Dopamine reseptè D2 nan dejwe-tankou malfonksyon rekonpans ak konpulsif manje nan rat obèz (2010)

Kòmantè: Etid sa a demontre ke lè yo bay yon bèt aksè san limit, yon ranfòsman natirèl fò (manje trè enteresan) ka lakòz yon bès nan reseptè D2. N bès sa a te wè nan prèske tout rat, e li te rive byen vit. Lè yo te retire manje "trè gou", rat yo te refize manje manje nòmal. Rat yo te kontinye binge (lè yo te kapab) malgre appariement chòk elektrik ak "trè gou" konsomasyon manje a.

• Etid konplè

Nat Neurosci. NAN Me; 13(5): 635-641. Pibliye sou entènèt 2010 mas 28. fè:  10.1038 / nn.2519

Abstrè

Nou te jwenn ke devlopman nan obezite te makonnen ak Aparisyon nan yon defisi progresivman vin pi grav nan repons rekonpans neral. Chanjman menm jan an nan omeyostaz rekonpans pwovoke pa kokayin oswa ewoyin yo konsidere kòm enpòtan nan deklanche tranzisyon an soti nan aksidantèl nan konpulsif pran dwòg. An konsekans, nou te detekte konpòtman konpulsif manje nan rat obèz men ki pa mèg, mezire kòm konsomasyon manje gou ki te rezistan a dezòd pa yon estimilis kondisyone aversif. Striatal dopamine D2 reseptè (D2Rs) yo te downregulated nan rat obèz, jan yo te rapòte nan imen dejwe dwòg. Anplis de sa, knockdown D2R striatal yo te rapidman akselere devlopman nan defisi rekonpans tankou dejwe ak aparisyon nan chèche manje konpulsif nan rat ak aksè pwolonje nan manje ki gen anpil grès. Done sa yo demontre ke twòp konsomasyon nan manje gou deklanche repons neuroadaptatif ki tankou dejwe nan sikui rekonpans nan sèvo ak kondwi devlopman nan manje konpulsif. Mekanis edonik komen yo ka kidonk kache obezite ak dejwe dwòg.

entwodiksyon

Manje enfliyanse pa plezi ak rekonpans, epi jwenn rekonpans manje kapab byen motive konsomasyon1, 2. Sepandan, mekanis edonik ki kontribye nan obezite yo rete mal konprann. Nan moun ipèfajik ki gen defisi leptin konjenital, aktivite nan striatum dorsal ak ventral la, ki se eleman debaz nan sikui rekonpans sèvo a ogmante ansibleman an repons a imaj manje3, ak terapi ranplasman leptin diminye tou de aktivite striatal ak pwòp tèt ou-rapòte 'senpati' nan manje3. . Sa a sijere ke striatum a enpòtan nan aspè edonik nan konpòtman manje. Li te montre dènyèman ke deklanchman nan striatum a an repons a manje trè gou se blunted nan moun ki obèz lè yo konpare ak kontwòl mèg4. Anplis, ipofonksyon nan striatum dorsal la ak pran pwa alontèm yo pi pwononse nan moun ki gen alèl TaqIA nan locus jèn DRD2-ANKK1, ki lakòz diminisyon ekspresyon striatal D2R epi yo montre yo predispoze moun nan maladi depandans sibstans4, 5. Obsèvasyon sa yo ak menm jan an te mennen nan pwopozisyon ke defisi nan pwosesis rekonpans yo ka yon faktè risk enpòtan pou devlopman nan obezite, e ke moun ki obèz ka konpulsif konsome manje gou pou konpanse pou iposansibilite rekonpans6. Miyò, li pa klè si defisi nan pwosesis rekonpans yo konstititif ak anvan obezite, oswa si konsomasyon twòp nan manje gou ka lakòz malfonksyònman rekonpans epi kidonk kontribye nan obezite rejim alimantè a.

Yon karakteristik defini nan moun ki twò gwo ak obèz se ke yo kontinye manje twòp malgre byen li te ye negatif sante ak konsekans sosyal yo. Vreman vre, anpil moun ki twò gwo eksprime yon dezi pou limite konsomasyon manje yo, men lite pou kontwole konsomasyon yo epi kontinye konsome pi lwen pase kondisyon enèji yo7, 8. Devlopman nan konpòtman manje ki pa sansib a rezilta negatif se analogue ak konpòtman konpulsif pran dwòg yo wè. nan moun adikte dwòg, ki se menm jan an enpèmeyab nan konsekans negatif9. Isit la nou te envestige efè aksè pwolonje nan yon rejim alimantè ki gen anpil grès gou sou sansiblite sistèm rekonpans sèvo nan rat. Nou te egzamine tou lyen ki genyen ant dysregulation edonik ki te pwovoke rejim alimantè a ak aparisyon nan chèche manje konpulsif. Finalman, nou te envestige wòl D2R striatal yo nan repons konpòtman sa yo tankou dejwe.

Defisi rekonpans tankou dejwe nan rat obèz

Pou teste efè aksè restriksyon oswa pwolonje nan yon rejim alimantè ki gen anpil grès, nou te prepare rat Wistar gason (300-350 g) ak yon elektwòd eksitan bipolè nan ipotalamus lateral la epi nou te fòme yo pou 10-14 d nan yon esè disrè. pwosedi rekonpans stimulation sèvo (BSR) aktyèl-papòt jiskaske papòt rekonpans ki estab yo te etabli4. Nan pwosedi BSR la, rat yo reponn kouray pou jwenn rekonpans elektrik eksitasyon pwòp tèt ou atravè elektwòd eksitasyon ki rete a, ak entansite eksitasyon minimòm ki kenbe konpòtman eksitasyon pwòp tèt ou yo rele papòt rekonpans la10. Paske papòt rekonpans rete estab epi yo pa chanje sou tan pwolonje nan kondisyon debaz, pwosedi sa a bay yon mezi sansib nan repons nan sistèm rekonpans nan sèvo. Apre etablisman papòt BSR ki estab (ki defini kòm <10% varyasyon nan papòt nan twa sesyon youn apre lòt), nou te asiyen rat nan twa gwoup ki pa te montre okenn diferans nan pwa kò mwayen oswa papòt rekonpans ant gwoup yo. Twa gwoup yo te bay aksè diferans nan yon rejim alimantè "kafeterya-style" ki gen ladan manje gou ki gen anpil enèji ki disponib fasilman pou konsomasyon imen (gade Metòd sou entènèt). Rat te gen 0 h (rat pou manje sèlman; n = 9), 1 h (rat ki gen aksè restriksyon; n = 11), oswa 18-23 h (rat ki gen aksè pwolonje; n = 11) aksè nan rejim alimantè a chak jou pou 40 jou youn apre lòt. Rejim kafeterya yo konnen ki lakòz obezite rejim alimantè a nan rat11. Tout rat te gen aksè ad libitum tou nan manje estanda laboratwa, ak papòt rekonpans, pran pwa ak konsomasyon kalorik anrejistre nan tout.

Pwa ogmante ansibleman nan rat ki gen aksè pwolonje nan rejim alimantè kafeterya a konpare ak gwoup chow-sèlman oswa aksè restriksyon (figi 1a). Pwa tou te gen tandans ogmante nan rat-aksè restriksyon yo konpare ak rat-chow-sèlman, men efè sa a pa t 'rive nan siyifikasyon estatistik. Devlopman obezite nan rat ki gen aksè pwolonje te asosye byen ak yon defisi vin pi grav nan fonksyon rekonpans nan sèvo, ki reflete nan papòt BSR progresivman elve (Fig. 1b). Paske pa gen okenn diferans nan latans repons pou BSR yo te obsève nan mitan twa gwoup yo (Siplemantè Fig. 1), defisi nan pèfòmans konpòtman pa ka kont pou obsèvasyon sa a. Defisi menm jan an nan fonksyon rekonpans nan sèvo yo te rapòte nan rat ki gen aksè pwolonje men ki pa restriksyon nan kokayin nan venn oswa ewoyin pwòp tèt-administrasyon12, 13, 14. Kidonk, aksè pwolonje nan manje ki gen anpil grès gou ka pwovoke defisi ki tankou dejwe nan fonksyon rekonpans nan sèvo. , konsidere kòm yon sous enpòtan nan motivasyon ki ka kondwi twòp manje ak kontribye nan devlopman nan obezite1, 6.

Figi 1: Pran pwa ak rekonpans malfonksyònman nan rat ak aksè pwolonje nan yon rejim kafeterya.

(a) Mwayèn (± sem) pran pwa nan rat manje sèlman, aksè restriksyon ak ak aksè pwolonje (aksè × entèraksyon jou: F39,702 = 7.9, P <0.0001; * P <0.05 konpare ak gwoup chow-sèlman, tès post hoc). (b) Mwayèn (± sem) pousantaj chanjman nan papòt rekonpans debaz (aksè × entèraksyon tan: F78,1092 = 1.7, P <0.0005; * P <0.05 konpare ak gwoup chow-sèlman, apre tès hoc).

Lè nou egzamine konpòtman manje an detay (Fig. 2), nou te jwenn ke total konsomasyon kalorik chak jou te menm jan ant rat chow-sèlman ak aksè restriksyon (Fig. 2a, d). Kontrèman, konsomasyon total kalorik nan rat ki gen aksè pwolonje te prèske de fwa nan rat ki gen aksè a restriksyon ak rat-sèlman manje (figi 2a, d). Malgre ke rat ki gen aksè a restriksyon ak rat-sèlman manje yo te kenbe apeprè menm konsomasyon kalorik chak jou (figi 2a, d), rat ki gen aksè restriksyon te jwenn sèlman ~ 33% kalori chak jou yo nan chow (figi 2b, d), ki endike ke yo te devlope yon konpòtman repa egzajere epi yo te konsome ~ 66% nan konsomasyon kalorik chak jou yo pandan sesyon aksè 1 èdtan yo nan rejim kafeterya a15 (Fig. 2d). Rat ki gen aksè pwolonje te jwenn sèlman yon ti fraksyon (~ 5%) nan konsomasyon total kalorik yo nan chow (Fig. 2b); yo konsome rejim alimantè kafeterya a prèske sèlman (Fig. 2d). Chanjman nan preferans dyetetik nan gwoup aksè restriksyon ak pwolonje yo te reflete tou nan yon ogmantasyon make nan konsomasyon grès konpare ak rat chow-sèlman (figi 2c ak Figi siplemantè 2). Konfòm ak rapò anvan yo16, te gen yon tandans pou konsomasyon nan rejim kafeterya a diminye sou tan nan rat yo ki gen aksè pwolonje. Sa ka reflete devlopman nan tolerans nan gou nan atik manje yo bay kòm yon pati nan rejim kafeterya a sou tan. Men, preferans pou rejim alimantè kafeterya a kont chow estanda rete toujou wo nan rat sa yo (figi siplemantè 3). Done sa yo montre ke aksè pwolonje, men pa restriksyon, nan yon rejim alimantè ki gen anpil grès pwovoke defisi rekonpans tankou dejwe, twòp manje ak pèt balans enèji omeyostatik. Kontrèman, aksè restriksyon nan manje gou bay ogmantasyon nan modèl konsomasyon ki tankou binge, men li pa deranje balans enèji omeostatik ni fonksyon rekonpans nan sèvo. Sepandan, li posib ke aksè restriksyon nan rejim alimantè kafeterya a pou plis pase 40 jou youn apre lòt ta pwovoke gwo pran pwa ak dezòd nan fonksyon rekonpans nan sèvo.

Figi 2: Modèl konsomasyon nan rat ak aksè pwolonje nan yon rejim kafeterya.

(a) Mwayèn (± sem) konsomasyon kalorik chak jou nan rat manje sèlman, aksè restriksyon ak ak aksè pwolonje (aksè: F1,324 = 100.6, P <0.0001; tan: F18,324 = 7.8, P <0.0001; aksè × tan entèraksyon: F18,324 = 4.6, P <0.0001; * P <0.05 konpare ak gwoup chow-sèlman, apre tès hoc). (b) Mwayèn konsomasyon kalorik chak jou (± sem) soti nan chow (aksè: F2,504 = 349.1, P <0.0001; tan: F18,504 = 5.9, P <0.0001; aksè × entèraksyon tan: F36,504 = 3.52, P <0.0001; *P <0.05 konpare ak gwoup chow-sèlman, apre tès hoc). (c) Mwayèn chak jou konsomasyon kalorik (± sem) soti nan grès (aksè: F2,486 = 118.7, P <0.0001; tan: F18,486 = 8.8, P <0.0001; aksè × entèraksyon tan: F36,486 = 6.2, P <0.0001; *P <0.05 konpare ak gwoup chow-sèlman, apre tès hoc). (d) Konparezon mwayèn (± sem) total konsomasyon kalori, ak kalori konsome sèlman nan chow, pandan tout peryòd 40 jou aksè a (aksè: F2,54 = 25.0, P <0.0001; sous kalori: F2,54 = 1235.2, P <0.0001; aksè × entèraksyon sous kalori: F2,54 = 485.7, P <0.0001; ***P <0.001 konpare ak kalori total nan gwoup chow-sèlman, ###P <0.001 konpare ak kalori total nan la. menm gwoup rat, tès post hoc).

Apre 40 d, rat yo pa te pèmèt aksè nan rejim alimantè a gou, men yo te kontinye gen aksè ad libitum nan manje estanda laboratwa. Nou te evalye papòt rekonpans ak konsomasyon chow chak jou pandan peryòd 'abstinans' sa a. Elevasyon yo nan papòt rekonpans pèsiste pou omwen 2 semèn nan rat yo ki gen aksè pwolonje lè yo pa te gen aksè a rejim alimantè a gou ankò (Fig. 3a). Sa a diferansye ak defisi relativman pasajè (~ 48 h) nan fonksyon rekonpans yo rapòte nan rat ki sibi abstinans nan kokayin pwòp tèt ou administre13. Te gen tou yon diminisyon ki make nan konsomasyon kalorik (Fig. 3b) ak yon diminisyon gradyèl nan pwa kò (Fig. 3c) nan rat ki gen aksè pwolonje, ak nan yon pi piti limit nan rat ki gen aksè restriksyon, pandan peryòd sa a abstinans, ki konsistan avèk rapò anvan yo11, 15. Apre 14 d nan abstinans, rat yo te touye ak plasman elektwòd yo te detèmine pa tach vyolèt kresyl (figi 3d).

Figi 3: Malfonksyònman rekonpans pèsistan ak ipofaji pandan abstinans nan rat ak aksè pwolonje nan yon rejim kafeterya.

(a) Chanjman pousantaj mwayèn nan papòt rekonpans debaz (± sem) pandan abstinans nan yon rejim alimantè ki gen anpil grès (aksè: F2,112 = 3.7, P <0.05; tan: F4,112 = 2.3, P > 0.05; * P <0.05 konpare ak gwoup chow-sèlman, tès post hoc). (b) Konsomasyon kalorik vle di (± sem) nan dènye jou aksè a rejim alimantè ki gen anpil grès (debaz) ak pandan 14 d abstinans lè sèlman manje estanda te disponib (aksè: F2,168 = 41.7, P <0.0001). ; tan: F6,168 = 65.6, P <0.0001; aksè × tan entèraksyon: F12,168 = 38.3, P <0.0001; * P <0.05 konpare ak gwoup chow-sèlman, apre tès hoc). (c) Chanjman nan pwa kò mwayèn (± sem) konpare ak pwa kò nan dènye jou aksè a rejim alimantè ki gen anpil grès (debaz) ak pandan 14 d abstinans la lè sèlman manje estanda te disponib (aksè: F1,126). = 37.2, P <0.0001; tan: F7,126 = 3.1, P <0.01; aksè × entèraksyon tan: F7,126 = 40.9, P <0.0001; * P <0.05 konpare ak gwoup chow-sèlman, apre tès hoc). (d) Rekonstriksyon istolojik kote BSR eksitan elektwòd nan ipotalamus lateral rat chow-sèlman (triyang), aksè restriksyon (kare) ak aksè pwolonje (sèk).

Striatal D2Rs nan rat obèz: wòl nan defisi rekonpans

Apre sa, nou teste ipotèz ke twòp konsomasyon nan yon rejim kafeterya gou ta ka diminye dansite striatal D2R, kontribiye nan devlopman iposansibilite rekonpans tankou dejwe. Yo te pèmèt yon nouvo gwoup rat pou manje sèlman, akse restriksyon ak akse pwolonje aksè nan rejim kafeterya jiskaske te gen yon ogmantasyon estatistik enpòtan nan pwa kò nan rat ki gen aksè pwolonje konpare ak gwoup chow sèlman (P <0.05). ; Fig. 4a). Ekspresyon striatal nan fòm D70R ki te gen anpil glikozile (~ 2 kDa) manbràn te pi ba nan rat aksè pwolonje yo pase nan rat ki gen aksè a restriksyon oswa rat chow-sèlman (figi 4b; gade Metòd sou entènèt). Lè nou divize rat yo nan chak gwoup aksè an de sougwoup sou baz yon fann medyàn nan pwa kò (lejè oswa lou), nou jwenn yon relasyon klè envès ant pwa kò ak ekspresyon striatal D2R (Fig. 4a, c). Nou pa detekte okenn diminisyon estatistik siyifikatif nan ekspresyon de fòm ki pa matirite ki pa glikozile (~ 39 kDa) ak fòm sitoplasmik entèmedyè glikozile (~ 51 kDa) nan D2R (figi siplemantè 4) 17, ki endike ke ekspresyon striatal D2R nan rat ki gen aksè pwolonje se pwobableman. reglemante atravè mekanis pòs-transkripsyon.

Figi 4: Pran pwa se envès ki gen rapò ak nivo striatal D2R.

(a) Rat chow-sèlman, aksè restriksyon ak aksè pwolonje yo te sibdivize an de gwoup pou chak kondisyon aksè ki baze sou yon fann medyàn nan pwa kò: limyè (L) oswa lou (H). (b) Tout konplèks striatal la te kolekte nan tout rat ak nivo D2R nan chak gwoup mezire pa Western blotting. Gwoup D2R ki asosye ak manbràn la te rezoud nan 70 kDa, epi kontwòl pwoteyin chaje a parèt anba a (β-aktin, 43 kDa). Tout longè imunoblots yo montre nan Figi Siplemantè 12. (c) Kantite relativman D2R nan striatum nan rat chow-sèlman, aksè restriksyon ak ak aksè pwolonje yo te quantifye pa densitometri (F2,6 = 5.2, P <0.05, prensipal). efè aksè; *P <0.05 ak **P <0.01 konpare ak gwoup chow-sèlman-L).

Apre sa, pou teste enpòtans fonksyonèl rediksyon rejim alimantè a nan striatal D2R nan fonksyon rekonpans nan sèvo, nou te fèt ak valide yon vektè lentiviral pou delivre yon epengl kout entèfere RNA (shRNA) yo nan lòd yo kraze D2R (Lenti-D2Rsh; Fig. 5 ak Figi Siplemantè 5). Papòt rekonpans yo te kòmanse ogmante nan rat ki te trete ak Lenti-D2Rsh prèske imedyatman apre yo te pèmèt aksè pwolonje nan rejim alimantè kafeterya a, tandiske papòt rekonpans yo te rete san chanje nan rat ki gen aksè pwolonje trete ak yon vektè lentivirus vid (Lenti-kontwòl) sou peryòd la relativman kout. nan aksè nan rejim alimantè kafeterya a (14 d; Fig. 6a). Latans repons yo pa chanje nan tou de gwoup rat, ki montre ke efè sa a pa t 'segondè nan defisi nan pèfòmans travay (Siplemantè Fig. 6). Papòt rekonpans yo te tou pa chanje nan rat trete ak Lenti-D2Rsh oswa Lenti-kontwòl ki te gen aksè a chow sèlman sou menm peryòd la (Fig. 6b).

Papòt yo te rete toujou elve pandan yon 15 d siplemantè nan abstinans lè tout rat te gen aksè sèlman nan chow estanda (Siplemantè Fig. 7). Knockdown D2R striatal Se poutèt sa, ogmante vilnerabilite nan ipofonksyon rekonpans rejim alimantè a te pwovoke men li pa t chanje aktivite debaz sistèm rekonpans nan sèvo.

Figi 5: Lentivirus medyatè knockdown nan ekspresyon striatal D2R.

(a) Reprezantasyon grafik zòn striatal kote Lenti-D2Rsh te twòp eksprime. Sèk vèt nan emisfè striatal gòch la reprezante kote yo te vize perfusion viral yo. Tach vèt nan emisfè striatal dwat la se yon tach imunochimik reprezantan pou pwoteyin fliyoresan vèt (GFP) ki soti nan sèvo yon rat Lenti-D2Rsh. (b) Reprezantan imunoblot nan ekspresyon D2R diminye nan striatum nan rat Lenti-D2Rsh. Tout longè imunoblots yo montre nan Figi Siplemantè 13. (c) Kantite relativman D2R nan striatum nan Lenti-kontwòl ak Lenti-D2Rsh rat, quantifiée pa densitometry (* P <0.05 konpare ak gwoup la Lenti-kontwòl, apre tès hoc). ). (d) Enfeksyon nan selil glial nan striatum a pa vektè Lenti-D2Rsh la pa te detekte. Tach vèt se GFP ki soti nan viris; wouj se makè astrosit glial fibrillary asid pwoteyin (GFAP); nwayo selil yo make pa DAPI tach an ble. Flèch blan yo endike yon zòn lokalize nan glioz yo te jwenn sèlman nan sit la nan piki viris nan striatum la epi yo pa nan tisi ki antoure nan ki viris la te difize. Menm nan zòn sa a, okenn nan astwosit yo pa GFP-pozitif. Flèch jòn yo nan imaj agrandi yo mete aksan sou tipik astwosit GFP-negatif yo te detekte. (e) Nivo segondè nan enfeksyon newòn nan striatum a pa vektè Lenti-D2Rsh la. Tach vèt se GFP ki soti nan viris; wouj se makè nikleyè newòn NeuN; nwayo selil yo make pa DAPI tach an ble. Flèch jòn yo nan imaj la agrandi mete aksan sou GFP-pozitif ak NeuN-pozitif newòn nan striatum la. (f) Yon imaj ki pi wo nan yon newòn ki enfekte viralman (GFP-pozitif) nan striatum nan rat Lenti-D2Rsh ki montre karakteristik mòfolojik tipik nan newòn epinè mwayen.

Figi 6: Knockdown D2R striatal ogmante vilnerabilite pou rekonpanse malfonksyònman nan rat ak aksè pwolonje nan yon rejim kafeterya.

(a) Chanjman pousantaj mwayèn (± sem) soti nan papòt rekonpans debaz nan rat Lenti-control ak Lenti-D2Rsh ki te gen aksè pwolonje nan rejim kafeterya a pou 14 jou youn apre lòt (viris: F1,156 = 5.9, P <0.05; tan: F13,156 = 2.2, P <0.05; viris × tan entèraksyon: F13,156 = 2.2, P <0.05; #P <0.05, efè entèraksyon). (b) Mwayèn (± sem) pousantaj chanjman nan papòt rekonpans debaz nan rat Lenti-kontwòl ak Lenti-D2Rsh ki te gen aksè sèlman pou chow. (c) Mwayèn (± sem) konsomasyon kalorik nan rat pandan 14 d nan chow sèlman oswa aksè pwolonje (aksè: F2,28 = 135.6, ***P <0.0001). (d) Vle di (± sem) pran pwa pandan 14 d nan chow sèlman oswa aksè pwolonje (aksè: F2,28 = 96.4, P <0.0001; ***P <0.001, efè prensipal aksè).

Nou te jwenn ke konsomasyon kalorik (figi 6c) ak pran pwa (figi 6d) yo te menm jan an nan Lenti-D2Rsh ak korespondan Lenti-kontwòl gwoup yo anba kondisyon chow-sèlman oswa pwolonje-aksè (figi siplemantè 8 ak 9). Kidonk, striatal D2R knockdown chanje ni preferans pou rejim alimantè kafeterya a ni konsomasyon total kalorik lè manje a gou te disponib gratis pou konsomasyon.

Manje konpulsif nan rat obèz: wòl pou striatal D2R

Apre sa, nou te teste ipotèz ke manje ki tankou konpulsif ta ka parèt nan rat ki gen aksè pwolonje nan rejim alimantè kafeterya a e ke defisi nan siyal D2R striatal ta ka kontribye nan efè sa a. Yon nouvo gwoup rat pou manje sèlman, ak aksè restriksyon ak ak aksè pwolonje yo te pèmèt aksè nan rejim kafeterya a pou > 40 d jiskaske ogmantasyon pwa estatistik siyifikatif te fèt nan rat pwolonje yo (P < 0.05 konpare ak rat manje sèlman; done pa montre). Lè sa a, tout twa gwoup rat yo te pèmèt sèlman 30 minit aksè pa jou nan rejim kafeterya a pou 5-7 d nan yon chanm opere jiskaske konsomasyon ki estab yo te reyalize (defini kòm <10% varyasyon nan konsomasyon chak jou). Mwatye rat yo nan chak kondisyon aksè Lè sa a, yo te ekspoze a yon limyè (estimilis kondisyone) pè ak livrezon nan chòk pye (gwoup pini), tandiske rat yo ki rete nan chak gwoup yo te ekspoze a limyè siy la nan absans la nan chòk pye (gwoup san pinisyon). ). Nan jou tès la, nou egzamine efè ekspoze limyè siy pou kont li sou konsomasyon manje gou (figi 7; gade Metòd sou entènèt). Nou te jwenn ke konsomasyon kalorik vle di pandan sesyon yo debaz 30-min te pi wo nan rat yo chow-sèlman ak aksè restriksyon pase nan rat yo ki gen aksè pwolonje (Fig. 7a, b). Sa a sijere ke rat ki gen sèlman manje ak aksè restriksyon yo te pran manje ki bon gou pandan sesyon aksè tanzantan 30-min, sa ki reflete nan lefèt ke rat sa yo te konsome ~ 40-50% nan konsomasyon chak jou kalori yo, anjeneral ~ 100 kCal, pandan sesyon sa yo (figi 7a,b). Kontrèman, rat ki gen aksè pwolonje yo sanble rezistan pou devlope konpòtman repa egzajere sa a, petèt paske istwa yo nan aksè prèske san limit nan manje a gou pou> 40 jou youn apre lòt te etabli modèl manje ki te relativman enflexibl pou chanje. Nan jou tès la, nou te obsève pa gen okenn efè estatistik siyifikatif nan replik limyè replik sou konsomasyon manje nan rat yo san pinisyon ki soti nan gwoup chow-sèlman, aksè restriksyon oswa aksè pwolonje lè yo konpare ak konsomasyon pandan peryòd debaz la (Fig. 7a). Limyè replik la pou kont li Se poutèt sa pa te gen okenn sayans motivasyon. Nan rat pini, limyè siy chòk-pè a siyifikativman diminye konsomasyon manje gou nan rat yo sèlman ak aksè restriksyon. Sepandan, limyè siy la pa te gen okenn efè sou konsomasyon manje gou nan rat yo ki gen aksè pwolonje, ki montre ke konsomasyon yo te ensansib nan siyal anviwònman degoutan ki predi advèsite. Konsomasyon enèji debaz nan rat ki gen aksè pwolonje yo te pi ba pase sa nan lòt gwoup yo. Sepandan, paske konsomasyon chow pandan peryòd tan ki sanble yo te pi ba anpil (figi 7d), li pa posib ke sa a reprezante yon 'efè etaj' ki konfonn rezilta nou yo. Ansanm, done nou yo sipòte lide ke konpòtman konpulsif pou manje ka parèt nan rat ki gen aksè pwolonje nan yon fason ki sanble ak konpulsif pran kokayin yo wè nan rat ki gen yon istwa aksè pwolonje nan dwòg la18.

Figi 7: Konpulsif-tankou reponn pou manje gou.

(a) Mwayèn (± sem) konsomasyon rejim alimantè gou nan rat san pinisyon pandan sesyon debaz 30-min yo ak nan jou tès la lè rat yo te ekspoze a yon estimilis kondisyone net ki pa te deja asosye ak chòk pye danjere (aksè: F2,20). = 5.2, P <0.05; #P <0.05 konpare ak rat chow-sèlman). (b) Mwayèn (± sem) konsomasyon rejim alimantè gou nan rat pini pandan sesyon debaz yo 30-min ak nan jou tès la lè rat yo te ekspoze a yon estimilis kondisyone ki te deja asosye ak chòk pye danjere (aksè: F2,21 = 3.9). , P <0.05; siy: F1,21 = 8.6, P <0.01; aksè × entèraksyon siy: F2,21 = 4.7, P <0.05; *P <0.05 konpare ak konsomasyon pandan sesyon debaz la, #P <0.05 konpare ak rat manje sèlman). (c) Konsomasyon rejim alimantè vle di (± sem) gou pandan 30-min sesyon debaz yo ak nan jou tès la nan rat Lenti-control ak Lenti-D2Rsh ki te deja gen aksè pou manje sèlman oswa pwolonje nan yon rejim kafeterya (siyal: F1,26, 29.7 = 0.0001, P <0.05; *P <0.01, **P <30 konpare ak konsomasyon pandan sesyon debaz yo, apre tès hoc). (d) Mwayèn (± sem) konsomasyon chow pandan sesyon debaz yo 2-min ak nan jou tès la nan rat Lenti-control ak Lenti-D1,26Rsh ki te deja gen chow sèlman oswa aksè pwolonje nan yon rejim kafeterya (siyal: F44.9 = 0.0001, P <0.05; *P <0.01, **P <XNUMX konpare ak konsomasyon pandan sesyon debaz yo, apre tès hoc).

Finalman, nou te egzamine efè estimilis kondisyone pinisyon-pè a sou konsomasyon manje nan rat Lenti-control ak Lenti-D2Rsh ki te deja gen aksè a chow sèlman oswa aksè pwolonje nan rejim kafeterya a (rat soti nan Fig. 6). Nou te jwenn ke debaz konsomasyon manje gou pandan 30-min sesyon debaz yo te menm jan an wo (~ 40 kCal) nan tout kat gwoup (Fig. 7c). Anplis de sa, total konsomasyon chow chak jou (nan kaj kay la) te menm jan an ant tout kat gwoup rat pandan sesyon kondisyone yo ak nan jou tès la (Siplemantè Fig. 10). Se poutèt sa, 14 d nan aksè anvan nan rejim alimantè kafeterya a pa t ase pou bloke konpòtman manje tankou repa egzajere nan yon fason ki sanble ak sa yo wè nan rat ki te gen> 40 d aksè pwolonje nan rejim alimantè kafeterya (figi 7a, b). Estimilis limyè replik avèrsiv la deranje konsomasyon manje gou nan rat Lenti-kontwòl ak Lenti-D2Rsh ki te deja gen aksè pou chow-sèlman (figi 7c). Menm jan an tou, estimilis kondisyone avèrsiv la deranje konsomasyon manje gou nan rat yo Lenti-kontrole ki te deja te gen aksè pwolonje 14 d nan rejim kafeterya a. Kontrèman, estimilis kondisyone aversif la pa te gen okenn enpak sou konsomasyon manje gou nan rat Lenti-D2Rsh ki te deja gen 14 d aksè pwolonje nan rejim alimantè kafeterya a (Fig. 7c). Papòt BSR yo te rete siyifikativman elve nan rat sa yo lè yo te anrejistre 48 èdtan apre sesyon tès la, tandiske papòt yo te rete estab epi yo pa chanje nan twa lòt gwoup rat yo.

(figi siplemantè 11). Pou verifye ke rezistans nan repwesyon estimilis kondisyone-pwovoke nan konsomasyon manje gou nan rat yo Lenti-D2Rsh ak aksè pwolonje pa t 'segondè nan andikap nan pwosesis kondisyone klasik, nou teste efè estimilis kondisyone avèrsif la sou konsomasyon nan manje estanda mwens gou nan. tout kat gwoup rat. Kontrèman ak konsome bon jan kantite manje ki gen bon gou, nou te jwenn ke tout kat gwoup rat te konsome ti kras (~ 2 kCal) pandan 30 min sesyon debaz yo (Fig. 7d) e ke konsomasyon chow te deranje nan tout kat gwoup yo. yon mayitid menm jan an sou ekspoze a estimilis kondisyone aversif la (figi 7d). Done sa yo demontre ke kraze D2R striatal yo te akselere anpil aparisyon manje konpulsif tankou manje gou, men sèlman nan rat ki gen yon istwa aksè pwolonje. Anplis, paske yo te detekte manje konpulsif sèlman nan rat Lenti-D2Rsh ki te elve papòt BSR, ipofonksyon rekonpans rejim alimantè a ka yon antecedent nesesè pou aparisyon chèche manje konpulsif.

Diskisyon

Fasilite pou gen aksè a manje ki gen anpil grès ki gen anpil grès konsidere kòm yon faktè enpòtan nan risk nan anviwònman an pou obezite19. Nou te jwenn ke aksè pwolonje nan yon rejim alimantè kafeterya ki trè bon gou te lakòz twòp manje ak pran pwa makonnen ak pwogresivman elve papòt BSR nan rat. Efè sa a sou papòt BSR yo ka eksplike pa piti piti diminye reyaksyon nan sikui rekonpans nan sèvo, yon entèpretasyon ki konsistan avèk lefèt ke restriksyon nan manje ak pèdi pwa ka ogmante20, tandiske overfeeding egi ka pasajèman diminye21, reponn pou BSR nan rat. Konklizyon sa a reprezante yon ekstansyon nan travay ki montre ke twòp manje egi nan rat atravè yon tib manje entragastric21, ak distenksyon gastric oswa perfusion glucagon nan venn ki imite sasyete apre pran22, 23, 24, diminye repons pou rekonpanse BSR ipotalamik lateral ak ogmante repons ki sanble ak degoutans. eksitasyon25. Travay anvan yo te montre tou ke rat yo repete fòse yo nan tib entragastrik jiskaske pwa yo ogmante pa ~ 200 g menm jan an diminye pousantaj nan repons pou BSR, yon efè ki pèsiste jiskaske pwa kò yo te nòmalize23. Kòm nan rezilta sa yo nan rat, reponn nan chat pou lateral ipotalamik BSR te inibit pa manje anvan satiation26, ki montre ke entèraksyon ant fonksyon rekonpans nan sèvo ak eta metabolik yo konsève e konsa gen anpil chans rive nan imen tou. Fasilite pou jwenn aksè ak konsekan twòp manje nan alimantasyon kafeterya nan moun yo konsidere kòm yon kontribitè anviwònman enpòtan nan epidemi obezite aktyèl la nan sosyete oksidantal yo19. Done nou yo montre ke ipofonksyon rekonpans rive nan rat ki volontèman manje twòp yon rejim kafeterya gou menm jan ak sa ki konsome pa moun e ke efè sa a vin pi piti piti pi mal lè yo pran plis pwa. Miyò, tout rat ki gen elevasyon papòt rekonpans ≥20% te gen elektwòd BSR ki sitiye nan ~ 500 μm nan dorsolateral fornix la. Sansiblite newòn ki gen rapò ak rekonpans nan zòn sa a ogmante pa restriksyon manje nan yon fason ki sansib a leptin òmòn ki sòti nan grès, epi rejyon sèvo sa a konsidere kòm yon substrate enpòtan pou rekonpans manje27. Se poutèt sa, sikwi yo nan sèvo ki kontwole edonik manje yo anpeche siyal postingestif ki predi sasyete, ki konsistan avèk dènye etid imaj imen ki montre ke distenksyon gastric28 ak peptide faktè postprandial ki sòti nan zantray YY3-36 (PYY)29 modile aktivite rejyon nan sèvo a. patisipe nan pwosesis rekonpans. Anplis de sa, sistèm rekonpans yo tou anpeche pa pran pwa twòp. Rapò ki sot pase yo endike ke leptin sikile, yon regilatè kle nan balans enèji, ka antre nan tisi nan sèvo ak anpeche aktivite sikui rekonpans3, 27, 30, 31.

Defisi rekonpans nan rat ki twò gwo ka reflete diminisyon kont-adaptatif nan sansiblite debaz nan sikui rekonpans nan sèvo pou opoze twòp stimulation yo pa manje gou. Sa yo ipofonksyon rekonpans pwovoke rejim alimantè a ka kontribye nan devlopman obezite lè yo ogmante motivasyon pou konsome alimantasyon 'obesogenic' ki gen anpil rekonpans pou evite oswa soulaje eta sa a nan rekonpans negatif6, 32. Sa a ta ka kont pou ipofaji nou obsève nan aksè pwolonje. rat ak nan yon pi piti degre nan rat ki gen aksè restriksyon lè yo te retire manje ki gen gou a epi sèlman manje ki gen mwens gou a te disponib. Yon senaryo konsa se tou ki konsistan avèk done ki soti nan etid imaj nan sèvo imen kote deklanchman striatum a an repons a manje trè gou, patikilyèman nan moun ki gen polimorfism jenetik panse diminye ekspresyon striatal D2R, ki asosye ak pran pwa alontèm4. Li te klè si iposansibilite rekonpans sa yo nan moun ki obèz yo manifeste anvan devlopman nan obezite ak ki gen rapò sèlman ak faktè jenetik ("sendwòm deficiency rekonpans") oswa si twòp manje ka lakòz dezòd nan pwosesis rekonpans. Done nou yo demontre ke aksè pwolonje a manje ki gen anpil enèji ak gou ki vin apre twòp manje rekonpanse sansiblite epi kidonk li ka reprezante yon mekanis edonik enpòtan ki ankouraje devlopman obezite. Yo detekte malfonksyònman rekonpans menm jan ak sa yo rapòte isit la nan rat obèz tou nan rat ki gen yon istwa aksè pwolonje nan kokayin nan venn oswa ewoyin pwòp tèt ou administrasyon, men se pa nan moun ki gen yon istwa nan aksè restriksyon12, 13, 14. Anplis, tranzisyon an soti nan te pwopoze pou chèche dwòg aksidantèl nan konpulsif kòm rezilta nan yon tantativ soulaje eta ki pèsistan nan rekonpans diminye pwovoke pa malfonksyònman rekonpans dwòg-induit sa a12, 32, 33. Kidonk, done nou yo endike ke obezite ak dejwe dwòg ka pataje mekanis edonik kache.

Downregulation nan ekspresyon striatal D2R se yon repons neuroadaptatif remakab nan twòp konsomasyon nan manje gou. Vreman vre, rediksyon nan dansite striatal D2R yo wè nan moun ki twò gwo4, 34 ak wonjè35, 36. Kontrèman, moun ki gen anorexia nève yo gen D2R37 striatal ki wo, epi pèdi pwa nan moun ki obèz apre operasyon baryatrik (kontoune gastric) ki asosye ak D2R striatal ki wo. . Polimorfis jèn yo refere yo kòm alèl TaqIA A28 rezilta nan diminye dansite striatal D1R, ak moun ki ebèje alèl sa a twò reprezante nan popilasyon obèz2. Alèl TaqIA ogmante vilnerabilite tou pou dejwe alkòl, opioid ak eksitan sikomotè4. Rediksyon nan dansite striatal D38R ki fèt swa atravè faktè jenetik konstititif oswa kòm yon konsekans twòp manje ka Se poutèt sa kontribye nan mekanis nerobyolojik obezite. Nou te jwenn ke nivo striatal nan izofòm nan 2 kDa D70R, te panse yo reflete manbràn-asosye D2R la, yo te envers ki gen rapò ak pwa kò nan rat soti nan chow-sèlman, restriksyon-aksè ak pwolonje-aksè gwoup yo (Fig. 2). Knockdown nan ekspresyon striatal D4R, ki pi enpòtan nan striatum dorsolateral la (Fig. 2), te lakòz papòt BSR ogmante prèske imedyatman lè yo ekspoze a rejim alimantè kafeterya a. Diminisyon nan ekspresyon striatal D5R Se poutèt sa, rapidman akselere aparisyon ipofonksyon rekonpans nan rat ki gen aksè pwolonje nan manje trè gou, yon rezilta ki konsistan avèk done imaj nan sèvo imen ki endike ke defisi nan dansite striatal D2R kontribye nan rekonpans ipofonksyon nan moun ki obèz2.

Twa karakteristik rat yo Lenti-D2Rsh yo enpòtan tou. Premyèman, byenke striatal D2R knockdown konbine avèk aksè pwolonje nan rejim alimantè a gou te lakòz elve papòt BSR, pa te gen okenn diferans nan konsomasyon kalorik oswa pran pwa nan rat sa yo konpare ak rat kontwòl. Sa a ta ka reflete lefèt ke rat sèlman te gen 14 d aksè nan rejim alimantè kafeterya a; peryòd aksè pi long yo ta ka lakòz pi gwo pran pwa sou tan, menm jan ak pi gwo sansibilite a pran pwa yo wè nan moun ki gen defisi nan siyal D2R striatal4. Sepandan, avantaj ki genyen nan limite aksè a rejim alimantè kafeterya a sèlman 14 d se ke rat knockdown ki gen aksè pwolonje te sèl gwoup ki te montre papòt BSR ki wo, e sa te pèmèt nou evalye wòl potansyèl ipofonksyon rekonpans nan devlopman konpulsif. manje (gade anba a). Dezyèmman, papòt BSR yo te rete estab epi yo pa chanje nan rat knockdown ki te gen aksè a chow sèlman. Sa a endike ke redwi ekspresyon striatal D2R pou kont li pa t ase pou pwovoke iposansibilite rekonpans; olye de sa, li te sanble yo kominike avèk twòp konsomasyon nan manje gou akselere Aparisyon nan eta sa a nan sansiblite rekonpans redwi. Lòt repons adaptasyon nan sikui rekonpans sèvo yo ta ka deklanche iposansibilite rekonpans nan rat ki gen aksè pwolonje nan rejim kafeterya a. Avèk sa a nan tèt ou, nou sonje ke bromocriptine agonist D2R la diminye nivo sikile nan leptin39, ak leptin inibit manje omwen an pati nan anpeche rejyon yo striatal ki kontwole repons edonik nan manje3, 30, 31. Kidonk, li posib ke downregulation nan striatal D2R an repons a ogmante pwa kò ogmante siyal leptin ak kidonk ranfòse efè inhibition adipokine sa a sou sistèm rekonpans nan sèvo. Finalman, nou sonje ke nou vize vektè lentivirus nou yo nan direksyon striatum dorsolateral la. Sa a te prensipalman pou rezon teknik, kòm plasman lateral nan kanul pou livrezon viris nan striatum a pèmèt nou tou akomode elektwòd eksitan ipotalamik ki rete a pou detèminasyon papòt BSR. Kidonk, li posib ke vize D2R yo pou kraze nan lòt zòn nan striatum a, patikilyèman zòn dorsomedial ak vantral yo (nwayo ak koki nwayo accumbens), ta ka gen papòt BSR ki wo menm nan absans rejim alimantè a gou.

Striatum dorsolateral la te enplike anpil nan aprantisaj kalite abitid estimilis-repons, jan yo reflete nan devlopman konpòtman konsomatwa ki pa sansib nan devalorizasyon lè yo te manje anvan satiyasyon oswa lè yo asosye ak estimilis ki danjere40. Lè nou vize majorite striatum dorsolateral la, nou ta ka kraze popilasyon D2R ki kontwole vilnerabilite rat la nan devlopman manje konpulsif. An akò ak yon wòl D2R striatal nan konpòtman konpulsif, alèl TaqIA nan locus jèn DRD2-ANKK1 imen an—ki lakòz dansite D2R striatal ki ba5, efase deklanchman striatal an repons a manje ki bon gou4 epi ogmante vilnerabilite nan obezite4—ki asosye tou ak defisi nan aprann evite aksyon ki gen konsekans negatif41. Pèt kontwòl inhibition sou konpòtman ki ka gen yon rezilta negatif se yon karakteristik tou de obezite ak dejwe dwòg, nan ki konpòtman konsomatory pèsiste malgre negatif sosyal, sante oswa konsekans finansye. Konpòtman pou pran kokayin nan rat ki gen yon istwa konsome bon jan kantite dwòg ka vin pa fleksib epi rezistan a dezòd pa yon estimilis kondisyone aversif ki predi yon rezilta negatif (chòk pye)18. Menm jan an tou, sourit ki te deja gen aksè a yon rejim alimantè ki gen anpil grès pral pase plis tan nan yon anviwonman ki pa gen anpil valè (limen byen klere) pou jwenn manje ki bon gou pase sourit ki pa te gen okenn eksperyans ak rejim alimantè a42. Nou te jwenn ke konsomasyon manje gou nan rat ki gen aksè pwolonje nan rejim alimantè kafeterya a te menm jan an ensansib nan yon estimilis kondisyone aversif. Konfòm ak yon wòl pou D2R striatal nan efè sa a, yo te jwenn manje ki tankou konpulsif nan rat knockdown D2R striatal yo ki te deja gen aksè pwolonje 14 d nan rejim kafeterya a men pa nan gwoup kontwòl yo. Soti nan yon pèspektiv neurocircuitry, aksè pwolonje nan manje gou ta ka deklanche plastisit nan chemen kortikostriatal, kidonk rann bèt yo pi vilnerab a devlopman nan konpòtman konpulsif, ak defisi nan siyal D2R striatal amelyore pwosesis sa a. Vreman vre, redwi dansite striatal D2R nan moun ki obèz yo korelasyon ak metabolis redwi nan zòn prefrontal ak orbitofrontal cortical43 ki egzèse kontwòl inhibition sou konpòtman44.

Miyò, yo te detekte konsomasyon konpulsif manje ki gen bon gou sèlman nan rat knockdown ki te deja gen aksè pwolonje nan rejim kafeterya a, pa nan rat kontwòl ki te gen aksè pwolonje nan rejim kafeterya a pou menm peryòd tan an, ni nan rat knockdown ki te genyen. aksè pou manje sèlman. Diferans prensipal ant rat knockdown yo ak aksè pwolonje anvan ak lòt gwoup yo se te papòt BSR ki te elve yo. Sa a ta ka reflete orijin nerobyolojik komen nan ipofonksyon rekonpans ak aparisyon nan manje konpulsif, ki se fenomèn tanporèman konyensidans men endepandan. Altènativman, ipofonksyon rekonpans pwovoke rejim alimantè a ta ka sèvi kòm yon substrate pou ranfòsman negatif ki fasilite devlopman nan manje ki tankou konpulsif14, 32, 33. Kèlkeswa mekanis ki kache yo, rezilta nou yo demontre ke repons konpulsif ki tankou dejwe pou manje gou ka parèt nan obèz. rat, epi endike ke defisi nan siyal striatal D2R ogmante vilnerabilite nan devlopman nan konpòtman sa a.

An rezime, nou te jwenn ke twòp eksitasyon nan sistèm rekonpans nan sèvo atravè konsomasyon twòp nan manje gou, enèji-dans pwovoke yon eta pwofon nan iposansibilite rekonpans ak devlopman nan manje konpulsif tankou. Repons konpòtman maladaptive sa yo nan rat obèz pwobableman rive nan defisi rejim alimantè a nan siyal D2R striatal. Konsomasyon twòp nan dwòg nan abi menm jan an diminye dansite striatal D2R, pwovoke yon eta pwofon nan ipofonksyon rekonpans ak deklanche Aparisyon nan konpòtman konpulsif ki tankou pran dwòg. Se poutèt sa, rezilta nou yo sipòte travay anvan yo 4, 19, 42, 45, 46, 47 nan endike ke obezite ak dejwe dwòg ka rive nan repons neuroadaptive menm jan an nan sikui rekonpans nan sèvo.

Metòd

Rat.

Rat Wistar gason ki te peze 300-350 g nan kòmansman eksperyans yo te jwenn nan Charles River. Lè yo rive, rat yo te loje endividyèlman nan tanperati konstan sou yon sik limyè-fè nwa 12-h (limyè limen nan 2200 h). Rat yo te pèmèt ad libitum aksè nan manje estanda laboratwa ak dlo pou dire a nan eksperyans la. Tout pwosedi yo te apwouve pa Komite Enstitisyonèl Swen ak Itilizasyon Animal nan Scripps Florida, epi rat yo te trete an akò ak direktiv yo tabli pa Enstiti Nasyonal Sante konsènan prensip yo nan swen bèt.

Pwosedi chirijikal.

Rat ki te prepare ak elektwòd eksitan BSR yo te premye anestezi pa rale 1-3% isoflurane nan oksijèn epi yo te pozisyone nan yon ankadreman estereyotaksik (Kopf). Elektwòd BSR bipolè (11 mm nan longè) yo te enplante nan ipotalamus lateral posterior (anteroposterior, -0.5 mm soti nan bregma; mediolateral, ±1.7 mm soti nan liy mitan; dorsoventral, 8.3 mm soti nan dura; yo te ajiste ba enzis a 5 mm pi wo a liy entèaural la. )47. Rat k ap resevwa piki viris yo te prepare tou ak kanul gid bilateral (23 kalib, 14 mm longè) pozisyone pi wo a striatum a (anteroposterior, 2.8 mm soti nan bregma; mediolateral, ± 3.1 mm soti nan liy mitan; dorsoventral, -2.4 mm soti nan dura)48 ak plen. ak stylets 14-mm. Kat vis zo bwa tèt asye pur ak Acrylic dantè ki te kenbe elektwòd la ak kanul an plas. Blesi chirijikal la te trete ak antibyotik aktualite yon fwa chak 12 èdtan pou 5 d apre operasyon an. Rat yo te pèmèt 7-10 d refè apre operasyon epi yo te resevwa fòmasyon nan pwosedi papòt BSR la.

Pwosedi BSR.

Rat yo te antrene pou reponn pou eksitasyon BSR dapre yon pwosedi papòt aktyèl disrè-jijman ki sanble ak sa ki dekri yon lòt kote10, 14. Yon ti tan, nivo aktyèl BSR yo te varye nan altène desann ak monte seri nan etap 5-μA. Nan chak sesyon tès yo, yo te prezante kat seri altènatif desandan/monte. Papòt la pou chak seri te defini kòm pwen mitan ant de entansite aktyèl youn apre lòt pou ki rat te reponn nan omwen twa nan senk esè yo, ak de entansite aktyèl youn apre lòt pou ki rat pa t reponn nan twa oswa plis nan senk esè yo. Papòt jeneral sesyon an te defini kòm mwayen papòt yo pou kat seri endividyèl yo. Chak sesyon tès te apeprè 30 minit nan dire. Papòt BSR ki estab yo te defini kòm ≤10% varyasyon nan papòt sou 5 jou youn apre lòt, anjeneral, etabli apre 10-14 d nan fòmasyon. Latansi repons pou chak sesyon tès yo te defini kòm latansi repons mwayèn nan tout esè pandan ki te gen yon repons pozitif.

Anbalaj viral ak livrezon.

Kout epengl RNA te delivre ak konstititifman eksprime lè l sèvi avèk sistèm vektè pRNAT-U6.2/Lenti (GenScript). Patikil viral yo te prepare dapre pwotokòl manifakti a. Yon ti tan, selil HEK 293FT yo te transfekte ak vektè ki gen insert shRNA (5′-GGATCCCGCGCAGCAGTCGAGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCTCGACTGCTGCGCTTTTTTCCAACTCGAG-3′) oswa vektè vid la, plis ViraPower Packaging Mix (Invitrogen) pou 72 h apre (24 h) ranplase. Lè sa a, supernatant te kolekte epi konsantre pa ultracentrifugation (76,755g, Beckman Coulter SW 32 TI rotor., 90 min, 4 °C) ak tit viral yo te detèmine pa klasman selil fluoresans aktive dapre enstriksyon manifakti a. Viris yo te aliquot ak estoke nan bwat ki pwoteje limyè nan -80 ° C jiskaske yo itilize.

Rat ki gen papòt BSR ki estab te resevwa piki viral bilateral nan twa sit nan striatum nan chak emisfè sèvo (2 μl pou chak piki, 1 μl min-1, 1 min ant piki, yon total de sis piki pou chak rat). Rat yo te pèmèt omwen 2-3 d rekiperasyon nan piki intrastriatal anvan yo te rekòmanse evalyasyon papòt BSR. Evalyasyon papòt BSR chak jou te kontinye pandan 33 jou apre piki viris la pou asire ke yo te reyalize maksimòm striatal D2R knockdown anvan yo te pèmèt rat aksè nan rejim kafeterya a. Pa te gen okenn diferans nan papòt BSR ant Lenti-kontwòl ak Lenti-D2Rsh rat yo pandan 33 d sa yo (done yo pa montre).

Immunoblotting.

Rat yo te touye apeprè 1 èdtan apre aksè regilyèman pwograme yo nan rejim kafeterya a, epi sèvo yo te rapidman retire. Seksyon nan sèvo ki gen ~ 1-2 mm epesè yo te prepare lè l sèvi avèk yon matris sèvo coronal (entèval tranch 1-mm; Plastics One) sou yon blòk glas, epi yo te pran pwenson tisi nan striatum dorsal (bregma: ~ 2.2 a -0.26 mm). Pwen tisi striatal yo te rapidman kolekte, menen nan frizè epi estoke nan -80 ° C jiskaske yo itilize. Echantiyon endividyèl yo te dekonjle sou glas ak kantite egal tisi striatal yo te pisin sou baz yon divize medyan pwa depandan nan gwoup aksè (7-10 rat pou chak pisin). Tisi yo te resuspend nan 500 μl glas-frèt tanpon RIPA (Thermo Scientific) ki gen orthovanadate sodyòm, inhibiteur bwason fosfataz 1 ak 2 (Sigma-Aldrich), leupeptin ak pepstatin anvan omojènizasyon. Lysates tisi yo te bouyi pou 10 minit nan tanpon echantiyon epi yo chaje sou 4% -20% oswa 10% Tris-glycine SDS jèl (Invitrogen). Pwoteyin yo te transfere nan manbràn nitrocellulose, bloke pou 1 èdtan nan ~ 23-25 ​​°C (5% lèt sèk ki pa gen anpil grès ak 0.2% Tween-20 nan PBS, pH 7.4), ak enkubasyon nan antikò prensipal lannwit lan nan 4 °C. Antikò prensipal sa yo te dilye nan solisyon blòk: D2R sourit monoklonal (Santa Cruz, 1:100) oswa β-aktin sourit monoklonal (Santa Cruz, 1:200). Yo te ajoute reyaktif chemiluminescent ECL apre enkubasyon ak antikò segondè konjige peroksidaz refor (Amersham, 1:2,000). Fòm D2DR ki asosye ak manbràn ki gen matirite (~ 70 kDa)17, 49 te nòmalize nan yon kontwòl pwoteyin chaje (β-aktin; 43 kDa) ak quantifye pa densitometri lè l sèvi avèk lojisyèl NIH Image J.

Analiz imunochimik.

Rat yo te anestezi ak transcardially perfused ak 4% paraformaldehyde nan PBS (pH 7.6). Sèvo yo te retire, postfixed lannwit lan epi estoke nan sikwoz (solisyon 30% nan PBS, pH 7.4) pou omwen 72 èdtan. Seksyon tisi nan frizè (30 μm epesè) yo te kolekte nan yon mikrotom ak bloke (3% BSA, 5% serom kabrit nòmal ak 0.3% Triton X-100 nan PBS) pou 1 èdtan nan ~ 23-25 ​​°C. Antikò prensipal sa yo te ajoute nan solisyon an blòk ak enkubasyon lannwit lan nan 4 °C: poul poliklonal GFP (Abcam, 1:1,000); lapen monoklonal nan GFAP (Millipore, 1:1,000); sourit monoklonal nan NeuN (Millipore, 1:1,000). Seksyon yo te enkube ak antikò segondè ki konjige fliyoresan nan ~ 23-25 ​​°C: anti-poul-488-nm lank (Jackson ImmunoResearch, 1:1,000), anti-lapen-594-nm lank (Invitrogen, 1:1,000). ), ak anti-sourit-594-nm lank (Invitrogen, 1:1000). Seksyon yo te monte ak Vectashield aliye medya ki gen DAPI (Vector Labs) ak coverslipped. Imaj yo te pran lè l sèvi avèk yon mikwoskòp fliyoresan Olympus BX61 (×2 objektif) oswa yon mikwoskòp konfokal Olympus (×10 ak ×100 objektif).

Pwosedi manje.

Rat yo te loje endividyèlman sou kabann papye (kousinen alfa; Shepherd Specialty Papers) pou anpeche pwodwi manje yo sal ak materyèl kabann ki lach. Rejim kafeterya a te gen ladann bekonn, sosis, gato fwomaj, gato liv, glase ak chokola, ki te peze endividyèlman anvan yo te disponib pou rat yo. Atik manje rejim alimantè kafeterya yo te delivre nan ti resipyan metal. Tout atik manje, ki gen ladan manje estanda laboratwa, yo te peze ankò lè yo fini sesyon manje a. Konsomasyon kalorik ki soti nan divès makronutriman yo te kalkile lè l sèvi avèk enfòmasyon nitrisyonèl manifakti a bay.

Repwesyon siy ki pwovoke nan konpòtman manje.

Pwosedi manje yo te pran plas nan chanm opere son atenuasyon ki idantik nan dimansyon ak sa yo itilize nan eksperyans BSR yo. Rat yo te mete nan yon chanm opere epi yo te gen aksè a rejim alimantè kafeterya oswa manje pou 30 minit. Pwodwi manje yo te delivre nan ti resipyan metal. Tout atik manje yo te peze anvan ak apre sesyon manje, ki te fèt pandan peryòd nòmal manje rat yo. Konsomasyon Chow te evalye pa konsomasyon nan 45-mg granules chow ki idantik nan konpozisyon ak chow yo bay nan kaj kay rat yo. Lè sa a, rat yo te pèmèt aksè 30 minit pou chak jou nan rejim alimantè kafeterya a jiskaske yo te reyalize yon konsomasyon ki estab (ki defini kòm <10% varyasyon nan konsomasyon chak jou), ki mande 5-7 d. Apre estabilizasyon nan konsomasyon manje gou pandan peryòd debaz sa a, rat nan chak kondisyon aksè yo te asiyen nan de gwoup: pini (sa yo ki resevwa chòk pye) ak san pinisyon (pa resevwa chòk pye). Lè sa a, rat yo te sibi kat sesyon kondisyone nan jou konsekitif nan menm chanm opere kote yo te deja te gen aksè a manje a gou. Pandan sesyon kondisyone 30-min yo, yo te aktive yon limyè siyal (estimilis kondisyone) pou 10 minit, etenn pou 10 minit, epi li tounen limen pou 10 minit. Rat pini yo te resevwa chòk pye sèlman pandan prezantasyon limyè siyal la (0.5 mA pou 1.0 s; 10 eksitasyon ak entèval ~ 1-min). Rat san pinisyon yo te prezante ak limyè siyal la nan menm fason an, men san livrezon nan chòk pye. Nan jou tès la, jou apre sesyon kondisyone final la, rat nan gwoup pini yo te resevwa chòk pye tanzantan (senk eksitasyon an total) ansanm ak aktivasyon limyè siy la pou 5 min. Rat san pinisyon yo te ankò ekspoze a limyè siyal la nan absans chòk pye. Apre peryòd pinisyon 5-min la, tout rat yo te pèmèt aksè nan manje a bon gou pou yon sesyon 30-min ak estimilis kondisyone a aktive tanzantan (10 min limyè siyal limen, 10 min limyè siyal koupe, 10 min limyè siyal limen).

Estatistik analyses.

Papòt rekonpans debaz yo te defini kòm valè papòt mwayèn pou 5 d anvan aksè nan rejim kafeterya pou chak sijè. Papòt rekonpans yo te eksprime kòm pousantaj chanjman nan valè papòt debaz la. Done sou pousantaj valè papòt rekonpans debaz yo, pran pwa, konsomasyon kalorik, ak konsomasyon kalorik ki soti nan grès yo te analize pa de faktè, repete-mezi analiz de divèjans, ak aksè (chow sèlman, aksè restriksyon oswa aksè pwolonje), sous kalori ( manje estanda oswa manje kafeterya), viris (Lenti-control oswa Lenti-D2Rsh) ak siyal (pè oswa depaire ak pinisyon) kòm faktè ant-sijè yo ak tan kòm faktè a andedan-sijè. Lè sa apwopriye, efè prensipal yo nan analiz divèjans yo te analize plis pa tès post hoc Bonferroni. Tout analiz estatistik yo te fèt lè l sèvi avèk lojisyèl GraphPad Prism.

Referans

Referans

Korespondans a:

· Paul J Kenny ([imèl pwoteje])