد که Cdk5 موجب کاهش تنظیمات گیرنده های Dopamine D2 می شود. شگفت آور، عامل ترجمه دلتا فسب باعث تولید Cdk5 می شود.

Jeong J، Park YU، Kim DK، Lee S، Kwak Y، et al. (2013) PLoS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

چکیده

گیرنده دوپامین D2 (DRD2) یک گیرنده کلیدی است که میان عملکردهای مغز مرتبط با دوپامین مانند خلق و خوی، پاداش و احساسات متمرکز است. کیناز وابسته به سیکلین 5 (Cdk5) یک سریین / ترئونین کیناز با پرولین است که عملکرد آن در مدار پاداش مغز دخیل است. در این مطالعه، ما نشان دادیم که باقی مانده سریین 321 (S321) در حلقه درون سوم سلولی DRD2 (D2i3) یک سایت قانونی جدید Cdk5 است. فسفریلاسیون وابسته به Cdk5 از S321 در D2i3 در در شرایط in vitro و سیستم های کشت سلولی.

ما همچنان مشاهده کردیم که فسفوریلاسیون S321 باعث کاهش بیان سطح DRD2 و تحریک سطح Aggonist و کاهش اتصال پروتئین G به DRD2 می شود. علاوه بر این، مسیر cAMP downstream در سیستم heterologous و در فرهنگ های اولیه نورون از جنین های ناکارد p35 تحت تاثیر کاهش فعالیت مهاری DRD2 تحت تأثیر قرار گرفت. این نتایج نشان می دهد که فسفریلاسیون SDNXX با استفاده از CDK5 مهار عملکرد DRD321 را فراهم می کند، ارائه یک مکانیزم جدید نظارتی برای سیگنالینگ دوپامین.

آمار و ارقام

ارجاع: Jeong J، Park YU، Kim DK، Lee S، Kwak Y، et al. (2013) Cdk5 فسفریلاتین Dopamine D2 گیرنده و ضعیف سیگنالینگ Downstream. PLoS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

تدوین: جیمز پورتر، دانشگاه داکوتای شمالی، ایالات متحده آمریکا

اخذ شده: مه 20، 2013؛ پذیرفته شده: نوامبر 14، 2013؛ تاریخ انتشار: دسامبر 31، 2013

کپی رایت: © 2013 Jeong و همکاران. این یک مقاله دسترسی آزاد است که تحت شرایط آن توزیع شده است مجوز صدور مجوز خلاقیت های رایج، که اجازه استفاده، توزیع و بازتولید نامحدود را در هر وسیله می دهد، ارائه دهنده منبع و منبع اصلی است.

بودجه: این کار توسط دولت کره ای (MSIP) کمک های مالی (NRF-2012R1A2A2A01012923 و NRF-2012R1A4A1028200) پشتیبانی می شود و همچنین تحت حمایت برنامه های همکاری بین المللی تحت مدیریت NRF کره (2012K2A1A2033117) و موسسه تحقیقات مغز کره (KBRI) برنامه تحقیقاتی پایه MSIP (2031-415). SKP دریافت کننده جوایز جوایز جوان اسکیزوفرنیا و افسردگی (NARSAD) بود که از اتحادیه ملی 2004 و 2006 ملی بود. تأمین کنندگان نقشی در طراحی مطالعه، جمع آوری و تجزیه و تحلیل داده ها، تصمیم گیری در مورد انتشار یا تهیه نسخه ی خطی نداشتند.

منافع رقابت: نویسندگان اعلام کرده اند که منافع رقابتی وجود ندارد.

معرفی

سیگنالینگ دوپامین در عملکرد مغزهای مختلف شامل هماهنگی حرکتی، کنترل روح و مکانیسم پاداش است [1]. یک جزء اصلی سیگنالینگ دوپامین در مهره داران توسط نورون های کروی غشایی (MSNs) که به صورت انتخابی یک زیر مجموعه از گیرنده های دوپامین را بیان می کنند و دریافت ورودی های دوپامینرژیک را عمدتا از منطقه Ventricular Tmental (VTA) و substantia nigra (SN) [2]. گیرنده های دوپامین GTP-گیرنده های پروتئینی G (GPCR) با 7 دامنه فرابنفش هستند و شامل دو نوع زیر هستند: D1-like and D2-like receptors that mediate action reciprocal in dopamine signaling [1]. به عنوان مثال، گیرنده های Dopamine D1 مانند (D1، D5) آدنینیل سیکلاز را از طریق Gαs و افزایش سطح داخل سلولی cAMP، اما گیرنده های D2 مانند Dopamine D2 (D3، D4، DXNUMX) مهار adenylyl cyclase از طریق Gαi و سطح داخل سلولی cAMP را کاهش می دهد [1], [3].

از جمله گیرنده های dopamin، گیرنده D2 (DRD2) در پاتوفیزیولوژی اختلالات متعدد روانپزشکی شامل اسکیزوفرنی و اعتیاد به مواد مخدر [4]، به طوری که بسیاری از داروهای ضدپسیکوتیک حداقل تا حدی DRD2 را هدف قرار می دهند. همچنین شناخته شده است که فعالیت DRD2 به خوبی با پیامدهای رفتاری داروهای سوء استفاده در مدل های حیوانی ارتباط دارد [5]. داروهای ضد افسردگی و اثربخشی تثبیت کننده حالت نیز با تغییرات در بیان سطح سیگنال DRD2 یا سیگنالهای داخل سلولی در پایین سلول بوسیله PKA، ERK و GSK3 مرتبط است [1], [4], [6]. با وجود این نقش های حیاتی برای DRD2 در مغز، مکانیزم های دقیق تنظیم کننده ای که ناهمگونی و پیچیدگی را به خواص DRD2 می رساند، به طور کامل درک نمی شود.

خطوط تلفیقی شواهد نشان می دهد که تعدادی از تغییرات بعد از ترجمه در تنظیم صحت فعالیت DRD2 دخیل هستند. گلیکوزیلتینگ گسترده ای از DRD2 در مطالعات زودهنگام عکسبرداری نشان داده شده است [7]و تشکیل پیوند دیسولفید در DRD2 نیز به عنوان یک اصلاح مهم برای اتصال لیگاند شناخته شده است [8]. علاوه بر این، سایت های فسفوریلاسیون DRD2 ابتدا توسط شناسایی شدند در شرایط in vitro آزمایش با رادیو ایزوتوپ ها، فراهم کردن راه های مختلف مسیرهای تنظیم کننده ای که بوسیله کیناز های مختلف بوجود می آیند [9]. در واقع، پروتئین کیناز C (PKC) تنظیم کننده متصل کردن DRD2 از کلسیم داخل سلولی است و مداخله متابولیسم DRD2 با پروتئین های سیتو اسکلتی [10]. فسفریلاسیون توسط GPCR kinase 2 (GRK2) تنظیم کننده های حساسیت زدایی آگونیست های DRD2 [11].

کیناز وابسته به سیکلین 5 (Cdk5) یک سریین / ترئونین کیناز با پرولین است که دارای فعالیت ترجیحی است به دلیل بیان خاصی از مغز فعال کننده های آن، p35 و p39 [12]. Cdk5 در فرآیندهای مختلفی از جمله انتقال مورب و راهنمای آکسون دخالت دارد و موشهای Cdk5 و p35 null در لایه های قشر کورتیکال [13]. اخیرا نشان داده شده است که فسفوریلاسیون WAVE1 و اپی اکسیژن توسط Cdk5 تنظیم مورفوژنز ستون فقرات دندریتیک [14]. علاوه بر این، Cdk5 همچنین سطوح بیان سطح NMDA گيرنده NMDA، NR2B و NMDA را تحت تأثير NR2A تنظيم می کند [15], [16]. قابل توجه است که شواهد متعدد از شواهد نشان می دهد رابطه صمیمانه بین Cdk5 و سیستم dopamine. Cdk5 فسفریلید تیروزین هیدروکسیلاز (TH)، تنظیم ثبات آن، و در نتیجه حفظ homeostasis dopaminergic [17]. در نورونهای Postynaptic، زمانی که پسماند T75 از Dopamin و cyclic-AMP تنظیم شده فسفو پروتئین 32kD (DARPP-32) توسط Cdk5 فسفورید می شود، می تواند فعالیت PKA را مهار کند و به این ترتیب سیگنالینگ PKA متعهد dopamine DRD1 متوقف می شود [18]. جالب توجه است، هنگامی که کوکائین، یک آگونیست غیرمستقیم از گیرنده های dopamin، در موش ها به طور مداوم به اجرا در می آید، سطح mRNA و پروتئین Cdk5 در نورون های نخاعی متوسط ​​افزایش می یابد [19]. به طور خلاصه، Cdk5 به نظر می رسد در سازگاری های سیناپسی ناشی از مواد مخدر دخالت داشته باشد. در این مطالعه، ما یک تعامل کاربردی DRD2 و Cdk5 را نشان می دهد که بیشتر نقش Cdk5 را در سیگنالینگ دوپامین نشان می دهد.

مواد و روش ها

آنتی بادی

سرم ضد خرگوش در برابر پپتید هایی حاوی فسفو-سریین 321 (pS321) از حلقه درون سلولی سوم DRD2 (D2i3) مطرح شد. فسفوپپتید، CNPDpSPAKPEK (PEPTRON)، برای ساخت یک ستون کنجوپتید شده برای پپتید برای تصفیه هوشی (20401، PIERCE) استفاده شد. آنتی بادی anti-pS321 با استفاده از یک سیستم تصفیه وابسته پس از دستورالعمل سازنده، غنی شد. آنزیم فسفات خالص در PBS با 0.1٪ سدیم آزید و 0.1٪ ژلاتین ذخیره شد. آنتی بادی anti-Cdk5 Anti-mouse (sc-249) و آنتی بادی ضد p35 anti-خرگوش (sc-820) برای غربالگری و ایمونوسیتوشیمی Cdk5 / p35 مورد استفاده قرار گرفت. آنتی بادی anti-GFP anti-mouse (sc-9996) برای immunoprecipitation و Western blotting DRD2-GFP استفاده شد. آنتی بادی anti-FLAG ضد خرگوش (sc-807)، آنتی بادی anti-HA ضد خرگوش (sc-805)، آنتی بادی anti-GST anti-mouse (sc-138) و آنتی بادی anti-GAPDH anti-mouse (sc- 32293) از Biotechnologies سانتا کروز خریداری شد.

حیوانات

موش ناکافی p35 یک هدیه دلخواه از دکتر Katsuhiko Mikoshiba در موسسه علوم مغزی RIKEN در ژاپن بود و برای فرهنگ نورون اولیه استفاده می شود. مجموعه ژنوتیپهای اولیه شامل 5'GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG، 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC و 5'- TCCATCT GCACGAGACTAGT همانطور که قبلا شرح داده شده است [20]. موش های ICR و موش های Sprague Dawley برای آماده سازی لیزات مغز استفاده می شوند. تمام روش های حیوانی توسط کمیته مراقبت و مراقبت از حیوانات موسسه علمی و فناوری Pohang تایید شده است.

ساخت پلاسمید

ایزوفرم طولانی انسان DRD2 در یک بردار پلاسمید EGFP-N1 و حلقه درون سلولی سوم DRD2 (212-373 بقایای آمینو اسید از جمله بقایای آمینو اسید اضافی 29 منحصر به ایزوفرم طولانی DRD2) در یک پلاسمید pFLAG-CMV-2 استفاده شد. انسان Cdk5 در یک پلاسمید pCMV-HA قرار داده شد و p35 انسان در یک پلاسمید pcDNA 3.1 قرار داده شد. انسانی Cdk5 تحت یک پروموتر سیتومگالوویروس (CMV) همراه با p35 انسان در یک بردار pcDNA 3.1 قرار داده شد تا یک ساختار دوبعدی (Cdk5 / p35) برای ایمونوسیتو شیمیایی، آزمون داخلی شدن گیرنده، [35S] -GTPγS آزمون اتصال، تست اتصال اتصال radioligand و آنزیم cAMP immunoassay.

در شرایط in vitro تست کیناز

مرتبط با آی پی در شرایط in vitro تست کیناز به صورت زیر انجام شد. یک مغز تمام موش در لیزر لیزر اریتروسیت 3 (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0)، 250 mM NaCl، 5 mM EDTA، 0.1٪ NP-40) با سکته های 20 از یک هموژنیزاسیون Dounce برای لیزات مغناطیسی همگن شد . لیزات روی یخ برای 30 دقیقه، سانتریفیوژ و سانتریفوژ در 16,000 × g برای 10 دقیقه برای تولید یک مجموعه فعال Cdk35 / p5، سوپروانانت ها با آنتی بادی ضد خرگوش anti-p35 ايمن گرديدند. پروتئین ترکیبی پیچیده و پاک شده Gd Cdk5 / p35 با آدنوزین 5-triposfate، [γ-32P] (NEG-502H، PerkinElmer) و در بافر کیناز (30 mM HEPES (pH 7.2)، 10 mM MgCl2، 0.2 mM DTT) برای 1 h در دمای اتاق [18], [21]. مجتمع Cdk5 / p25 خالص (14-516، Millipore) همچنین برای در شرایط in vitro آزمون کیناز همانطور که در بالا توضیح داده شد. بافر جذب نمونه 2 × به مخلوط واکنش اضافه شد و در دمای 100 ° C جوشانده شد. سپس نمونه ها به SDS-PAGE منتقل و ژل خشك شده توسط autoradiography ارزيابي شد.

کروماتوگرافی مایع (LC) -Mass Spectrometry (MS) / تجزیه و تحلیل MS

پروتئین GST-D2i3 نوترکیب با استفاده از LC-MS / MS پس از پیوند IP در شرایط in vitro تست کیناز ما داده های LC-MS / MS پپتید را با استفاده از X !! Tandem (نسخه Dec-01-2008) انجام دادیم. هر فایل داده RAW ابتدا به mzXML با استفاده از خط انتقال پروتئومیک (TPP؛ نسخه 4.3) تبدیل شد. اسکن MS / MS در mzXML های تبدیل شده سپس به دنبال پایگاه داده توالی پروتئین موس UniProt (انتشار 2010_07) از جمله توالی GST-D2i3 با استفاده از X !! Tandem مورد بررسی قرار گرفت. تحمل به 3 Da برای یون های پیش ساز و 2 Da برای یون های قطعه تعریف شد. خصوصیات آنزیم برای تریپسین استفاده شد. گزینه های اصلاح متغیر برای کربامیدیمتیلیسیون سیتئین (57.021 Da)، اکسیداسیون متیونین (15.995 Da)، هیدرولیز آسپاراژین (0.987 Da) و فسفوریلاسیون سریین (79.966 Da) مورد استفاده قرار گرفت.

ايمن زدايي

ایزوتوپهای ایزوله در لیزات سلولی در بافر لیز ELB انجام شد. آنتی بادی ضد GFP به لیزات اضافه شد و برای 3 ساعت در 4 ° C انکوباتور شد. ايمونوكپلكس ها با استفاده از پروتئين A آگاروز پاکسازي شدند. رسوب ها با استفاده از بافر SDS نمونه برای 30 دقیقه در 37 ° C، و تحت SDS-PAGE و Western blots مورد آزمایش قرار گرفتند.

آزمون GST پایین کشیدن

10 میکروگرم خالص GST و GST-D2i3 با لیزات مغز موش صحرایی برای 1.5 ساعت در 4 ° C انکوباس شدند. 30 μL دانه های Sepharose 4B (XHNUMX-17-0756، GE Healthcare) با گلوتاتیون (GSH) متعادل با بافر لیز اضافه شده و برای 01 h اضافه شد. دانه ها توسط سانتریفوژ در 1 × جمع آوری شدندg و شستشو با بافر لیزر 4 بار [22], [23]. رسوبات با استفاده از وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی های ضد Cdk5 و anti-p35 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.

ایمونوسیتوشیمی

سلول های HEK 293 منتقل شده و نورون های استریاتال که بر روی روکش ها کشت شده اند، یکبار با محلول فسفات بافر (PBS) شسته شدند و توسط غوطه وری در 4٪ پروپرانالدئید / PBS سرد برای 30 دقیقه ثابت شد. آنتیبادی اولیه در محلول مسدود کننده (2٪ سرم اسب و 1٪ Triton X-100 در PBS رقیق شد). آنتی بادی ضد موش های مخلوط Alexacluor-647 (A20990، Invitrogen) و آنتی بادی ضد خرگوش مخلوط Alexacluor-568 (A11011، Invitrogen) به عنوان آنتی بادی ثانویه مورد استفاده قرار گرفت. Hoechst برای رنگ آمیزی هسته استفاده می شود. تصاویر توسط میکروسکوپ پاپوکال (Olympus، FluoView-1000) به دست آمد.

آزمون داخلی شدن گیرنده

24 h بعد از انتقال، سلول ها با 1 μM quinpirole (Q102، Sigma) برای 30 دقیقه و 90 دقیقه در 37 ° C تحت درمان قرار گرفتند. سلول ها در 2 میلی لیتر PBS سرم و برای هر واکنش از XLUMX μL برای هر واکنش استفاده شد. درمان مواد مخدر در دمای اتاق برای 200 ساعت در غلظت های زیر انجام شد؛ 3 nM [3H] -spiperone (NET-565، PerkinElmer)، 3 μM sulpiride (895، TOCRIS)، 10 μM هالوپریدول (H1512، سیگما). آبگریز [3H] -spiperone برای نشان دادن گیرنده های کل بیان شده مورد استفاده قرار گرفت و از سولپیرید هیدروفیلی برای جایگزینی گیرنده غشایی استفاده شد [3H] -spiperone سیگنال سیگنال گیرنده مرتبط با غشاء، با تفریق مقادیر گیرنده داخل سلولی از کل مقدار گیرنده بیان شده محاسبه شد. سلول ها بر روی یک فیلتر GF / B (Millipore) فیلتر شده و 3 بار با بافر شستشو (50 mM Tris-HCl (pH 7.4)، 100 mM NaCl) شسته شد. فیلترها خشک شدند و رادیواکتیو باقی مانده با استفاده از ضد شمعدان مایع اندازه گیری شد [24].

آماده سازی غشای سلولی

سلول های مخلوط در ظروف غذائی 100 میلی لیتر بعد از ترانسفکشن با PBS یخ سرد و بر روی 1 ml HME بافر (25 mM HEPES (pH 7.5)، 2 mM MgCl2، 1 mM EDTA). لیزات همگن شده با 500 × g برای 15 دقیقه سانتریفیوژ شد و پس از آن 36,000 × g برای 30 دقیقه سانتریفوژ شد. گلوله های معلق در HME بافر برای آزمایشات مورد استفاده قرار گرفتند.

[35S] -GTPγS Binding Test

فراوانی غشای سلولی با 1 μM quinpirole (Q102، Sigma) در بافر تست (25 mM HEPES (pH 7.5)، 1.5 mM MgCl2، 100 mM NaCl، 1 mM EDTA و 0.01 mM GDP) برای 10 دقیقه. [35S] -GTPγS (NET-030H، PerkinElmer) به غلظت نهایی 3 nM در 30 μL اضافه شد و سپس برای 90 دقیقه انکوباسیون شد. 170 μL بافر یخ سرد (10 mM Tris-HCl (pH 8.0)، 100 mM NaCl، 10 mM MgCl2و 0.1 mM GTP) برای جلوگیری از واکنش اضافه شد. غشاء بر روی یک فیلتر GF / B (Millipore) فیلتر شده و 3 بار با بافر شستشو (50 mM Tris-HCl (pH 7.4)، 100 mM NaCl) شسته شد. فیلترها خشک شدند و رادیواکتیویته با استفاده از شمارش معکوس اندازه گیری شد [25], [26].

آزمون پیوند Radioligand

غشاهای سلولی تهیه شده با 0.01 nM [3H] -spiperone (NET-565، PerkinElmer) و افزایش غلظت quinpirole (Q102، سیگما) برای 30 دقیقه در بافر آزمون (25 mM HEPES (pH 7.5)، 1.5 mM MgCl2، 100 mM NaCl، 1 mM EDTA). غشاء بر روی یک فیلتر GF / B (Millipore) فیلتر شده و 3 بار با بافر شستشو (50 mM Tris-HCl (pH 7.4)، 100 mM NaCl) شسته شد. واکنش با فیلتر کردن سریع توسط فیلترهای GF / C خاتمه یافت. رادیواکتیو باقی مانده با استفاده از یک شمارنده شمارش مایع اندازه گیری شد [27]-[29].

آنزیم cAMP Immunoassay

سلولهای HEK 293 منتقل شده با 10 μM رولیپروم (R6520، سیگما) برای 1 h قبل از تزریق و سپس با 0.1 μM forskolin (F6886، سیگما) و افزایش غلظت quinpirole (Q102، سیگما) برای 30 دقیقه تحت درمان قرار گرفتند. نورونهای استریاتال در ابتدا با 10 μM روالیپرام برای 1 h تحت درمان قرار گرفتند و پس از آن 1 μM دوپامین برای 1 h [22]. لیزات سلولی با 0.1 M HCl تهیه شد و سطوح cAMP با استفاده از کیت ایمونواسی آنزیم cAMP (Sapphire Bioscience) با توجه به دستورالعمل سازنده مشخص شد.

نورون سرطانی کشت اولیه

ناحیه تناسلی از مغز جنین موش (E15) جدا شده است. بافت جدا شده در حداقل مواد ضروری (MEM) (11095، Invitrogen) حاوی 0.25٪ تریپسین (T4549-100، سیگما) و 0.1٪ DNase I برای 6 دقیقه در 37 ° C جدا شد. سلول ها در محیط کشت (MEM با 0.01 M HEPES (pH 7.4) و 10٪ (حجم / حجم) سرم اسب (16050-122، GIBCO) دوباره تحت فشار قرار گرفتند. نورون ها برای روز 7 کشت شدند در شرایط in vitro (DIV 7) در MEM با مکمل B27 (17504-044، Invitrogen) قبل از اعمال آن به آزمایشات ایمنی آنزیم cAMP.

نتایج

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 در سومین حلقه Intracellular DRD2 در شرایط in vitro

برای شناسایی ریشه های جدید Cdk5، ما یک جستجوی سیستماتیک با استفاده از (S / T) PX (K / H / R) به عنوان دنباله ای توافق پذیری به رسمیت شناختن Cdk5 انجام دادیم [30] و DRD2 را به عنوان یک بستر نامزد شناسایی کرد. توالی اجماع، از جمله serine 321، در حلقه درون سلولی سوم DRD2 (D2i3) قرار گرفته است که مکانیزم های مختلفی نظیر [3], [10], [11]. این دنباله در DRD2 به صورت تکاملی در مهره داران حفظ می شود، و به این معنی است که اهمیت کاربردی بقایای (شکل 1A).

کوچک

شکل 1 Cdk5 فسفرولیز serine 321 در حلقه درون سلولی سوم DRD2 در in vitro

(A) همبستگی توالی آمینو اسید با نشان دادن مناطق محافظت شده از DRD2 از گونه های مختلف (سایه دار). سایت فسفوریلاسیون Cdk5 بالقوه با ستاره مشخص می شود. (ب) مرتبط با آی پی در شرایط in vitro تست کیناز با پروتئین های جهش یافته نوترکیب GST-D2i3 و GST-D2i3. مجموعه ای از Cdk5 / p35 غنی شده از عصاره مغز موش با استفاده از واکنش های کیناز با استفاده از ایزوله شدن anti-p35 استفاده شد. یک autoradiograph از پروتئین های فسفرولیید شده همراه با رنگ آمیزی آبی درخشان Coomassie از همان ژل نشان داده شده است. Arrowhead نشان می دهد سیگنال رادیواکتیو مربوط به GST-D2i3s و سربرگ باز است نشان می دهد سیگنال های رادیواکتیو از p35. (C) طیف MS / MS از پپتید فسفریک شده D2i3. الگوهای تثبیت نظری در زیر طیف نشان داده شده است. در بین تمام یونهای قطعه، یون های تشخیص ی و b در طیف مشخص شده اند. آنها6 و ی7 یون ها به شدت فسفوریلاسیون serine 321 را نشان می دهند. (D) در شرایط آزمایشگاهی تست کیناز با ترکیبات Cdk5 / GST-p25 خالص با استفاده از پروتئین جهش یافته GST-D2i3 و GST-D2i3. پروتئین های فسفریلیت شده در autoradiograph همراه با رنگ آمیزی آبی رنگ آبی Coomassie نشان داده شده است. Arrowhead نشان می دهد که سیگنال رادیواکتیو مربوط به GST-D2i3 و سربرگ باز نشان دهنده سیگنال های رادیواکتیو از GST-p25 است.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

برای ارزیابی ظرفیت Cdk5 برای فسفوریلاسیون D2i3، ما با استفاده از IP مرتبط در شرایط in vitro تست های کیناز با استفاده از یک ترکیب فعال Cdk5 / p35 غنی شده از لیزات مغز موش با استفاده از p35 ایزوپروتئین سازی با استفاده از پروتئین های GST-D2i3 (پروتئین 212-373 باقی مانده اسیدهای آمینه) به عنوان زیرمسترها. ما سیگنال های فسفوریلاسیون را در پروتئین های پاک شده GST-D2i3 و GST-D2i3 S297A مشاهده کردیم اما این سیگنال با استفاده از GST-D2i3 S321A (شکل 1B) برای بررسی بیشتر فسفوریلاسیون serine 321 در GST-D2i3، ما انجام LC-MS / MS تجزیه و تحلیل نمونه ها از IP مرتبط در شرایط in vitro تست های کیناز با استفاده از طیف سنجی جرم LTQ XL. به طور مداوم، فسفوپپتید های مربوط به جرم پپتید های فسفو-سریین 321 بهبود یافت (شکل 1C) با توجه به این که خرید وابسته به داده ها در طی تجزیه و تحلیل LC-MS / MS تمایل به شناسایی پروتئین فراوان در نمونه است [31]، این داده ها نشان می دهد که باقی مانده serine 321، سایت مهمی فسفوریلاسیون Cdk5 در منطقه D2i3 است. برای اثبات فسفوریلاسیون مستقیم serine 321 در GST-D2i3 توسط Cdk5، در شرایط in vitro تست کیناز با استفاده از کمپلکس Cdk5 / GST-p25 خالص با پروتئین GST-D2i3 نوترکیب شده به دست آمده انجام شد. ما یک سیگنال فسفوریلاسیون قابل توجه در GST-D2i3 که در GST-D2i3 S321A (شکل 1D) با این نتایج، این نتایج نشان می دهد که باقی مانده S2 D3i321 یک هدف ترجیحی برای فسفوریلاسیون Cdk5 است.

Cdk5 Phosphorylates serine 321 در سومین حلقه درون سلولی DRD2 در سلول ها

برای شناسایی فسفوریلاسیون serine 321، ما آنتیبادی اختصاصی برای فسفو سیرین 321 (pS321) را تولید کردیم. نمونه هایی از مرتبط با IP در شرایط in vitro آنزیم کیناز با استفاده از آنتی بادی anti-pS321 با استفاده از غربالگری غربی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. Blots یک گروه مشخص در واکنش کیناز نشان داد که وابسته به GST-D2i3 (شکل 2A) برای بررسی فسفوریلاسیون بالقوه serine 321 در DRD2 توسط Cdk5 در سلول، anti-GFP immunoprecipitates از HEK 293 سلول بیان DRD2-GFP و DRD2 S321A-GFP با یا بدون HA-Cdk5 و p35 با غربالگری غربی با استفاده از ضد GFP و آنتی بادی ضد pS321. سیگنال های باند مشخص شده توسط آنتی بادی ضد GFP که به علت گلوکوزیلتینگ بیش از حد DRD2 شناخته می شوند تنها در حضور DRD2-GFP دیده می شود و آنتی بادی anti-pS321 مشابه سیگنال DRD2 تنها با بیان Cdk5 / p35 (شکل 2B) [7]. برای بررسی بیشتر فسفوریلاسیون serine 321 توسط Cdk5، D2i3 (FLAG-D2i3) و شکل جهش یافته D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) تولید شد. FLAG-D2i3 و FLAG-D2i3 S321A بیان شده با یا بدون HA-Cdk5 و یا p35 در سلولهای HEK 293 با استفاده از روش تحرک تحرک تحریک SDS-ژل مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. تغییر قابل توجهی از Cdk5 وابسته به تغییر FLAG-D2i3، اما نه برای FLAG-D2i3 S321A (شکل 2C) ما همچنین سطح فسفوریلاسیون DRD2 را بر روی تحریک آگونیست در Ser321 ارزیابی کردیم. سلول های HEK 293 که از ترکیبات DRD2-GFP و Cdk5 / p35 بیان شده توسط quinpirole تحریک می شوند و آنتی بادی های anti-GFP و anti-pS321 با استفاده از Western-blotting با استفاده از Western-blotting مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. ما دریافتیم که فسفریلاسیون DRD5 متمرکز شده توسط Cdk2 در Ser321 تحت تاثیر تحریک آگونیست قرار نگرفته است، که به نظر می رسد متفاوت از فسفوریلاسیون GRK و PKC (شکل 2D) [32], [33]. با هم، این نتایج نشان می دهد که Cdk5 می تواند باقی مانده سریین 321 DRD2 را در محیط سلولی فسفریلید کند.

کوچک

شکل 2 Cdk5 فسفریلید serine 321 در حلقه درون سلولی سوم DRD2 در سلول ها.

فسفریلاسیون شده توسط Cdk5 از serine 321 با استفاده از آنتی بادی anti-pS321 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. (A) نمونه های مرتبط با IP در شرایط in vitro تست کیناز با استفاده از پروتئین GST-D2i3 با استفاده از وسترن بلات (WB) با آنتیبادی های نشان داده شده مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. Arrowheads نشان می دهد GST-D2i3s. (B) DRD2-GFP و DRD2 S321A-GFP با یا بدون HA-Cdk5 و p35 در سلول های HEK 293 بیان می شود. ایمپلنت های ضد GFP با استفاده از وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی های ضد GFP و anti-pS321 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. براکت نشان می دهد سیگنال های DRD2 و arrowhead باز نشان می دهد سیگنال های غیر اختصاصی از anti-GFP immunoprecipitates. '٪ ورودی'٪ حجم کل لیزات برای یک واکنش IP است. سیگنال های Cdk5 درون زا ضعیف با ستاره ها نشان داده شده است. (C) تحرک حرکت تحرک ژل. سلول های HEK 293 که به صورت نشان داده شده بودند با استفاده از غربالگری غربی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. (D) سلول های HEK 293 منتقل شده با Quinpirole درمان شدند و ایمونوتراپی های ضد GFP با غربالگری غربی با آنتی بادی های ضد GFP و ضد pS321 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. arrowhead باز می شود سیگنال های غیر اختصاصی از anti-GFP immunoprecipitates.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 Complex و DRD2 به صورت فیزیکی مرتبط هستند

ما تعامل فیزیکی بالقوه بین مجتمع Cdk5 / p35 و DRD2 را مورد بررسی قرار دادیم زیرا بسیاری از بسترهای Cdk5 به صورت فیزیکی مرتبط با مجتمع Cdk5 / p35 [23], [34], [35]. ابتدا آزمایشی GST انجام شد. پروتئین GST-D2i3 نوترکیب خالص با لیزات مغز موشها انکوباس شده و رسوبات کششی GST برای غربالگری غربی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. همانطور که در شکل 3A، Cdk5 درونی و p35 در رسوب های پایین کشف شناسایی شدند، که نشان دهنده یک تعامل فیزیکی بین DRD2 و مجموعه Cdk5 / p35 (شکل 3A) علاوه بر این، HA-Cdk5 و p35 در immunoprecipitates anti-GFP از لیزات سلول HEK 293 که DRD2-GFP و Cdk5 / p35 (شکل 3B) علاوه بر این، ما آنالیز ایمنی سیتو شیمیایی را انجام دادیم و مشاهده کردیم که DRD2-GFP، HA-Cdk5 و p35 سیگنال های هم محلی سازی را در ناحیه غشایی سلول های HEK 293 نشان می دهد (شکل 3C، پانل های بالا). ما همچنین محلی سازی DRD2 و Cdk5 / p35 را در زمینه نورون بررسی کردیم. به طور مداوم، DRD2-GFP همچنین محل های مشترک با Cdk5 درونی و p35 در نورون های استرییتال کشت (DIV7) را نشان داد، و همچنین حمایت کننده های عملکردی بین DRD2 و Cdk5 / p35 (شکل 3C، پانل های پایین). نتایج نشان می دهد که DRD2 و Cdk5 / p35 می توانند یک پیچیده را تشکیل دهند و از این مفهوم پشتیبانی می کنند که DRD2 یک بستر فیزیولوژیکی Cdk5 است.

کوچک

شکل 3 Cdk5 / p35 می تواند پیچیده با DRD2 تشکیل دهد.

(A) GST با استفاده از پروتئین GST-D2i3 نوترکیب شده با عصاره مغز موش صحرایی. رسوبات کششی GST تحت آزمایشات غربالگری غربی قرار گرفتند. 'مهره' نشان می دهد رسوب پایین کشیدن بدون پروتئین GST. (B) Immunoprecipitation از مجموعه DRD2 و Cdk5 / p35. ضد GFP IP از لیزات از سلول های انتقال یافته تحت تجزیه و تحلیل غلظت غربی قرار گرفتند. براکت نشان می دهد سیگنال های DRD2 و arrowhead باز نشان می دهد سیگنال های غیر اختصاصی از anti-GFP immunoprecipitates. یک بلوط بیش از حد برای ورودی نیز در سمت راست نشان داده شده است. (C) آنالیز ایمونوسیتوشیمیایی DRD2 و Cdk5 / p35. سلولهای HEK 293 بیان کننده DRD2-GFP و Cdk5 / p35 با آنتی بادی های ضد Cdk5 و anti-p35 (پانل های بالایی) رنگ آمیزی شدند. DRD2-GFP به تنهایی در نورونهای استرییتال کشت شده و با آنتیبادی های anti-Cdk5 و anti-p35 (پانل های پایین تر) رنگ آمیزی شد. Hoechst برای رنگ آمیزی هسته استفاده می شود. نوار مقیاس 5 میکرومتر است. تمام تصاویر با استفاده از میکروسکوپ کانکوکال (Olympus، FluoView-1000) به دست آمد.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

فسفریلاسیون Cdk5 توسط DRD2 باعث کاهش فعالیت گیرنده می شود

گزارش شده است که فسفوریلاسیون خواص انتقالی GPCR، مانند اتصال پروتئین G، گیرنده داخلی، موضع گیری داخل سلولی و ارتباط با پروتئین های مدولاتور [9], [11], [24]. درونی سازی گیرنده ناشی از gonist یک فرایند کنترل انتقادی انتقال سیگنال است. ما مدولاسیون مداخله Cdk5 از internalize DRD2 را مورد بررسی قرار دادیم. سلولهای HEK 293 که DRD2-GFP و DRD2 S321A-GFP را با یا بدون Cdk5 / p35 بیان می کنند با 1 μM quinpirole انکونیزه شدند تا باعث تسریع درونی شدن DRD2 (شکل 4A) [3H] -spiperone از سلول های بیان کننده DRD2-GFP به طور معنی داری در درمان XINUMX min quinpirole کاهش یافت و در 30 دقیقه بهبود یافت. جالب توجه است، [3H] -spiperone سیگنال های DRD2-GFP و Cdk5 / p35 بیان سلول ها نیز در درمان XINUMX دقیقه quinpirole کاهش یافته است اما در 30 دقیقه (شکل 4A، بخش دوم). از سوی دیگر، [3H] -spiperone سیگنال های بیان کننده DRD2 S321A-GFP در 30 دقیقه کاهش می یابد و در زمان 90 دقیقه، صرف نظر از همکاری با Cdk5 / p35 بهبود می یابد. مطالعات پیشین نشان داده است که DRD2 داخلی درونی را مجددا به غشای پلاسما تحریک می کند [11]است. Tبه نظر می رسد که فسفریلاسیون DRD5 متمرکز شده توسط Cdk2 در فرآیند های حساس سازی به دنبال درونی شدن DRD2 ناشی از آگونیست است.

کوچک

شکل 4 فسفوریلاسیون متمرکز شده توسط Cdk5 موجب کاهش بیان DRD2 و سیگنالینگ پایین دست می شود.

(A) بیان سطح DRD2 با اندازه گیری توسط [3H] -spiperone اتصال آزمون. سلولهای HEK293 منتقل شده با 1 μM quinpirole برای زمان مشخص شده و برداشت شده و سپس 3 nM [3درمان H] - اسپایپرون به مدت 3 ساعت. رادیواکتیویته اندازه گیری شد و سیگنال های سطح محاسبه شد. میله های خطا نشان دهنده میانگین ± SE (n = 8 ؛ * p <0.05 ، ** p <0.01 ؛ ANOVA یک طرفه با آزمون تعقیبی Dunnett: مقایسه تمام ستون ها در مقابل ستون کنترل). (ب) [35S] -GTPγS آزمون اتصال غشاهای سلولی از سلولهای ترانسفکت شده به صورت نشان داده شده تهیه می شوند. داروهای غشایی با 1 μM quinpirole و 3 nM [35S] -GTPγS به مدت 90 دقیقه میله های خطا نشان دهنده میانگین ± SE (n = 8 ؛ * p <0.05 ، ** p <0.01 ، *** p <0.001 ؛ ANOVA یک طرفه با آزمون تعقیبی Bonferroni: مقایسه همه جفت ستون ها). (C) مسابقه کوینپیرول [3H] -spiperone اتصال آزمون. آماده سازی غشاء از سلول های ترانسفکت شده با 0.01 nM [3H] -spiperone و افزایش غلظت کوینپیرول به مدت 30 دقیقه. رگرسیون غیرخطی توسط GraphPad بدست آمد. میله های خطا میانگین ± SE را نشان می دهند (3 = n). (D) سنجش ایمنی آنزیمی cAMP در سلولهای HEK 293 ترانسفکت شده. سلولهای ترانسفکت شده با 10 میکرومولار رولیپرام به مدت 1 ساعت تحت تیمار قرار گرفتند و پس از آن با 0.1 میکرومولار فورسکولین و افزایش غلظت کوینپیرول به مدت 30 دقیقه تحت درمان قرار گرفتند. رگرسیون غیرخطی توسط GraphPad بدست آمد. میله های خطا نشان دهنده میانگین ± SE (n = 4 ؛ ** p <0.01 ؛ دو دم است tتست ها) (E) نورونهای استریاتای کشت شده از جنین های وحشی و جنین های ناخوشایند p35 (DIV 7) با 10 μM روالیپرام برای 1 h و سپس 1 μM دوپامین برای 1 h درمان شدند. خطوط خطا نشان دهنده میانگین ± SE (n = 4؛ **p<0.01 ؛ دو دم tتست ها)

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

ما بیشتر به بررسی تغییر پتانسیل اتصال پروتئین G به Agonist تحریک شده به DRD2 مرتبط با فسفوریلاسیون واسطه Cdk5 با استفاده از [35S] -GTPγS آزمون اتصال [25], [26]. DRD2-GFP و DRD2 S321A-GFP با یا بدون Cdk5 / p35 در سلولهای HEK 293 بیان شدند. غشاهای تهیه شده و با 1 μM quinpirole تهیه شده و مجددا [35S] -GTPγادغام S DRD2-GFP و Cdk5 / p35 بیان غشاء سلولی نشان دهنده اختلال در عملکرد [35S] -GTPγاتصال S به مقایسه با سایر غشاهای سلولی (شکل 4B) این نتایج نشان می دهد که فسفوریلاسیون متمرکز شده توسط Cdk5 تنظیم کننده ی اتصال پروتئین G به تحریک آگونیست در DRD2 را کاهش می دهد.

علاوه بر این، رقابت کوینبیرول [3H] -spiperone برای بررسی هر گونه تغییر پتانسیلی در مورد Agonist-affinity در DRD2 توسط فسفوریلاسیون Cdk5 مورد بررسی قرار گرفت. پیوند رقابتی [3H] -spiperone پس از درمان افزایش غلظت quinpirole به آماده سازی غشا از transfected اندازه گیری شد. پیوستگی کوینیفورل و [3H] -spiperone در DRD2-GFP و DRD2 S321A-GFP ساخته شده است logK مشابهi مقادیر (-9.789 برای DRD2-GFP؛ -9.691 برای DRD2 S321A-GFP)، نشان می دهد که وابستگی لیگاند به DRD2 به طور قابل ملاحظه ای توسط فسفوریلاسیون متمرکز شده توسط Cdk5 در DRD2 (شکل 4C).

فسفریلاسیون Cdk5 پایین تنظیم مسیر سیگنالینگ DRD2-cAMP

سپس، ما بررسی کردیم که تغییر DRD2 توسط Cdk5 بر مسیرهای سیگنالینگ پایین دست تاثیر می گذارد. ما مانیتور شده از DRD2 مهار تولید cAMP تحریک شده از forskolin توسط آدنینیل سیتالاس در سلول بیان DRD2-GFP و DRD2 S321A-GFP با استفاده از آنزیم آنزیم cAMP امتحان. سلولهای بیان کننده DRD2 نشان داد که سطح cAMP در پاسخ به کوینیفورول به میزان وابسته به دوز کاهش می یابد. به طور قابل ملاحظه ای، بیان مشترک Cdk5 / p35 به طور قابل توجهی کاهش مهار حداکثر تشکیل cAMP (شکل 4D، پانل سمت چپ) از سوی دیگر، در سلولهای بیان شده DRD2 S321A-GFP، ساختارهای cAMP به طور موثر در پاسخ به درمان کوینیفوروم بدون در نظر گرفتن بیان Cdk5 / p35 (شکل 4D، پانل راست) این نتایج نشان می دهد که فسفوریلاسیون DRD5 متمرکز شده توسط Cdk2 موجب کاهش فعالیت مهار کننده DRD2 در مسیر سیگنالینگ پایین آمدن cAMP می شود. برای تأیید بیشتر این پدیده ها در یک محیط فیزیولوژیکی بیشتر، از نورون های کشت شده اولیه از جنین هایی که در p35، یک فعال کننده Cdk5 ضروری هستند، استفاده می شود. نورونهای استریاته کشت اولیه با 1 μM دوپامین تحت درمان قرار گرفتند و با استفاده از آنزیم cAMP immunoassay مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. نورونهای موشهای نابودکننده p35 نشان دادند که در مقایسه با نورونهای وحشی، هنگامی که با دوپامین (شکل 4E) Tبا هم، ما نتیجه گرفتیم که فسفوریلاسیون DRD5 متمرکز شده توسط Cdk2 باعث کاهش تون مهار کننده در مسیر cAMP توسط DRD2 می شود.

بحث

ما DRD2 را به عنوان یک زیرمجموعه جدید از Cdk5 شناسایی کردیم. به نظر می رسد فسفوریلاسیون بیان سطح سرمی DRD2 را تحت تأثیر قرار می دهد و با توجه به سرنوشت DRD2 پس از درونی شدن گیرنده، کاهش DRD2 Giاتصال و مسیر cAMP پایین دست. همانطور که S321 باقی مانده فسفوریلاسیون هم در ایزوفرمهای طولانی و کوتاه DRD2 وجود دارد، مکانیزم پیشنهاد شده در این مطالعه ممکن است یک حالت کلی تنظیم در سیگنالینگ واسطه DRD2 باشد.

DRD2 در نورونهای کروی متوسط ​​نه تنها به عنوان یک زیرمجموعه گیرنده اصلی دوپامین شناخته شده بلکه برای حساسیت به تغییرات در دسترس بودن آن در پاسخ به محرک های محیطی نیز شناخته شده است. Desensitization ناشی از آگونیست و حساس سازی حساسیت DRD2 به طور گسترده مورد مطالعه قرار گرفته است [11], [24]. به طور خاص، تعدادی از مطالعات نشان داده اند که اثرات مواجهه مزمن روانگردان، مانند کوکائین و آمفتامین، که باعث افزایش سطح خارج سلولی دوپامین در سیناپس استرییتال می شود، با تغییرات پویا از DRD2 به صورت Postnonaptically [36]. در واقع، مصرفکنندگان مزمن کوکائین سطح DRD2 را در ناحیه استریاتال کاهش داده و در دسترس بودن DRD2 در nucleus accumbens (NAcc) ارتباط منفی با رفتارهای درمانی و تقویت کننده در موش و مقعد دارد [37]-[39]. این یافته ها نشان می دهد که عملکرد DRD2 بسیار حساس به تنظیمات سازگار یا جبرانناپذیر در واکنش به محرک های مختلف از جمله داروهای مزمن می باشد. نتایج ما نشان می دهد که باقی مانده S321 در حلقه درون سلولی سوم DRD2 می تواند توسط Cdk5 فسفوری شود، که منجر به کاهش اثر مهاری DRD2 در مسیر cAMP می شود. این تعامل پیشنهاد یک مکانیزم تنظیم قانونی جدید مرتبط با Cdk5 در نورون های dopaminoceptive است که ممکن است با طبیعت پویا در دسترس بودن سطح DRD2 مرتبط باشد.

لازم به ذکر است که Cdk5 شناخته شده است که یکی از مولفه های اصلی در میان سازی تغییرات سازگار محیط محیطی عصبی است. به عنوان مثال، تغییرات ساختاری و عملکردی ستونهای دندریتیک در نورونهای مدار لمبی یکی از عوارض قرار گرفتن در معرض روانی است [40]. این تغییرات همراه با تغییرات مختلف مولکولی شامل القاء پروتئین اتصال دهنده پروتئین پاسخ cAMP (CREB) و ΔFosB، فاکتورهای رونویسی است که در تنظیم واکنش پایدار در پاسخ به تجویز مزمن کوکائین [41], [42]. مهم این است که Cdk5 هدف از ΔFosB است [19], و بسیاری از مولفه های مهم درگیر در دینامیک دندریتیک ستون فقرات، مانند PSD-95، kinase فعال p21 (PAK)، بتا-کتانین و اسپینوفیلین، به عنوان زیربنای Cdk5 گزارش شده است [43]-[46]. به طور مداوم، دستکاری ژنتیکی یا فارماکولوژی فعالیت Cdk5 باعث تغییرات مورفولوژی ستون فقرات دندریتیک و پاسخ های رفتاری به کوکائین می شود و نقش های حیاتی Cdk5 را در تغییرات مولکولی و مورفولوژیکی مدارهای دوپامین mesolimbic نشان می دهد [47], [48]. نتایج ما نشان می دهد که DRD2 یک هدف جدید از Cdk5 است که بینش های بالقوه ای را در تغییرات تطبیقی ​​سیستم دوپامین در پاسخ به عوارض مزمن دارو به دست می دهد، به دلیل آنکه پس از کنترل ΔFosB، Cdk5 ممکن است افزایش تونیک در فسفوریلاسیون DRD2 . علاوه بر این، DRD2 شناخته شده است که بر فرآیندهای سلولی متعدد، از جمله تنظیم مسیرهای cAMP و MAP کیناز و رویدادهای رونویسی پایین [42], [49]. بنابراین، یافته های این مطالعه ممکن است نه تنها تنظیم مستقیم DRD2 را با Cdk5 نشان دهد، بلکه یک بینش جدید را در مورد پاسخ های سازگار سیستم دوپامین به داروهای مزمن دارو ارائه می دهد.

مقالات نویسنده

آزمایشات انجام شده و طراحی شده: JJ YUP DH SKP. آزمایشات انجام شد: JJ YUP DKK YK. داده ها را تجزیه و تحلیل کرد: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. معرف مواد / مواد / ابزارهای تجزیه و تحلیل: YHS. مقاله را چاپ کرد: JJ SKP.

منابع

  1. 1 Missale C، Nash SR، Robinson SW، Jaber M، Caron MG (1998) گیرنده های دوپامین: از ساختار به عملکرد. Physiol Rev 78: 189-225.
  2. 2 Wise RA (2002) مدار پاداش مغز: بینش از انگیزه های بی سابقه است. Neuron 36: 229-240. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00965-0
  3. مشاهده مقاله
  4. PubMed / NCBI
  5. گوگل اسکولار
  6. مشاهده مقاله
  7. PubMed / NCBI
  8. گوگل اسکولار
  9. مشاهده مقاله
  10. PubMed / NCBI
  11. گوگل اسکولار
  12. مشاهده مقاله
  13. PubMed / NCBI
  14. گوگل اسکولار
  15. مشاهده مقاله
  16. PubMed / NCBI
  17. گوگل اسکولار
  18. مشاهده مقاله
  19. PubMed / NCBI
  20. گوگل اسکولار
  21. مشاهده مقاله
  22. PubMed / NCBI
  23. گوگل اسکولار
  24. مشاهده مقاله
  25. PubMed / NCBI
  26. گوگل اسکولار
  27. مشاهده مقاله
  28. PubMed / NCBI
  29. گوگل اسکولار
  30. مشاهده مقاله
  31. PubMed / NCBI
  32. گوگل اسکولار
  33. مشاهده مقاله
  34. PubMed / NCBI
  35. گوگل اسکولار
  36. مشاهده مقاله
  37. PubMed / NCBI
  38. گوگل اسکولار
  39. مشاهده مقاله
  40. PubMed / NCBI
  41. گوگل اسکولار
  42. مشاهده مقاله
  43. PubMed / NCBI
  44. گوگل اسکولار
  45. مشاهده مقاله
  46. PubMed / NCBI
  47. گوگل اسکولار
  48. مشاهده مقاله
  49. PubMed / NCBI
  50. گوگل اسکولار
  51. مشاهده مقاله
  52. PubMed / NCBI
  53. گوگل اسکولار
  54. مشاهده مقاله
  55. PubMed / NCBI
  56. گوگل اسکولار
  57. مشاهده مقاله
  58. PubMed / NCBI
  59. گوگل اسکولار
  60. مشاهده مقاله
  61. PubMed / NCBI
  62. گوگل اسکولار
  63. مشاهده مقاله
  64. PubMed / NCBI
  65. گوگل اسکولار
  66. مشاهده مقاله
  67. PubMed / NCBI
  68. گوگل اسکولار
  69. مشاهده مقاله
  70. PubMed / NCBI
  71. گوگل اسکولار
  72. مشاهده مقاله
  73. PubMed / NCBI
  74. گوگل اسکولار
  75. مشاهده مقاله
  76. PubMed / NCBI
  77. گوگل اسکولار
  78. مشاهده مقاله
  79. PubMed / NCBI
  80. گوگل اسکولار
  81. مشاهده مقاله
  82. PubMed / NCBI
  83. گوگل اسکولار
  84. مشاهده مقاله
  85. PubMed / NCBI
  86. گوگل اسکولار
  87. مشاهده مقاله
  88. PubMed / NCBI
  89. گوگل اسکولار
  90. مشاهده مقاله
  91. PubMed / NCBI
  92. گوگل اسکولار
  93. مشاهده مقاله
  94. PubMed / NCBI
  95. گوگل اسکولار
  96. مشاهده مقاله
  97. PubMed / NCBI
  98. گوگل اسکولار
  99. مشاهده مقاله
  100. PubMed / NCBI
  101. گوگل اسکولار
  102. مشاهده مقاله
  103. PubMed / NCBI
  104. گوگل اسکولار
  105. مشاهده مقاله
  106. PubMed / NCBI
  107. گوگل اسکولار
  108. مشاهده مقاله
  109. PubMed / NCBI
  110. گوگل اسکولار
  111. مشاهده مقاله
  112. PubMed / NCBI
  113. گوگل اسکولار
  114. مشاهده مقاله
  115. PubMed / NCBI
  116. گوگل اسکولار
  117. مشاهده مقاله
  118. PubMed / NCBI
  119. گوگل اسکولار
  120. مشاهده مقاله
  121. PubMed / NCBI
  122. گوگل اسکولار
  123. مشاهده مقاله
  124. PubMed / NCBI
  125. گوگل اسکولار
  126. مشاهده مقاله
  127. PubMed / NCBI
  128. گوگل اسکولار
  129. مشاهده مقاله
  130. PubMed / NCBI
  131. گوگل اسکولار
  132. مشاهده مقاله
  133. PubMed / NCBI
  134. گوگل اسکولار
  135. مشاهده مقاله
  136. PubMed / NCBI
  137. گوگل اسکولار
  138. مشاهده مقاله
  139. PubMed / NCBI
  140. گوگل اسکولار
  141. مشاهده مقاله
  142. PubMed / NCBI
  143. گوگل اسکولار
  144. 3 Neve KA، Seamans JK، Trantham-Davidson H (2004) سیگنال دهنده گیرنده دوپامین. J دریافت سیگنال انتقال 24: 165-205. doi: 10.1081 / lrst-200029981
  145. 4 Amar S، Shaltiel G، Mann L، Shamir A، Dean B، et al. (2008) احتمال دخالت مولکول های سیگنالینگ گیرنده D2 پس از دوپامین در پاتوفیزیولوژی اسکیزوفرنیا. اینترانت J Neuropsychopharmacol 11: 197-205. doi: 10.1017 / s1461145707007948
  146. 5 Caine SB، Negus SS، Mello NK، Patel S، Bristow L و همکاران. (2002) نقش گیرنده های D2 مانند dopamine در خود تزریق کوکائین: مطالعات با موش جهش یافته گیرنده D2 و آنتاگونیست های گیرنده جدید D2. J Neurosci 22: 2977-2988.
  147. 6 لی S، Jeong J، Park YU، Kwak Y، Lee SA و همکاران. (2012) والپروات موجب تغییر سیگنال دوپامین در ارتباط با القاء بیان پروتئین Par-4 می شود. PLoS یک 7: e45618. doi: 10.1371 / journal.pone.0045618
  148. 7 فیشبرن CS، الازار Z، Fuchs S (1995) گالیسوزیلت دیفرانسیل و قاچاق داخل سلولی برای ایزوفرم های طولانی و کوتاه D2 dopamine. J Biol Chem 270: 29819-29824. doi: 10.1074 / jbc.270.50.29819
  149. 8 خواننده TA، Molina-Holgado E، Lima L، Boulianne S، Dewar KM (1992) خاصی [3H] اتصال رکلوپید به گیرنده D2 دوپامین نئوستیتال: نقش گروه های دی سولفید و سولفیدریل. Neurochem Res 17: 749-759. doi: 10.1007 / bf00969008
  150. 9 Ng GY، O'Dowd BF، Caron M، Dennis M، Brann MR، et al. (1994) فسفوریلاسیون و palmitoylation گیرنده Doping D2L Dopamine در سلول های Sf9. J Neurochem 63: 1589-1595. doi: 10.1046 / j.1471-4159.1994.63051589.x
  151. 10 Li M، Bermak JC، Wang ZW، Zhou QY (2000) مدولاسیون سیگنال گیرنده دوپامین D (2) با پروتئین اتصال دهنده اکتین (ABP-280). مامور Pharmacol 57: 446-452.
  152. 11 چو D، ژنگ م، مین سی، م، L، Kurose H، و همکاران. (2010) گیرنده های دپوامین D (2) که به وسیله آگونیست ها ایجاد شده اند و فسفوریلاسیون گیرنده دارند. مول اندوکرینول 24: 574-586. doi: 10.1210 / me.2009-0369
  153. 12 Tsai LH، Delalle I، Caviness VS Jr، Chae T، Harlow E (1994) p35 یک زیر ساختار تنظیم کننده عصبی وابسته به سیکلین وابسته به کیناز 5 است. طبیعت 371: 419-423. doi: 10.1038 / 371419a0
  154. 13 دهان R، Tsai LH (2001) یک دهه از CDK5. Nat Rev مول سلول Biol 2: 749-759. doi: 10.1038 / 35096019
  155. 14 Fu AK، Ip NY (2007) کیناز وابسته به سیکلین 5 لینک نشانه های خارج سلولی را به سیتوکسیت Actin در طی توسعه دندریتیک ستون فقرات می دهد. سلول Adh Migr 1: 110-112. doi: 10.4161 / cam.1.2.4617
  156. 15 فعال سازی Cdk2003 موجب مرگ سلولی CA5 هیپوکامپ به طور مستقیم توسط فسفوریلی کردن گیرنده های NMDA می شود. عضلانی Neurosci 1: 6-1039. doi: 1047 / nn10.1038
  157. 16 ژانگ S، Edelmann L، لیو ج، Crandall JE، Morabito MA (2008) Cdk5 تنظیم فسفوریلاسیون تریروزین 1472 NR2B و بیان سطح NMDA گیرنده. J Neurosci 28: 415-424. doi: 10.1523 / ucuresci.1900-07.2008
  158. 17 Moy LY، Tsai LH (2004) کیناز وابسته به سیکلین 5 فسفریله می کند serine 31 از هیدروکسیلاز تیروزین و ثبات آن را تنظیم می کند. J Biol Chem 279: 54487-54493. doi: 10.1074 / jbc.m406636200
  159. 18 Bibb JA، اسنایدر GL، Nishi A، یان Z، Meijer L، و همکاران. (1999) فسفریلاسیون DARPP-32 توسط Cdk5 مدولاسیون سیگنالینگ دوپامین در نورون است. طبیعت 402: 669-671.
  160. 19 Bibb JA، چن ج، تیلور JR، Svenningsson P، Nishi A، و همکاران. (2001) اثرات مواجهه مزمن با کوکائین توسط پروتئین عصبی Cdk5 تنظیم می شود. طبیعت 410: 376-380.
  161. 20 Ohhima T، Ogawa M، Veeranna، Hirasawa M، Longenecker G، و همکاران. (2001) مشارکت سینرژیک کیناز وابسته به سیکلین 5 / p35 و Reelin / Dab1 به موقعیت نورون های قشر در مغز در حال توسعه مغز. Proc Natl Acad Sci USA 98: 2764-2769. doi: 10.1073 / pnas.051628498
  162. 21 Morabito MA، Sheng M، Tsai LH (2004) کیناز وابسته به سیکلین 5 فضاپیمای دامنه N-terminal از پروتئین PSD-95 پانینوپتس در نورون ها را فسفریل می کند. J Neurosci 24: 865-876. doi: 10.1523 / ucuresci.4582-03.2004
  163. 22 Park SK، نگوین MD، فیشر A، لوک MP، Affar ال B، و غیره. (2005) Par-4 پیوند دهنده سیگنالینگ و افسردگی دوپامین است. سلول 122: 275-287. doi: 10.1016 / j.cell.2005.05.031
  164. 23 Niethammer M، اسمیت DS، Ayala R، Peng J، Ko J، و همکاران. (2000) NUDEL یک رشته Cdk5 جدید است که با LIS1 و سینوپلاسم دینین همکاری می کند. Neuron 28: 697-711. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 00147-1
  165. 24 Kim KM، Valenzano KJ، Robinson SR، Yao WD، Barak LS و همکاران. (2001) تنظیم دیفرانسیل از گیرنده های dopamine D2 و D3 توسط گیرنده پروتئین kinases و بتا آرئستین همراه است. J Biol Chem 276: 37409-37414. doi: 10.1074 / jbc.m106728200
  166. 25 Waldhoer M، Bofill-Cardona E، Milligan G، Freissmuth M، Nanoff C (1998) جداسازی دیفرانسیل از آدنوزین A1 و گیرنده های Dopamine D2 توسط سارامین و سعامین (NF037). مامور Pharmacol 53: 808-818.
  167. 26 Bofill-Cardona E، Kudlacek O، Yang Q، Ahorn H، Freissmuth M، و همکاران. (2000) اتصال کالمدولین به گیرنده D2-dopamin باعث کاهش سیگنالینگ گیرنده توسط مهار سوئیچ فعال سازی پروتئین G می شود. J Biol Chem 275: 32672-32680. doi: 10.1074 / jbc.m002780200
  168. 27 فهرست SJ، Seeman P (1981) تفکیکپذیری از ترکیبات گیرنده دوپامین و سروتونین [3H] اتصال اسپپپررون به مناطق مغزی موش صحرایی. Proc Natl Acad Sci USA 78: 2620-2624. doi: 10.1073 / pnas.78.4.2620
  169. 28 گاردنر B، عجیب و غریب PG (1998) عمل آگونیست در گیرنده های D2 (طولانی) دوپامین: لیگاند اتصال و آزمون های عملکردی. جی Pharmacol 124: 978-984. doi: 10.1038 / sj.bjp.0701926
  170. 29 سمپن P، Tallerico T، Ko F (2003) دوپامین جابجایی [3H] دامپری دیون از سایت های باکتری گیرنده D2 دوپامین، اما نه 3H] راکلوپرید یا [3H] اسپیرپرون در محیط ایزوتونی: پیامدهای توموگرافی انتشار پوزیترون انسان. Synapse 49: 209-215. doi: 10.1002 / syn.10232
  171. 30 Obenauer JC، Cantley LC، Yaffe MB (2003) Scansite 2.0: پیش بینی متقابل پروتئین از تعاملات سیگنال سلولی با استفاده از مضامین مختلط کوتاه. اسیدهای نوکلئیک Res 31: 3635-3641. doi: 10.1093 / nar / gkg584
  172. 31 Liu H، Sadygov RG، Yates JR 3rd (2004) یک مدل برای نمونه گیری تصادفی و برآورد فراوانی نسبی پروتئین در پروتئومیکس تفنگ ساچمهای است. شیمی مقوی 76: 4193-4201. doi: 10.1021 / ac0498563
  173. 32 Ito K، Haga T، Lameh J، Sadee W (1999) تداخل گیرنده های D2 دوپامین به بیان همزمان ژن پروتئین گیرنده کیناز 2 یا 5 بستگی دارد. Eur J Biochem 260: 112-119. doi: 10.1046 / j.1432-1327.1999.00125.x
  174. 33 Namkung Y، Sibley DR (2004) پروتئین کیناز C، فسفوریلاسیون، حساس سازی و قاچاق گیرنده D2 dopamine می باشد. J Biol Chem 279: 49533-49541. doi: 10.1074 / jbc.m408319200
  175. 34 وانگ AS، لی RH، چونگ AY، Yeung PK، Chung SK و همکاران. (2011) فسفریلسیون واسطه شده Cdk5 از اندوفیلین B1 برای autophagy القا شده در مدل های بیماری پارکینسون مورد نیاز است. Nat Cell Biol 13: 568-579. doi: 10.1038 / ncb2217
  176. 35 Kesavapany S، Lau KF، McLoughlin DM، Brownlees J، Ackerley S، و همکاران. (2001) p35 / cdk5 بتا كاتینین را بسپار و فسفریلات می كند و همچنین تعامل بتا كاتینین / پرسزنین-1 را تنظیم می كند. Eur J Neurosci 13: 241-247. doi: 10.1046 / j.1460-9568.2001.01376.x
  177. 36 MJ Kuhar، Ritz MC، Boja JW (1991) فرضیه دوپامین از خواص تقویت کوکائین. روند Neurosci 14: 299-302. doi: 10.1016 / 0166-2236 (91) 90141-g
  178. 37 Volkow ND، Fowler JS، Wolf AP، Schlyer D، Shiue CY و همکاران. (1990) اثرات سوء مصرف کوکائین مزمن بر گیرنده های dopamin postynaptic. ام آی جی روانپزشکی 147: 719-724.
  179. 38 Dalley JW، Fryer TD، Brichard L، Robinson ES، Theobald DE و همکاران. (2007) گیرنده های D2 / 3 هسته accumbens پیش بینی کننده تکانشی بودن ویژگی و تقویت کوکائین را پیش بینی می کنند. علم 315: 1267-1270. doi: 10.1126 / science.1137073
  180. 39 نادر MA، مورگان D، Gage HD، نادر SH، Calhoun TL و همکاران. (2006) PET تصویربرداری از گیرنده D2 دوپامین در زمان خودکاستار مزمن کوکائین در میمون ها. عضلانی Neurosci 9: 1050-1056. doi: 10.1038 / nn1737
  181. 40 Robinson TE، Kolb B (1997) تغییرات ساختاری پایدار در هسته accumbens و نورون قشر پیش مغز ناشی از تجربه قبلی با آمفتامین است. J Neurosci 17: 8491-8497.
  182. 41 Robinson TE، Kolb B (1999) تغییرات در مورفولوژی دندریت ها و ستون های دندریتیک در هسته آکومبنس و کورتکس پیش فرنتون تحت درمان مکرر با آمفتامین یا کوکائین. Eur J Neurosci 11: 1598-1604. doi: 10.1046 / j.1460-9568.1999.00576.x
  183. 42 McClung CA، Nestler EJ (2003) مقررات بیان ژن و پاداش کوکائین توسط CREB و DeltaFosB. عضلانی Neurosci 6: 1208-1215. doi: 10.1038 / nn1143
  184. 43 Feng J، Yan Z، Ferreira A، Tomizawa K، Liauw JA، و غیره. (2000) اسپینوفیلین تشکیل و عملکرد ستون فقرات دندریتیک را تنظیم می کند. Proc Natl Acad Sci USA 97: 9287-9292. doi: 10.1073 / pnas.97.16.9287
  185. 44 Prange O، Murphy TH (2001) حمل و نقل مدولار خوشه های چگالی-95 Postynaptic و ارتباط با پیش سازهای پایدار ستون فقرات در طول توسعه زودهنگام نورون های قشر. J Neurosci 21: 9325-9333.
  186. 45 Murase S، Mosser E، Schuman EM (2002) Depolarization درایو بتا کتونین را به ستون های عصبی ترویج تغییر در ساختار و عملکرد سیناپسی. Neuron 35: 91-105. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00764-X
  187. 46 Hayashi ML، Choi SY، Rao BS، Jung HY، Lee HK و همکاران. (2004) تغيير مورفولوژي سيناپتيك قشر و اختلال در تثبيت حافظه در موش هاي ترانس ژنيك PAK غلظت منفي غدد لنفاوي خاصي است. Neuron 42: 773-787. doi: 10.1016 / j.neuron.2004.05.003
  188. 47 بنویدز DR، کوین جی جی، ژونگ P، Hawasli AH، DiLeone RJ، و همکاران. (2007) Cdk5 مدرک پاداش کوکائین، انگیزه و تحریک پذیری نورونی استریاتال است. J Neurosci 27: 12967-12976. doi: 10.1523 / ucuresci.4061-07.2007
  189. 48 Meyer DA، Richer E، Benkovic SA، Hayashi K، Kansy JW و همکاران. (2008) انسداد Striatal Cdk5 تغییر پاسخ های حرکتی به کوکائین، یادگیری حرکتی و مورفولوژی دندریتیک است. Proc Natl Acad Sci USA 105: 18561-18566. doi: 10.1073 / pnas.0806078105
  190. 49 Impey S، Obrietan K، Storm DR (1999) ایجاد اتصالات جدید: نقش ERK / MAP سیگنالینگ کیناز در پلاستیک عصبی. Neuron 23: 11-14. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 80747-3