Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 resèpteur ak atenu desann siyal (2013)

Kòmantè: Parèt pou montre ke Cdk5 lakòz règleman de dopamine D2 récepteurs. Étonant, tradiksyon deltafosb faktè ankouraje pwodiksyon an nan Cdk5.

Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (N PLT) PLoS YON NAN (2013): e8. doi: 12 / journal.pone.84482

Abstrè

Reseptè Dopamine D2 (DRD2) se yon reseptè kle ki medye fonksyon sèvo ki gen rapò ak Dopamine tankou atitid, rekonpans ak emosyon. Cyclin-depandan kinaz 5 (Cdk5) se yon prolin ki dirije serine / kinazin kinaz ki gen fonksyon ki te enplike nan kous la rekonpans nan sèvo. Nan etid sa a, nou revele ke serin 321 rezidi a (S321) nan twazyèm entranèl bouk nan DRD2 (D2i3) se yon sit roman regilasyon nan Cdk5. Te fosforilasyon Cdk5-depandan nan S321 nan D2i3 a obsève nan vitro ak sistèm kilti selil yo.

Nou pli lwen obsève ke fosforilasyon nan S321 gen pwoblèm pou ekspresyon nan sifas agonist-ankouraje nan DRD2 ak diminye g pwoteje pwoteje DRD2. Anplis de sa, chemen ki te anba a CAMP te afekte nan sistèm heterolog a ak nan prensipal kilti newonal yo nan anbriyon p35 ki ta gen pou wè akòz aktivite redwi inhibition nan DRD2. Rezilta sa yo endike ke fosforilasyon Cdk5-medyatè nan S321 inibit fonksyon DRD2, bay yon roman mekanis regilasyon pou Dopamine siyal.

figi

Sitasyon: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 reseptè ak atenu Downstream siyal. PLoS YON NAN (8): e12. doi: 84482 / journal.pone.10.1371

Editè: James Porter, University of North Dakota, Etazini nan Amerik la

resevwa: Me 20, 2013; Aksepte: Novanm NAN, NAN; Published: 31 Desanm 2013

Copyright: © 2013 Jeong et al. Sa a se yon atik aksè louvri-distribiye anba kondisyon ki nan la Creative Commons Wikimedia, ki pèmèt san restriksyon, distribisyon, ak repwodiksyon nan nenpòt mwayen, bay otè orijinal la ak sous yo kredite.

Finansman: Travay sa a te sipòte pa sibvansyon yo (NRF-2012R1A2A2A01012923 ak NRF-2012R1A4A1028200) nan men Gouvènman Koreyen an (MSIP) epi tou li sipòte anba kad pwogram koperasyon entènasyonal jere pa NRF nan Kore di (2012K2A1A2033117) ak Kore di nan sèvo Research Institute (KBRI). Pwogram rechèch debaz nan MSIP (2031-415). SKP te yon moun k ap resevwa 2004 ak 2006 Alliance Nasyonal pou Rechèch sou Eskizofreni ak Depresyon (NARSAD) Young Investigator Awards. Finansè yo pa te gen okenn wòl nan konsepsyon etid, koleksyon done ak analiz, desizyon yo pibliye, oswa preparasyon nan maniskri la.

Konpetisyon enterè: Otè yo te deklare ke pa gen okenn enterè konpetisyon egziste.

entwodiksyon

Se siyal Dopamine ki enplike nan fonksyon sèvo divès ki gen ladan kowòdinasyon motè, kontwòl atitid ak mekanis rekonpans [1]. Yon eleman enpòtan nan Dopamine siyal nan vètebref egzèse pa striatal newòn mwayen epineux (MSNs) ki oaza eksprime yon gwoup nan reseptè dopamine ak resevwa dopaminergic opinyon sitou nan zòn nan ventral tegmental (VTA) ak substantia nigra (SN) [2]. Reseptè Dopamine yo se pwoteyin-makonnen reseptè G (GPCR) ak sèt domèn transmembrane epi yo konpoze de de subtip, D1 ki tankou ak D2 ki tankou reseptè, ki medyasyon aksyon resipwòk nan Dopamine siyalizasyon. [1]. Pou egzanp, dopamine D1 ki tankou reseptè (D1, D5) aktive adenylyl siklaz nan Gαs epi ogmante nivo a intracellular nan cAMP, men dopamine D2 ki tankou reseptè (D2, D3, D4) anpeche adenylyl cyclase nan Gαi ak diminye nivo a entranglan CAMP [1], [3].

Pami reseptè Dopamine yo, se reseptè D2 (DRD2) ki enplike nan fizyopoloji nan plizyè gwo pwoblèm psikyatrik ki gen ladan eskizofreni ak dwòg. [4], tankou anpil dwòg antisikotik omwen pasyèlman sible DRD2. Li se tou konnen ki aktivite DRD2 korelasyon byen ak konsekans yo konpòtman nan dwòg nan abi nan modèl bèt [5]. Antidepreseur ak efikasite estabilizasyon atitid te tou te lye nan amenajman nan ekspresyon sifas selil la nan DRD2 oswa en entelèkile siyal medyatè pa PKA, ERK ak GSK3. [1], [4], [6]. Malgre sa yo wòl kritik pou DRD2 nan sèvo a, mekanis detaye regilasyon ki konfere eterojeneite ak konpleksite nan pwopriyete DRD2 pa konplètman konprann.

Liy konvèje nan prèv endike ke miltip modifikasyon posttranslasyonèl yo patisipe nan akor anfòm nan aktivite DRD2. Te vaste glikosilasyon nan DRD2 devwale nan syans foto-rapwòch bonè etikèt [7], ak disulfid kosyon fòmasyon nan DRD2 te tou idantifye kòm yon modifikasyon enpòtan pou ligand obligatwa [8]. Anplis de sa, sit fosforilasyon nan DRD2 yo te okòmansman idantifye pa vitro tès ak radyoisotop yo, ki bay wout pou divès chemen regilasyon medyatè pa divès kalite kinases [9]. Vreman vre, pwoteyin kinaz C (PKC) kontwole DRD2-medyize mobilizasyon nan kalsyòm entelektyèl ak modifye entèraksyon an nan DRD2 ak pwoteyin èskoksèl. [10]. Fosforilasyon pa GPCR kinaz 2 (GRK2) kontwole agonist-induit modèl rensibilizasyon nan DRD2 [11].

Kinaz-depandan siklin 5 (Cdk5) se yon serin / prolonyen ki dirije serin / kinazin ki gen aktivite preferansyèl akòz ekspresyon nan sèvo-espesifik nan aktivatè esansyèl li yo ,. p35 ak p39 [12]. Cdk5 ki enplike nan divès pwosesis nerono ki gen ladan migrasyon nerono ak gidon axon, ak sourit Cdk5 ak p35 nwa montre domaj nan stratifikasyon cortical. [13]. Dènyèman, li te montre fosforilasyon WAVE1 ak epheksin pa Cdk5 kontwole morfojenèz dendritik kolòn vètebral la. [14]. Anplis de sa, Cdk5 tou kontwole nivo ekspresyon sifas nan reseptè a NMDA, NR2B, ak NR2A-medyatè kouran NMDA. [15], [16]. Li enpòtan pou remake ke plizyè moso prèv sijere yon relasyon entim ant Cdk5 ak sistèm nan dopamine. Cdk5 fosforil tyrosin hydroxylase (TH), reglemante estabilite li yo, e konsa kenbe dopasyergic omeyostazi [17]. Nan newòn postsinaptik, lè rezidi T75 nan Dopamine ak siklik-AMP ki te kontwole fosfoprotein-32kD (DARPP-32) fosforil pa Cdk5, li ka anpeche aktivite PKA e konsa antagonize Dopamine DRD1-medyize PKA siyalizasyon. [18]. Enteresan, lè kokayin, yon agonist endirèk nan dopamine reseptè, se administrasyon kwonik nan rat, mRNA ak nivo pwoteyin nan Cdk5 ogmantasyon nan newòn mwayen epineux. [19]. Kolektivman, Cdk5 parèt yo dwe patisipe nan dwòg-pwovoke adaptasyon sinaptik. Nan etid sa a, nou montre yon entèraksyon fonksyonèl nan DRD2 ak Cdk5 ki pli lwen fin wòl nan Cdk5 nan Dopamine siyal.

Materyèl ak Metòd

Antikò

Anti-lapen serom yo te leve soti vivan kont peptides ki gen fosfo-serin 321 (pS321) nan twazyèm lan entranglè nan DRD2 (D2i3). Phospho-peptide, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), te itilize pou fè yon kolòn peptide-konjige pou garanti vokasyon (20401, PIERCE). Anti-pS321 antikò te anrichi pa yon sistèm pou pirifye afeksyon swiv enstriksyon fabrikan an. Pirifye fosfò-antikò te estoke nan PBS ak 0.1% sodyòm azid ak 0.1% jelatin. Anti-sourit anti-Cdk5 antikò (sc-249) ak anti-lapen anti-p35 antikò (sc-820) yo te itilize pou Western blòk ak imunositokemik nan Cdk5 / p35. Anti-sourit anti-GFP antikò (sc-9996) te itilize pou imunoprecipitation la ak Western Western nan DRD2-GFP. Anti-lapen anti-FLAG antikò (sc-807), anti-lapen anti-HA antikò (sc-805), anti-sourit anti-GST antikò (sc-138), ak anti-sourit anti-GAPDH antikò (sc- 32293) te achte nan men Santa Cruz Biyoteknoloji.

bèt

Sourit pent la p35 se te yon kado kalite soti nan Dr Katsuhiko Mikoshiba nan RIKEN Brain Science Institute nan Japon ak itilize pou kilti prensipal newòn. Jadendanfan ansanm pou jenotip yo te 5′- GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5′-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC ak 5′-TCCATCT GCACGAGACTAGT jan yo te dekri deja [20]. Sourit ICR ak rat Sprague Dawley te itilize pou preparasyon lisans nan sèvo. Tout pwosedi bèt yo te apwouve pa Pohang Inivèsite nan Syans ak Teknoloji Enstitisyon Swen Animal ak Komite Sèvi ak.

Plasmid Constructions

Imèn DRD2 isoform long nan yon vektè plasmid EGFP-N1 ak twazyèm entranèl bouk la nan DRD2 (212-373 résidus asid amine ki gen ladan 29 adisyonèl résidus yo asid amine inik nan DRD2 isoform long) nan yon vektè pFLAG-CMV-2 plasmid. Imen Cdk5 te antre nan yon pCMV-HA vektè plasmid ak moun p35 te antre nan yon pcDNA vektè xnom plasmid. Imèn Cdk3.1 te mete anba yon pwomotè sitomegalovirus (CMV) ansanm ak moun p5 nan yon vektè pcDNA 35 fè yon konstwi ekspresyon doub (Cdk3.1 / p5) pou imunocitokemik, tès inovalizasyon reseptè, [35S] -GTPγS esè obligatwa, radioligand obligatwa épreuve ak cAMP anzim imunoito.

Nan Vitro Kenzaz

IP-lye vitro assay kinaz te fèt tankou sa yo. Yon sèvo antye sourit te pase lis nan 3 mL erythrocytes lysis buffer (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) pa 20 kou nan yon omojenizeur Dounce jwenn omojeneize sèvo lisin . Lysates yo te enkubasyon sou glas pou 30 min, sonicated, ak santrifigasyon nan 16,000 × g pou XNIM min. Supernatant yo te immunoprecipitated ak anti-lapen anti-p10 antikò jwenn yon Cdk35 aktif / p5 konplèks. Cdk35 / p5 konplèks ak pirifye pwoteyin fizyon gst te melanje ak adenozin 35′-triposphate, [γ-32P] (NEG-502H, PerkinElmer) ak enkubatèr nan kinaz dezenferans (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl2, 0.2 mM DTT) pou XN h nan tanperati chanm [18], [21]. Pirifye Cdk5 / p25 konplèks (14-516, Millipore) te tou itilize pou vitro tès kinaz jan sa dekri anwo a. 2 × echantiyon tanp lan te ajoute nan melanj reyaksyon an ak bouyi nan 100 ° C. Echantiyon yo te Lè sa a, sibi SDS-PAJ ak jèl la seche te evalye pa autoradiography.

Kromatografi likid (LC) -Mase Spectrometry (MS) / MS analiz

Pwoteyin GST-D2i3 recombinant la te analize pa LC-MS / MS apre IP lye vitro assay kinaz. Nou fè idantifikasyon peptides nan done LC-MS / MS lè l sèvi avèk X !! tandem (vèsyon Dec-01-2008). Chak dosye done RAW te premye konvèti nan mzXML lè l sèvi avèk tiyo a trans-proteomik (TPP; vèsyon 4.3). MS / MS analiz nan mzXMLs yo konvèti te Lè sa a, sibi rechèch kont baz done sekans pwoteyin sourit UniProt (lage 2010_07) ki gen ladan GST-D2i3 sekans lè l sèvi avèk X !! tandem. Te tolerans la mete nan 3 Da pou iyon précurseur ak 2 Da pou iyon fragman. Yo te itilize anzim espesifik pou trypsin. Opsyon modifikasyon varyab yo te itilize pou carbamidomethylation nan stenin (57.021 Da), oksidasyon nan metionin (15.995 Da), idroliz nan asparagine (0.987 Da) ak fosforilasyon nan serin (79.966 Da).

Iminoprecipitation

Imunoprecipitation te fèt sou lysates selil nan ELB tan lizo. Anti-GFP antikò te ajoute nan lysates yo ak enkibatè pou 3 h nan 4 ° C. Imunokwiplis yo te pirifye lè yo itilize pwoteyin-A agaroz. Presipite yo te enkubatèr ak tanpon SDS echantiyon loading pou min 30 nan 37 ° C, ak sibi SDS-PAJ ak machandiz Western.

GST Pull-down Assay

10 µg nan pirifye GST ak GST-D2i3 yo te enkubatèr ak rat lis lis pou 1.5 h nan 4 ° C. 30 µL nan glutathione (GSH)-konjige pèl yo 4B konjak (17-0756-01, GE Swen Sante) ekilibre ak lysis tanpon te ajoute ak enkibasyon pou lòt 1 h. Pèl yo te ranmase nan santrifigasyon nan 2,000 ×g ak rense yo ak lysis tanpon XNUM fwa [22], [23]. Presipit te analysé pa Western blot lè l sèvi avèk anti-Cdk5 ak anti-p35 antikò.

Imunitochimik

Transfected HEK selil 293 ak newòn striatal kiltive sou coverslips yo te lave yon fwa ak fosfat tanbore sal (PBS) ak fiks pa imèsyon nan frèt 4% paraformaldehyde / PBS pou XN min. Prensipal antikò te dilye nan solisyon an bloke (30% chwal serom ak 2% Triton X-1 nan PBS). Alexafluor-100-konjige antikò anti-sourit (A647, Invitrogen) ak Alexafluor-20990-konjige antikò anti-lapen (A568, Invitrogen) yo te itilize kòm antikò segondè. Hoechst te itilize pou tach nwayo. Imaj yo te jwenn pa konfokal mikroskopi (Olympus, FluoView-11011).

Receving internalization assay

NAN H apre transfeksyon, selil yo te trete ak 24 µM ​​quinpirole (Q1, Sigma) pou min 102 ak 30 nan 90 ° C. Selil yo te re-sispann nan 37 mL PBS frèt ak alikòt 2 µL yo te itilize pou chak reyaksyon. Tretman dwòg yo te pote soti nan tanperati chanm pou XN h nan konsantrasyon sa yo; 200 nM3H] -spiperon (NET-565, PerkinElmer), 3 µM ​​sulpirid (895, TOCRIS), 10 µM ​​haloperidol (H1512, Sigma). Idrofob3H] -spiperon te itilize yo mete etikèt sou reseptè total eksprime yo epi yo te idrofil Sulpiride itilize ranplase membranous reseptè-lye [...3H] -spiperon siyal. Siyal reseptè manb ki asosye yo te kalkile lè soustraksyon valè reseptè entrakelilè yo soti nan valè total reseptè eksprime yo. Selil yo te filtre sou yon GF / B (Millipore) filtre ak lave 3 fwa ak lave zòn de defans (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filtè yo te fin chèch nèt ak rezidyèl radyoaktivite te mezire lè l sèvi avèk yon kontwa scintillation likid [24].

Preparasyon Selilè Manb

Selil konfluan nan 100 mm kilti-asyèt apre transfeksyon te lave ak glas-frèt PBS ak rekolt nan 1 mL HME tanpon (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA). Lysate omojene yo te santrifuje ak 500 × g pou 15 min ak supranantan yo te imedyatman santrifye ak 36,000 × g pou 30 min. Pellets re-sispann nan tanpon HME yo te itilize pou assay.

[35S] -GTPγS ansanbl obligatwa

Frape manbràn selilè yo te enkubatète ak 1 µM ​​quinpirole (Q102, Sigma) nan tanpon enstab la (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA ak 0.01 mM GDP) pou XNX min. [35S] -GTPγS (NET-030H, PerkinElmer) te ajoute nan konsantrasyon final la nan 3 nM nan 30 µL ak plis enkibatè pou XNX min. 90 µL de glas-frèt tanpon (170 mM Tris-HCl (pH 10), 8.0 mM NaCl, 100 mM MgCl2, ak 0.1 mM GTP) te ajoute yo sispann reyaksyon an. Manbràn yo te filtre sou yon filtre GF / B (Millipore) ak lave 3 fwa ak lave zòn de defans (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filtè yo te fin chèch nèt epi yo te mezire radyoaktivite lè l sèvi avèk kontwa a sentiyasyon [25], [26].

Radioligand Obligation Assay

Preparasyon manbràn selilè yo te enkibasyon ak 0.01 nM [3H] -spiperon (NET-565, PerkinElmer) ak konsantrasyon ogmante nan quinpirole (Q102, Sigma) pou 30 min nan ékrazan tanpon an (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Manbràn yo te filtre sou yon filtre GF / B (Millipore) ak lave 3 fwa ak lave zòn de defans (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Reyaksyon an te sispann nan filtraj rapid nan filtè GF / C. Radyaktivite rezidyèl te mezire lè l sèvi avèk yon kontwa scintillation likid [27]-[29].

cAMP anzim imunoopay

Selil transfòme HEK 293 yo te pretrakipe ak 10 µM ​​rolipram (R6520, Sigma) pou 1 h, epi yo te trete avèk 0.1 µM ​​forskolin (F6886, Sigma) ak konsantrasyon ogmante nan quinpirole (Q102, Sigma) pou 30 min. Premye newòn striatal kilt yo te trete ak 10 µM ​​rolipram pou 1 h, ak Lè sa a, 1 µM ​​dopamine pou 1 h [22]. Lysat selil yo te prepare ak 0.1 M HCl ak nivo cAMP yo te detekte avèk cAMP anmwensim twous (Sapphire Bioscience) apre enstriksyon fabrikan an.

Prensipal kwonik kwonik newòn

Zòn striatal te izole nan sèvo anbriyon sourit la (E15). Tèks diseksyone yo te asosye nan minimòm medya esansyèl (MEM) (11095, Invitrogen) ki gen 0.25% trypsin (T4549-100, Sigma) ak 0.1% DNase I pou 6 min nan 37 ° C. Selil yo te re-suspened nan medya yo kouvri (MEM ak 0.01 M HEPES (pH 7.4) ak 10% (vol / vol) serik chwal (16050-122, GIBCO)). Neon yo te kiltive pou 10 jou vitro (DIV 7) nan MEM ak sipleman B27 (17504-044, Invitrogen) anvan yo te aplike nan imanisay anmè CAMP.

rezilta

Cdk5 fosforil Serin 321 nan twazyèm lan entèkselulèr nan DRD2 vitro

Pou idantifye nouvo substrats Cdk5, nou fè yon rechèch sistematik lè l sèvi avèk (S / T) PX (K / H / R) kòm sekans konsesyon yo rekonesans Cdk5 ... [30] ak idantifye DRD2 kòm yon substrate kandida. Sekans konsansis la, ki gen ladan serin 321, sitiye nan twazyèm entèliyel bouk nan DRD2 (D2i3) kote divès kalite mekanism regilasyon yo te enplike nan sa. [3], [10], [11]. Sekans lan evolisyonèman konsève nan DRD2 nan vètebre, ki endike yon enpòtans fonksyonèl nan rezidi a (Figi 1A).

thumbnail

Figi 1. Cdk5 fosforil serin 321 nan twazyèm bouk entraksilye nan DRD2 in vitro.

(A) Amine asid aliyman sekans ki montre konsève rejyon nan DRD2 a soti nan divès kalite espès (fonse). Sit potansyèl fosforilizasyon Cdk5 la endike avèk yon asterisk. (B) IP-lye vitro assay kinaz ak pwoteyin mutan GST-D2i3 ak GST-D2i3 recombinant. Cdk5 / p35 konplèks anrichi soti nan sourit ekstrè nan sèvo pa anti-p35 imunoprecipitation te itilize pou kinaz reyaksyon. Yon otadiyograf nan pwoteyin fosforil yo montre ansanm ak Coomassie briyan tach ble nan jèl la menm. Flèch ki endike siyal radyo-aktif ki koresponn a GST-D2i3s ak flèch louvri ki endike siyal radyo-aktif soti nan p35. (C) MS / MS espèk nan fragman an peptides fosforil nan D2i3. Modèl yo fragmentasyon teyorik yo montre anba a spectre la. Pami tout iyon fragman, y-detèkte ak b-iyon yo deziye nan spectre la. Y la6 ak y7 Iyon endike fòtman fosforilasyon serin 321. (D) Nan vitro assay kinaz ak pirifye Cdk5 / GST-p25 konplèks lè l sèvi avèk GST-D2i3 ak GST-D2i3 pwoteyin mutan. Pwoteyin fosforil yo te montre nan yon autoradiograph, ansanm ak Coomassie briyan tach ble. Flèch ki endike siyal radyo-aktif ki koresponn lan GST-D2i3 ak flèch louvri ki endike siyal radyo-aktif soti nan GST-p25.

fè: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Pou evalye kapasite Cdk5 pou fosforil D2i3, nou fè IP-lye vitro assay kinaz lè l sèvi avèk yon Cdk5 aktif / p35 konplèks anrichi soti nan lis nan sourit sourit pa p35 imunoprecipitation ak pirifye recombinant GST-D2i3 pwoteyin (asid amine résidus 212-373) kòm substrats yo. Nou obsève siyal fosforilasyon nan pwoteyin GST-D2i3 ak GST-D2i3 S297A pirifye, men siyal la te siyifikativman diminye lè l sèvi avèk GST-D2i3 S321A (Figi 1B). Plis verifye fosforilasyon nan serin 321 nan GST-D2i3 la, nou fè analiz LC-MS / MS nan echantiyon yo soti nan IP lye-. vitro assay kinaz lè l sèvi avèk spectrometry mas LTQ XL. Toujou, phospho-peptides ki koresponn a mas nan peptides 321 fosfo-serin yo te refè (Figi 1C). Lè ou konsidere ke akizisyon done ki depann de analiz LC-MS / MS gen tandans detekte pwoteyin abondan nan echantiyon an [31], done sa a sijere ke serin 321 rezidi a se sit la fosforilasyon dominan nan Cdk5 nan rejyon an D2i3. Pou pwouve dirèk fosforilasyon nan serin 321 nan GST-D2i3 a pa Cdk5, vitro assay kinaz lè l sèvi avèk pirifye konplèks Cdk5 / GST-p25 ak pirifye pwoteyin GST-D2i3 recombinant te fèt. Nou idantifye yon siyal fosforilasyon enpòtan nan GST-D2i3 ki te absan nan S2A GST-D3i321 (Figi 1D). Ansanm, rezilta sa yo endike rezidi D2i3 S321 la se yon sib preferansyèl pou fosforilasyon Cdk5-medyatè.

Cdk5 Phosphorylates Serin 321 nan twazyèm lan entèkselel nan DRD2 nan Selil yo

Pou idantifye fosforilasyon serin 321, nou leve soti vivan antikò espesifik pou fosfo-serin 321 (pS321). Samples soti nan IP-lye la vitro assay kinaz yo te analysé pa Western blot lè l sèvi avèk anti-pS321 antikò. Blots te montre yon gwoup distenk nan reyaksyon kinaz la ki te depann sou GST-D2i3 (Figi 2A). Pou verifye potansyèl fosforilasyon serin 321 nan DRD2 pa Cdk5 nan selil yo, yo te analize imunoprecipitè anti-GFP soti nan selil HEK 293 ki eksprime DRD2-GFP ak DRD2 S321A-GFP avèk oswa san HA-Cdk5 ak p35 te analize pa Western-bloting lè l sèvi avèk anti-GFP ak anti-pS321 antikò. Siyal band andwi karakteristik pa anti-GFP antikò ki ke yo konnen yo dwe akòz glikozilasyon twòp nan DRD2 yo obsève sèlman nan prezans DRD2-GFP, ak anti-pS321 antikò detekte menm siyal DRD2 sèlman ak ekspresyon ko Cdk5 / p35 koFigi 2B) [7]. Plis verifye fosforilasyon nan serin 321 pa Cdk5, D2i3 (flag-D2i3) ak mitasyon fòm D2i3 (flag-D2i3 S321A) te pwodwi. FLAG-D2i3 ak FLAG-D2i3 S321A ki eksprime avèk oswa san HA-Cdk5 ak p35 nan HEK 293 selil yo te analysé pa yon SDS-jeni mobilite ensistans chanjman. Yon gwo chanjman mobilite depans Cdk5 te obsève pou FLAG-D2i3, men pa pou FLAG-D2i3 S321A (Figi 2C). Nou menm tou nou evalye nivo fosforilasyon nan DRD2 nan Ser321 sou eksitasyon agonist. Selil HEX 293 ki eksprime konplèks DRD2-GFP ak Cdk5 / p35 te ankouraje pa quinpirole, ak anti-GFP immunoprecipitates soti nan lis la selil yo te analysé pa Western blot lè l sèvi avèk anti-GFP ak anti-pS321 antikò. Nou jwenn ke fosforilasyon Cdk5-medyatè nan DRD2 nan Ser321 pa te afekte pa stimulation agonis, ki parèt diferan de GRK- ak fosforilasyon medya PKC ((...)Figi 2D) [32], [33]. Ansanm, rezilta sa yo endike ke Cdk5 ka fosforil serin 321 rezidi nan DRD2 nan anviwònman selilè.

thumbnail

Figi 2. Cdk5 fosforil serin 321 nan twazyèm bouk entraksilye nan DRD2 nan selil yo.

Fosforilasyon Cdk5-medyatè nan serin 321 te analize lè l sèvi avèk anti-pS321 antikò. (A) Samples soti nan IP lye- vitro assay kinaz lè l sèvi avèk GST-D2i3 pwoteyin yo te analize nan Western blot (WB) ak antikò ki endike yo. Flèch yo endike GST-D2i3s. (B) DRD2-GFP ak DRD2 S321A-GFP te eksprime avèk oswa san HA-Cdk5 ak p35 nan selil HEK 293. Anti-GFP immunoprecipitates yo te analysé pa Western blot lè l sèvi avèk anti-GFP ak anti-pS321 antikò. Bracket la endike siyal DRD2 ak flèch louvri ki endike siyal nonspecific ki soti nan anti-GFP immunoprecipitates yo. '% opinyon' se% volim nan lisin total pou yon reyaksyon IP. Siyal fèb Cdk5 andojèn yo te endike pa asterisk. (C) jestisman sou mobilite jèl. Selil HEK 293 transfekte jan endike a te analize pa Western blot. (D) Transfected HEK 293 selil yo te trete ak quinpirole ak anti-GFP immunoprecipitates yo te analysé pa Western blot ak anti-GFP ak anti-pS321 antikò. Open arrowhead endike siyal nonspec anti-GFP immunoprecipitates.

fè: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 konplèks ak DRD2 yo fizikman asosye yo

Nou envestige potansyèl entèraksyon fizik ki genyen ant konplèks la Cdk5 / p35 ak DRD2 paske anpil substrats Cdk5 yo konnen yo dwe fizikman asosye ak Cdk5 / p35 konplèks. [23], [34], [35]. Premyèman, te eksperyans lan GST rale-desann fè. Pirifye pwoteyin gst-D2i3 recombinant yo enkibasyon ak rat lis nan sèvo ak GST rale-desann presipite yo te analize pou Western blot. Jan yo montre nan Figi 3A, yo te idwojèn Cdk5 ak p35 idantifye nan presipite yo rale-desann, ki endike yon entèraksyon fizik ant DRD2 ak Cdk5 a / konplèks p35 (Figi 3A). Anplis, HA-Cdk5 ak p35 yo te detekte nan anti-GFP immunoprecipitates yo soti nan lis selil HEK 293 eksprime DRD2-GFP ak Cdk5 / p35 (Figi 3B). Anplis de sa, nou fè analyses immunocytochemical ak obsève ke DRD2-GFP, HA-Cdk5 ak p35 montre siyifikatif siyalizasyon ko-lokalizasyon nan zòn nan manbràn nan selil HEK 293 (Figi 3C, panno anwo). Nou menm tou nou envestige ko-lokalizasyon nan DRD2 ak Cdk5 / p35 nan kontèks la neronal. Toujou, DRD2-GFP te montre tou siyifikatif ko-lokalizasyon ak andojèn Cdk5 ak p35 nan newòn yo striatal kiltive (DIV7), plis sipòte lyen fonksyonèl ant DRD2 ak Cdk5 / p35 (Figi 3C, panno anba). Rezilta yo endike ke DRD2 ak Cdk5 / p35 ka fòme yon konplèks e konsa, sipòte nosyon ki DRD2 se yon substra fizyolojik nan Cdk5.

thumbnail

Figi 3. Cdk5 / p35 ka fòme yon konplèks ak DRD2.

(A) GST rale-desann épreuves lè l sèvi avèk pirifye rkonbine gst-D2iXNX pwoteyin ak ekstrè nan sèvo rat. GST rale-desann presipite yo te sibi analyses Western efase. 'Chaplèt' endike presye rale-desann san pwoteyin GST yo. (B) iminoprecipitation nan DRD3 ak Cdk2 / p5 konplèks. Anti-GFP IP soti nan lysates soti nan transfected selil yo te sibi analyses Western efase. Bracket la endike siyal DRD35 ak flèch louvri ki endike siyal nonspecific ki soti nan anti-GFP immunoprecipitates yo. Yon blot surèkspoze pou entrain yo montre tou nan dwa. (C) analiz imunitochimik nan DRD2 ak Cdk2 / p5. Selil HEK 35 ki eksprime DRD293-GFP ak Cdk2 / p5 te tache ak anti-Cdk35 ak anti-p5 antikò (panno Upper). DRD35-GFP te eksprime pou kont li nan newòn yo striatal kiltive ak tache ak anti-Cdk2 ak anti-p5 antikò (Lower panno). Hoechst te itilize pou tach nwayo. Ba echèl la se 35 µm. Tout imaj yo te jwenn lè l sèvi avèk mikroskopi confocal (Olympus, FluoView-5).

fè: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Fosforilasyon Cdk5-medyatè nan DRD2 Atenu Aktivite reseptè

Li te rapòte ke fosforilasyon modile pwopriyete kritik nan GPCRs tankou kouch pwoteyin G, entènizasyon reseptè, entranglan lokalizasyon, ak asosyasyon ak pwoteyin modulateur. [9], [11], [24]. Yongonist-endike reseptè entènalisasyon se yon pwosesis kritik regilasyon nan transdiksyon siyal. Nou envestige Cdk5-medyatè modulation nan internalizasyon DRD2. Selil HEX 293 ki eksprime DRD2-GFP ak DRD2 S321A-GFP avèk oswa san Cdk5 / p35 yo te enkubatète ak 1 µM ​​quinpirole pouse agonist-stimulé DRD2 internalizasyon (Figi 4A). [3H] -spiperon siyal nan DRD2-GFP eksprime selil yo te siyifikativman redwi nan 30 min tretman quinpirole ak refè nan 90 min. Enteresan, [3H] -spiperon siyal DRD2-GFP ak Cdk5 / p35 eksprime selil yo te redwi tou nan 30 tretman min quinpirol men yo pa refè nan 90 min (Figi 4A, dezyèm seksyon). Nan lòt men an, [3H] -spiperon siyal nan selil DRD2 S321A-GFP eksprime yo te redwi nan 30 min ak refè nan 90 min, kèlkeswa ko-ekspresyon an ak Cdk5 / p35. Etid anvan yo montre ke DRD2 an internalize resikle tounen nan manbràn nan plasma sou eksitasyon agonist pwolonje. [11]. TMari li sanble ke fosforilasyon medyatè Cdk5 nan DRD2 enplike nan pwosesis resensitizasyon apre agonist ki induit DRD2 internalizasyon.

thumbnail

Figi 4. Fosforilasyon Cdk5-medyatè atenu ekspresyon sifas DRD2 ak siyal en.

(A) ekspresyon sifas DRD2 mezire pa [3H] -spiperon obligatwa assay. Selil transfè HEK293 yo te ankouraje ak 1 µM ​​quinpirol pou tan ki endike a ak rekolt, ki te swiv pa 3 nM [3H] -spiperone tretman pou 3 h. Radyoaktivite te mezire ak siyal sifas yo te kalkile. Ba Erè reprezante vle di ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; One-way ANOVA ak tès Dunnett post hoc: konpare tout kolòn vs kolòn kontwòl). (B) [35S] -GTPγEsè S obligatwa. Manbràn selilè yo te prepare soti nan selil yo transfected jan endike yo. Preparasyon pou manbràn yo te enkibasyon ak 1 µM ​​quinpirole ki te swiv pa 3 nM [35S] -GTPγS pou 90 min. Ba Erè reprezante vle di ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; One-way ANOVA ak tès Bonferroni post hoc: konpare tout pè kolòn). (C) Quinpirole-konpetisyon [3H] -spiperon obligatwa assay. Preparasyon pou manbràn ki soti nan selil transfekte yo te enkibasyon ak 0.01 nM [3H] -spiperone ak konsantrasyon ogmante nan quinpirole pou 30 min. Ki pa Peye-lineyè retou annaryè te jwenn nan GraphPad. Ba Erè endike vle di ± SE (n = 3). (D) imunolojik anzim cAMP nan selil transfè HEK 293 yo. Selil transfekte yo te trete avèk 10 µM rolipram pou 1 h, epi imedyatman ko-trete ak 0.1 µM forskolin ak ogmante konsantrasyon nan quinpirole pou 30 min. Ki pa Peye-lineyè retou annaryè te jwenn nan GraphPad. Ba Erè reprezante vle di ± SE (n = 4; ** p <0.01; de-keu t-test). (E) kiltirèl newòn striatal soti nan kalite sovaj ak anbriyon pentch p35 (DIV 7) yo te trete ak 10 µM ​​Rolipram pou 1 ki te swiv pa 1 µM ​​dopamine pou 1 h. Ba erè reprezante mwayèn ± SE (n = 4; **p<0.01; de-keu t-test).

fè: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Nou pli lwen evalye yon chanjman potansyèl nan agonist-stimulé koupin pwoteyin G DRD2 ki asosye ak fosforilasyon Cdk5-medyatè lè l sèvi avèk [...35S] -GTPγEsè S obligatwa [25], [26]. DRD2-GFP ak DRD2 S321A-GFP avèk oswa san Cdk5 / p35 yo te eksprime nan HEK 293 selil yo. Manbràn yo te prepare ak ankouraje ak 1 µM ​​quinpirole ak plis pèmèt [35S] -GTPγS enkòporasyon. DRD2-GFP ak Cdk5 / p35 eksprime manbràn selil te montre siyifikativman [...35S] -GTPγS obligatwa konpare ak tout lòt manbràn selilè yo (Figi 4B). Rezilta sa yo endike ke fosforilasyon Cdk5-medyatè desann-kontwole agonist-ankouraje G obligasyon pwoteyin nan DRD2.

Anplis de sa, quinpirole-konpetisyon [...3Assay obligatwa H] -spiperon te fèt pou envestige nenpòt chanjman potansyèl nan agonist-vokasyon nan DRD2 pa fosforilasyon Cdk5-medyatè. Lyen konpetitif nan [...3H] -spiperon sou tretman pou ogmante konsantrasyon nan quinpirol nan preparasyon an manbràn soti nan transfected te mezire. Konpetisyon obligasyon nan quinpirole ak [3H] -spiperon nan DRD2-GFP ak DRD2 S321A-GFP te fè menm jan an.i valè (−9.789 pou DRD2-GFP; −9.691 pou DRD2 S321A-GFP), ki endike ke rapor a ligann DRD2 pa siyifikativman afekte pa fosilatasyon Cdk5 medyatè-nan DRD2 (Figi 4C).

Fosforilasyon Cdk5-medyatè Down-kontwole DRD2-CAMP Path la siyal Chemen

Next, nou envestige si wi ou non modifikasyon an nan DRD2 pa Cdk5 afekte en siyal wout. Nou kontwole anpèchman DRD2-medyatè nan forskolin-ankouraje pwodiksyon CAMP pa adenylyl siklaz nan selil yo eksprime DRD2-GFP ak DRD2 S321A-GFP lè l sèvi avèk AMPASS CAMP anzim. Selil DRD2-eksprime te montre diminye nivo cAMP an repons a quinpirole nan yon mannyè ki depann de dòz. Remakableman, ko-ekspresyon nan Cdk5 / p35 siyifikativman redwi anpèchman maksimòm nan fòmasyon CAMP (Fig. 4D, panèl bò gòch). Nan lòt men an, nan DRD2 S321A-GFP eksprime selil yo, fòmasyon yo CAMP yo te efikasman inibe nan repons a tretman quinpirole kèlkeswa ekspresyon an nan Cdk5 / p35 (Fig. 4D, dwa panèl). Rezilta sa yo endike ke fosforilasyon Cdk5-medyatè nan DRD2 diminye aktivite a inhibition nan DRD2 sou wout la CAMP descendant siyal. Pli lwen konfime fenomèn yo nan yon anviwònman pi fizyolojik ki enpòtan yo, nou te fè pou sèvi ak newòn primè kilt soti nan embesil pentch ensifizan nan pXNX, yon esansyèl Cdk35 activator. Premye newòn striatal kilt yo te trete ak dopaminer 5 µM ​​ak analize pa iman ima ensifòm CAMP. Newòn nan p1 sourit pentch ekspoze redwi nivo AMPAS konpare ak newòn kalite sovaj lè stimulé ak dopamine (Figi 4E). Taken ansanm, nou konkli ke Cdk5-medyatè fosforilasyon nan DRD2 rezilta nan yon diminisyon nan ton an inhibition sou wout la CAMP egzèse pa DRD2.

Diskisyon

Nou idantifye DRD2 kòm yon substrate roman nan Cdk5. Fosforilasyon a parèt desann-kontwole ekspresyon sifas DRD2 pa afekte sò a nan DRD2 apre reseptè internalizasyon kidonk diminye DRD2 Gi-coupling ak chemen downstream CAMP. Kòm rezèv la fosforilasyon S321 egziste tou de nan DRD2 izoform long ak kout, mekanis ki pwopoze a nan etid sa a ka yon mòd jeneral nan règleman nan DRD2-medyatè siyal..

DRD2 nan newòn mwayen epineux pa sèlman te konsidere kòm yon subtip pi gwo reseptè Dopamine men tou te rekonèt pou emotivite li nan chanjman ki fèt nan disponiblite nan repons a stimuli anviwònman an. Desensibilizasyon agonist-induit ak resensibilizasyon nan DRD2 yo te anpil etidye [11], [24]. An patikilye, gen yon seri de etid ki montre efè ekspozisyon sikostimulan kwonik, tankou kokayin ak anfetamin, ki ogmante nivo ekstrakililè Dopamine nan sinaps striatal, akonpaye pa chanjman dinamik nan DRD2 postsynaptically [36]. Vreman vre, itilizatè yo kwonik kokayin yo konnen ki redwi nivo DRD2 nan zòn nan striatal, ak disponiblite DRD2 nan nwayo accumbens yo (NAcc) montre yon korelasyon negatif ak chèche dwòg la ak konpòtman ranfòsman nan sourit yo ak primat. [37]-[39]. Rezilta sa yo endike ke fonksyonalite nan DRD2 se trè sansib a adaptasyon oswa konpansasyon règleman an repons a stimuli divès ki gen ladan ekspoze kwonik dwòg. Rezilta nou yo montre ke rezidu S321 nan twazyèm entèlièl bouk DRD2 ka fosforil pa Cdk5, ki rezilta nan yon diminisyon nan enfliyanse inhibition nan DRD2 sou chemen an CAMP. Entèraksyon sa a pwopoze yon nouvo mekanis regilasyon ki asosye avèk Cdk5 nan newòn dopaminoceptive ki ta kapab lye ak nati dinamik disponibilite sifas DRD2.

Li ta dwe te note ke Cdk5 se li te ye yo dwe yon eleman kle nan medyatè chanjman adaptasyon nan anviwònman an nerono. Pou egzanp, chanjman estriktirèl ak fonksyonèl nan epin dendritik nan newòn yo nan kous la lenbik yo se youn nan konsekans yo nan ekspoze sikostimulan repete. [40]. Chanjman sa yo akonpaye pa plizyè chanjman molekilè ki gen ladan endiksyon nan pwoteyin CAMP eleman-obligatwa repons (CREB) ak ΔFosB, faktè transkripsyon ki montre yon dirab moute-règleman an repons a administrasyon kokayin kwonik. [41], [42]. Enpòtan, Cdk5 se yon sib nan ΔFosB [19], ak anpil eleman kritik patisipe nan dinamik dendritik kolòn vètebral, tankou PSD-95, p21-aktive kinaz (PAK), β-catenin, ak spinophilin, yo te rapòte kòm substrats Cdk5 [43]-[46]. Toujou, manipilasyon jenetik oswa famasi nan aktivite Cdk5 lakòz chanjman nan morfoloji dendritik kolòn vètebral ak repons konpòtman nan kokayin, qui wòl kritik pou Cdk5 nan chanjman sa yo molekilè ak mòfoloji nan sikwi dopamine mesolimbic [47], [48]. Rezilta nou yo ki montre ke DRD2 se yon sib roman nan Cdk5 bay insight adisyonèl nan chanjman sa yo adaptasyon nan sistèm nan dopamine an repons a ekspozisyon medikaman kwonik paske nan ki vin apre B-medyasyon an moute-règleman nan Cdk5 medsin ka pwovoke yon ogmantasyon tonik nan fosforilasyon nan DRD2. . Anplis, DRD2 se li te ye ki afekte anpil pwosesis selilè, ki gen ladan règleman CAMP ak MAP kinaz chemen ak evènman transcriptional en ... [42], [49]. Kidonk, rezilta yo nan etid sa a ta ka pa sèlman dekri yon règleman dirèk nan DRD2 pa Cdk5 men tou bay yon insight roman nan repons yo adaptasyon nan sistèm Dopamine nan ekspoze dwòg kwonik.

Otè Kontribisyon

Konsevwa ak ki fèt eksperyans yo: JJ YUP DH SKP. Fè eksperyans yo: JJ YUP DKK YK. Analize done yo: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Reyaktif kontribiye / materyèl / zouti analiz: YHS. Ekri papye a: JJ SKP.

Referans

  1. NAN. Missale C, Nash SR, Robinson SW, Jaber M, Caron MG (1) Reseptè Dopamine: soti nan estrikti nan fonksyon. Physiol Rev 1998: 78 – 189.
  2. NAN. Wise RA (2) Sikwi sikwi rekonpans: Sur soti nan ankourajman unsen. Newòn 2002: 36 – 229. doi: 240 / s10.1016-0896 (6273) 02-00965
  3. View Atik
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. View Atik
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. View Atik
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. View Atik
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. View Atik
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. View Atik
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. View Atik
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. View Atik
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. View Atik
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. View Atik
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. View Atik
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. View Atik
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. View Atik
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. View Atik
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. View Atik
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. View Atik
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. View Atik
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. View Atik
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. View Atik
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. View Atik
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. View Atik
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. View Atik
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. View Atik
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. View Atik
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. View Atik
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. View Atik
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. View Atik
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. View Atik
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. View Atik
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. View Atik
  91. PubMed / NCBI
  92. Google Scholar
  93. View Atik
  94. PubMed / NCBI
  95. Google Scholar
  96. View Atik
  97. PubMed / NCBI
  98. Google Scholar
  99. View Atik
  100. PubMed / NCBI
  101. Google Scholar
  102. View Atik
  103. PubMed / NCBI
  104. Google Scholar
  105. View Atik
  106. PubMed / NCBI
  107. Google Scholar
  108. View Atik
  109. PubMed / NCBI
  110. Google Scholar
  111. View Atik
  112. PubMed / NCBI
  113. Google Scholar
  114. View Atik
  115. PubMed / NCBI
  116. Google Scholar
  117. View Atik
  118. PubMed / NCBI
  119. Google Scholar
  120. View Atik
  121. PubMed / NCBI
  122. Google Scholar
  123. View Atik
  124. PubMed / NCBI
  125. Google Scholar
  126. View Atik
  127. PubMed / NCBI
  128. Google Scholar
  129. View Atik
  130. PubMed / NCBI
  131. Google Scholar
  132. View Atik
  133. PubMed / NCBI
  134. Google Scholar
  135. View Atik
  136. PubMed / NCBI
  137. Google Scholar
  138. View Atik
  139. PubMed / NCBI
  140. Google Scholar
  141. View Atik
  142. PubMed / NCBI
  143. Google Scholar
  144. NAN. Neve KA, Seamans JK, Trantham-Davidson H (3) reseptè Dopamine siyal. J Recept Signal Transduct Res 2004: 24 – 165. doi: 205 / lrst-10.1081
  145. NAN. Amar S, Shaltiel G, Mann L, Shamir A, Dean B, et al. (4) Posib patisipasyon nan post-Dopamine D2008 reseptè konpozan siyal konpozan nan fizyopoloji nan eskizofreni. Int J Neuropsychopharmacol 2: 11 – 197. doi: 205 / s10.1017
  146. NAN. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, et al. (5) Wòl Dopamine D2002 ki tankou reseptè nan kokayin oto-administrasyon: etid ak D2 reseptè sourit mutant ak roman antagonist D2 reseptè. J Neurosci NUMT: KIJAN-NAN.
  147. NAN. Lee S, Jeong J, Park YU, Kwak Y, Lee SA, et al. (6) Valproate modifye Dopamine siyal an asosyasyon avèk endiksyon nan Par-2012 pwoteksyon ekspresyon. PLoS One 4: e7. doi: 45618 / journal.pone.10.1371
  148. NAN. Fishburn CS, Elazar Z, Fuchs S (7) Diferansye glikosilasyon ak trafik entèkselilè pou izoform long ak kout nan reseptè Dopamine D1995. J Biol Chem 2: 270 – 29819. doi: 29824 / jbc.10.1074
  149. NAN. Reader TA, Molina-Holgado E, Lima L, Boulianne S, Dewar KM (8) Espesifik [1992H] obligatwa raclopride nan neostozib dopamine D3 reseptè: wòl disulfure ak gwoup sulfhydryl. Neurochem Res 2: 17 – 749. doi: 759 / bf10.1007
  150. NAN. Ng GY, O'Dowd BF, Caron M, Dennis M, Brann MR, et al. (9) fosforilasyon ak palmitoylasyon imen an D1994L reseptè dopamine nan SF2 selil yo. J Neurochem 9: 63 – 1589. doi: 1595 / j.10.1046-1471.x
  151. NAN. Li M, Bermak JC, Wang ZW, Zhou QY (10) Modilasyon reseptè Dopamine D (2000) siyal pa pwoteyin actin-obligatwa (ABP-2). Mol Pharmacol 280: 57 – 446.
  152. NAN. Cho D, Zheng M, Min C, Ma L, Kurose H, et al. (11) Agonist-induit endocytosis ak reseptè fosforilasyon medyasyon rensibilizasyon nan Dopamine D (2010) reseptè. Mol Endocrinol 2: 24 – 574. doi: 586 / me.10.1210-2009
  153. NAN. Tsai LH, Delalle mwen, Kavite VS Jr, Chae T, Harlow E (12) p1994 se yon nòm ki espesifik regilye subunit nan kinin-depandan kinaz 35. Nati NAN: NAN-NAN. doi: 5 / 371a419
  154. NAN. Dhavan R, Tsai LH (13) Yon deseni nan CDK2001. Nat Rev Mol Cell Biol 5: 2 – 749. doi: 759 / 10.1038
  155. NAN. Fu AK, IP NY (14) kinaz ki depann siklin 2007 konekte siyal entansèl yo nan zitoskelèt aktin pandan devlopman dendritik kolòn vètebral la. Cell Adh Migr NAN: NAN-NAN. doi: 5 / cam.1
  156. NAN. Wang J, Liu S, Fu Y, Wang JH, Lu Y (15) Cdk2003 deklanchman antren ipokampal CA5 selil lanmò pa dirèkteman fosforil reseptè NMDA. Nat Neurosci 1: 6 – 1039. doi: 1047 / nn10.1038
  157. NAN. Zhang S, Edelmann L, Liu J, Crandall JE, Morabito MA (16) Cdk2008 kontwole fosforilasyon tyrosin 5 NR1472B ak ekspresyon sifas reseptè NMDA yo. J Neurosci NUMT: KIJAN-NAN. doi: 2 / jneurosci.28-415
  158. NAN. Moy LY, Tsai LH (17) kinaz-depandan kinaz 2004 fosforil serin 5 nan idroksilaz tirozin ak kontwole estabilite li yo. J Biol Chem 31: 279 – 54487. doi: 54493 / jbc.m10.1074
  159. NAN. Bibb JA, Snyder GL, Nishi A, Yan Z, Meijer L, et al. (18) Fosforilasyon nan DARPP-1999 pa Cdk32 modile Dopamine siyal nan newòn. Nati NAN: NAN-NAN.
  160. NAN. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, et al. (19) Efè ekspozisyon kwonik nan kokayin yo réglementées pa nerono pwoteyin Cdk2001 la. Nati NAN: NAN-NAN.
  161. NAN. Ohshima T, Ogawa M, Veeranna, Hirasawa M, G Longenecker, et al. (20) kontribisyon sinèrjistik kinin-depandan kinaz 2001 / p5 ak Reelin / Dab35 nan pwezante a nan newòn cortical nan sèvo a sourit devlope. Proc Natl Acad Sci USA NAN: KIJAN-NAN. doi: 1 / pnas.98
  162. NAN. Morabito MA, Sheng M, Tsai LH (21) kinaz ki depann siklin 2004 fosforil domèn N-tèminal pwoteyin dansite postsinapik PSD-5 nan newòn. J Neurosci NUMT: KIJAN-NAN. doi: 95 / jneurosci.24-865
  163. NAN. Park SK, Nguyen MD, Fischer A, Lik, Affar el B, et al. (22) Par-2005 lyen Dopamine siyal ak depresyon. Pòtab 4: 122-275. doi: 287 / j.cell.10.1016
  164. NAN. Niethammer M, DS DS, Ayala R, Peng J, Ko J, et al. (23) NUDEL se yon roman Cdk2000 substrate ki asosye ak LIS5 ak cytoplasmic dynein. Newòn 1: 28 – 697. doi: 711 / s10.1016-0896 (6273) 00-00147
  165. NAN. Kim KM, Valenzano KJ, Robinson SR, Yao WD, Barak LS, et al. (24) Diferansyèl règleman nan Dopamine D2001 la ak D2 reseptè pa g kenz yo reseptè pwoteyin-pwoteje ak beta-arrestins. J Biol Chem 3: 276 – 37409. doi: 37414 / jbc.m10.1074
  166. NAN. Waldhoer M, Bofill-Cardona E, Milligan G, Freissmuth M, Nanoff C (25) Diferansye koudon nan A1998 adenozin ak D1 Dopamine reseptè pa suramin ak didaminik suramin (NF2). Mol Pharmacol 037: 53 – 808.
  167. NAN. Bofill-Cardona E, Kudlacek O, Yang Q, Ahorn H, Freissmuth M, et al. (26) Obligatwa nan kalmodulin reseptè a D2000-dopamine diminye reseptè siyal pa arete switch la aktivasyon pwoteyin G. J Biol Chem 2: 275 – 32672. doi: 32680 / jbc.m10.1074
  168. NAN. Lis SJ, Seeman P (27) Rezolisyon nan Dopamine ak serotonin konpozan reseptè nan [1981H] spipèrrons obligatwa nan rejyon nan sèvo rat. Proc Natl Acad Sci USA NAN: KIJAN-NAN. doi: 3 / pnas.78
  169. NAN. Gardner B, etranj PG (28) aksyon agonist nan D1998 (long) reseptè dopamine: ligand obligatwa ak analiz fonksyonèl. Br J Pharmacol 2: 124 – 978. doi: 984 / sj.bjp.10.1038
  170. NAN. Seeman P, Tallerico T, Ko F (29) Dopamine deplase [2003H] domperidone soti nan sit-wo vokasyon nan Dopamine D3 reseptè a, men se pa [2H] raclopride oswa [3H] spiperon nan mwayen izotonic: Enplikasyon pou imè pozisyon imen pozisyon. Sinaps 3: 49 – 209. doi: 215 / syn.10.1002
  171. NAN. Obenauer JC, Cantley LC, Yaffe MB (30) Scansite 2003: prediksyon Proteome-lajè nan entèraksyon siyal selil lè l sèvi avèk motif sekans kout. Nucleic Acids Res 2.0 Resous Acids Res 31: 3635 – 3641. doi: 10.1093 / nar / gkg584
  172. NAN. Liu H, Sadygov RG, Yates JR 31rd (3) Yon modèl pou pran echantiyon o aza ak estimasyon an abondans pwoteyin relatif nan pwomotomik pwent. Anal Chem 2004: 76 – 4193. doi: 4201 / ac10.1021
  173. NAN. Ito K, Haga T, Lameh J, Sadee W (32) Sechrès nan dopaminè D1999 reseptè depann sou coexpression nan k-pwoteyin-makine-reseptè kinas 2 oswa 2. Eur J Biochem NAN: 5 – 260. doi: 112 / j.119-10.1046.x
  174. NAN. Nam Y, Sibley DR (33) Pwotey kinaz C medye fosforilasyon, desansibilizasyon, ak trafik nan D2004 reseptè a dopamine. J Biol Chem 2: 279 – 49533. doi: 49541 / jbc.m10.1074
  175. NAN. Wong AS, Lee RH, Cheung AY, Yeung PK, Chung SK, et al. (34) fosforilasyon Cdk2011-medyatè nan endofilin B5 obligatwa pou otofagi induit nan modèl maladi Parkinson la. Nat Cell Biol 1: 13 – 568. doi: 579 / ncb10.1038
  176. NAN. Kesavapany S, Lau KF, McLoughlin DM, Brownlees J, Ackerley S, et al. (35) p2001 / cdk35 mare ak fosforil beta-catenin ak kontwole beta-catenin / presenilin-5 entèraksyon. Eur J Neurosci NUMT: KIJAN-NAN. doi: 1 / j.13-241.x
  177. NAN. Kuhar MJ, Ritz MC, Boja JW (36) Ipotèz Dopamine nan pwopriyete yo ranfòse nan kokayin. Tandans Neurosci NUMT: NAN-NAN. doi: 1991 / 14-299 (302) 10.1016-g
  178. NAN. Volk ND, Fowler JS, Wolf AP, Schlyer D, Shiue CY, et al. (37) Efè abi kokayin kwonik sou reseptè postsamine-dopatik. Am J Sikyatri 1990: 147 – 719.
  179. NAN. Dalley JW, Fryer TD, Brichard L, Robinson ES, Theobald DE, et al. (38) Nukle accumbens D2007 / 2 reseptè predi karakteristik enèji ak ranfòsman kokayin. Syans NAN: KIJAN-NAN. doi: 3 / science.315
  180. NAN. Nader MA, Morgan D, Gage HD, Nader SH, Calhoun TL, et al. (39) PET an ki kalite dopamine D2006 reseptè pandan kwonik kokayin pwòp tèt ou-administrasyon nan makak. Nat Neurosci 2: 9 – 1050. doi: 1056 / nn10.1038
  181. NAN. Robinson TE, Kolb B (40) Persistent modifikasyon estriktirèl nan nwayo accumbens ak prefrontal neurones cortical ki te pwodwi pa eksperyans anvan ak anfetamin. J Neurosci NUMT: KIJAN-NAN.
  182. NAN. Robinson TE, Kolb B (41) Chanjman nan mòfolojik dandrit yo ak epin dendritik nan nwayo accumbens yo ak cortical prefrontal apre repete tretman ak anfetamin oswa kokayin. Eur J Neurosci NUMT: KIJAN-NAN. doi: 1999 / j.11-1598.x
  183. NAN. McClung CA, Nestler EJ (42) Règleman nan ekspresyon jèn ak rekonpans kokayin pa CREB ak DeltaFosB. Nat Neurosci 2003: 6 – 1208. doi: 1215 / nn10.1038
  184. NAN. Feng J, Yan Z, Ferreira A, Tomizawa K, Liauw JA, et al. (43) Spinophilin kontwole fòmasyon an ak fonksyon nan epin dendritic. Proc Natl Acad Sci USA NAN: KIJAN-NAN. doi: 2000 / pnas.97
  185. NAN. Prange O, Murphy TH (44) Transpò modilè nan grap postsinaptik dansite-2001 ak asosyasyon avèk precursè kolòn vètebral ki estab pandan devlopman bonè nan newòn kortik. J Neurosci NUMT: KIJAN-NAN.
  186. NAN. Murase S, Mosser E, Schuman EM (45) Depolarizasyon kondwi beta-catenin nan epin nerono fè pwomosyon chanjman nan estrikti sinaptik ak fonksyon. Newòn 2002: 35 – 91. doi: 105 / s10.1016-0896 (6273) 02-x
  187. NAN. Hayashi ML, Choi SY, Rao BS, Jung HY, Lee HK, et al. (46) Chanje cortical senaptik mòfoloji ak pwoblèm konsolidasyon memwa nan forebrain-espesifik dominan-negatif sourit transgenik PAK. Newòn 2004: 42 – 773. doi: 787 / j.neuron.10.1016
  188. NAN. Benavides DR, Quinn JJ, Zhong P, Hawasli AH, DiLeone RJ, et al. (47) Cdk2007 modifye kokayan rekonpans, motivasyon, ak stritale neuron entelijans. J Neurosci NUMT: KIJAN-NAN. doi: 5 / jneurosci.27-12967
  189. NAN. Meyer DA, Richer E, SA Benkovic, Hayashi K, Kansy JW, et al. (48) dysregulation striatal nan Cdk2008 modifye repons lokomotè kokayin, aprantisaj motè, ak mòfoloji dendritic. Proc Natl Acad Sci USA NAN: KIJAN-NAN. doi: 5 / pnas.105
  190. NAN. Impey S, Obrietan K, Tanpèt DR (49) Fè nouvo koneksyon: wòl ERK / MAP kinaz siyal nan plasticite nerono. Newòn 1999: 23 – 11. doi: 14 / s10.1016-0896 (6273) 00-80747